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Forschungsartikel

Wen Yang Ding Chuan Tang schwächt die Umgestaltung der asthmatischen Atemwege ab, indem er die durch M2-Makrophagen getriebene Fibroblastenaktivierung hemmt

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DOI:

10.3791/69737

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24. März 2026

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1Department of Traditional Chinese Medicine, The Third Affiliated Hospital of Qiqihar Medical University, 2Department of Respiratory, The First Affiliated Hospital of Heilongjiang University of Chinese Medicine, 3Department of Clinical Pharmacy, The Third Affiliated Hospital of Qiqihar Medical University, 4Department of Central Laboratory, The Third Affiliated Hospital of Qiqihar Medical University, 5Department of Stomatology, The Third Affiliated Hospital of Qiqihar Medical University, 6Department of Magnetic Resonance, The Third Affiliated Hospital of Qiqihar Medical University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieser Artikel beschreibt eine Studie zur Regulation der pulmonalen Fibroblastfibrose durch Wenyang Dingchuan Decoction durch Hemmung der M2-Makrophagenpolarisation.

Zusammenfassung

Die Untersuchung der Auswirkungen von Wen Yang Ding Chuan Tang (WYDCT) auf die Funktion von Fibroblasten, die Atemwegsremodellierung bei Asthma und den zugrunde liegenden Mechanismus. IL-4 wurde verwendet, um die M2-Polarisation von RAW264.7-Makrophagen zu induzieren, und die polarisierten Makrophagen wurden anschließend mit WYDCT behandelt, um deren Wirkung auf Maus-Lungenfibroblasten zu untersuchen. Polarisierte RAW264.7-Zellen wurden verschiedenen Behandlungen unterzogen und anschließend gemeinsam mit Fibroblasten kultiviert. M1- und M2-Markerwerte, Zellmorphologie und IL-6-Konzentration wurden bewertet. Der STAT3-Proteinspiegel wurde analysiert. Fibroblastenlebensfähigkeit, Proliferation, Koloniebildung, PCNA-Expression sowie die Expression von Fibronectin, COL1A1 und α-SMA wurden mit verschiedenen Assays analysiert, darunter Echtzeit-PCR, Western blot, CCK-8, Edu, Immunfluoreszenz und Koloniebildungstests. WYDCT hat die durch IL-4 induzierten morphologischen Veränderungen in RAW264.7-Zellen umgekehrt, die Spiegel der M2-Marker (Arg-1, CD206) und IL-6 reduziert und die STAT3-Expression in RAW264.7-Zellen verringert, während die Supplementierung mit IL-6 die Wirkung von WYDCT auf M2-Marker wiederherstellte. Darüber hinaus hemmte WYDCT die Vitalität und Proliferation von Fibroblasten, verringerte die PCNA-Expression und senkte die Fibrosemarker (Fibronectin, COL1A1, α-SMA), was darauf hindeutet, dass WYDCT die Lebensfähigkeit, Proliferation und Fibrose von Lungenfibroblasten hemmt, indem es die Polarisation der Makrophagen M2 unterdrückt, wobei der IL-6/STAT3-Signalweg eine Schlüsselrolle spielen könnte.

Einleitung

Asthma, auch bekannt als Bronchialasthma, ist eine anhaltend entzündliche Erkrankung der Atemwege1. Häufig wird dieser Zustand mit Allergenexposition, Kälte und Reizstoffen sowohl physikalischer als auch chemischer Natur in Verbindung gebracht und ist durch Infiltration von Entzündungszellen, reversible Verengung der Atemwege, Schleimsekretion und Bronchospasmus2 gekennzeichnet. Derzeit gibt es weltweit mindestens 300 Millionen Asthmapatienten, und die Prävalenz steigt von Jahrzu Jahr 3. Im Jahr 2015 starben 400.000 Menschen an Asthma, was es zu einem ernsten globalen Gesundheitsproblemmacht. 4,5. Auch China steht vor demselben Problem, mit Studien, die eine Asthmaprävalenz von 4,2 % zeigen, was etwa 45,7 Millionen erwachsene Patienten ausmacht, mit niedrigeren Kontrollraten im Vergleich zu Industrieländernmit 6,7 %. Das Wohlbefinden der von dieser Krankheit betroffenen Personen ist stark beeinträchtigt, was zu erheblicher finanzieller Belastung für Familien führt.

