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Forschungsartikel

Die zirkuläre RNA ZBTB46 dämpft Apoptose und oxidativen Stress in durch Lipopolysaccharid beschädigten menschlichen Endothelzellen durch Modulation der ERBB2-AKT-Signalübertragung

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DOI:

10.3791/69765

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13. Februar 2026

1Department of Emergency, Fuzhou University Affiliated Provincial Hospital, Fujian Provincial Hospital, 2Fujian Provincial Key Laboratory of Emergency Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Sepsisassoziierte akute Nierenschädigung (SA-AKI) ist mit erheblichen Sterblichkeitsraten verbunden. Diese Studie zeigt, dass circZBTB46 in LPS-induzierten HUVECs (SA-AKI in vitro) herunterreguliert ist. Seine Überexpression erhöht die Lebensfähigkeit von HUVEC, reduziert Apoptose, Entzündung und oxidativen Stress in Verbindung mit der ERBB2/AKT-Signalübertragung, was auf ein mögliches therapeutisches Ziel hindeutet, das für SA-AKI relevant ist.

Zusammenfassung

Zirkuläre RNAs sind aufkommende Regulatoren von Stressreaktionen, doch ihre Rolle bei Endothelverletzungen, die zu sepsisbedingten akuten Nierenschäden führen, sind weiterhin unvollständig definiert. Wir haben die Hypothese aufgestellt, dass die zirkuläre RNA ZBTB46 (circZBTB46) durch die Aktivierung der ERBB2-AKT-Signalübertragung den Endothelschutz gewährt. Mit einem zellbasierten Modell, in dem menschliche Nabelvenendothelzellen mit Lipopolysaccharid herausgefordert wurden, quantifizierten wir die circZBTB46-Expression und testeten die Auswirkungen ihrer erzwungenen Expression auf Überleben, Apoptose, entzündliche Mediatoren und Redoxhomöostase. Zellviabilitätstests und Durchflusszytometrie bewerteten Überleben und Apoptose. Enzymgekoppelte immunsorbent-Assays maßen Interleukin-6, Tumornekrosefaktor-α und Interleukin-1β, während reaktive Sauerstoffspezies, Malondialdehyd, Superoxiddismutase und Katalase als Indizes für oxidative Schäden und antioxidative Kapazitäten bewertet wurden. Um den Mechanismus zu definieren, führten wir ein Transkriptom-Profiling mit Gen-Set-Anreicherungsanalyse durch, bestätigten Wegproteine mittels Western Blotting und bewerteten die Notwendigkeit mit dem ERBB2-Inhibitor AG-825. Lipopolysaccharid unterdrückt circZBTB46. Die Überexpression von circZBTB46 erhöhte die Lebensfähigkeit, senkte Apoptose, reduzierte pro-inflammatorische Zytokine und reaktive Sauerstoffspezies, verringerte Malondialdehyd und erhöhte die Aktivitäten der Superoxiddismutase und Katalase. Transkriptomische und Proteinanalysen unterstützten die Aktivierung der ERBB2-AKT-Achse, und die pharmakologische ERBB2-Blockade schwächte die Zytoprotektion und kehrte die Redoxbilanzgewinne um. Diese Ergebnisse identifizieren circZBTB46 als endogene Bremse der durch Lipopolysaccharid induzierten endothelialen Schäden durch ERBB2-AKT-Signalübertragung und nominieren circZBTB46 als mechanistischen Knoten und potenziellen therapeutischen Ziel für sepsisbedingte akute Nierenschädigungen.

