Methodenartikel

Modellierung der Adipozyten-Insulinresistenz mittels meines subkutanen Fettgewebe-abgeleiteten stromalen Gefäßbruchs

DOI:

10.3791/69769

⸱

27. März 2026

 ,  , 
1State Key Laboratory of Pathogenesis, Prevention and Treatment of High Incidence Diseases in Central Asia, Xinjiang Key Laboratory of Molecular Biology for Endemic Diseases, Department of Biochemistry and Molecular Biology, School of Basic Medical Sciences, Xinjiang Medical University, 2Changzhou Third People's Hospital

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Diese Studie präsentiert ein experimentelles Protokoll, das stromale vaskuläre Fraktion aus dem subkutanen Fettgewebe der Maus verwendet und mit Dexamethason behandelt wird, um Insulinresistenz zu simulieren. Durch die Beibehaltung der Komplexität des Fettgewebes bietet es eine physiologisch authentische Grundlage für mechanistische Forschung.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Insulinresistenz im Fettgewebe ist ein zentrales Merkmal von Stoffwechselerkrankungen wie Typ-2-Diabetes, doch viele In-vitro-Modelle basieren auf unsterblichen Zelllinien, die die zelluläre Komplexität des nativen Fettgewebes unvollständig widerspiegeln. Ziel dieses Protokolls ist es, eine reproduzierbare und experimentell zugängliche Methode zur Modellierung der Insulinresistenz von Adipozyten mit primären Adipozyten zu etablieren, die aus der stromalen vaskulären Fraktion (SVF) des subkutanen Fettgewebes der Maus abgeleitet sind. Das Protokoll beschreibt die Isolierung von SVF-Zellen durch enzymatische Verdauung, ihre adipogene Differenzierung in lipidgeladene reife Adipozyten und die anschließende Induktion von Insulinresistenz mittels Dexamethason. Insulinresistenz wird operativ durch funktionelle und molekulare Messungen validiert, darunter eine reduzierte insulinstimulierte Glukoseaufnahme und -aufnahme sowie eine verringerte Phosphorylierung wichtiger Insulin-Signalproteine im PI3K-AKT-Weg. Durch die Beibehaltung der SVF-abgeleiteten zellulären Heterogenität bietet dieser Ansatz ein primärzellbasiertes System, das die Untersuchung der Insulinsignalübertragung von Adipozyten unter Bedingungen unterstützt, die der Fettgewebephysiologie näher kommen als konventionelle Zelllinien. Dieses Protokoll richtet sich an Forscher, die eine standardisierte Plattform suchen, um Mechanismen der Insulinresistenz von Adipozyten zu untersuchen oder metabolische Interventionen zu bewerten, wobei anerkannt wird, dass die Anzeigen Reaktionen einer gemischten SVF-Kultur widerspiegeln und nicht einer gereinigten Adipozytenpopulation.

Einleitung

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Typ-2-Diabetes mellitus (T2DM) ist zu einer der am schnellsten wachsenden nichtübertragbaren Stoffwechselerkrankungen weltweit geworden, mit einer Gesamtzahl der Patienten, die mittlerweile 537 Millionen überschreitet und bis 2045 voraussichtlich 783 Millionen übersteigenwird. Ihre pathophysiologischen Kernmerkmale äußern sich als periphere Gewebeinsulinresistenz (IR), begleitet von fortschreitender β-Zell-Dysfunktion2. Das Wesen von IR liegt in den deutlich verminderten biologischen Effekten, die durch physiologisch konzentriertes Insulin in Zielorganen ausgelöst werden, was zu einer verminderten Glukoseaufnahme, einer erhöhten Leberglukoseproduktion und einer gestörten Hemmung der Liphyseführt. Fettgewebe ist eines der wichtigsten Zielorgane des Insulins. Fettleibigkeit führt dazu, dass Fettzellen unempfindlich auf Insulin reagieren, was die Glukoseaufnahme verringert, die Triglyzeridsynthese hemmt, während gleichzeitig die Lipolyse erhöht und mehr freie Fettsäuren freigesetzt werden, wodurch die systemische Insulinresistenz verschlimmertwird 4,5.

