Methodenartikel

Eine vereinfachte Methode zur agrobakterie-vermittelten Transformation von Phytophthora palmivora

DOI:

10.3791/69753

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20. März 2026

 ,  , 
1Department of Plant Pathology, University of Georgia

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Wir präsentieren ein einfaches, wirksames und reproduzierbares Protokoll für die Agrobacterium-vermittelte Transformation von Phytophthora palmivora, das auch auf P. capsici anwendbar ist.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Phytophthora ist eine Oomycetengattung, die zahlreiche zerstörerische Pflanzenpathogene beherbergt, darunter die weit verbreitete Wirtsart P. palmivora. Die funktionelle Genomik von Phytophthora wurde durch die begrenzte Verfügbarkeit robuster, leicht implementierbarer Transformationsmethoden eingeschränkt. Unter den verfügbaren Ansätzen ist die Agrobacterium-mediated transformation (AMT) besonders attraktiv, da sie nur minimale Spezialausrüstung erfordert und oft stabile Transformanten mit Einzelkopien-Geninsertionen erzeugt. Die meisten AMT-Protokolle zur Pilz- und Oomycet-Transformation verwenden Minimalmedium-(MM)-Salze in Agrobacterium-Induktions - und Kokultivierungsmedien. Die Herstellung dieser Medien beinhaltet typischerweise die Herstellung und das Mischen mehrerer Lagerlösungen, von denen einige zahlreiche Komponenten in unterschiedlichen Konzentrationen enthalten. Der Prozess ist zeitaufwendig und fehleranfällig, was zu inkonsistenten Transformationserfolgen führt. Hier präsentieren wir ein schlanklanges, einfaches und reproduzierbares AMT-Protokoll für P. palmivora , das kommerziell erhältliches Basalmedium Murashige und Skoog (MS) verwendet, um das Agrobacterium-Induktions - und Kokultivierungsmedium herzustellen. Dieses Protokoll wurde auch erfolgreich zur Transformation von P. capsici angewandt und kann auch auf andere Phytophthora-Arten angewendet werden.

Einleitung

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Phytophthora, eine Gattung von Oomyceten, umfasst viele der zerstörerischsten Pflanzenpathogene der Welt und ist für schwere wirtschaftliche Verluste verantwortlich 1,2. Unter ihnen ist Phytophthora palmivora ein Erreger mit breitem Wirtsspektrum, der viele wirtschaftlich wichtige Pflanzen infiziert, darunter Kakao und Papaya3. Sie ist der am weitesten verbreitete ursächliche Erreger der schwarzen Schotenfäule im Kakao, einem tropischen mehrjährigen Baum, der den Hauptbestandteil der milliardenschweren Schokoladenindustrie 4,5,6 produziert. Das Verständnis der molekularen Pathogenitätsmechanismen dieses destruktiven Erregers ist entscheidend für die Entwicklung neuartiger, effektiver Krankheitskontrollstrategien, und genetische Transformation ist ein wesentliches Werkzeug für solche Untersuchungen.

Mehrere Methoden wurden entwickelt, um Phytophthora-Arten zu transformieren, darunter Mikroprojektilbombardement7, Polyethylenglykol und Calciumdichlorid (PEG/CaCl2)-vermittelte Protoplasttransformation 8,9,10,11, Zoosporenelektroporation 12,13,14 und Agrobacterium-mediated Transformation (AMT)15,16. Unter diesen Ansätzen bietet AMT entscheidende Vorteile, da es typischerweise eine Genintegrationmit einer Einzelkopie erzeugt 15,16 und relativ einfach durchzuführen ist, ohne spezielle Geräte erforderlich zu machen.

Ein Protokoll zur effizienten Transformation von P. palmivora mittels AMT wurde bereitsentwickelt 16. Mit dieser Methode haben wir P. palmivora erfolgreich mit mehreren Konstrukten17,18 transformiert. Diese Methode verwendet Minimalmedium (MM) Salz-basierte Agrobacterium-Induktions- und Kokultivierungsmedien, die häufig fürdie Umwandlung von Pilzen und Oomyceten verwendet werden. Obwohl das MM-basierte Transformationsprotokoll sich als wirksam bei der Erzeugung von Transformanten erwiesen hat, kann die Vorbereitung mehrerer Standardlösungen und deren Kombination zu Medien zeitaufwendig und fehleranfällig sein.