Einleitung

Sepsis, eine lebensbedrohliche systemische Entzündungskaskade, die durch pathogene Invasion ausgelöst wird, gipfelt häufig in einem Multiorganversagen1. In diesem kritischen Kontext tritt SA-AKI als vorherrschende und klinisch bedeutsame Komplikation auf Intensivstationen2 hervor. Gekennzeichnet durch eine abrupte Verschlechterung der Nierenfiltrationskapazität gleichzeitig mit einer systemischen Infektion, zeigt dieser Zustand eine Sterblichkeitsrate, die die der nicht-septischen AKI um 38 % bis 42 % in klinischen Kohorten2 übersteigt. Etwa 60 % der mit Sepsis oder septischem Schock diagnostizierten Personen werden voraussichtlich an SA-AKI3 entwickelt. Daher ist SA-AKI zu einer großen Herausforderung auf der Intensivstation geworden und trägt wesentlich zu Morbidität und Sterblichkeitbei. Derzeit ist der Mechanismus von SA-AKI noch unvollständig verstanden. Obwohl präklinische Studien Mikrozirkulationsstörungen, Veränderungen im zellulären Stoffwechsel und Ungleichgewichte im Renin-Angiotensin-Aldosteron-System (RAAS), mitochondriale Dysfunktion und entzündliche Dysregulation umfassen, bleibt der pathophysiologische Mechanismus von SA-AKI unfassbar, und es fehlen derzeit optimale Maßnahmen zur Unterstützung einer frühen Diagnose und fortlaufender Behandlung 5,6,7,8 . SA-AKI weist eine erhöhte Apoptose, übermäßigen oxidativen Stress und Entzündung9 auf. Innerhalb dieses Forschungsrahmens wurde Lipopolysaccharid (LPS) in einem in-vitro-System eingesetzt, um die Manifestationen einer sepsisassoziierten AKI in humanen Nabelvenendothelzellen (HUVECs) für eine vorläufige Zieluntersuchung5 nachzuahmen.

In den letzten Jahren haben zirkuläre RNAs (circRNAs), eine kürzlich identifizierte Kategorie nicht-kodierender RNA-Moleküle, zunehmend Aufmerksamkeit für ihre Rolle bei verschiedenen Krankheiten erlangt10. CircRNAs besitzen eine stabile Zirkulationsstruktur und nehmen an zellulären physiologischen und pathologischen Prozessen teil, indem sie als molekulare Schwämme für MikroRNAs (miRNAs) dienen, die Gentranskription regulieren oder an Proteininteraktionen teilnehmen11. Untersuchungen haben gezeigt, dass circRNAs maßgeblich an der Modulation von Entzündungen, oxidativem Stress und apoptotischen Signalwegen beteiligt sind, was zu einem verstärkten Forschungsfokus auf ihre möglichen Auswirkungen auf Sepsis und verwandte Erkrankungen, einschließlich akuter Nierenschädigung12, führt. So wurde hsa_circ_0072463 beispielsweise als vielversprechender diagnostischer Marker und therapeutisches Ziel für SA-AKI13 identifiziert. Circ_001653 wurde berichtet, dass SA-AKI durch die Rekrutierung von BUD1314 entlastet wurde. Die funktionelle Bedeutung von circRNAs in SA-AKI ist jedoch weitgehend unerforscht.

Diese Studie wurde entwickelt, um den Einfluss von circZBTB46 auf die Funktion der Endothelzellen, oxidativen Stress und entzündliche Reaktionen mit einem in vitro SA-AKI-System zu untersuchen. Durch den Aufbau eines LPS-induzierten HUVEC-Modells untersuchten wir Endothelschäden unter Endotoxinstimulation. Es sollte beachtet werden, dass LPS-angefochtene HUVECs ein reduktionistisches Endotoxin-/TLR4-getriebenes endotheliales Stressmodell darstellen, das relevant für, aber nicht gleichwertig mit der multifaktoriellen Pathophysiologie der sepsisassoziierten akuten Nierenschädigung ist. Dieses Modell erfasst in erster Linie TLR4-vermittelte entzündliche Aktivierung, oxidativen Stress und apoptosebedingte endotheliale Reaktionen, während wichtige in vivo Komponenten wie hämodynamische Veränderungen, Komplement- und Gerinnungskaskaden, schadensassoziierte molekulare Muster sowie heterogene mikrobielle Reize ausgelassen werden. In diesem experimentellen Rahmen untersuchten wir, ob circZBTB46 durch LPS-induzierten oxidativen Stress und Apoptose durch Modulation des ERBB2-Signalwegs lindert und so die Funktion der Endothelzellen schützt. Soweit wir wissen, liefert diese Studie den ersten Nachweis, der circZBTB46 mit endothelialen Stressreaktionen im Zusammenhang mit einer sepsisassoziierten akuten Nierenschädigung verbindet. Durch die Aufklärung der molekularen Mechanismen, die dem circZBTB46-vermittelten Endothelschutz zugrunde liegen, könnte diese Forschung das Verständnis der pathogenen Mechanismen von SA-AKI vertiefen und den Weg für innovative therapeutische Ansätze mit Schwerpunkt circRNA ebnen.