Unter physiologischen Bedingungen aktiviert Insulin den PI3K-AKT-Weg, um Glukosetransporter 4 (GLUT4) in die Zellmembran zu translokieren, was die Glukoseaufnahme und Triglyzeridsynthese in Adipozyten fördert. Gleichzeitig hemmt Insulin die Aktivität von Fetttriglyzeridlipase (ATGL) und hormonsensitiver Lipase (HSL) auf der Oberfläche von Lipidtröpfchen und blockiert so Lipolyse6. Wenn IR auftritt, schwächt die gestörte Insulinsignalübertragung die Hemmung der Lipolyse und führt zu einer massiven Freisetzung freier Fettsäuren (FFAs) in den Blutkreislauf. Dies führt zu einer massiven Freisetzung von FFAs in den Blutkreislauf, was eine Eileitertriglyzeridablagerung in Organen wie Leber, Skelettmuskulatur und Bauchspeicheldrüse verursacht. Dies führt zu Lippentoxizität und chronischer Entzündung, was letztlich zum Beginn und Fortschreiten von T2DM7 beiträgt. Daher ist es entscheidend, ein reifes Adipozytenmodell zu etablieren, das in vivo IR-Eigenschaften reproduziert, um die molekularen Mechanismen der IR aufzuklären und neuartige Interventionsstrategien zu entwickeln.

Derzeit ist die 3T3-L1-Maus-embryonale Fibroblastenzelllinie aufgrund ihres kurzen Induktionszyklus und ihrer guten Reproduzierbarkeit 8,9 zu einem klassischen Werkzeug für In-vitro-Studien von Adipozyten-IR geworden. Der embryonale Ursprung der 3T3-L1-Zellen, ihr einheitlicher genetischer Hintergrund und die Anfälligkeit für phänotypische Drift nach Langzeitpassage führen jedoch zu signifikanten Unterschieden im metabolischen Verhalten im Vergleich zu adulten in situ Adipozyten, was ihren translationalen medizinischen Werteinschränkt 10,11. Im Gegensatz dazu ist die stromale vaskuläre Fraktion (SVF), die aus nagetiersubkutanem Fettgewebe isoliert wird, reich an multipotenten fetthaltigen Stammzellen (ASCs). Reife Adipozyten, die sich von diesen ASCs unterscheiden, zeigen morphologische, funktionale und transkriptionelle Merkmale, die denen der natürlichen weißen Adipozyten eher ähneln als die weit verbreitete 3T3-L1-Zelllinie. Dies macht SVF-abgeleitete Adipozyten zu einem komplementären Modell zur Untersuchung von Insulinsignalübertragung und -resistenz in einem Kontext, der die primäre Gewebekomplexität12 besser annähert.

Dieses Protokoll eignet sich am besten für Forscher, die die Insulinwirkung in einem primären Adipozytenmodell untersuchen wollen, das eine größere Gewebe-Heterogenität als unsterbliche Zelllinien behält. Nutzer sollten jedoch beachten, dass SVF eine gemischte Population mit Endothel- und Immunzellen ist; Daher spiegeln die Anzeigen das Verhalten einer Kultur wider, bei der Adipozyten ein wesentlicher, aber nicht ausschließlicher Bestandteil sind. Dieses Modell ist möglicherweise weniger geeignet für Studien, die eine reine, synchronisierte Adipozytenpopulation erfordern.

Diese Studie schlägt ein Protokoll zum Aufbau eines insulinresistenten Zellmodells unter Verwendung reifer Adipozyten aus SVF vor. Das Protokoll beschreibt den gesamten Prozess der SVF-Isolierung, Kultivierung, Differenzierung und Induktion von Insulinresistenz und imitiert dabei erfolgreich den insulinresistenten Zustand der Adipozyten in vivo. Die Modellevaluation erfolgt auf den Niveaus des Glukosekonsums, der zellulären Morphologie und der molekularen Mechanismen. Dies bildet eine technische Grundlage zur Untersuchung der molekularen Mechanismen, die der Insulinresistenz in Adipozyten zugrunde liegen.

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Protokoll

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Alle Tierversuche wurden vom Ethikkomitee für Tierversuche der Medizinischen Universität Xinjiang genehmigt (Ethische Zulassungsnummer: IAGUC-20240228-41).