Hier präsentieren wir eine stark vereinfachte Methode für AMT von P. palmivora, indem kommerzielles Murashige- und Skoog-(MS)-Basalmedium verwendet wird, um die MM-salzbasierten Mediumkomponenten im Agrobacterium-Induktions - und Kokultivierungsmedium16 zu ersetzen. Diese Methode überflüssig macht, mehrere chemische Lagerlösungen herzustellen, was den Prozess weniger zeitaufwendig und hochgradig reproduzierbar macht. Darüber hinaus scheint dieser Ansatz eine höhere Transformationseffizienz im Vergleich zur zuvor beschriebenen Methode16 zu liefern und ist auch auf P. capsici anwendbar.

Protokoll

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1. Vorbereitung von Lagerlösungen, Medien und anderen für die Transformation benötigten Materialien

  1. Antibiotika-Stocklösungen
    1. Lagerlösungen von Kanamycin (50 mg/mL), G418 (15 mg/mL) und Cefotaxim (100 mg/mL) bereiten: Ausreichende Mengen der Antibiotika in Wasser auflösen, die Lösungen filtersterilisieren, 1-mL-Aliquots zubereiten und bei -20 °C lagern.
    2. Baulösung von Rifampicin (15 mg/mL) bereiten: Die passende Menge Rifampicin in DMSO auflösen, 1-mL Aliquots zubereiten, sie in Folie wickeln und bei -20 °C lagern.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass chemische Lösungen, die in DMSO hergestellt werden, mit Spritzenfiltern aus DMSO-kompatiblen Materialien wie Nylon oder PTFE (Teflon) sterilisiert werden.
  2. Medien für das Wachstum von Agrobacterium
    1. Luria-Bertani (LB) flüssiges Medien: Um 250 ml Medium herzustellen, geben Sie 6,25 g LB-Pulver zu 250 mL Wasser, autoklavieren Sie die Lösung und lagern sie bei Raumtemperatur (RT).
    2. LB-Agarmedium: Um 250 ml Medium herzustellen, geben Sie 6,25 g LB-Pulver und 3,75 g Agar zu 250 mL Wasser, autoklavieren Sie die Lösung und lagern Sie sie bei RT. Geben Sie vor der Herstellung der Platten geeignete Antibiotika zum geschmolzenen LB-Agar. Lagern Sie die mit Antibiotika ergänzten Platten bei 4 °C.
  3. Medien für Wachstum und Transformation von P. palmivora
    1. 10 % V8 Agar: Um 500 ml herzustellen, fügen Sie 50 ml originalen 100 % Gemüsesaft V8 zu 450 ml Wasser hinzu. Dann geben Sie 0,5 g CaCO3 zur Suspension und rühren Sie es gut um. Autoklavieren Sie die Lösung und gießen Sie sie auf Teller.
      HINWEIS: Fügen Sie bei Bedarf geeignete Antibiotika hinzu. Lagern Sie die mit Antibiotika ergänzten Platten bei 4 °C.
    2. Halbstarkes Murashige und Skoog (1/2 MS) flüssiges Medium: Fügen Sie 2,15 g Murashige und Skoog Basalmedium (MS) zu 950 ml Wasser hinzu, stellen Sie den pH-Wert auf 5,6 mit 1 N KOH ein und fügen Sie Wasser bis zu 1 L hinzu. Verwenden Sie direkt 1/2 MS Agar (Schritt 1.3.3), autoklavieren Sie die verbleibende 1/2 MS Flüssigkeit und lagern Sie sie bei RT.
    3. 1/2 MS Agar für Agrobacterium-Zoospore Co-Cultivation Agar (AZCA): Zur Herstellung von 600 mL AZCA mischen Sie 567 mL 1/2 MS Flüssigkeit aus Schritt 1.3.2 mit 9 g Agar. Autoklavieren Sie die Lösung und speichern Sie sie bei RT.
    4. 50 % Glycerol: 50 ml Glycerol mit 50 ml Wasser mischen, die Lösung autoklavieren und bei RT lagern.
    5. 1M MES (pH 5,6): Um 200 ml herzustellen, fügen Sie 39,048 g MES-Hydrat zu 160 mL Wasser hinzu und stellen Sie dann den pH-Wert mit NaOH-Lösung auf 5,6 ein. Als Nächstes geben Sie Wasser bis zu 200 ml dazu, filtern die Lösung und lagern sie bei Dunkelheit bei RT.