Die Atemwegsanierung gilt als entscheidender Faktor bei der Behandlung von Asthma, das schwerzu kontrollieren ist. Daher wird die Behandlung von chronischem persistierendem Asthma zu einem zentralen Punkt. Die klinische Praxis beinhaltet häufig die Verwendung inhalierter Kortikosteroide in Kombination mit Bronchodilatatoren, die die Symptomebei Patienten effektiv lindern können. Diese Behandlungen haben jedoch bestimmte Nebenwirkungen und können bei manchen Patienten weniger wirksam sein, um die Symptome zu verbessern. Außerdem tritt Asthma oft nach Absetzen der Medikation wieder auf. Forschungen haben gezeigt, dass die Aktivierung von Lungenfibroblasten mit der Umstrukturierung der Atemwege während des Fortschreitens von Asthma10 zusammenhängt. Nach der Aktivierung durchlaufen die Lungenfibroblasten eine phänotypische Transformation und sezernieren Schlüsselproteine, um die Ablagerung der extrazellulären Matrix (ECM) anzutreiben – das pathologische Kernmerkmal der Atemwegsanstrukturierung. Insbesondere dient Fibronectin als frühes Gerüst für die ECM-Assemblierung und fördert die Rekrutierung und Haftung anderer Matrixkomponenten; COL1A1 (Typ-I-Kollagen-α1-Kette) ist das wichtigste strukturelle Protein der ECM, und seine übermäßige Ansammlung führt zu einer Verdickung und Steifheit der Atemwegswand; α-SMA (α-glatte Muskelaktin) markiert die Umwandlung von Fibroblasten in Myofibroblasten mit starken kontraktilen und sekretorischen Fähigkeiten, was die ECM-Ablagerung und Atemwegsfibrose weiter beschleunigt.

IL-6 ist der wichtigste zytoplasmatische Signalfaktor für die Aktivierung des STAT3-Wegs11. Erhöhtes IL-6 aktiviert den STAT3-Pfad. Im asthmatischen Mauslungengewebe sind die Expression von STAT3 sowie phosphorylierter mRNA und Protein signifikant erhöht. Der IL-6/STAT3-Signalweg ist eines der Ziele für die Asthmabehandlung. Studien haben bestätigt, dass die Aktivierung des IL-6/STAT3-Signalwegs mit einer Entzündung der Atemwege bei Asthma assoziiert ist und die Hemmung dieses Weges die Entzündung der Atemwegereduzieren kann 12,13. IL-6/STAT3 ist ebenfalls mit der M2-Polarisation von Makrophagen assoziiert. Ausländische Studien haben gezeigt, dass die Expression von IL-6 die nachgelagerte STAT3-Aktivierung signifikant reduziert, was mit einer Verringerung der Tumoroberflächenzahlen, verringerter Proliferation und reduzierter M2-Makrophagenzahl in derLeber-14 korreliert.

Immunzellen, die als Makrophagen bekannt sind, lassen sich in verschiedene Phänotypen einteilen, nämlich klassische Aktivierung (M1) und alternative Aktivierung (M2), die jeweils einzigartige Funktionenerfüllen 15. M1-Makrophagen können entzündliche Reaktionen und Gewebeschäden auslösen, während M2-Makrophagen die Zellproliferation fördern und Wundheilung sowie Gewebereparatur fördern. Forschungen haben gezeigt, dass die Remodellierung der Atemwege bei Asthma mit M2-Makrophagen16 assoziiert ist. In-vitro-Experimente haben gezeigt, dass die Induzierung der M2-Polarisation von Makrophagen mit IL-4 die Proliferationskapazität der α-SMA-positivenZellen 17 signifikant erhöht. Die Hemmung der M2-Makrophagenpolarisation ist ein wirksamer Ansatz zur Behandlung der Atemwegsumbildung bei Asthma.