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Protokoll

Dieses Protokoll beschreibt die experimentellen Verfahren zur Untersuchung der Auswirkungen der circZBTB46-Modulation auf die entzündliche Signalübertragung, oxidativen Stress und die Aktivierung des ERBB2-AKT-Weges in HUVECs.

Zellkultur
Die in dieser Studie verwendeten HUVECs-Zellen stammen aus einer kommerziellen Quelle. HUVECs wurden als repräsentatives Modell der Endothelzellen verwendet, da sie breit verfügbar, reproduzierbare Kulturbedingungen und hohe Transfektionseffizienz haben, was genetische Manipulation und mechanistische Untersuchung der endothelialen Signalwege unter entzündlichem Stressermöglicht 15,16. HUVECs wurden in DMEM kultiviert, ergänzt mit 10 % (v/v) fetalem Rinderserum und einem antibiotikum-antimykotischen Cocktail bei 1 % Konzentration. Alle Zellkulturen wurden unter standardisierten physiologischen Bedingungen in einer befeuchteten Kammer (37 °C, 5 %CO2) aufrechterhalten, was eine anhaltende zelluläre Proliferation förderte und gleichzeitig >95 % Lebensfähigkeit bewahrte, wie durch den Trypan-Blue-Ausschlusstest bestätigt. Obwohl endothelspezifische Medien (z. B. EGM-2 oder M199 mit Endothelwachstumsergänzungen) häufig für die langfristige HUVEC-Erhaltung empfohlen werden, wurde DMEM in dieser Studie verwendet, um Konsistenz zwischen experimentellen Behandlungen und Kompatibilität mit LPS-Stimulation und pharmakologischen Inhibitor-Tests sicherzustellen. Für die AG-825-Inhibitor-Tests werden HUVECs mit frischem DMEM mit 10 μM AG-825 für 1 Stunde inkubiert. Anschließend wird die LPS-Lösung in die Brunnen gegeben, um eine Endkonzentration von 10 μg/mL zu erreichen, und die Kultur 24 Stunden fortgesetzt. Um potenzielle phänotypische Drift zu minimieren, wurden HUVECs bei niedrigen Durchgangszahlen eingesetzt und DMEM-basierten experimentellen Bedingungen nur für kurzfristige Tests ausgesetzt. Alle funktionellen Experimente wurden innerhalb definierter Behandlungsfenster durchgeführt und nicht während längerer Kultur.