      HINWEIS: MES löst sich allmählich auf, wenn der pH-Wert steigt. Verwenden Sie zunächst 10 N NaOH, um den pH-Wert auf 5,6 zu bringen, was das Pulver fast auflöst. Dann fügen Sie 1 N NaOH hinzu, um den pH-Wert genau auf 5,6 zu bringen.
    6. 20 % Glukose: 10 g Glukose in 40 ml Wasser auflösen, dann bis zu 50 ml Wasser hinzufügen, die Lösung filtersterilisieren und bei RT lagern.
    7. 200 mM Acetosyringon (AS): 40 mg 4'-Hydroxy-3', 5'-Dimethoxyacetophenon in 1 mL DMSO auflösen (siehe Hinweis unter 1.1.2) und die Lösung mit Folie abdecken. Machen Sie es frisch am Tag der Verwandlung.
    8. Agrobacterium-Induktionsmedium (AIM): Zur Herstellung von 40 mL Medium werden 400 μL 50 % Glycerol, 400 μL 20 % Glukose, 1,6 ml 1 M MES (pH 5,6), 40 μL 200 mM AS bis 37,6 ml 1/2 MS flüssige (pH 5,6) Lösung (hergestellt in Schritt 1.3.2) in einem sterilen 50 mL Rohr hinzugefügt. Die Lösung gut mischen, den Schlauch mit Folie abdecken und innerhalb weniger Stunden frisch verwenden.
    9. Agrobacterie-Zoosporen-Kokultivierungsagar (AZCA): Zur Herstellung von 600 ml Agar werden 6 ml 50 % Glycerol, 3 ml 20 % Glukose, 24 ml 1 M MES (pH 5,6), 600 μL 200 mM AS zu autoklaviertem und geschmolzenem 567 ml 1/2 MS Agar (pH 5,6) (hergestellt in Schritt 1.3.3) (hergestellt) hinzugefügt. Gieße die Lösung auf Platten und decke sie mit einem schwarzen Tuch ab, um vor Licht zu schützen.
      HINWEIS: Gib die chemischen Lösungen zu geschmolzenem 1/2 MS Agar (Schritt 1.3.9) bei 55–60 °C dazu. Schalte die Lichter in der Motorhaube während der Schritte 1.3.7-1.3.9 aus, da AS lichtempfindlich ist. Führen Sie diese drei Schritte am Tag der Verwandlung aus.
    10. Plich Agar: Um 1 L Agar in 950 ml Wasser herzustellen, fügen Sie 0,5 g KH2PO4, 0,25 g MgSO4·7H2O, 1 g L-Asparagin, 5 g Glukose, 0,5 g Hefeextrakt, 10 μL Thiamin (100 mg/mL in Wasser, bei 4 °C gelagert), 10 mg β-Sitosterol (vor dem Zufügen in 3 mL Ethanol auflösen) hinzu. Rühren Sie die Lösung um, um alle Zutaten aufzulösen, und fügen Sie dann Wasser hinzu, um das Volumen auf 1 L zu erreichen. Teilen Sie die Lösung in 500 ml Portionen und fügen Sie 7,5 g Agar zu jedem 500 ml hinzu. Die Lösung autoklavieren, und bei Temperaturfall auf 55 °C geeignete Antibiotika hinzufügen, dann auf Teller gießen.
    11. Hybond N+ Membran: Schneiden Sie die Membran mit den Schutzfolien in Stücke von 5 cm x 6 cm, wickeln Sie die Stücke in Alufolie und autoklavieren Sie sie. Während Sie die autoklavierte Membran auf AZCA-Medien legen, halten Sie sie mit einer sterilen Pinzette an und entsorgen Sie die Schutzfolien.

2. Kultivierung von P. palmivora

  1. Sieben bis acht Tage vor der Verwandlung werden P. palmivora-Papaya-Isolat P1 16 auf frisch hergestellten 10%-V8-Agarplatten angebaut, indem ein Agar-Plug einer bereits gezüchteten Phytophthora-Kultur (oder aus dem Fond) in die Mitte der Petrischale gelegt wird.
    HINWEIS: Um eine höhere Konzentration an Zoosporen zu erreichen, ist es wichtig, frisch zubereiteten, ungekleinigten 10%igen V8-Agar zu verwenden.
  2. Inkubieren Sie die Platten bei 25 °C unter einem 12-Stunden-Licht/12-Stunden-Dunkelzyklus für 7-8 Tage bis zur Verwandlung.