Asthma gehört in der traditionellen chinesischen Medizin zur Kategorie "Xiao Bing". Die pathologischen Faktoren von Xiao Bing betreffen hauptsächlich Schleim. Die Schleimbildung entsteht durch ein Ungleichgewicht zwischen Yin und Yang in den Eingeweiden, kombiniert mit externen Faktoren wie exogenen Krankheitserregern, Ernährung und nachträglichen Erkrankungen, die die Bewegung der Körperflüssigkeiten beeinflussen und zu Stagnation und Ansammlung führen. Mit der fortgesetzten Untersuchung der Mechanismen der traditionellen chinesischen Medizin bei der Behandlung von Asthma haben immer mehr Studien gezeigt, dass die traditionelle chinesische Medizin erhebliche Effekte bei der Linderung von Atemwegsentzündungen, der Verringerung der übermäßigen Schleimsekretion und der Hemmung der Atemwegsreform18,19. Bei Xiao Bing ist hauptsächlich die Lunge betroffen, gefolgt von der Milz und den Nieren. Patienten mit Xiao Bing haben einen mangelnden Lungen-Qi und eine schwache Abwehr gegen äußere Krankheitserreger, was zu einem Verlust der Lungen-Qi-Ausbreitung und langfristigen, wiederholten Verletzungen des Yang-Qi führt, was zu einem Lungen-Yang-Mangel führt. Yang-Mangel führt zu einer abnormalen Zirkulation von Körperflüssigkeiten, die sich zu Schleim kondensieren. Bei Langzeitanfällen beeinträchtigt kalter Schleim das Yang der Milz und der Nieren, was zu einem Muster von Lungen-Milz-Niere-Yang-Mangel, einem Ungleichgewicht von Yin und Yang, übermäßiger Überlagerung oder Funktionsstörung sowie einer abnormalen Zirkulation der Körperflüssigkeiten führt. Die Lunge kann keine Flüssigkeit abgeben, die Milz kann Wasser und Essenz nicht umwandeln, und die Nieren können nicht verdampfen und Flüssigkeiten umwandeln, was zur Kondensation von Schleim und zur Bildung einer Stase führt, die sich als Asthma äußert. Daher ist Yang-Mangel die Hauptursache von Xiao Bing, und Schleimstasis ist sein Merkmal. Wen Yang Ding Chuan Tang besteht aus 12 chinesischen Heilkräutern, darunter Epimedium (15 g), Ephedra (verarbeitet) (10 g), Ginseng (15 g), Astragalus (15 g), Ginkgo biloba (15 g), Flos Farfarae (15 g), Bitterer Aprikosenkern (15 g), Pinellia ternata (verarbeitet) (10 g), Schisandra chinensis (10 g), Regenwurm (10 g), Persica (10 g) und Lakritz (verarbeitet) (10 g). Diese Kräuterformel stammt aus der modifizierten Formulierung von Ding Chuan Tang im Buch "She Sheng Zhong Miao Fang" und hat die Wirkung, Yang zu erwärmen, Qi zu verstärken, Schleim aufzulösen, die Durchblutung zu fördern sowie Husten und Asthma zu lindern. Die klinische Wirksamkeit dieser Behandlung wurde nachgewiesen, was aktuelle experimentelle Untersuchungen zu ihrem Mechanismus zur Behandlung der Atemwegsremodellierung bei Asthma anstößt.

Im Vergleich zu aktuellen pharmakologischen Therapien für Asthma, wie inhalierten Kortikosteroiden, β2-Agonisten und monoklonalen antikörperbasierten Biologika, die auf IgE oder IL-5 abzielen, bietet Wen Yang Ding Chuan Tang (WYDCT) eine potenzielle multitargetierte und sicherere Therapiestrategie. Konventionelle Kortikosteroide lindern effektiv die Entzündung der Atemwege, sind jedoch oft mit Nebenwirkungen wie Immunsuppression, hormonellem Ungleichgewicht und Rückfällen beim Entzug verbunden. Biologische Substanzen sind zwar spezifischer, aber kostspielig und auf bestimmte Asthma-Phänotypen beschränkt. Im Gegensatz dazu zeigt WYDCT, abgeleitet von der Theorie der traditionellen chinesischen Medizin, das "Yang erwärmt und Schleim auflöst", umfassende Effekte auf die Regulierung des Immungleichgewichts, die Verringerung von Atemwegsentzündungen und die Unterdrückung der Atemwegsremodellierung, wie in klinischen und experimentellen Studiengezeigt wurde 20. Seine Mehrkomponentenzusammensetzung kann gleichzeitig die Makrophagepolarisation, die Aktivierung von Fibroblasten und die Freisetzung von Zytokinen modulieren und so eine breitere und potenziell nachhaltigere Verbesserung der Asthmapathologie ermöglichen.