Zelltransfektion
Um die biologische Rolle von circZBTB46 zu klären, wurden Überexpressionsplasmide (oe-circZBTB46) und passende negative Kontrollkonstrukte (oe-NC) von GenScript synthetisiert und validiert. HUVECs wurden in 6-Well-Platten mit einer Dichte von 1 x 10⁵ Zellen/Brunnen ausgesät und über Nacht kultiviert, um zum Zeitpunkt der Transfektion eine Konfluenz von ~70%–80% zu erreichen. Für jedes Bohrloch wurden 2,5 μg Plasmid-DNA (oe-circZBTB46 oder oe-NC) in 125 μL reduziertem Serummedium verdünnt und mit 2,5 μL P3000-Reagenz (Tube A) vermischt. Parallel dazu wurden 3,75 μL Lipofectamin 3000 in 125 μL reduziertem Serummedium (Tube B) verdünnt. Röhre A und Röhre B wurden dann kombiniert, sanft gemischt und 15–20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, um eine Komplexbildung zu ermöglichen (Endvolumen des Komplexes: 250 μL/Bohrloch). Die Komplexe wurden tropfenweise in einem antibiotikafreien vollständigen Medium zu den Zellen hinzugefügt. Nach 6 Stunden Inkubation bei 37 °C und 5 %CO2 wurde das Transfektionsmedium durch frisches, vollständiges Wachstumsmedium ersetzt. Die Zellen wurden 48 Stunden lang kultiviert, bevor weitere Tests durchgeführt wurden. Alle Verfahren folgten den Anweisungen des Herstellers.

LPS-induziertes Modell
Um ein in-vitro-SA-AKI-Modell zu erzeugen, wurden HUVECs (5 x 105 Zellen/Well), transfektiert mit oe-circZBTB46 oder NC, in 96-Well-Platten ausgesät und 24 Stunden erhalten, bis eine 80%ige Konfluenz erreicht war. Anschließend wurden diese Zellen mit LPS bei 10 μg/mL für 24 Stunden behandelt. HUVECs ohne LPS-Behandlung dienten als Kontrollgruppe.

qRT-PCR
Die vollständige RNA-Extraktion aus HUVECs verwendete ein kommerzielles Reagenz. Die Reverse-Transkription für die cDNA-Synthese wurde mit dem kommerziellen Reagenz-Kit durchgeführt. Quantitative PCR (qPCR) wurde dreifach mit einem Echtzeit-PCR-System zusammen mit einem Master-Mix durchgeführt. Die Expressionsmengen der Zielgene wurden gegen U6 kalibriert, wobei die Analyse mit der 2−ΔΔCT-Methode 17,18 durchgeführt wurde. Für die circRNA-Expressionsanalyse wurde U6-Kleinkern-RNA als interne Referenz für die Normalisierung verwendet, da sie häufig zur Quantifizierung kleiner nicht-kodierender RNAs verwendet wird und berichtet wurde, dass sie unter kurzfristigen in-vitro-experimentellen Bedingungen relativ stabile Expression zeigt. Die in dieser Studie angewandten Primer-Sequenzen sind wie folgt aufgeführt:

circZBTB46-Vorwärts: 5'-CGGCGCTCATGAGTAAGAAC-3'

circZBTB46 – Rückwärts: 5' – CGCCTCTTCTACAGACTGGG-3'

U6-Forward: 5'-TGCTATCACTTCAGCAGCA-3'

U6-Rückwärts: 5'-GAGGTCATGCTCTCTCTCTCTG-3'.

CCK-8-Assay
Die Tragfähigkeit von HUVECs wurde mit CCK-8 bewertet, das kommerziell gekauft wurde. Kurz gesagt, die Zellen wurden in eine 96-Well-Platte eingesät, und die Zellen wurden 24 Stunden lang einer Adhäsionskultur unterzogen. Danach wurden jedem Bohrloch 10 μL CCK-8-Lösung zugesetzt, und die Zellen wurden für 2 Stunden bei 37 °C weiter inkubiert. Ein Mikroplattenleser wurde eingesetzt, um die optische Dichte (OD) bei einer Wellenlänge von 450 nm zu messen. Vorläufige Beobachtungen zeigten, dass 10 μg/mL LPS die Lebensfähigkeit von HUVECs signifikant verringerten, was zur Auswahl dieser Konzentration für nachfolgende experimentelle Prozesse führte.