1. SVF-Isolierung

  1. Versuchstiere: Verwenden Sie 4-6 Wochen alte SPF-Grade C57BL/6J-Mäuse mit einem Gewicht von 9-11 g. Halten Sie sie bei 22 ± 2 °C in einem 12-Stunden-Hell-Dunkel-Zyklus mit freiem Zugang zu Nahrung und Wasser.
  2. Sterile Zubereitung: Autoklaven alle Instrumente und Verbrauchsgüter bei 121 °C für 30 Minuten. Vor dem Experiment wird die laminare Flusshaube mit 75 % Ethanol besprüht und mit UV-Licht für ≥15 Minuten bestrahlt. Führen Sie alle Verfahren in einem Biosicherheitsschrank der Klasse II durch. Tragen Sie sterile Handschuhe und Masken.
  3. Fettgewebeentnahme: Euthanasierung von Mäusen durch Kohlendioxidinhalation gefolgt von zervikaler Verrenkung. Sofort 10 Minuten lang in 75 % Ethanol eintauchen, um die Oberflächendesinfektion durchzuführen. Mit steriler Augenschere wird ein kreisförmiger Schnitt entlang der Mittellinie von Brust und Bauch gemacht. Führen Sie eine stumpfe Dissektion durch, um das beidseitige leistenales weiße Fettgewebe freizulegen, das sich an der Innenseite des Oberschenkels befindet und sich in V-Form zum Hodenbereich erstreckt. Entfernen Sie vorsichtig alle sichtbaren Lymphknoten. Sammeln Sie das Fettgewebe zu vorgekühltem PBS und führen Sie drei schnelle Spülungen durch.
  4. Kollagenaseverdauung: Das gewaschene Fettgewebe wird sofort in eine sterile Kulturschale überführt und in 1–2 mm³ große Fragmente zerkleinert. Fügen Sie 0,2 % Typ-II-Kollagenase hinzu (gelöst im PBS von Dulbecco, pH 7,4, vorerwärmt auf 37 °C) in einem Volumen von 1,5-2x dem des Gewebes. Inkubieren Sie bei 37 °C auf einem Schüttler mit konstanter Temperatur bei 100 U/min für 10 Minuten. Alle 3 Minuten sanft umdrehen, um Überverdauung zu vermeiden.
  5. Abbruch und Filtration: Nach Abschluss der Verdauung wird ein gleiches Volumen vorgeheiztes vollständiges Medium (DMEM/F-12 + 10 % FBS + 1 % Penicillin-Streptomycin) bei 37 °C hinzugefügt, um die Reaktion zu beenden. Pipette vorsichtig 5x-8x mit einer 1-mL Pipettenspitze. Filtern Sie durch ein 70-μm-Zellsieb, um unverdaute Gewebefragmente und reife Adipozyten zu entfernen.
  6. Zentrifugation und Waschen: Zentrifugieren Sie das Filtrat bei 300 x g für 5 Minuten bei 25 °C. Entsorgen Sie vorsichtig den Supernatant mit reifen Adipozyten. Das Pellet in vollständigem Medium wieder aufhängen. Zentrifugiere erneut bei 300 x g für 5 Minuten bei 25 °C. Wiederholen Sie diesen Waschschritt zweimal, um die restlichen Kollagenase und alle verbleibenden reifen Adipozyten zu entfernen.
  7. Aussäen und Kultur: Die endgültige Pellet in 1 ml vollständigem Medium aufhängen. Samen mit einer Dichte von 4 Mäusen Leistenfettproben pro 10 cm Zellkulturschale. Inkubieren Sie bei 37 °C mit 5 % CO₂. Führen Sie den ersten Mediumwechsel nach 24 Stunden durch, um nicht haftende Zellen zu entfernen. Wechselt anschließend das Medium alle 48 Stunden. Passieren Sie die Zellen, wenn sie eine 80%-90%ige Konfluenz erreichen.
    HINWEIS: Zellen werden nicht durchführt, wenn die Konfluenz 90 % überschreitet, da die Zellen die Kontakthemmung erreicht haben und ihre Proliferationskapazität verringert ist.

