Forschungsartikel

Echtzeit-PCR-Quantifizierung der roten komplexen bakteriellen DNA und des parodontalen Status bei entfernbaren Teilprothesenträgern

DOI:

10.3791/69774

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2. Januar 2026

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1Department of Prosthodontics, Dental School, Faculty of Medicine, University of Prishtina, 2Department of Reconstructive Dentistry and Gerodontology, School of Dental Medicine, University of Bern, 3Oral Implantology Research Institute, 4School of Dental Medicine, University of Zagreb

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Die Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wurde verwendet, um die DNA von roten Komplexbakterien bei Trägern der herausnehmbaren Teilprothesen (RPD) zu quantifizieren. Diese Studie verspricht einen neuartigen Ansatz für zukünftige Behandlungsstrategien für Implantatprothesen bei diesen Patienten, wobei die Rolle dieser Bakterien bei der Entwicklung von Peri-Implantitis berücksichtigt wird.

Zusammenfassung

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Das Einsetzen von abnehmbaren Teilprothesen (RPDs) in die Mundhöhle ist mit Veränderungen der oralen Mikroflora im Laufe der Zeit verbunden. Allerdings gibt es einen Mangel an Literatur, die das Vorkommen von roten Komplexbakterien (RCB) bei diesen Patienten untersucht. Angesichts der etablierten Rolle von RCB bei der Entwicklung von Parodontitis, Peri-Implantitis und verschiedenen systemischen Erkrankungen ist die Untersuchung der Auswirkungen von RPDs auf diese Bakterien entscheidend. Diese Studie zielt darauf ab, die subgingivale Belastung von RCB-Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia und Treponema denticola-in-in Abutment-Zähnen teilweise edentulöser Patienten, die mit RPDs rehabilitiert wurden, mittels Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) zu quantifizieren. Ein sekundäres Ziel war es, den parodontalen Status von Stütz- und Nicht-Widerstandszähnen zu bewerten sowie die Korrelationen zwischen mikrobieller Last und klinischen parodontalen Indizes zu bestimmen.

Dreißig Teilnehmer, die RPDs benötigten, wurden eingeschrieben. Desoxyribonukleinsäure (DNA) wurde aus bakteriellen Proben isoliert, die vor (T0) und drei Monate nach der Einsetzung (T3) von Widerlagerzähnen entnommen wurden. Die RCB-Quantifizierung erfolgte mittels RT-PCR und wurde als "Lg (Genomäquivalente/Probe)" ausgedrückt. Klinische Parameter – Plaque-Index (PI), Zahnfleischindex (GI), Sondtiefe (PD) und Zahnbeweglichkeit (TM) – wurden für Widerlager und Nicht-Widerstandszähne zu beiden Zeitpunkten erfasst.

Widerlagerzähne zeigten statistisch signifikante Zunahmen der RCB-Belastungen über alle drei Zielarten von T0 bis T3: P. gingivalis (1,99 ± 2,01 vs 3,64 ± 2,21, p = 0,00003), T. forsythia (2,20 ± 2,17 vs 3,56 ± 2,33, p = 0,00009) und T. denticola (0,82 ± 1,41 vs 2,35 ± 2,21, p = 0,0001). Während die parodontalen Parameter bei den Zähnen des Widerlagers im Vergleich zu den Nicht-Stützzähnen nach der Behandlung erhöht waren, erreichten die Unterschiede keine statistische Signifikan. Unter den Krankheitserregern zeigte T. forsythia die stärkste positive Korrelation mit parodontalen Indizes auf.

Der kurzfristige Einsatz von RPDs ist mit einem signifikanten Anstieg der RCB-Kolonisierung von Widerlagerzähnen verbunden, was auf frühe mikrobielle und entzündliche Veränderungen hindeutet, die einem klinisch erkennbaren parodontalen Zerfall vorausgehen können.