3. Herstellung von Agrobacterium tumefaciens

  1. Drei Tage vor der Transformation stammt der Streifen A. tumefaciens EHA105, der pCB301TOR-GFP16 auf einer LB-Agarplatte transportiert, die mit Rifampicin (15 μg/mL) und Kanamycin (50 μg/mL) ergänzt wird. Inkubieren Sie die Platte bei 28 °C für 2 Tage.
    HINWEIS: Die erste Zubereitung von Agrobacterium (Schritt 3.1) kann eine Woche vor der Transformation erfolgen, und die Platten können nach der zweitägigen Inkubationszeit bei 4 °C gelagert werden.
  2. Am Tag vor der Transformation nehmen Sie eine kleine Menge Agrobacterium-Zellen und verteilen Sie sie auf einer neuen LB-Agarplatte, die mit Antibiotika ergänzt wird (wie in Schritt 3.1 beschrieben), wobei der Boden und die flache Basis eines sterilen 1,5-mL-Mikrozentrifugenröhrchens verwendet wird. Zur leichteren Streuung geben Sie 20 μL LB flüssiges Medium in die Mitte der LB-Agarplatte, mischen Sie die Bakterienzellen mit dem LB-Medium und verteilen Sie sie dann gleichmäßig über die Platte. Inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 28 °C für etwa 16–18 Stunden.
  3. Schöpfen Sie die über Nacht gezüchteten Zellen mit einer 1-ml-Pipettenspitze und suspendieren Sie sie in einem 1-ml-Agrobacterium-Induktionsmedium (AIM) durch Pipettieren auf und ab. Verdünnen Sie die Zellen auf OD600 = 0,4 mit AIM in einem sterilen 50-mL-Rohr, das mit Folie bedeckt ist. Stellen Sie mindestens 5 ml vor, die für die Ko-Inkubation mit P. palmivora-Zoosporen verwendet werden (Schritt 5.1).
    HINWEIS: Ein OD600 im Bereich von 0,1 bis 0,8 würde eine erfolgreiche Transformation ermöglichen. OD600 = 0,4 wird routinemäßig verwendet, da diese Konzentration die höchste Transformationseffizienz erzielte, wenn für die Transformationvon Agrobacterium-Induktions- und Kokultivierungsmedien mit minimalem Medium (MM) Salz verwendet wurden.
  4. Inkubieren Sie die Bakterien bei RT unter dunklen Bedingungen 1,5–2 Stunden auf einem Plattformschüttler mit sanfter Bewegung (ca. 70 U/min).
    HINWEIS: Es wird empfohlen, die Haubenlampen während Schritt 3.3 auszuschalten und die Kappe des 50-mL-Rohrs während der Inkubation zu lockern (Schritt 3.4).

4. Freisetzung der Zoosporen

  1. Nach 1 Stunde Inkubation von Agrobacterium tumefaciens (Schritt 3,4) fluten Sie eine 7–8 Tage alte P. palmivora-Platte mit 10 ml Wasser, das bei 4 °C vorgekühlt ist, entfernen Sie die Luftblasen auf der Medienoberfläche durch sanftes Anklopfen mit einer Pipettenspitze und befruchten Sie die Platte bei 4 °C für 15 Minuten, gefolgt von 15 Minuten bei RT unter Licht.
  2. Übertragen Sie die freigesetzten Zoosporen (etwa 7–8 ml) vorsichtig in ein 15 mL steriles Zentrifugenrohr mit einer Pipette, ohne Myzel und Sporangien zu stören.
  3. Um die Zoosporenkonzentration zu messen, überträgt man etwas von der Zoosporensuspension (z. B. 20 μL) in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr und verdünnt es zehnmal mit Wasser (180 μL H2O für 20 μL Zoosporen). Wirbel das Rohr für 1 Minute vortex, um die Zoosporen für eine einfache Zählung einzukapseln, und zähle dann die Anzahl der Zoosporen unter dem Mikroskop mit einem Hämatocytometer. Multiplizieren Sie die gezählte Zahl mit dem Faktor 10, um die Konzentration der in Schritt 4.2 hergestellten Zoosporensuspension zu bestimmen.
    HINWEIS: Die Zoosporenkonzentration wird zur Berechnung der Transformationseffizienz gemessen. Wir verwenden typischerweise Konzentrationen von 1,5 × 106 bis 5 × 106 Zoosporen pro ml, mit erfolgreicher Transformation.