2. Herstellung einer Arbeitslösung des Typ-II-Kollagenases

  1. Reagenzien und Verbrauchsgüter: Erhalt von Typ-II-Kollagenas (Aktivität ≥ 120 U/mg); BSA (fettsäurefrei ≥ 98 %); HEPES; Dulbeccos PBS (mit Ca²⁺ 1,8 mmol/L, Mg²⁺ 0,9 mmol/L), pH 7,2–7,4; 0,22 μm steriler, proteinarmer Bindungsfilter.
  2. Herstellung einer 0,2%igen Typ-II-Kollagenase-Lösung: Gewichten Sie 60 mg Typ-II-Kollagenasepulver, 800 mg BSA und 48 mg HEPES in ein 50-mL-Zentrifugenrohr. Verdünne auf 40 mL mit Dulbeccos PBS. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 ± 0,1 mit 1 M NaOH oder HCl ein. Sterilisieren Sie durch Filtration durch einen 0,22-μm-Filter. Aliquot 5 ml pro Rohr und bei -20 °C lagern. Vermeiden Sie wiederholte Gefrier-Tau-Zyklen.
  3. Fördern Sie die Differenzierung, wenn die Zellen nach dem Durchgang 100 % Konfluenz erreichen. Der optimale Differenzierungszustand wird durch Zellen angezeigt, die eine wirbelartige Morphologie aufweisen. Verwenden Sie für die ersten 48 Stunden Induktionslösung I und wechseln Sie dann zu Induktionslösung II (Tabelle 1).
  4. Bestätigen Sie die erfolgreiche Differenzierung anhand folgender Kriterien: Am Tag 4 der Induktion zeigt die Ölrot-O-Färbung eine Lipidtröpfchenansammlung in den meisten Zellen (etwa 50 %), begleitet von einem statistisch signifikanten Anstieg (p < 0,05) der Expression wichtiger Adipogenesemarker.

3. Etablierung des Insulinresistenzmodells

  1. Wählen Sie den Differenzierungstag 4 als Ausgangspunkt für die Einleitung der Insulinresistenz. Unter dem Mikroskop wird bestätigt, dass alle Zellen einen morphologischen Übergang von spindelförmig zu rund aufweisen, wobei das Zytoplasma der meisten Zellen mit Lipidtröpfchen mit hohem Brechungsindex gefüllt ist.
  2. Ersetze das Medium durch Induktionsmedium II mit 1 μmol/L Dex und setze die Kultivierung 48 Stunden fort (Tabelle 1). Nach diesem Verfahren betrachten Sie das etablierte insulinresistente Adipozytenmodell. Beachten Sie, dass diese Zellen keine weiteren morphologischen Veränderungen aufweisen. Verwenden Sie diese Zellen direkt für Glukoseaufnahme- und -verbrauchstests und zur Detektion von Proteinen des Insulinsignalwegs.
  3. Kriterien für den erfolgreichen Aufbau eines Insulinresistenzmodells: Nach 48 Stunden Dexamethasonbehandlung wird bestätigt, dass die Glukoseaufnahmekapazität in den meisten mit 100 nM stimulierten Zellen um etwa 40 % sinkt. Bestätigen Sie außerdem eine statistisch signifikante Reduktion (p < 0,05) der Phosphorylierungsniveaus wichtiger Proteine des Insulinsignalwegs.
    HINWEIS: Dieser Prozess erfordert kontinuierliches Zufügen des Induktionswartungsmediums II.

4. Nachweis von Restglukose im Kultursupernatant

  1. Sammeln Sie Zellkultur-Supernatanten zum festgelegten Zeitpunkt. Entferne die Zellen durch Zentrifugation bei 4 °C und 300 x g für 5 Minuten.
  2. Missen Sie die Glukosekonzentrationen in den Supernatanten mit dem Glucose-Oxidase-Peroxidase-(GOD-POD)-Testset. Berechnen Sie die Konzentrationen mit folgender Formel:
    Glukosekonzentration (mmol/L) = (A(Stichprobe) - A(Leerstoff)) / (A(Standard) - A(Leerstoff)) * C(Standard)
    Glukoseverbrauch (mmol/L) = Glukosekonzentration im zellfreien Medium (mmol/L) - Glukosekonzentration im Zellüberstandsstoff (mmol/L)
    Normalisierter Glukosekonsum (mmol/mg Protein) = Rohglukosekonsum (mmol/L) / Gesamtzelluläre Proteinkonzentration (mg/L)