Einleitung

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Die Mundhöhle beherbergt ein dynamisches Mikrobiom, dessen ökologisches Gleichgewicht entscheidend für die Aufrechterhaltung der parodontalen Gesundheitist. Eine Störung dieser mikrobiellen Homöostase durch endogene und exogene Faktoren kann die mikrobielle Homöostase stören und so günstige Bedingungen für das Wachstum pathogener Bakterien schaffen, darunter parodontale Krankheitserreger wie Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia und Treponema denticola, die zusammen als rote Komplexbakterien (RCB)2 bezeichnet werden. Diese Krankheitserreger sind entscheidend für die Entstehung von Parodontitis und Peri-Implantitis, da sie synergetisch daran arbeiten, die Abwehr des Wirts zu umgehen, Entzündungen zu fördern und die Zerstörung von Parodontalgewebe zu erleichtern, was häufig zu Zahnverlustführt. Zahnverlust beeinträchtigt die Fähigkeit einer Person zu essen und zu sprechen und trägt zu einem verminderten Selbstvertrauen und Wohlbefinden bei, wodurch der Bedarf an Prothesenkompensation steigt. Eine der am häufigsten verwendeten Methoden, insbesondere bei älteren Menschen aufgrund verschiedener lokaler und allgemeiner Erkrankungen, ist die Prothesenbehandlung mit herausnehmbaren Teilprothesen (RPDs). Im Laufe der Zeit kann RPDs5 jedoch zu verschiedenen Problemen führen.

Starke Belege deuten darauf hin, dass der Einsatz von RPDs zu Zahnbelag und zur Entwicklung einer Entzündung des Zahnfleisches und des Parodontalgewebes führen kann, insbesondere bei den Widerlagerzähnen 6,7,8,9,10. Das Auftreten solcher oralen Störungen hängt jedoch auch vom Engagement des Patienten für die Mundhygiene sowie von der Pflege und Pflege der Protheseab 11,12,13,14. Bassi et al. betonten in ihrer Forschung die Bedeutung der Kontrolle von Zahnbelag. Sie untersuchten Patienten, die RPDs über einen Zeitraum von 6 bis 12 Jahren getragen hatten, und stellten fest, dass der parodontale Zustand der Widerlagerzähne bei regelmäßiger Mundhygiene dem von Nicht-Widerlagerzähnen ähnelte. Im Gegensatz dazu verschlechterte sich der parodontale Zustand in der Patientengruppe, die der Nachsorge und Aufrechterhaltung der Mundhygienekeine Bedeutung beimaßen.

Trotz der funktionalen Vorteile von RPDs behindert ihr Einsetzen in die Mundhöhle den freien Speichelfluss, wodurch die Bildung einer Pellicle-Schicht auf der Oberfläche der Prothese anfällig ist, die zur bakteriellen Besiedlung führen kann. Bei PRPD-Patienten wurden verschiedene Arten schädlicher Bakterien identifiziert15. Neuere Studien haben gezeigt, dass die Mengen an Krankheitserregern, die mit Karies verbundene Infektionen verursachen, wie Streptococcus mutans16, sowie die von Staphylococcus aureus17, nach dem Einsetzen der Prothesen deutlich steigen können. Neben der Funktion als Indikator für den Zustand der Mundschleimhaut können Veränderungen im Bakteriengehalt durch die Verwendung von RPDs auch zur Entwicklung von Zahnerkrankungen in den verbleibendenZähnen führen. Wenn Patienten ihre RPDs nicht ordnungsgemäß pflegen, können unter der Prothesenbasis anaeroben Erkrankungen entstehen, was zu einem übermäßigen Wachstum pathogener Bakterien führen kann. Bestimmte Arten von parodontalen Krankheitserregern können über das oropharyngeale Portal in den allgemeinen Blutkreislauf gelangen und stellt einen erheblichen Risikofaktor für die Entwicklung verschiedener systemischer Erkrankungendar 19,20.

