Methodenartikel

Differenzierung und Induktion der Lipidtröpfchenansammlung in humanen Adipozyten als Modell zur Untersuchung von Fettleibigkeit in vitro

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DOI:

10.3791/69759

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20. März 2026

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1Department of Cell Pathology, Faculty of Biotechnology, University of Wroclaw

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Das vorgestellte Protokoll zielt darauf ab, ein zelluläres Modell zu entwickeln, das menschliche Fettleibigkeit nachahmt. Um dies zu erreichen, werden humane fettabgeleitete Stammzellen zu Adipozyten differenziert, die anschließend mit einer Mischung ausgewählter Fettsäuren gemästet werden.

Zusammenfassung

Fettleibigkeitsbedingte Veränderungen im Fettgewebe verändern lokale sekretorische Profile und beeinflussen die Wechselwirkungen mit anderen umliegenden Zellen, einschließlich Krebszellen. Die fortlaufende Nährstoffabgabe verändert den Stoffwechsel der Fettzellen, sodass sie als Lipidreservoir fungieren. Typischerweise stützt sich die Forschung zu Fettleibigkeitsmechanismen auf Tiermodellen, die jedoch keine Analyse von Stoffwechselprozessen auf zellulärer Ebene erlauben. Daher besteht die Notwendigkeit, ein zuverlässiges In-vitro-Modell der menschlichen Fettleibigkeit zu entwickeln, das dazu beitragen kann, Veränderungen in der Funktion fettleibiger Adipozyten im Vergleich zu ihren schlanken Gegenstücken zu untersuchen. Diese Arbeit präsentiert ein Protokoll zur Differenzierung menschlicher Adipozyten von ihren Vorläufern (fettabgeleiteten Stammzellen) unter Verwendung einer Mischung aus Insulin, Isobutyl-1-Methylxanthin, Dexamethason und Indomethacin. Anschließend wurden differenzierte Adipozyten mit einer Reihe von Fettsäuren inkubiert, darunter Linolat, Palmitat und Olat, um die Lipidansammlung zu fördern. Dadurch wurde ein wertvolles Modell entwickelt, das die hypertrophen Zellen unter Fettleibigkeitsbedingungen nachahmt, das für weitere Studien genutzt werden kann.

Einleitung

Fettleibigkeit gilt als Hauptrisikofaktor für eine Vielzahl von Krankheiten, wie muskuloskelettale Erkrankungen, Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Insulinresistenz, metabolisches Syndrom, Diabetes und ausgewählte Krebsarten1. Fettleibigkeit ist eines der am meisten wahrnehmbaren und unterschätzten Probleme der öffentlichen Gesundheit mit multielementaren Ursachen. Kurz gesagt: Fettleibigkeit wird durch ein Ungleichgewicht zwischen konsumierten und verbrauchten Kalorien ausgelöst, was zu einer verbessertenFettspeicherung führt. Der Kalorienüberschuss führt zu pathologischer Ausdehnung und Dysfunktion des Fettgewebes (AT), dem Schlüsselelement zur Kontrolle der Energiehomöostase durch den Körper.

Adipozyten sind die Hauptzellkomponente von AT3. Der Hauptverursacher für das Wachstum von AT unter Fettleibigkeitsbedingungen ist die Zellhypertrophie, also die Zunahme des Volumens von Adipozyten durch eine Erhöhung der Fettmenge im Zytoplasma in Form von Lipidtröpfchen (LDs)4. Selbst wenn Fettleibigkeit eine komplexe pathologische Erkrankung ist, können Studien zur biologischen Funktion von Adipozyten als Modell dienen, um ihre Ursachen zu analysieren und neue Behandlungsstrategien zu erforschen. Dies unterstreicht die Notwendigkeit eines tieferen Verständnisses der molekularen Mechanismen, die Veränderungen in der Adipozytenfunktion antreiben, um neue therapeutische Strategien zur Entwicklung von fettleibigkeitsbedingten Erkrankungen zu entwickeln.