5. Westlicher Fleck

  1. Stimulieren Sie die Zellen zum festgelegten Zeitpunkt mit 100 nM Insulin im vollständigen Medium für 10 Minuten bei 37 °C, um den PI3K-AKT-Weg zu aktivieren. Anschließend werden 200 μL Zelllysepuffer zu jeder 3,5 cm großen Zellkulturschüssel hinzugefügt. Brüte 30 Minuten auf Eis. Zentrifugiere bei 13.040 x g für 10 Minuten bei 4 °C. Übertragen Sie das Überstandsmittel auf ein neues 1,5-mL-Mikrozentrifugenrohr. Quantifizieren Sie die Proteinkonzentration mit der BCA-Arbeitslösung.
  2. Laden Sie Proben auf ein 8%iges SDS-PAGE-Gel. Führe das Gel bei 80 V aus, bis die Proben die Stapel-/Trenngel-Schnittstelle erreichen. Erhöhe die Spannung auf 120 V und lasse laufen, bis die Markierbänder vollständig aufgelöst sind. Führen Sie die Übertragung bei einem konstanten Strom von 200 mA für 2 Stunden durch.
  3. Inkubiere die Membran bei Zimmertemperatur mit 5 % Magermilch oder BSA für 2 Stunden zum Blockieren. Wasche die Membran dreimal mit TBST. Anschließend über Nacht mit dem primären Antikörper bei 4 °C inkubieren. Primäre Antikörper (Verdünnung): AKT: 1:1000, p-AKT (Ser473): 1:1000, β-Aktin: 1:1000, PI3K p110α: 1:1000, Phospho-PI3K p110: 1:1000, C/EBPα: 1:2000, FABP4: 1:2000.
  4. Wasche die Membran dreimal mit TBST. Anschließend wird mit HRP-konjugiertem sekundären Antikörper bei Raumtemperatur 1 Stunde lang inkubiert. Sekundäre Antikörper (Verdünnung): Ziegenanti-Maus IgG-HRP: 1:5000, Ziegenanti-Kaninchen IgG-HRP: 1:5000.
  5. Erkennen Sie das Signal mit ECL-Chemilumineszenz. Visualisieren und dokumentieren Sie die experimentellen Ergebnisse mit einem Western-Blot-Imager.
  6. Analysieren Sie die Graustufenwerte der resultierenden Bänder mit der ImageJ-Software.

6. Glukoseaufnahme-Färbungstest

  1. Lassen Sie die Zellen an den beiden angegebenen Zeitpunkten jeweils 12 Stunden lang getrennt aushungern, wobei RPMI 1640 mit 1 % FBS verwendet wird, um Interferenzen durch die Basalglukose zu eliminieren.
  2. Nach 10 Minuten Stimulation mit 100 nM Insulin geben Sie 1 ml 1x 2-NBDG-Lösung zu jedem Brunnen. Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C für 1 Stunde, geschützt vor Licht.
  3. Wasche die Zellen zwei- bis dreimal. Gib jedem Brunnen 1 ml Fertige Hoechst-Färbelösung hinzu. Inkubiere den Teller bei 37 °C im Dunkeln für 10 Minuten. Fügen Sie die Färbelösung langsam entlang der Seitenwand des Kulturgefäßes ein, wobei Sie direkten Kontakt mit der Zellschicht vermeiden, um eine Ablösung der Zellen zu verhindern.
  4. Wasche die Zellen zwei- bis dreimal und gib dann PBS hinzu. Nehmen Sie fluoreszierende Bilder der Zellen mit einem invertierten Fluoreszenzmikroskop auf.
  5. Führen Sie eine quantitative Analyse der Bilder mit der ImageJ-Software durch. Verwenden Sie ImageJ, um jeden Kanal zu trennen und das Glukoseaufnahmesignal (grüner Kanal) vom Kernfluoreszenzsignal (blauer Kanal) zu isolieren.
  6. Konvertiere alle Bilder in 8-Bit-Graustufenbilder. Wenden Sie den Standard-Automatik-Schwellenwertalgorithmus an, um Bereiche mit positivem Signal zu definieren.
  7. Missen Sie die durchschnittliche Fluoreszenzintensität innerhalb dieser ausgewiesenen Regionen. Normalisieren Sie das Glukoseaufnahme-Fluoreszenzsignal, indem Sie die durchschnittliche Fluoreszenzintensität des grünen Kanals durch die entsprechende durchschnittliche Fluoreszenzintensität des blauen Kanals teilen.