Durchflusszytometrie
Anfangs wurden HUVECs gemäß den Standardverfahren mit EDTA-freiem Trypsin abgetrennt. Gemäß den Herstellerrichtlinien für das Annexin V-APC/PI Apoptosis Assay Kit wurden die Zellsuspensionen bei 1.000 x g für 5 Minuten bei 4 °C nach enzymatischer Dissoziation zentrifugiert. Die pelletierten Zellen wurden dann zweimal mit eiskalten PBS unter identischen Bedingungen gewaschen und in 100 μL 1x Bindungspuffer wieder suspendiert. Jede Probe wurde mit 5 μL Annexin V-FITC-Konjugat und 5 μL Propidiodid-(PI)-Färbelösung behandelt, gefolgt von einer 10-minütigen Inkubation in Dunkelheit bei Raumtemperatur (20–25 °C). Schließlich wurden allen Proben 400 μL 1x-Bindungspuffer hinzugefügt, und die Apoptose wurde innerhalb von 1 Stunde mit einem Durchflusszytometer analysiert. Veranstaltungen wurden zunächst von FSC/SSC gesperrt, um Trümmer auszuschließen. Für die Apoptoseanalyse wurden anschließend Quadrantengatter auf dem Annexin V-FITC vs. PI-Plot angewendet, wobei geeignete Kontrollen (ungefärbte und einzelfarbene/Kompensationskontrollen) verwendet wurden, um lebende (Annexin V-/PI-), frühe apoptotische (Annexin V+/PI-), spätapoptotische (Annexin V+/PI+) und nekrotische (Annexin V-/PI+) Populationen zu definieren. Die gleiche Gating-Vorlage und Schwellenwerte wurden auf alle Stichproben angewendet.

ELISA-Assay
Die Konzentrationen von Entzündungsfaktoren – Tumornekrosefaktor-α (TNF-α), Interleukin-6 (IL-6) und Interleukin-1β (IL-1β) – im Supernatant kultivierter HUVECs wurden mit kommerziell erhältlichen ELISA-Kits gemessen. Konkret wurden das Human TNF-α ELISA Kit, Human IL-6 ELISA Kit und Human IL-1β ELISA Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet. Für jeden Test wurden pro Bohrloch 50 μL unverdünntes Zellkultur-Supernatant geladen. Standardkurven wurden mit den bereitgestellten seriellen Verdünnungen (TNF-α: 0–1000 pg/mL; erzeugt; IL-6: 0-500 pg/mL; IL-1β: 0-200 pg/mL). Nach Probe und Standardaddition wurden die Platten bei 37 °C für 90 Minuten inkubiert, gefolgt von fünf Waschphasen mit Waschpuffer. Anschließend wurde ein biotinkonjugierter Detektionsantikörper hinzugefügt und bei 37 °C für 60 Minuten inkubiert. Nach einem weiteren Waschschritt wurde Streptavidin-HRP hinzugefügt und 30 Minuten bei 37 °C inkubiert. Nach einer Endwäsche wurde 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin (TMB)-Substrat hinzugefügt und bei 37 °C im Dunkeln 15 Minuten lang inkubiert. Die Reaktion wurde mit einer Stopplösung beendet, und die Absorption wurde sofort bei 450 nm mit einer Referenzwellenlänge von 630 nm gemessen. Jede Probe und jeder Standard wurde doppelt getestet, und alle Experimente enthielten drei unabhängige biologische Replikate. Die Konzentrationen der oxidativen Stressmarker – Malondialdehyd (MDA), Superoxiddismutase (SOD) und Katalase (CAT) – im Supernatant wurden mit dem MDA ELISA Kit, SOD ELISA Kit und CAT ELISA Kit gemäß den bereitgestellten Protokollen 19,20,21 bewertet. Für MDA- und SOD-Assays wurden pro Bohrloch 40 μL Supernatant ohne Verdünnung verwendet; für CAT wurden die Proben vor dem Laden im Verhältnis 1:10 mit einem Prüfpuffer verdünnt. Standardkurven wurden gemäß den Bausatzspezifikationen vorbereitet (MDA: 0–60 nmol/mL; SOD: 0-100 U/mL; KAT: 0-100 U/mL). Die Inkubationsschritte wurden wie folgt durchgeführt: MDA – 60 Minuten bei 37 °C; SOD – 60 Minuten bei 37 °C; CAT – 30 Minuten bei 37 °C. Die Platten wurden viermal zwischen wichtigen Inkubationsschritten gewaschen. Die Farbentwicklung wurde durch das Hinzufügen der jeweiligen Substrate und das Inkubieren bei 37 °C (MDA: 15 Min; SOD: 20 Min; KAT: 15 Min.). Die Absorption wurde bei 450 nm für SOD und CAT und bei 532 nm für MDA gemessen. Alle Messungen wurden in doppelten Brunnen durchgeführt und in drei unabhängigen biologischen Replikaten wiederholt.