In dieser Studie wurde der Wasserextrakt von Wen Yang Ding Chuan Tang (WYDCT) aus zwölf Kräutern in einem festen traditionellen Verhältnis hergestellt, zu einer von 1 g/ml (Roharzneimitteläquivalent) konzentriert und für die Verwendung in Zellkulturen gefiltert. Der Extrakt wurde in Konzentrationen von 50, 100 und 200 μg/mL aufgetragen, die anhand von vorläufigen Zellviabilitätstests ausgewählt wurden, um eine Nicht-Zytotoxizität zu gewährleisten und gleichzeitig die pharmakologische Aktivität aufrechtzuerhalten. Das In-vitro-Modell beinhaltete IL-4-induzierte M2-Polarisation von RAW264.7-Makrophagen und Kokultur mit Maus-Lungenfibroblasten (L929-Zellen), was es uns ermöglichte, die Auswirkungen der parakrinen Makrophagen auf die Aktivierung von Fibroblasten und fibrosebezogene Reaktionen zu bewerten. Diese Details bieten einen reproduzierbaren Rahmen für zukünftige Studien, die die Dosis-Antwort-Eigenschaften und mechanistischen Signalwege von WYDCT bei der Atemwegsremodellierung untersuchen.

Basierend auf den oben genannten Ergebnissen spekulieren wir, dass Wen Yang Ding Chuan Tang seine anti-atemwegsremodelierenden Effekte bei Asthma ausübt, indem es die M2-Polarisation von Makrophagen hemmt und die Aktivierung von Fibroblasten unterdrückt.

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Protokoll

Diese Studie wurde nach internationalen, nationalen und institutionellen Richtlinien für die humane Tierbehandlung durchgeführt und in Übereinstimmung mit den einschlägigen Gesetzen. Konkret wurden alle Verfahren mit Mäusen vom Animal Ethical Care Committee des Third Affiliated Hospital des Qiqihar Medical College (AECC-2022-009) genehmigt. Die Mäuse wurden unter standardisierten Laborbedingungen untergebracht, mit Zugang zu Nahrung und Wasser ad libitum, und alle Anstrengungen wurden unternommen, um das Leiden zu minimieren. Humane Endpunkte wurden während der gesamten Studie festgelegt und überwacht.

1. Herstellung von WYDCT-Extrakt

Die 12 Kräuter von Wen Yang Ding Chuan Tang wurden nach dem traditionellen Verhältnis gewogen: Epimedium (15 g), verarbeitetes Ephedra (10 g), Ginseng (15 g), Astragalus (15 g), Ginkgo biloba (15 g), Flos Farfarae (15 g), Bitterer Aprikosenkern (15 g), verarbeitete Pinellia ternata (10 g), Schisandra chinensis (10 g), Regenwurm (10 g), Persica (10 g), und verarbeitetes Lakritz (10 g).

Zehnmal so viel destilliertes Wasser wurde hinzugefügt und die Mischung 30 Minuten gekocht. Die Extraktion wurde zweimal wiederholt, und die Filtrate wurden kombiniert. Der kombinierte Extrakt wurde unter reduziertem Druck auf eine rohe Arzneimitteläquivalentkonzentration von 1 g/ml konzentriert. Der Extrakt wurde durch eine 0,22 μm-Membran gefiltert, alicitiert und bei −20 °C gelagert. Arbeitskonzentrationen (50, 100 und 200 μg/mL) wurden unmittelbar vor der Verwendung durch Verdünnung hergestellt.