7. Ölrote O-Färbung

  1. Verdünnen Sie die Oil Red O-Stocklösung mit RNase-freiem Wasser im Verhältnis 3:2. Filtern Sie die Lösung nacheinander durch Filterpapier und einen 0,22 μm-Filter, um die Arbeitslösung herzustellen.
  2. Aspirieren Sie das Zellkulturmedium und waschen Sie die Zellen vorsichtig zweimal mit PBS. Gib jedem Brunnen 4 % Paraformaldehyd hinzu und fixiere die Zellen 30 Minuten lang bei Raumtemperatur.
  3. Fügen Sie das Fixierungsmittel hinzu und waschen Sie die Zellen mit doppelt destilliertem Wasser. Gib jedem Bohrloch 1 ml Oil Red O Arbeitslösung hinzu. Den Teller 25 Minuten bei Zimmertemperatur im Dunkeln inkubieren lassen.
  4. Nach dem Färben aspirieren Sie die Färbungslösung. Waschen Sie die Zellen gründlich mit destilliertem Wasser, um Hintergrund- und Fleckenartefakte zu entfernen. Gib 1 ml destilliertes Wasser dazu, um die Zellen abzudecken. Sofort werden Hellfeldbilder mit einem umgekehrten Mikroskop aufgenommen.

8. BODIPY

  1. Verdünnen Sie die BODIPY-Lagerlösung mit sterilem Wasser im Volumenverhältnis von 1:200, um die Arbeitslösung herzustellen.
  2. Waschen Sie die Zellendeckblätter mit sterilem PBS. Fügen Sie 30 μL 4%ige Paraformaldehydlösung zu jeder Deckschicht hinzu und fixieren Sie 30 Minuten bei Raumtemperatur.
  3. Aspiriere das Fixativ und wasche dreimal mit PBS. Fügen Sie 30 μL BODIPY-Arbeitslösung zu jeder Zelldeckfolie hinzu. Brüte bei Zimmertemperatur im Dunkeln 30 Minuten aus.
  4. Wasche die Deckblätter dreimal mit PBS. Fügen Sie 30 μL DAPI-Fleck zu jedem Deckmantel hinzu. Inkubieren Sie bei Raumtemperatur im Dunkeln für 10 Minuten, um die Zellkerne zu markieren.
  5. Waschen Sie die Deckblätter noch dreimal mit PBS. Fahren Sie mit der Montage fort: Fügen Sie 10 μL Anti-Fade-Montagemedium auf einen sauberen Mikroskopobjektträger hinzu. Mit einer Pinzette wenden Sie den Zelldeckmantel (Zellseite nach unten) vorsichtig auf das Montagemedium. Lass den Mountant im Dunkeln trocknen.
  6. Nehmen Sie sofort Bilder mit einem laserabtastenden Konfokalmikroskop auf.

9. Statistische Analyse

  1. Jedes Experiment umfasste drei biologische Replikate. Analysieren Sie Daten mit der GraphPad Prism 10.0 Software. Präsentieren Sie quantitative Daten, die die Kriterien für die Normalverteilung als Mittelwert ± Standardabweichung (Mittelwert ± SD) erfüllen. Für zwei Gruppen, die Normalität und Varianzhomogenität erfüllen, wenden wir den unabhängigen Stichproben-t-Test an. Für mehrere Gruppen führt man einseitig ANOVA durch, gilt p < 0,05 als statistisch signifikant.

10. Sicherheit und Abfallentsorgung

  1. Umgang mit tierischen Geweben
    1. Führen Sie alle Verfahren mit Primärzellen in einem Biosicherheitsschrank der Klasse II unter sterilen Bedingungen durch.
    2. Klassifizieren Sie alle tierischen Gewebeabfälle, ungenutzte Organe und kontaminierte Verbrauchsmaterialien als biologisch gefährliche Abfälle. Solche Abfälle werden in ausgewiesene Biohazard-Beutel gelegt, durch Autoklaven verarbeitet und schließlich entsorgt.
  2. Umgang mit Dexamethason
    1. Trage Handschuhe, medizinische Masken und Laborkittel, wenn du Dex-Pulver wiegst. Führen Sie die Lösungsvorbereitung in einer chemischen Abzugshaube durch.
    2. Sammeln Sie Abfälle, die mit Dex kontaminiert sind, separat und entsorgen Sie sie als chemische Abfälle.
  3. Umgang mit biologisch gefährlichen Materialien
    1. Desinfizieren Sie Arbeitsflächen und das Innere der Biosicherheitsschränke gründlich mit 70 % Ethanol, bevor die experimentellen Verfahren beginnen können.
    2. Stellen Sie sicher, dass alle flüssigen Abfälle, die aus der Zellkultur entstehen, autoklaviert werden, um sie vor der Entsorgung nicht mehr infektiös zu machen.