5. Ko-Inkubation von Agrobacterium und Zoosporen

  1. Geben Sie 5 ml Agrobacterium (hergestellt in Schritt 3.4) zu 5 ml Zoosporensuspension (vorbereitet in Schritt 4.2) in ein steriles 50-mL-Rohr, das mit Folie bedeckt ist. Sanft mischen und das Röhrchen 2 Stunden im Dunkeln bei RT inkubieren. Halte den Deckel locker und schüttle den Schlauch während der Co-Inkubation nicht.
  2. Während der Ko-Inkubationszeit (Schritt 5.1) bereiten Sie die AZCA-Platten vor (Schritt 1.3.9). Wenn das Medium erstarrt ist, lege ein Stück sterilisierte Hybond N+ -Membran (vorbereitet in Schritt 1.3.11) auf jede AZCA-Platte und halte die Platten im Dunkeln.
  3. Nach 2 Stunden Agrobacterium- und Zoosporen-Co-Inkubation (Schritt 5.1) wird 300 μL der Mischung auf jede Hybond N+- Membran verteilt, die auf den AZCA-Platten (Schritt 5.2) mit einer Pipettenspitze platziert ist, wobei die Ränder frei von der Flüssigkeit bleiben.
  4. Lassen Sie die Mischung etwa 10 Minuten an der Luft trocknen, indem Sie die Petrischalen unbedeckt lassen. Decken Sie die Platten ab, sobald die Lösung auf der Membran aufhört zu fließen.
    HINWEIS: Während der Schritte 5.1-5.4 sollten Sie die Motorhaubenbeleuchtung ausschalten. Falls nötig, verwenden Sie Lichter, während Sie die Mischung auf die Membranen geben und verteilen (Schritt 5.3).
  5. Nach dem Lufttrocknen werden die Platten 2 Tage lang bei 25 °C im Dunkeln ausgebrütet.

6. Auswahl von G418-resistenten Transformanten

  1. Nach 48 Stunden Co-Inkubation (Schritt 5,5) werden die Hybond N+ -Membranen mit sterilisierter Pinzette auf Plich-Agarplatten mit G418 (30 μg/mL) und Cefotaxim (100 μg/mL) übertragen. Während Sie die Membranen auf die Platten legen, ziehen Sie sie nicht über die Oberfläche des Mediums.
    HINWEIS: Die Konzentration von G418 für die Auswahl der Transformanten für jedes P. palmivora-Isolat muss bestimmt werden, da unterschiedliche Empfindlichkeitsstufen für verschiedene Isolate beobachtet werden. Dazu wird ein 0,5 cm großer Myzelstopfen in die Mitte der Plich-Agarplatten gelegt, ergänzt durch eine Reihe von G418-Konzentrationen in 5 μg/mL-Schritten, beginnend bei null. Bereite für jede Konzentration drei Replikationsplatten vor. Inkubieren Sie die Platten 7 Tage lang bei 25 °C. Identifizieren Sie die niedrigste G418-Konzentration, die das Wachstum des Phytophthora-Isolats vollständig hemmt, und verwenden Sie sie für die Auswahl von Transformatoren.
  2. Verwenden Sie die flache Basis eines 1,5-ml-Mikrozentrifugenrohrs, um vorsichtig über die Oberfläche der Membran zu drücken und zu schieben, damit sie in engem Kontakt mit dem Medium steht. Beobachten Sie die Unterseite der Platten, um das Vorhandensein von Luftblasen zwischen Membran und Medium zu überprüfen. Drücken Sie die Luftblase, falls vorhanden, vorsichtig mit der flachen Basis desselben Mikrozentrifugenrohrs aus.
  3. Inkubieren Sie die Platten unter einem 12-Stunden-Licht/12-Stunden-Dunkelzyklus bei 25 °C für 2-3 Tage.
  4. Nach 3 Tagen Inkubation werden die Membranen mit steriler Pinzette entfernt und die Platten unter denselben Bedingungen weiter bebrütet. Die Membranen können nach 2 Tagen entfernt werden, wenn sichtbare Kolonien auf den Platten sichtbar sind.
    HINWEIS: Die Transformanten erscheinen typischerweise innerhalb von 1–3 Tagen nach der Membranentfernung, aber einige Kolonien können später erscheinen. Um mehr Transformanten zu erhalten, überwachen Sie die Platten etwa eine Woche nach dem Entfernen der Membranen.
  5. Übertragen Sie die Transformanten auf 10%-V8-Agarplatten mit derselben G418-Konzentration oder einer um 30 % reduzierten Konzentration.

Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Unter Befolgung dieses Protokolls führten wir zwei unabhängige Experimente durch, um P. palmivora mit A. tumefaciens EHA105 zu transformieren, der pCB301TOR-GFP16 trägt. Wie erwartet führte die Ko-Inkubation von Zoosporen mit Agrobacterium zu G418-resistenten Kolonien auf Plich-Agarplatten, ergänzt mit 30 μg/mL G418, während auf Kontrollplatten keine Kolonien ohne Infektion mit Agrobacterium beobachtet wurden (Abbildung 1A). Die Anzahl der G418-resistenten Transformanten pro 107 Zoosporen, die aus diesen beiden Experimenten erzeugt wurden, betrug 55 bzw. 50 (Tabelle 1), was fast doppelt so hoch ist wie die höchste Zahl (27 ± 5), die zuvor mit dem früheren Protokoll16 erzielt wurde.

Echte Transformanten wurden mit zwei Methoden verifiziert: Erstens durch Beobachtung der GFP-Fluoreszenz mit einem Fluoreszenzmikroskop, und zweitens durch PCR-Amplifikation eines 550-bp-Fragments des EGFP-Gens mit Taq 2X Master Mix (NEB) und dem Primerpaar EGFP-F2 (5' – GACGTAAAACGGCCAAGTTC-3') und EGFP-R2 (5' – GGGTGCTCAGGTAGTAGTTG-3'). In Experiment (Exp) 1 zeigten 15 von 18 G418-resistenten Transformanten und in Exp 2 17 von 21 Transformanten GFP-Fluoreszenz (Tabelle 1, Abbildung 1B). Für die sieben G418-resistenten Transformanten, die aus beiden Experimenten keine Fluoreszenz zeigten, wurden drei durch PCR als echte Transformanten bestätigt (Abbildung 1C). Insgesamt wurde die Rate der wahren Transformanten auf 90 % geschätzt.

Zusätzlich konnten wir erfolgreich ein P. capsici-Kürbisisolat , PC2024-14sz, mit A. tumefaciens EHA105 transformieren, das pCB301TOR-GFP transportiert, wobei das Protokoll mit einer geringfügigen Änderung bei der Herstellung von Zoosporensuspensionen erfolgt ist (die Inkubationszeit bei 4 °C nach Überflutung einer sieben Tage alten P. capsici-Platte mit vorgekühltem Wasser wurde auf 30 Minuten verlängert). Die Anzahl der G418 (30 μg/mL)-resistenten Transformanten pro 107 aus einem einzelnen Experiment betrug 13. Neun Transformanten wurden unter einem Fluoreszenzmikroskop beobachtet, und alle erzeugten Fluoreszenz (Supplementary File 1), was darauf hindeutet, dass es sich um echte Transformanten handelt.

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Abbildung 1: Transformation von P. palmivora mit A. tumefaciens EHA105, der pCB301TOR-GFP transportiert. (A) Auftreten von G418-resistenten P. palmivora-Transformanten auf Plich-Agar, ergänzt mit 30 μg/mL G418. (B) Nachweis der GFP-Expression unter einem Fluoreszenzmikroskop in einem repräsentativen Transformanten und einem Wildtyp-Stamm von P. palmivora (WT). Die Bilder wurden sowohl unter Hellfeld- (BF) als auch GFP-Fluoreszenzkanälen aufgenommen. (C) PCR-Amplifikation von EGFP von vier Transformanten mit nachweisbarer GFP-Fluoreszenz und sieben ohne GFP-Fluoreszenz. Das universelle Primerpaar ITS4/ITS520 wurde verwendet, um den Bereich des internen transkribierten Spacers (ITS) zu amplifizieren und die DNA-Integrität zu überprüfen. Transformanten ohne GFP-Fluoreszenz sind in fetter, unterstrichener Schrift hervorgehoben. Abkürzungen: M = NEB 100 bp DNA-Leiter; WT = Wildtyp-P . palmivora P1-Isolat; N = Negativkontroll-PCR unter Verwendung von H2O als Vorlage. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