2. Zellkultur und M2-Polarisation

RAW264,7 Zellen (ATCC, USA) wurden aufgetaut und mit einer Dichte von 1 × 10⁶ Zellen pro 10 cm Napf in 10 mL DMEM besetzt, ergänzt mit 10 % fetalem Rinderserum, 100 U/mL Penicillin und 100 μg/mL Streptomycin. Die Zellen wurden bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO₂ für 24 Stunden inkubiert, bis eine Konfluenz von 80 % bis 90 % erreicht war.

Das Kulturmedium wurde dann durch frisches DMEM mit 20 ng/mL IL-4 ersetzt, und die Zellen wurden weitere 24 Stunden inkubiert, um die M2-Polarisation zu induzieren. Nach der Inkubation wurden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen und anschließend 24 Stunden lang mit WYDCT-Extrakt (10 mg/ml Lagerlösung, auf die angegebenen Endkonzentrationen verdünnt) behandelt. Für IL-6-Supplementierungsexperimente wurde während der WYDCT-Behandlung 50 ng/mL IL-6 hinzugefügt.

Zellen, die mit 0,1 % DMSO behandelt wurden, dienten als Negativkontrolle. Die zelluläre Morphologie wurde unter einem invertierten Mikroskop untersucht und repräsentative Bilder aufgenommen.

3. Isolierung und Kultur von Maus-Lungenfibroblasten

Mäuse wurden gemäß genehmigten ethischen Protokollen eingeschläfert. Die Lungenlappen wurden gesammelt und in die ausgewogene Salzlösung von Hanks gegeben. Sichtbare Blutgefäße und Bindegewebe wurden entfernt, und das Lungengewebe wurde in kleine Stücke (~1 mm3) zerkleinert.

Die Gewebefragmente wurden in 0,25 % Trypsin für 40 Minuten bei 37 °C mit sanfter Bewegung verdaut, gefolgt von einer zweiten Verdauung mit 0,25 % Trypsin für 30 Minuten. Die Zellsuspension wurde bei 300 × g für 5 Minuten zentrifugiert, das Überlagerungsmittel entsorgt und das Pellet in DMEM mit 10% fetalem Rinderserum aufgehängt.

Die Suspension wurde 100 Minuten inkubiert, damit die Fibroblasten haften konnten, danach wurden die Zellen erneut bei 300 × g für 5 Minuten zentrifugiert, um die Reinigung zu verbessern. Gereinigte Fibroblasten wurden in geeignete Kulturplatten ausgesät und bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO₂ inkubiert, bis etwa 80 % Konfluenz erreicht war.

4. Kokultivierung von Fibroblasten mit konditioniertem Medium

Der Supernatant wurde aus behandelten RAW264.7-Zellen entnommen und bei 3000 × g für 10 Minuten bei 4 °C zentrifugiert. Das Fibroblast-Kulturmedium wurde durch das gesammelte, makrophage-konditionierte Medium ersetzt. Fibroblasten wurden 24 Stunden lang bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO₂ inkubiert, bevor die funktionellen Tests durchgeführt wurden. Nach der Inkubation wurden Fibroblasten für RNA- und Proteinextraktion für anschließende qRT-PCR- und Western-Blot-Analysen entnommen.

5. Zellviabilität (CCK-8-Test)

Fibroblasten wurden mit einer Dichte von 5 × 10³ Zellen pro Bohrloch in 96-Well-Platten mit 100 μL Kulturmedium ausgesaat. Die Zellen wurden 24 Stunden lang den angezeigten Behandlungen unterzogen. Anschließend wurden jedem Bohrloch 10 μL CCK-8-Reagenz zugegeben, und die Platten wurden 2 Stunden bei 37 °C inkubiert. Die optische Dichte (OD) wurde mit 450 nm mit einem Mikroplattenleser gemessen. Die Zelllebensfähigkeit wurde mit (OD_treated / OD_control) × 100 % berechnet. Alle Experimente wurden mit drei biologischen Replikaten durchgeführt.