Allerdings gibt es weiterhin einen Mangel an Studien zu mikrobiologischen Veränderungen im Zahnfleisch der Stützzähne bei Patienten mit RPD 21,22,23,24. Unter den wenigen Studien zu diesem Thema wurden konventionelle Methoden zur Erkennung parodontaler Krankheitserreger, darunter der BANA-ZymeTM-Test und die Kulturmethode, verwendet. Da die meisten parodontalen Krankheitserreger fakultativ anaerobe sind, kann der Einsatz solcher Methoden zu Schwierigkeiten bei deren Kultivierung führen, da in diesem Zusammenhang Bedingungen hoher Reduktionsintensität und für die Sauerstoff toxisch ist,25 erforderlich sind. Zudem hat die verfügbare zahnärztliche Literatur die Beziehung zwischen solchen Krankheitserregern und den verschiedenen parodontalen Indizes in dieser Perspektive noch nicht zufriedenstellend behandelt.

Um die Einschränkungen herkömmlicher mikrobieller Kultur zu überwinden und die diagnostische Genauigkeit zu verbessern, setzte diese Studie daher eine Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) ein, um die Belastungen des roten Komplexes (RCB) in den Widerlagerzähnen von RPD-Trägern zu quantifizieren. Parallel dazu wurde der parodontalen Status sowohl der Widerstands- als auch der Nicht-Stützzähne anhand standardisierter klinischer Indizes bewertet. Die Studie untersuchte weiter die Korrelationen zwischen bakterieller Belastung und parodontalen Parametern, um das biologische Zusammenspiel zwischen Prothesennutzung und mikrobieller Dysbiose besser aufzuklären.

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Protokoll

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Diese Studie umfasste 30 teilweise edentulöse Patienten, die zwischen September 2021 und März 2022 in der Klinik für Zahnprothesen des Universitätszahnmedizinischen Klinischen Zentrums Kosovo eine prosthetische Behandlung in Anspruch nahmen. Die ethische Genehmigung wurde vom institutionellen Überprüfungsausschuss eingeholt (Genehmigung Nr. 378/19), und alle Verfahren folgten den Grundsätzen der Erklärung von Helsinki. Von allen Teilnehmern wurde eine schriftliche informierte Zustimmung eingeholt.

Die Stichprobengröße wurde auf Basis früherer Forschung bestimmt, die darauf hindeutet, dass 11 bis 30 Teilnehmer ausreichen, um signifikante Ergebnisse bei mikrobiellen und parodontalen Parametern bei RPD-Trägernzu erzielen – 21,23. Unter der Annahme eines zweiseitigen gepaarten T-Tests mit einem Alpha-Niveau von 0,05 zeigte die Power-Analyse, dass eine Stichprobengröße von 28 Teilnehmern 80 % Leistung liefern würde, um einen statistisch signifikanten Unterschied dieser Größenordnung zu erkennen. Um mögliche Abbrecher zu berücksichtigen, haben wir 30 Teilnehmer eingeschrieben. Darüber hinaus reichte eine Nachbeobachtungszeit von drei Monaten aus, um bei diesen Patienteneine Zunahme der Bakterienlast zu beobachten.

Geeignete Patienten waren Erstanwender von Prothesengeräten und präsentierten sich sowohl mit angrenzender als auch antagonistischer natürlicher Zahnbesatzung. Ausschlusskriterien umfassten: Sondierungstiefen >4 mm, immungeschwächter Status (z. B. Chemotherapie), Antibiotikaeinnahme in den letzten 90 Tagen, starkes Rauchen (>25 Zigaretten/Tag) und kognitive Beeinträchtigung, die das Verständnis von RPD-Verfahren erschwert.

Alle Teilnehmer erhielten verschlossene RPDs, die mit einem Kobalt-Chrommetall-Gerüst und Acrylharz (Polymethylmethacrylat) gefertigt wurden. Das Design jedes RPD wurde basierend auf der Klassifikation von Edentulismus, der Qualität der Restgrate und biomechanischen Überlegungen angepasst.