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Ergebnisse

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SVF-Zellen, die aus dem iWAT von C57BL/6J-Mäusen isoliert wurden, zeigten beim ersten Aussäen in Kulturschalen eine punktierte Suspension. Ungefähr 40 % der Zellen vollendeten die primäre Anhaftung nach 18 Stunden Aussaat; bis Tag 5 nach der Aussaatung waren die Zellen vollständig ausgebreitet, mit einer Konfluenz von 95 % (Abbildung 1A, B). Wenn die Zellen die Konfluenz erreichten und eine charakteristische wirbelartige Anordnung aufwiesen, wurde das Differenzierungsmedium ...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Umfangreiche Forschungen zeigen, dass SVF-zellbasierte Modelle einen einzigartigen Wert bei der Simulation pathologischer Merkmale von Fettgewebe bieten. Der lange Konstruktionszyklus dieser Modelle, der typischerweise etwa 14 Tage für Gewebeisolation, Primärkultur, induzierte Differenzierung und Dex-Behandlung benötigt, stellt jedoch Herausforderungen für die experimentelle Kontinuität und die Stabilität des zellulären Zustands dar. Um diese Herausforderungen zu bewältigen, hat diese St...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt in diesem Werk.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (82260177) und dem State Key Laboratory of Pathogenesis, Prevention, and Treatment of High Incidence Diseases in the Central Asia Program (SKL-HIDCA-2023-20) unterstützt. Die Förderbehörde hatte keinen Einfluss auf das Design, die Umsetzung oder die Interpretation dieser Studie. Die Förderagentur beteiligte sich nicht an der Erstellung oder Einreichung dieses Manuskripts zur Veröffentlichung.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,22 μ M-FilterBiosharpBSF-XS-0232-01
2-NBDGBeyotimeS0561M
3-Isobutyl-1-MethylxanthinSigma15879
4 % PolyformaldehydBiosharpBL1278A
70 & mu; M-Zell-SiebBiosharpBS-70-CS
Anti-AKTProteintech10175
Anti-C/EBPΑAbcloneab40764
Anti-FABP4Zell-Signaltechnik 2120ER JAHRE
Anti-pAKT (Ser473)Proteintech28731
Anti-PI3K Bioss10657R
Anti-pPI3K (S. 110)Bioss6417R
Anti-β-ACTINProteintech60008
BCA-Protein-Assay-KitThermo Fisher23225
BODIPY 493/503InvitrogenD3922
BSA SigmaA7030
Zell-Kletterschnitte Biosharp & NBSP;BiosharpBS-14-RC
Zellkulturschale, 100 mm x 20 mmCorning430167
Zellkulturschale, 35 mm x 10 mmCorning430165
DAPI-LösungSolarbio28718-90-3
DexamethasonSigmaD2915
DMEM/F-12GibcoC11330500BT
Dulbecco' s PBSCytivaSH30264.02
Eppendorfer RöhreCorningMCT-175-C 
FBSLife-iLabAC03L0555
FluoreszenzmikroskopLeicaDMi8
Glucose-Oxidase-PeroxidaseNanjing JianchengF006-1-1
Ziegen-Maus-IgG-HRPBeijing Zhongshan JinqiaoZB-2305
Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG-HRPBeijing Zhongshan JinqiaoZB-2301
GraphPad-PrismaVersion 10.0.0/
HepesBioFroxx1112GR025
HochestbiosharpBL803A
ImageJVersion 1.54p/
InsulinSolarbio18040
Laser-Scanning-KonfokalmikroskopNikon Ti-E
Montagemedium AntifadingSolarbioS2100
Ölrote O-FärbelösungSigmaO0625-25G
Penicillin-StreptomycinHycloneSV30010
RIPA-PufferThermo Fisher89901
RosiglitazonSigmaR2408
RPMI 1640VivaCellC3010-0500
MagermilchpulverBioFroxx1132GR500
TBS-PufferSolarbioT1060
Typ-II-KollagenaseSigmaC6885