ExperimentOD600 von AgrobacteriumZoosporenkonzentration (/mL)Zoosporenvolumen (mL)Anzahl der G418-resistenten TransformantenAnzahl der Transformanten mit nachweisbarem GFP-Signal (Detektiert / Beobachtet)Anzahl der G418-resistenten Transformanten / 107 Zoosporen
10.41,8 x 1064.34315/1855
20.42,9 x 1064.66717/2150

Tabelle 1: Effizienz der agrobakterienvermittelten Transformation von P. palmivora mit A. tumefaciens EHA105, das pCB301TOR-GFP transportiert.

Ergänzende Datei 1: GFP-Expression unter einem Fluoreszenzmikroskop bei Wildtyp-(WT) P. capsici und einem repräsentativen Transformanten, erzeugt mit A. tumefaciens EHA105, der pCB301TOR-GFP trägt. Die Bilder wurden sowohl unter Hellfeld- (BF) als auch GFP-Fluoreszenzkanälen aufgenommen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll verwendet halbstarke Murashige- und Skoog-Basalmedium (1/2 MS), um Komponenten von Minimalmedium-(MM)-Salzen zu ersetzen, die häufig in Agrobacterium-Induktions - und Kokultivierungsmedien für die Oomyceten- und Pilztransformation verwendet werden. Die Herstellung von MM-Salz-basierten Medien erfordert die Herstellung mehrerer Lagerlösungen aus verschiedenen einzelnen Chemikalien und anschließend das Kombinieren dieser Lösungen19. 1/2 MS enthält außerdem viele chemische Bestandteile; da MS jedoch kommerziell als vorgemischtes Pulver erhältlich ist, vereinfacht sich die Zubereitung des Mediums auf das Auflösen des Pulvers in Wasser. Diese Modifikation verkürzt die Vorbereitungszeit des Mediums erheblich und minimiert das Risiko menschlicher Fehler. Darüber hinaus verbessert das Protokoll die Transformationseffizienz und liefert eine größere Anzahl von Transformanten im Vergleich zur zuvor beschriebenen AMT-Methode16. Sie ist auch wirksam bei der Umwandlung von P. capsici und wahrscheinlich auch auf andere Phytophthora-Arten anwendbar. Zur weiteren Unterstützung seiner breiteren Anwendbarkeit wurde das MS-basierte Medium zuvor zur Kokultivierung von Agrobacterium tumefaciens-Stämmen verwendet, die AtVIP1 (Arabidopsis thaliana VirE2-interagierendes Protein 1) und P. infestans Zoosporen exprimieren, was eine erfolgreiche Transformation von P. infestans21 ermöglicht.

Es ist wichtig zu beachten, dass dieses Protokoll einen geringen Anteil an Fehlalarmen erzeugen kann. Unter 39 G418-resistenten Transformanten, die durch GFP-Fluoreszenzbeobachtung oder PCR getestet wurden, zeigten vier weder Fluoreszenz noch Amplifikation von EGFP (Tabelle 1, Abbildung 1C). Da die teilweise Integration von T-DNA während der Agrobacterium-vermittelten Transformationnicht ungewöhnlich ist, ist es möglich, dass nur der Teil der T-DNA, der das NPTII-Gen aus dem Plasmid pCB301TOR-GFP16 enthält, in das Genom von P. palmivora integriert wurde. Alternativ können die falsch-positiven Ergebnisse durch unzureichenden Kontakt zwischen Membran und selektivem Medium entstehen, was eine Flucht aus der G418-Auswahl ermöglicht. Daher ist es unerlässlich, sicherzustellen, dass die Membran in vollem Kontakt mit dem Medium bleibt (Schritt 6.2).