Probenentnahmeverfahren

Die Probenentnahme erfolgte ausschließlich an den Stützzähnen von herausnehmbaren Teilprothesen (RPDs) zwischen den Zeitpunkten T0 und T3. Die Teilnehmer wurden zunächst gebeten, gründlich mit Wasser zu gurgeln, um restliche Essensreste zu entfernen. Vor der Probenentnahme wurde der ausgewählte Widerlagerzahn mit Watterollen isoliert, um eine trockene Arbeitsumgebung zu gewährleisten. Zwei sterile Papierspitzen (Nr. 35; 04 konisch) wurden in den Zahnfleisch an den mesialen und distalen Seiten der Mundoberfläche des Zahns eingesetzt und 1 Minute an Ort und Stelle gelassen. Die Papierpunkte wurden dann in ein steriles Mikrorohr mit 1,5 ml Kochsalzlösung übertragen und in ein ausgewiesenes mikrobiologisches Labor transportiert. Die Proben wurden bis zum DNA-Isolierungsprozess bei -20°C gelagert.

Herstellung und Amplifikation von bakterieller DNA:

Der Parodontoscreen-Test (Materialübersicht) wurde verwendet, um T. denticola, T. forsythia und P. gingivalis mittels RT-PCR26 zu identifizieren. Der Test besteht aus: DNA-Präparation; Echtzeit-PCR-Amplifikation mit spezifischen Reagenzien (eine Mischung für universelle bakterielle Amplifikation, eine Mischung für opportunistische bakterielle Amplifikation und eine Mischung für humane genomische DNA-Amplifikation); sowie die Aufzeichnung und Interpretation von Verstärkungsergebnissen.

Die DNA-Extraktion erfolgte mit einem DNA-Extraktionskit (Materialtabelle) und folgte den Richtlinien des Herstellers, um eine optimale DNA-Qualität zu gewährleisten. Der Test verwendet eine Echtzeit-PCR-Qualitativanalyse mit einer paraffinversiegelten PCR-Mischung. Diese Mischung umfasst eine interne Kontrolle zur Überprüfung der Validität des PCR-Tests sowie eine Sample Intake Control (SIC) zur Bewertung der Extraktionsqualität und zur Bestätigung ausreichender DNA für eine genaue Amplifikation.

Die PCR-Amplifikation erfolgte mit speziellen Streifen und Kappen, mit Reagenzien wie Taq-Polymerase-Lösung, Mastermischung unter Paraffinschicht, DNA-Probe und Mineralöl. Das PCR-Programm ist wie folgt: (i) Anfängliche Denaturierung bei 80 °C für 30 Sekunden, (ii) Denaturierung bei 94 °C für 1 Minute 30 S, (iii) 5 Zyklen mit 30 Sekunden bei 94 °C (Denaturierung), 15 Zyklen bei 64 °C (Primerbindung und Verlängerung, Nachweis von Fluoreszenz), (iv) 45 Zyklen mit 10 Sekunden bei 94 °C (Denaturierung), 15 s bei 64 °C (Primerbindung und Verlängerung, Nachweis von Fluoreszenz), (v) 5 s bei 94 °C (endgültige Denaturierung).

Die Fluoreszenzdetektion erfolgte auf den Fang- und Hex-Detektionskanälen, mit Ausnahme von Röhre Nr5, die den Marker enthielt (wo die Fluoreszenz auf den Flam- und Rox-Kanälen festgestellt wurde). Der Verstärkungsprozess wurde mit Echtzeit-Wärmezyklen durchgeführt (Materialtabelle). Die Software RealTime für das Instrument (Version 7.9) wurde für die automatische Registrierung, Interpretation und quantitative Analyse der PCR-Amplifikationsdaten verwendet, was eine präzise Schätzung der Pathogenlasten ermöglichte.

Mikrobielle Ladungen wurden als "Lg (Genomäquivalente/Probe)" dargestellt. Die Ergebnisse wurden im Parodontoscreen-Testbericht für jeden Patienten in drei Bereichen präsentiert, basierend auf den Bakterienbelastungsniveaus: P. gingivalis (normal <5,0; moderat ≥5,0; schwer >6,0); T. forsythia (normal <5,0; mäßig ≥5,0; schwer >5,5); und T. denticola (normal <3,5; moderat ≥3,5; schwer >5,0).