Die Tiermodelle spiegeln physiologische Bedingungen am nächsten wider, was sie weit verbreitet für in vivo-Studien zur Fettleibigkeitverwendet. Allerdings bleibt es in einem solchen mehrschichtigen System äußerst schwierig, Schlussfolgerungen über grundlegende biologische Prozesse auf zellulärer Ebene zu ziehen, was die Verwendung von In-vitro-Adipozytenmodellen begünstigt. Die in-vitro-Forschung basiert meist auf dem Maus-3T3-L1-Zellmodell, das unter geeigneten Bedingungen einen adipozytenähnlichen Phänotyp6 erhält. Dennoch kann dieses Modell aufgrund seines Ursprungs nicht für komplexere Analysen verwendet werden, etwa für Kokulturbedingungen mit menschlichen Zellen, und die Ergebnisse können nicht immer direkt in humane Adipozyten übersetzt werden. Aus all diesen Gründen wird ein Modell gesucht, das die Fettleibigkeit beim Menschen nachahmt, und die Verwendung von Stammzellen (ADSCs) mit ihrer anschließenden Differenzierung scheint rational zu sein. Dieses Modell eignet sich daher am besten für die Untersuchung der humanen Adipozytenhypertrophie in vitro , da es eine geringe Komplexität hat. Sie ermöglicht den Vergleich der Parameter eines einzelnen Zellkulturtyps unter unterschiedlichen Bedingungen, was in vivo aufgrund des Vorhandenseins mehrerer Zelltypen im Fettgewebe nicht erreichbar ist.

Humane Präadipozyten und fettabgeleitete Stammzellen, die aus AT isoliert sind, sind die häufigsten Beispiele zur Untersuchung der Funktionsstörung dieses Gewebes6. Diese Zellen sind nach der Differenzierung ein attraktives Modell zur Modulation der LD-Werte in Adipozyten durch zusätzliche Fettbildung. Dennoch gibt es relativ wenige Studien, die Hypertrophie in menschlichen Zellenuntersuchen 7,8,9, und die meisten verwenden nur eine Art von Fettsäure (FA), um die LD-Akkumulation zu induzieren.

Dieses Protokoll schlägt vor, menschliche Adipozyten mit einer Mischung aus FAs (Palmitat, Olat und Linolat) zu ergänzen, um Adipositasumgebungen nachzuahmen. Dies ermöglicht die Entwicklung eines Werkzeugs, das auf menschlichen Adipozyten basiert, die mit Lipiden überladen sind und direkt mit kontrollierenden (naiven) Fettzellen verglichen werden können. Dieses Modell kann anschließend verwendet werden, um die phänotypischen und funktionellen Veränderungen bei normalen und hypertrophen Adipozyten zu untersuchen oder, falls nötig, Experimente mit Kokulturbedingungen durchzuführen.

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Protokoll

Verwenden Sie sterile Techniken, um alle Schritte des Protokolls in einer laminaren Zellkulturhaube durchzuführen. Siehe Materialtabelle für Details zu allen Reagenzien und Ausrüstungen. Das unten beschriebene Differenzierungsprotokoll ist für menschliche, fettabgeleitete Stammzellen geeignet und kann sich zwischen anderen Zelltypen und deren Ursprung unterscheiden. Die Reagenzien und die verwendeten Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Vorbereitung von ADSCs zur Differenzierung