6. Koloniebildungstest

Die Zellen wurden mit einer Dichte von 1 × 10³ Zellen pro Bohrloch in 6-Brunnenplatten ausgesaat, mit drei Replikationsbohrungen pro Bedingung. Die Platten wurden 10–14 Tage bebrütet, bis sichtbare Kolonien entstanden waren. Die Kolonien wurden bei Zimmertemperatur 10 Minuten lang mit 0,1 % Kristallviolett gefärbt. Nach dem Flecken wurden die Kolonien gewaschen und fotografiert. Der gebundene Farbstoff wurde 15 Minuten lang in 30 % Essigsäure gelöst, und die optische Dichte wurde bei 590 nm gemessen. Drei unabhängige Experimente wurden durchgeführt.

7. EdU-Proliferationstest

Die Zellen wurden für 24 Stunden wie vorgesehen behandelt. Anschließend wurden jedem Bohrloch 100 μL 50 μM EdU hinzugefügt, und die Zellen wurden 2 Stunden bei 37 °C inkubiert. Die Zellen wurden 30 Minuten lang in 4 % Paraformaldehyd fixiert und 5 Minuten mit 2 mg/ml Glycin abgeschreckt. Die Zellen wurden mit 0,5 % Triton X-100 in PBS permeabilisiert, gewaschen und 30 Minuten lang mit Apollo-Färbelösung inkubiert. Die Kerne wurden 30 Minuten lang mit Hoechst 33342 (1×) gekontert. EdU-positive Zellen wurden mit einem Fluoreszenzmikroskop beobachtet und abgebildet.

8. ELISA für IL-6

Der RAW264.7-Zell-Supernatant wurde bei 3000 × g für 15 Minuten bei 4 °C zentrifugiert. Die IL-6-Werte wurden mit einem Beyotime ELISA-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers gemessen. Die Absorption wurde mit einem Mikroplattenleser gemessen, und IL-6-Konzentrationen wurden anhand einer Standardkurve berechnet.

9. Immunfluoreszenz

Die Fibroblasten wurden 10 Minuten lang in vorgekühltem Aceton fixiert und dreimal mit PBS gewaschen. Die Zellen wurden mit 0,1 % Triton X-100 für 10 Minuten permeabilisiert und 30 Minuten mit 1 % BSA in PBS blockiert. Die Zellen wurden anschließend über Nacht mit einem primären Antikörper gegen PCNA (1:100) bei 4 °C inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit PBS wurden die Zellen mit einem FITC-konjugierten Sekundärantikörper (1:200) für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Kerne wurden mit DAPI gegenfärbt, gewaschen und mit einem Fluoreszenzmikroskop abgebildet.

10. qRT-PCR

Die Gesamt-RNA wurde gemäß dem Protokoll des Herstellers mit Trizol-Reagenz (Beyotime, China) extrahiert. Die Reverse-Transkription wurde mit dem cDNA-Synthesekit unter Verwendung von 2 μg RNA und zufälligen Primern durchgeführt. PCR-Reaktionen wurden in einem 20 μL großen Volumen hergestellt, das 10 μL SYBR Green Master Mix, 0,5 μL jedes genspezifischen Primers (Endkonzentration 0,5 μM) und 1 μL cDNA-Vorlage enthielt. Zu den verwendeten Primern gehörten CD16, iNOS, Arg-1, CD206, Fibronectin, COL1A1, α-SMA und GAPDH (bereitgestellte Sequenzen).

Die thermischen Zyklusbedingungen bestanden aus einer anfänglichen Denaturierung bei 95 °C für 5 Minuten, gefolgt von 40 Zyklen mit 95 °C für 30 Sekunden, 60 °C für 30 Sekunden und 72 °C für 30 Sekunden. Die Analyse der Schmelzkurve wurde von 60 °C bis 95 °C in 0,5 °C-Schritten durchgeführt, um die Spezifität der Verstärkung zu überprüfen.