RNA-Sequenzierung
Die Gesamt-RNA wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers aus HUVECs mit kommerziellen Reagenzien extrahiert. Die Reinheit und Konzentration der RNA wurden mit einem Spektrophotometer bewertet, indem die Absorption bei 260 nm und 280 nm (A260/A280) gemessen wurde, und die RNA-Integrität wurde mit einem Bioanalysator bewertet. Für die anschließende Bibliotheksvorbereitung wurden nur RNA-Proben mit einer RNA-Integritätsnummer (RIN) ≥ 7 verwendet. Ribosomale RNA wurde während der Bibliotheksvorbereitung mit einem standardmäßigen rRNA-Depletionsverfahren eines kommerziellen Unternehmens entfernt. Wo angezeigt, wurde die RNase-R-Behandlung vor der Bibliothekskonstruktion angewendet, um lineare RNAs selektiv zu verdauen und zirkuläre RNA-Spezies anzureichern. Die RNA-Fragmentierung wurde dann unter erhöhten Temperaturbedingungen nach dem Standardprotokoll des RNA Library Preparation Kit Handbuchs durchgeführt, um passend große RNA-Fragmente zu erzeugen. Die Sequenzierungsbibliotheken wurden mit dem RNA Library Preparation Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers vorbereitet und auf einer Illumina-Plattform mit einer Paired-End-Sequenzierungsstrategie und einer Leselänge von 150 bp (PE150) sequenziert. Die Sequenzierungstiefe reichte aus, um eine transkriptomweite Analyse zu unterstützen. Roh-Sequenzierungslesungen wurden mit standardisierten Qualitätskontrollverfahren verarbeitet, um Adaptersequenzen und Lesearten niedriger Qualität zu entfernen. Saubere Reads wurden mit dem menschlichen Referenzgenom ausgeglichen, und die Genexpressionswerte wurden entsprechend quantifiziert:22,23. Differenziell exprimierte Gene (DEGs) zwischen circZBTB46-überexprimierenden HUVECs und NC-behandelten HUVECs unter LPS-Stimulation wurden mit etablierten statistischen Methoden identifiziert. Die Gen-Set-Anreicherungsanalyse (GSEA) wurde durchgeführt, um Signalwege zu identifizieren, die mit circZBTB46-Überexpression assoziiert sind. Die Gene wurden anhand der unterschiedlichen Expression zwischen experimentellen Gruppen bewertet. Kuratierte Gensets aus der Molecular Signatures Database (MSigDB) wurden für die Anreicherungsanalyse verwendet. Die Anreicherungssignifikans wurde anhand des normalisierten Anreicherungsscores (NES) und der False Discovery Rate (FDR) bewertet, wobei FDR < 0,25 als statistisch signifikant angesehen wurde. Die CircRNA-Sequenzierung und alle zugehörigen bioinformatischen Analysen wurden ausgelagert.