  1. Bereite ADSCs Wachstumsmedium (ADSCs GM) vor: Supplementiere Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) mit 1 g/L Glukose und 10 % fetalem Rinderserum (FBS), 2 mM Glutamin und Antibiotika – antimykotische Lösung (100 U/mL Penicillin, 100 μg/mL Streptomycin, 0,25 μg/mL Amphotericin B).
  2. Erwärmen Sie die ADSCs GM, phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) und Trypsin/EDTA-Lösung auf 37 °C.
    HINWEIS: ADSCs werden aus kommerziellen Quellen bezogen. Verwenden Sie die Zellen in den frühen Passagen. Mehrere Durchgänge führen zu einer Verringerung des Differenzierungspotenzials von ADSCs10.
  3. Entfernen Sie aseptisch das GM des ADSC aus den ADSCs, die in einer T75-Flasche für Zellkultur wachsen.
  4. Waschen Sie die restlichen ADSCs GM aus, indem Sie die Zellkulturschale mit 5 ml PBS ausspülen.
  5. Entferne das gesamte Volumen PBS aus dem Kolben.
  6. Gib 2 ml Trypsin/EDTA in die Kulturschale und inkubiere sie bei 37 °C, bis die Zellen abgetrennt sind. Überwachen Sie diesen Prozess mit einem umgekehrten Mikroskop.
    HINWEIS: Das Anklopfen der Kulturschüssel beschleunigt die Zellablösung.
  7. Blockieren Sie die Trypsinaktivität durch die Zugabe von 6 ml frischem ADSCs GM.
  8. Umschichten Sie das gesamte Volumen der Zellsuspension von der Kulturschale in ein für die Zentrifugation geeignetes Rohr.
  9. Zentrifugiere die Zellen bei 300 x g für 5 Minuten bei Raumtemperatur (RT).
  10. Entferne das Überwasser.
  11. Suspendiere die Zellen in 2 mL des neu hinzugefügten ADSCs GM.
  12. Berechnen Sie die Zelldichte und Lebensfähigkeit mit einem Hämozytometer oder einem automatischen Zellzähler.
    HINWEIS: Die Lebensfähigkeit der Zellen kann mittels Trypan-Blau-Farbstofffärbung bewertet werden.
  13. Säen Sie die Zellen in die gewünschte Anzahl von Brunnen, 15.000 Zellen pro Brunnen, 96-Bohrloch-Kunststoffplatten in 100 μL ADSC-Wachstumsmedium.
    HINWEIS: Samenzellen sind immer doppelt, um Adipozyten zu erhalten, die für Kontrolle und Inkubation mit FA-Bedingungen bestimmt sind. Je nach Art des Experiments können ADSCs auf verschiedenen Arten von Plastikteller oder Tellern gesät werden. Die empfohlene Samendichte liegt bei 30.000–60.000 Zellen pro cm². Je nach benötigter Zellanzahl für die nachfolgenden Analysen oder nachgelagerten Experimente wird das Format der Zellkulturschüssel für 6- oder 12-Well-Platten angepasst.
  14. Kultivieren Sie die Zellen bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 %CO2.
  15. Wenn die Zellen 100 % Konfluenz erreicht haben (typischerweise 24–48 Stunden nach der Plattierung), induzieren Sie ihre Differenzierung zu Adipozyten gemäß den untenstehenden Anweisungen.
    HINWEIS: Es ist wichtig, vor der Induktion der Differenzierung ein hohes Maß an Zellkonfluenz zu erreichen. In anderen Fällen kann dies die Effizienz der Differenzierung beeinflussen. Wenn es bei plattierten Zellen länger als 48 Stunden dauert, um eine hohe Konfluenz zu erreichen, wechseln Sie das Medium alle 3-4 Tage für das frische ADSC-Wachstumsmedium.

2. Induktion der adipogenen Differenzierung

  1. Vorbereitungsmedium (DM): Ergänzen Sie das DMEM/F12-Medium mit 10 % FBS, 2 mM Glutamin, Antibiotika – antimykotische Lösung (100 U/mL Penicillin, 100 μg/mL Streptomycin, 0,25 μg/mL Amphotericin B), 5 μg/mL Insulin, 0,5 mM 3-Isobutyl-1-Methylxanthin (IBMX), 5 μM Dexamethason und 200 μM Indomethacin.
    HINWEIS: Bereite DM nur in dem Band vor, das für den direkten Gebrauch notwendig ist. Lagere es nicht über einen langen Zeitraum und benutze immer frisch vorbereitete DM. Vor der Anwendung wird das DM in einem Wasserbad auf 37 °C erhitzt. IBMX und Indomethacin können ausfällen, wenn sie bei einer niedrigeren Temperatur als 37 °C ins Medium gegeben werden. Um sie zu lösen, erwärmen Sie die Flüssigkeit in einem Wasserbad auf 37 °C.
  2. Entfernen und entsorgen Sie aseptisch das gesamte Volumen des Mediums aus den konfluenten ADSCs.
    HINWEIS: Das Wachstumsmedium des ADSC sollte vollständig entfernt werden, bevor der DM hinzugefügt wird.
  3. Fügen Sie vorsichtig 100 μL/Well DM zu Zellen hinzu, die in einer 96-Well-Platte wachsen.
    HINWEIS: Lassen Sie die Zellen beim Wechsel des Mediums nicht austrocknen.
  4. Inkubieren Sie die Zellen in einem Inkubator bei einer Temperatur von 37 °C und 5 % CO2für 7 Tage.
  5. Entferne und entsorge das gesamte DM-Volumen aus den ADSCs.
  6. Füge vorsichtig 100 μL/Brunnen frischen DM zu Zellen hinzu, die in einer 96-Well-Platte wachsen.
  7. Inkubieren Sie die Zellen im Inkubator bei einer Temperatur von 37 °C, 5 % CO2, für die nächsten 7 Tage.
    HINWEIS: Der Fortschreiten der adipogenen Differenzierung kann durch Hellfeldbeobachtung von Lipidvakuolen in den induzierten Zellen nachgewiesen werden.