Datenanalyse: Die relative Expression wurde mit der 2^−ΔΔCT-Methode berechnet und auf GAPDH normalisiert. Die Zünder waren wie folgt: CD16 (Maus): 5′- AGGAGCTGAGGAGGAGGAGGAGG-3′ und 5′- TGAGGAGGAGGAGGAGGAGC-3′, iNOS (Maus): 5′-TGCTCCCAGAGATGTTGT-3′ und 5′-TGGTCTGGTAGGCTGTACGG-3′, Arg-1 (Maus): 5′- GCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTG-3′ und 5′- GGTGGCTTTGCTGGTCTCTCTC-3′ und 5′- GGTGGCTTTGCTGGTCTCTC-3′′ ��, CD206 (Maus): 5′- GGCTTCTATGAGCTGGGTGA-3′ und 5′- CTGGGCTCTGGATGTTGTTGTT-3′, Fibronectin (Maus): 5'-CGTGGTGAAGGTGTTTTTGC-3' und 5'-GAGGTCACAGTGGTCTTGCT-3', COL1A1 (Maus): 5'-CCCTGGACACCTGGCTTTTT-3' und 5'-GCGGGTCACCTTCTCTCTCCTC-3', α-SMA (Maus): 5'-CTGGAACAGCAGCTTCTC-3' und 5'-GGGACATAGCACAGCTCTC-3', GAPDH (Maus): 5′- TGTGTCCGTCGTGGATCTGA -3′ und 5′- CCTGCTTCACCTTCTTGAT-3′.

11. Westlicher Fleck

Die Zellen wurden mit RIPA-Puffern lysiert, die Proteaseinhibitoren enthielten. Die Proteinkonzentrationen wurden mittels eines BCA-Tests bestimmt. Für SDS-PAGE wurden 60 μg Protein in jede Bahn eines 10%igen Polyacrylamid-Gels geladen und bei 120 V für 1,5–2 Stunden getrennt. Die Proteine wurden mit einer feuchten Transfermethode bei 100 V für eine Stunde auf eine PVDF-Membran übertragen. Nach dem Blockieren mit 5 % fettarmer Milch in TBS-T für 1 Stunde bei Zimmertemperatur wurde die Membran über Nacht mit primären Antikörpern (1:1000 Verdünnung) bei 4 °C inkubiert. Nach Wascharbeiten mit TBS-T wurde die Membran mit HRP-konjugierten sekundären Antikörpern (1:5000 Verdünnung) für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Nach weiteren Waschbehandlungen wurden die Proteinbänder mit einem ECL-Chemikulumineszenzreagenz nachgewiesen und mit einem chemilumineszenzbildenden Bildgebungssystem abgebildet. Die Bandintensitäten wurden mit der ImageJ-Software quantifiziert, und die Proteinwerte wurden als interne Kontrolle auf GAPDH normalisiert.

12. Statistische Analyse

Die Daten wurden mit SPSS 17.0 analysiert. Kontinuierliche Variablen wurden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) angegeben. Vergleiche zwischen zwei Gruppen wurden mit einem ungepaarten t-Test durchgeführt, während Vergleiche zwischen mehreren Gruppen mit einseitigem ANOVA gefolgt vom LSD-Post-hoc-Test durchgeführt wurden. Ein p-Wert unter 0,05 galt als statistisch signifikant.

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Ergebnisse

Die Auswirkungen von WYDCT auf die M2-Polarisation von Makrophagen der RAW264.7-Zellen

Wir beobachteten die Zellmorphologie von RAW264.7 mit einem Lichtmikroskop. Wie in Abbildung 1A gezeigt, verursachte die IL-4-Stimulation eine Verlängerung der Zellen, was zu einer länglicheren, spindelartigen Form im Vergleich zu unbehandelten Zellen führte. Zusätzlich zeigten die IL-4-stimulierten Zellen eine erhöhte zytoplasmatische Granularität und eine verb...

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Diskussion

Ziel dieser Studie war es, die Auswirkungen von WYDCT auf die Fibroblastenaktivität und die Atemwegsreform bei Asthma sowie die zugrunde liegenden Mechanismen zu untersuchen. Die aktuellen Ergebnisse zeigen, dass WYDCT die M2-Polarisation von RAW264.7-Makrophagen hemmen kann, was wiederum die Lebensfähigkeit, Proliferation und Fibrose von Maus-Lungenfibroblasten beeinflusst. Darüber hinaus spielte der IL-6/STAT3-Signalweg eine Schlüsselrolle bei der Vermittlung dieser Effekte.