Identifikation von DEGs
Um DEGs zu screenen, wurden die Ausdrucksniveaus zwischen zwei unterschiedlichen Gruppen mittels des DESeq (2012) R-Softwarepakets gegenübergestellt. Die Schwellenwerte für die statistische Signifikanz wurden definiert als p < 0,05 mit einem |log2FC| Wert über 0,58. Die Heatmap wurde vom Pheatmap R-Paket generiert, und der Vulkan-Plot verwendete das Goplot2 R-Paket zum Zeichnen.

Funktionale Anreicherungsanalyse
GO- und KEGG-Anreicherungsanalysen, die aus linearen Transkripten abgeleitet wurden, wurden mit der Online-Plattform EnrichR durchgeführt, und das Bubble Chart wurde basierend auf dem GOplot R-Paket erstellt. Die GSEA-Software wurde auf Basis der Expressionsmatrix und der Genset-Dateien der MSigDB-Datenbank genutzt, mit Analyseparametern (z. B. Anzahl der Permutationen und statistische Methoden). Die Anreicherung der Gensätze wurde anhand des normalisierten Anreicherungswerts (NES), des P-Werts und des FDR-Werts bewertet, was eine tiefgehende Untersuchung der Funktionen und potenziellen biologischen Mechanismen der differenziell exprimierten Gene ermöglichte.

Westlicher Blot
Das Gesamtprotein wurde aus HUVECs (etwa 1 x 10⁶ Zellen) mit einem RIPA-Lysepuffer extrahiert, der mit Protease- und Phosphataseinhibitoren ergänzt wurde. Die Proteinkonzentration wurde mit einem BCA-Proteinquantifizierungskit bestimmt. Gleiche Mengen Protein (20 μg pro Lane) wurden durch Elektrophorese auf 10%igen Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelen (SDS-PAGE) bei 80 V für 30 Minuten aufgelöst, gefolgt von 120 V für 60 Minuten. Anschließend wurden Proteine mit einem Nasstransfersystem bei 100 V 90 Minuten bei 4 °C auf Polyvinylidenfluorid-(PVDF)-Membranen übertragen. Die Membranen wurden mit 5 % fettfreier Milch in Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit 0,1 % Tween-20 (TBST) für 1 Stunde bei Raumtemperatur blockiert, gefolgt von einer Inkubation mit primären Antikörpern, die im selben Blockpuffer verdünnt wurden (typischerweise 1:1000 für Zielproteine und 1:5000 für GAPDH) bei 4 °C über Nacht. Die verwendeten Hauptantikörper waren wie folgt: ERBB2, p-AKT, AKT und GAPDH. Nach der Inkubation wurden die Membranen dreimal (10 Minuten pro Wasch) mit TBST gewaschen und anschließend mit einem Meerrettichperoxidase (HRP)-konjugierten Ziegenanti-Kaninchen-IgG-Sekundärantikörper (1:5000 im Blockpuffer) für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Nach drei weiteren TBST-Waschungen (jeweils 10 min) wurden die Proteinbänder mit einem Enhanced Chemiluminescence (ECL) Western Blotting Substrate Kit visualisiert und mit einem Bildgebungssystem abgebildet. Die Bandintensitäten wurden mithilfe von Software quantifiziert.

Statistische Analyse
Statistische Bewertungen wurden mit GraphPad Prism 10 durchgeführt. Daten werden als Mittel ± Standardfehler der Mittel (SEMs) angezeigt. Ein p-Wert < 0,05 wurde definiert, um die statistische Signifikanz anzuzeigen.

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Ergebnisse

qRT-PCR-Analyse der circZBTB46-Expression in einem in-vitro SA-AKI-Modell
Diese Reihe von Experimenten wurde durchgeführt, um die Hypothese zu testen, dass die Expression circZBTB46 unter LPS-Stimulation verändert wird und dass die Modulation von circZBTB46 die Lebensfähigkeit der Endothelzellen und die Apoptose in einem in vitro SA-AKI-Modell beeinflusst. ...