3. Die Fettbildung der Adipozyten

  1. Bereiten Sie Adipozytenkulturmedium mit FAs vor: Ergänzen Sie das DMEM/F12-Medium mit 10 % FBS, 2 mM Glutamin, Antibiotika – antimykotische Lösung (100 U/mL Penicillin, 100 μg/mL Streptomycin, 0,25 μg/mL Amphotericin B), 0,33 mM Linolat, 0,17 mM Palmitat und 0,17 mM Olat.
  2. Kontroll-Adipozytenkulturmedium vorbereiten: Ergänzung des DMEM/F12-Mediums mit 10 % FBS, 2 mM Glutamin, Antibiotika – antimykotischer Lösung (100 U/mL Penicillin, 100 μg/mL Streptomycin, 0,25 μg/mL Amphotericin B), 0,44 % Rinderserumalbumin (BSA) und 0,26 % Ethanol (die beiden letztgenannten Verbindungen wurden ebenfalls als FA-Lösungsmittel verwendet).
    HINWEIS: Bereiten Sie die Kontrolle vor und ergänzen Sie mit Adipozyten-Kultivmedien von FAs nur in dem für den direkten Gebrauch erforderlichen Mengen. Lagern Sie es nicht zu lange und verwenden Sie immer frisch vorbereitetes Medium. Vor der Anwendung wird das Medium in einem Wasserbad auf 37 °C erhitzt.
  3. Nach insgesamt 14 Tagen Differenzierung wird das gesamte Volumen des DM-Mediums aus den auf einer 96-Well-Platte differenzierten Adipozyten sorgfältig entfernt und entsorgt.
  4. Fügen Sie vorsichtig 100 μL/Brunnen eines mit Adipozytenkulturmedium ergänzten Adipozytenkulturmediums zu der Hälfte der Brunnen hinzu, in denen Zellen in einer 96-Bohrloch-Platte wachsen.
  5. Füge vorsichtig 100 μL/Bohrloch des kontrollierten Adipozytenkulturmediums in die zweite Hälfte der Brunnen, wobei die Zellen in einer 96-Bohrloch-Platte wachsen.
    HINWEIS: Lassen Sie die Zellen beim Wechsel des Mediums nicht austrocknen.
  6. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 %CO2 für die nächsten 48 Stunden.
  7. Nach 48 Stunden werden die Kontrollzellen und mit FAs inkubierten Zellen für weitere Experimente verwendet.
    HINWEIS: In diesem Stadium können erreichte gefettete Adipozyten für verschiedene experimentelle Zwecke verwendet werden, wie z. B. Zellfärbung, Analyse des zellulären Stoffwechsels oder Kokultur mit anderen Zelltypen.