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Danksagungen

Wir danken allen Partnern, die zu diesem Forschungsprojekt beigetragen haben, aufrichtig. Diese Arbeit wurde 2022 durch die Betriebskosten der Universitätsgrundforschung in der Provinz Heilongjiang (Nr. 2022-KYYWF-0827) unterstützt, wofür wir dankbar sind.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Apollo 643 HybridisierungsreagenzGuangzhou RiboBio Co., Ltd.C10371-2
Arginase-1 (E4U1I) Maus mAb Cell Signaling Technology, Inc.43933T
BCA-Proteinkonzentrations-KitBeyotime Biotechnology Co., Ltd.P0012
BeyoBlot HRP-Konjugierte Maus Anti-Kaninchen-natives IgG (H+L)Beyotime Biotechnology Co., Ltd.A0210
Kohlendioxid-InkubatorShanghai Lishen Scientific Equipment Co., Ltd.HF240
CD206/MRC1 (E6T5J) XP® Rabbit MabCell Signaling Technology, Inc.24595T
Zellzähl-Kit-8Beyotime Biotechnology Co., Ltd.C0037
COL1A1 (E8F4L) XP Rabbit mAb Cell Signaling Technology, Inc.72026T
DimethylsulfoxidBeyotime Biotechnology Co., Ltd.ST038-100ml
DMEM-Medium mit hohem ZuckergehaltGrand Island Biologische Gesellschaft11965092
EDUBeyotime Biotechnology Co., Ltd.ST067-250 mg
Fcγ RIII/CD16 (F6K6G) Rabbit mAb Cell Signaling Technology, Inc.71345T
Fetales KalbserumGrand Island Biologische GesellschaftA5256701
Fibronektin/FN1-Antikörper  Cell Signaling Technology, Inc63779S
FITC-Konjugierte Ziegen-Anti-Maus IgG (H+L)Beyotime Biotechnology Co., Ltd.A0568
Fluoreszenzquantitatives PCR-InstrumentYarui Biotechnology Co., Ltd.MA-6000
Hoechst 33342 Live-Cell-Färbelösung (100X)Beyotime Biotechnology Co., Ltd.C1029
iNOS (E1W4J) Rabbit mAbCell Signaling Technology, Inc.70706SF
Invertiertes MikroskopGuangzhou Mingmei Optoelectronics Technology Co., Ltd.MI52-N
LRRK2 T1348N mut RAW 264.7ATCCSC-6005
Mmunostaining-Permeabilisierungspuffer (mit Triton X-100)Beyotime Biotechnology Co., Ltd.P0096-100ml
Maus IL-6 ELISA KitBeyotime Biotechnology Co., Ltd.PI326
MauslungenfibroblastenzellenWuhan Procell Life Technology Co., Ltd.CP-M006
PCNA (PC10) Maus-MAbCell Signaling Technology, Inc.2586T
Penicillin-StreptomycinGrand Island Biologische Gesellschaft15140148
Rekombinante Murine IL-4Beyotime Biotechnology Co., Ltd.P5916-5μ g
Rekombinante Murine IL-6Beyotime Biotechnology Co., Ltd.P5925-10μ g
Redu-Enzym-EtikettinstrumentRayto Life SciencesRT-6100
Stat3 (124H6) Maus mAb Cell Signaling Technology, Inc.9139T
Superclean-BankJinan BioBase Biotech Co., Ltd.BBS-SDC
SynGAP-α 2 (E4Y6I) Kaninchen mAb Cell Signaling Technology, Inc.56927T
Thermo Fisher Scientific RIPA Lysis- und ExtraktionspufferThermoFisher89901
Trizol (Gesamt-RNA-Extraktionsreagenz)Beyotime Biotechnology Co., Ltd.R0016
β-Aktin-AntikörperCell Signaling Technology, Inc.4967S

Referenzen

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