Dieses Protokoll kann weiter vereinfacht werden. Zum Beispiel können MES in Agrobacterium Induction Media (AIM) und Agrobacterium-Zoospore Co-cultivation Agar (AZCA) potenziell weggelassen werden. MES wird häufig als Puffermittel in biochemischen und molekularbiologischen Experimenten verwendet, um einen stabilen pH-Wert zu erhalten; die Herstellung einer 1 M MES-Lagerlösung bei pH 5,6 erfordert jedoch ausreichend Zeit und erhöht die Kosten. Bei AMT von Pflanzen wie Süßbasilikum24 und Papaya25 wurden ähnliche MS-basierte Agobacterium-Induktions - und Kokultivierungsmedien ohne MES verwendet, was darauf hindeutet, dass MES für die P. palmivora-Transformation möglicherweise nicht wesentlich ist. Weitere Experimente sind erforderlich, um zu bestätigen, dass das Auslassen von MES die Transformationseffizienz nicht beeinträchtigt.

Insgesamt bietet dieses vereinfachte Protokoll eine praktische und zugängliche Plattform für routinemäßige genetische Manipulationen von P. palmivora, P. capsici und möglicherweise anderen Oomyceten. Sie unterstützt ein breites Spektrum grundlegender Studien, von denen einige translationale Potenziale besitzen, darunter fluoreszierende Markierung von Krankheitserregern zur Nachverfolgung der Infektionsdynamik, das Markieren von Proteinen zur Untersuchung der subzellulären Lokalisierung sowie funktionelle Analysen durch gezielte Veränderungen der Genexpression oder der proteinkodierenden Sequenzen. In Kombination mit CRISPR-basierter Genomeditierung wird erwartet, dass das Protokoll die Analyse der Pathogenitätsmechanismen und die Identifizierung wichtiger Virulenzfaktoren in diesen destruktiven Krankheitserregern beschleunigen wird. Die daraus resultierenden Erkenntnisse werden wiederum die Entwicklung neuartiger, mechanismenbasierter Methoden zur Krankheitskontrolle ermöglichen.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Studie wird von der National Science Foundation (NSF Award Nr. 2418799) und dem National Institute of Food and Agriculture (NIFA Award Nr. 2023-67013-42262) unterstützt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1,5 mL MikrozentrifugenröhrenVWR525-1126
4'-Hydroxy-3', 5' DimethoxyacetophenonTCID2666Acetosyringon (AS)
50-mL-RöhreGreiner Bio-one227261
Absolutes EthanolFisher-BioReagenzienBP28184
AgarFisher-BioReagenzienBP1423-500
Alufolie
Hybond-N+-Membran (30 cm & mal; 3 m)CytivaRPN303B
CalciumcarbonatSigma-Aldrich239216-500GCaCO3
Cefotaxim-NatriumsalzThermowissenschaftliche ChemikalienAAJ6269006
D-(+)-GlukoseSigma-AldrichG8270-1KG
DNeasy PowerLyzer Mikrobielle-KitQiagen12255-50
Pinzette
FluoreszenzmikroskopZeissZEISS Axioscope 5 Fluoreszenzmikroskop mit Filtersatz 38 HE
G418-SulfatThermowissenschaftliche ChemikalienAC329400010
GlycerolSigma-Aldrich911046-1L
Hämatocytometer (Bright-Line)Hausser Scientific
Kanamycin-SulfatSanta Cruz BiotechnologieSC-257635
L-Asparagin wasserfreiMP BiomedizinICN10079425
LB Broth, MillerFisher-BioReagenzienBP1426-2
Magnesiumsulfat-HeptahydratSigma-Aldrich63138-250GMgSO4· 7H2O
MES HydrateSigma-AldrichM2933-100G
Murashige und Skoog BasalmediumSigma-AldrichM5519-50L
Petrischale (100 mm x 15 mm)VWR25384-342
KaliumdihydrogenphosphatSigma-Aldrich1370391000KH2PO4
RifampicinSanta Cruz BiotechnologieSC-200910
Taq 2X Master MixNEBM0270L
ThiaminhydrochloridSigma-AldrichT4625-5G
UV-sichtbares SpektrophotometerFisher Scientific14-385-355
V8 Original 100% GemüsesaftCampbell-Suppenfirma
VortexerFisher Scientific14-955-163
WasserMolekularbiologische Qualität, gereinigt mit dem Mill-Q Wasseraufbereitungssystem
HefeextraktACROS611805000Derzeit erhältlich über Thermo Scientific Chemicals
β-SitosterolSigma-Aldrich85451-100G

Referenzen

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