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Diskussion

Während der Sepsis aktivieren pathogen-assoziierte molekulare Muster (PAMPs), wie LPS, die von Krankheitserregern freigesetzt werden, Toll-ähnliche Rezeptoren (z. B. TLR4) und lösen eine systemische Entzündungsreaktion26 aus. Dieser Prozess löst die Sekretion mehrerer proinflammatorischer Mediatoren wie TNF-α, IL-6 und IL-1β aus, was zu einem Zytokinsturm27 führt. Gleichzeitig schädigt LPS direkt die vaskulären Endothelzellen, was zu Mikrok...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen. Die Autoren erklären, dass die Hauptergebnisse dieses Manuskripts bisher nicht veröffentlicht wurden und nicht für eine Veröffentlichung anderswo in Betracht gezogen werden.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
AG-825 (ErbB2-Inhibitor)MedChemExpressHY-1019710 & mu; M steht für Wegblockade
Agilent 2100 BioanalyzerAgilentG2939BARNA-Integrität (RIN≥ 7)
AKT AntikörperProteintech60203-2-IgWB (1:15000)
Annexin V-APC/PI Apoptose-KitElabscienceE-CK-A327Apoptose-Erkennung
Antibiotikum-AntimykotikumGibco152400621 % Konzentration
BCA-Proteinquantifizierungs-KitBeyotimeP0012Proteinkonzentration
CAT ELISA KitMEIMIANMM-0897H2Antioxidatives Enzym
CCK-8-BausatzDojindoCK04Zellviabilitätstest
CircRNA-SeqFuzhou Huarong Kehui Biotechnology Co., Ltd.PE150CircRNA-Sequenzierung und alle damit verbundenen bioinformatischen Analysen
CytoFLEX FlusszytometerBeckman CoulterB53000Apoptose-Analyse
DMEMGibco (Invitrogen)11965092Zellkulturmedium
ECL-Substrat-KitMilliporeWBKLS0100Proteindetektion
ERBB2-AntikörperSino-Biologisch100271-T32WB (1:10000)
Fetales Rinderserum (FBS)Biologische Industrien04-001-1ACS10 % (v/v) Ergänzung
GAPDH-AntikörperProteintech60004-1-IgWB (1:50000)
HUVECsProcell-SystemCP-H082Ursprung der Zelllinie
IL-1β ELISA-TrikotMEIMIANMM-0181H2Entzündungsfaktor
IL-6 ELISA-KitMEIMIANMM-0049H2Entzündungsfaktor
Illumina NovaSeq 6000Illumina20012850RNA-Sequenzierung
Lipofektamin 3000InvitrogenL3000008Transfektionsreagenz
LPS (E. coli O111:B4)Sigma-AldrichL263010 & mu; g/mL für das SA-AKI-Modell
MDA ELISA KitMEIMIANMM-2037H2Oxidativer Stressmarker
NanoDrop 2000Thermo FisherND-2000RNA-Quantifizierung
NEBNext Ultra II RNA-BibliothekssetNEBE7770SRNA-seq-Bibliotheksvorbereitung
oe-circZBTB46-PlasmidGenScriptIndividuelle SynthesecircZBTB46 Überexpressionsvektor
oe-NC-PlasmidGenScriptIndividuelle SyntheseNegativer Kontrollvektor
p-AKT (Ser473) AntikörperProteintech66444-1-IgWB (1:1200)
PrimeScript RT Reagenz-KitTakaraRR047AcDNA-Synthese
PVDF-MembranenMilliporeIPVH00010Westblot-Transfer
QuantStudio 5 SystemThermo FisherA28137Echtzeit-PCR
Ribonuklease RLucigenRNR07250rRNA-Entfernung
RIPA Lysis-PufferBeyotimeP0013BProteinextraktion
RNAiso PlusTakara9109Totale RNA-Extraktion
SOD ELISA-KitMEIMIANMM-25469H2Antioxidatives Enzym
TB Green Premix Ex TaqTakaraRR420AqPCR-Reagenz
TNF-α ELISA-TrikotMEIMIANMM-0122H2Entzündungsfaktor

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