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. NCD Risk Factor Collaboration (NCD-RisC). Worldwide trends in underweight and obesity from 1990 to 2022: a pooled analysis of 3663 population-representative studies with 222 million children, adolescents, and adults. Lancet. 403 (10431), 1027-1050 (2024).
  2. Stumvoll, M., Goldstein, B. J., van Haeften, T. W. Type 2 diabetes: principles of pathogenesis and therapy. Lancet. 365 (9467), 1333-1346 (2005).
  3. Arkan, M. C., et al. IKK-beta links inflammation to obesity-induced insulin resistance. Nat Med. 11 (2), 191-198 (2005).
  4. Li, M., et al. Trends in insulin resistance: insights into mechanisms and therapeutic strategy. Signal Transduct Target Ther. 7 (1), 216(2022).
  5. Miao, Z., et al. The causal effect of obesity on prediabetes and insulin resistance reveals the important role of adipose tissue in insulin resistance. PLoS Genet. 16 (9), e1009018(2020).
  6. Santoro, A., McGraw, T. E., Kahn, B. B. Insulin action in adipocytes, adipose remodeling, and systemic effects. Cell Metab. 33 (4), 748-757 (2021).
  7. Segalla, L., Chirumbolo, S., Sbarbati, A. Dermal white adipose tissue: Much more than a metabolic, lipid-storage organ. Tissue Cell. 71, 101583(2021).
  8. Hoehn, K. L., et al. IRS1-independent defects define major nodes of insulin resistance. Cell Metab. 7 (5), 421-433 (2008).
  9. Zhou, X., Wang, L. L., Tang, W. J., Tang, B. Astragaloside IV inhibits protein tyrosine phosphatase 1B and improves insulin resistance in insulin-resistant HepG2 cells and triglyceride accumulation in oleic acid (OA)-treated HepG2 cells. J Ethnopharmacol. 268, 113556(2021).
  10. Liu, X., Liu, X. N., Li, T. J., Liu, B. Research Progress of the Differentiation of 3T3-L1 Preadipocytes into Mature Adipocytes. Zhongguo Yi Xue Ke Xue Yuan Xue Bao. 39 (5), 727-731 (2017).
  11. Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What we talk about when we talk about fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
  12. Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Eng. 7 (2), 211-228 (2001).
  13. Tan, S. X., et al. Selective insulin resistance in adipocytes. J Biol Chem. 290 (18), 11337-11348 (2015).
  14. Zebisch, K., Voigt, V., Wabitsch, M., Brandsch, M. Protocol for effective differentiation of 3T3-L1 cells to adipocytes. Anal Biochem. 425 (1), 88-90 (2012).
  15. Wang, T., Sharma, A. K., Wolfrum, C. Novel insights into adipose tissue heterogeneity. Rev Endocr Metab Disord. 23 (1), 5-12 (2022).
  16. Taniguchi, C. M., et al. Divergent regulation of hepatic glucose and lipid metabolism by phosphoinositide 3-kinase via Akt and PKClambda/zeta. Cell Metab. 3 (5), 343-353 (2006).
  17. Jacinto, E., et al. SIN1/MIP1 maintains rictor-mTOR complex integrity and regulates Akt phosphorylation and substrate specificity. Cell. 127 (1), 125-137 (2006).
  18. Cozzone, D., et al. Isoform-specific defects of insulin stimulation of Akt/protein kinase B (PKB) in skeletal muscle cells from type 2 diabetic patients. Diabetologia. 51 (3), 512-521 (2008).
  19. Sakoda, H., et al. Dexamethasone-induced insulin resistance in 3T3-L1 adipocytes is due to inhibition of glucose transport rather than insulin signal transduction. Diabetes. 49 (10), 1700-1708 (2000).
  20. Burén, J., Liu, H. X., Jensen, J., Eriksson, J. W. Dexamethasone impairs insulin signalling and glucose transport by depletion of insulin receptor substrate-1, phosphatidylinositol 3-kinase and protein kinase B in primary cultured rat adipocytes. Eur J Endocrinol. 146 (3), 419-429 (2002).

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Insulinsignalisierungadipogene DifferenzierungGlukoseaufnahmeInsulinresistenzmodellPI3K AKT SignalwegDexamethason Induktionprim re Adipozyten

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