4. Lipidtröpfchenfärbungen

  1. Bereite Adipozytenkulturmedium vor: Ergänzung des DMEM/F12-Mediums mit 10 % FBS, 2 mM Glutamin und Antibiotika – antimykotischer Lösung (100 U/mL Penicillin, 100 μg/mL Streptomycin, 0,25 μg/mL Amphotericin B).
  2. Fluoreszierende Farbstoffe verdünnen, um LDs im Adipozytenkulturmedium in einer Verdünnung von 1:1000 zu färben.
  3. Entfernen und entsorgen Sie das gesamte Volumen des Kontroll-Adipozytenkulturmediums und des Adipozytenkulturmediums, ergänzt mit FAs aus Zellen, die in einer 96-Well-Platte wachsen.
  4. Fügen Sie vorsichtig 50 μL/Welle des Adipozytenkulturmediums mit fluoreszierendem Farbstoff hinzu.
    HINWEIS: Lassen Sie die Zellen beim Wechsel des Mediums nicht austrocknen.
  5. Zellen bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 %CO2 für 15 Minuten inkubieren.
  6. Waschen Sie den Fluoreszenzfarbstoff aus, indem Sie ihn durch das 100 μL/Well-Adipozytenkulturmedium ersetzen.
  7. Bildaufnahme im grünen Fluoreszenzdetektionskanal (Ex 427 nm/Em 585 nm) mit dem Fluoreszenzmikroskop.
    HINWEIS: Dies ist das Protokoll für die Färbung lebender Zellen. Eine Färbung kann auch nach der Formaldehydfixierung der Zellen durchgeführt werden.

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Ergebnisse

Die hier beschriebene Methode ermöglicht die Differenzierung menschlicher ADSCs in reife Adipozyten, gefolgt von verstärkter Lipidakkumulation, die die hypertrophen Zellen unter Fettleibigkeitsbedingungen nachahmt. Der Zeitverlauf der Differenzierung menschlicher ADSCs ist in Abbildung 1 dargestellt. Am Tag 0, wenn die Zellen 100 % Konfluenz erreichen (Abbildung 1A), zeigen ADSCs eine verlängerte, spindelartige Morphologie. Zu d...

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Diskussion

Das vorliegende Protokoll ist ein replizierbares zweistufiges Verfahren zur Differenzierung von ADSCs, gefolgt von einer Inkubation mit FAs, um ein zelluläres Modell zu erreichen, das Fettleibigkeit nachahmt. Der entscheidende Schritt zur Bestimmung seiner Wirksamkeit ist die Anzahl der ADSC-Durchgänge nach der Isolierung. Mehrere Durchgänge führen zu einer Verringerung des Differenzierungspotenzials dieser Zellen10.

Während der Adipozy...

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Offenlegungen

Die Autoren geben an, dass sie keine bekannten konkurrierenden finanziellen Interessen oder persönlichen Beziehungen haben, die die in diesem Artikel berichtete Arbeit beeinflusst haben könnten.

Danksagungen

Der Artikel wurde vom Nationalen Wissenschaftszentrum Polens finanziert, mit Fördermitteln von Dorota Nowak (OPUS 22, Nr. 2021/43/B/NZ3/01458) und Aleksandra Simiczyjew (SONATA, 2020/39/D/NZ5/02330).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
3-Isobutyl-1-Methylxanthin (IBMX)MerckI5879
0,25 % Trypsin/0,05 % EDTA pH 7,2IITD PAN, Wrocfigure-materials-1aw, Polen20-500
96-Well-PlatteThermo130188
Antibiotika-antimykotische LösungSigma-AldrichA5955
Rinderserum-Albumin (BSA)Sigma-AldrichA3294
ZellzählerN/AN/A
ZentrifugeN/AN/A
DexamethasonSigma-AldrichD4902
Dulbeccos modifizierter Eagle Medium (DMEM)IITD PAN, Wrocfigure-materials-2aw, Polen10-500mit 1 g/L Glukose
Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium: Nährstoffmischung F12Gibco11320-033
EthanolChempur113964200#1L
Fetales Rinderserum (FBS)GibcoA5256701
hADSC Humane, fett-abgeleitete StammzellenLonzaPT-5006
InkubatorN/AN/A
IndomethacinSigma-AldrichI8280-5G
InsulinSigma-AldrichI9278
Invertiertes MikroskopN/AN/A
L-GlutaminSigma-Aldrich25030-024
Linolsäure-NatriumsalzSigma-AldrichL8134
LipidSpot-FluoreszenzBiotium70065
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)Thermo10010023
Soduim oleateSigma-AldrichO7501
Soduim palmitateSigma-AldrichP9767
T75-ZellkulturkolbenThermo130190
Trypan blauSigma-Aldrich95896HJ

Referenzen

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