Klinische Untersuchung

Die klinische Untersuchung umfasste eine detaillierte Untersuchung des parodontalen Zustands der Widerlager- und Nicht-Widerstandszähne bei T0 und T3. Der Plaqueindex (PI) wurde mit einer Zahnsonde nach den Silness-Loe-Kriterien (0-3)27 bewertet. Der Zahnfleischzustand wurde an sechs Stellen der Zahnoberfläche mittels Gingivalindex (GI) nach folgenden Kriterien bewertet: 0, keine Entzündung; 1, leichte Entzündung; 2. Entzündung mit Zahnfleischblutungen während des Sonden; 3, schwere Entzündung mit möglicher spontaner Zahnfleischblutung28.

Die Sondtiefe (PD) wurde mit der Williams-Sonde vom Zahnfleischrand bis zum Ende der klinischen Taschentiefe29 gemessen. Die Zahnbeweglichkeit (TM) wurde durch bimanuelle Palpation in horizontaler und vertikaler Richtung gemäß Millers Kriterien30 bestimmt.

Alle Studienteilnehmer erhielten vor der klinischen Untersuchung eine angemessene nicht-chirurgische Parodontalbehandlung, einschließlich der Entfernung von Zahnbelag und Zahnstein mittels Ultraschallkalk. Die Probanden wurden außerdem in Mundhygiene-Verfahren wie Zähneputzen und Reinigung von Prothesen unterrichtet sowie erhielten Ratschläge zum Entfernen der Prothese nachts.

Statistische Analyse

Die Daten wurden mit Microsoft Excel und IBM SPSS Statistics for Windows ausgewertet. Deskriptive Statistiken (Mittelwert, Standardabweichung und Bereich) wurden für Alter, mikrobielle Lasten und parodontale Indizes berechnet, einschließlich PI, GI, PD und TM. Veränderungen der klinischen und mikrobiologischen Parameter zwischen vor (T0) und 3 Monaten nach der Einführung (T3) wurden mit dem Wilcoxon-Signed-Rank-Test für gepaarte nichtparametrische Daten bewertet. Der exakte Fisher-Test (Monte-Carlo-Simulation, zweiseitig) wurde verwendet, um kategoriale Daten zur Klassifikation der mikrobiellen Last auszuwerten. Spearmans Rangkorrelationskoeffizient (ρ) wurde verwendet, um Zusammenhänge zwischen mikrobiellen Lasten und parodontalen Parametern zu bewerten. Ein p-Wert < 0,05 wurde für alle Analysen als statistisch signifikant angesehen.

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Ergebnisse

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Teilnehmerdemografie

Tabelle 1 zeigt die Verteilung der demografischen Parameter. Von den 30 Teilnehmern waren 16 männlich (53,3 %) und 14 weiblich (46,7 %). Das Durchschnittsalter der Teilnehmer betrug 64,6 Jahre, mit einer Spanne von 48 bis 76 Jahren. Weitere Details zur sozialen Demografie finden sich in Tabelle 1.

Klinische Untersuchung

Tabelle 2 zeig...

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Diskussion

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Die Aufrechterhaltung einer optimalen Mundhygiene wird mit zunehmendem Alter zunehmend herausfordernd, da die Immunreaktion verringert ist und die mechanischen Einschränkungen durch Prothesen wie verschlossene RPDs mit Sitz verbunden sind. Diese Bedingungen begünstigen die Ansammlung pathogener Biofilme, insbesondere um Widerlagerzähne, die als kritische tragende Strukturen dienen, aber auch anfällig für parodontalen Verfall sind. Diese Studie sollte diese Bedenken angehen, indem sie die...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1,5-mL Mikrozentrifugenröhren mit SicherheitsverriegelungBiotekMT1,5/100
ZahnpinzettenBader17/4021-1
DTprime Echtzeit-WärmecyclerDNA-TechnologieEchtzeit-Thermalzykler
IBM SPSS IBM CorpVersion 21.0 
Microsoft Excel Microsoft Office 2010
Papierspitzen (Nr. 35; 04 verjüngt)DiaDentMP210-602
ParodontoScreen REAL-TIME PCR Detection KitDNA-TechnologieR1-P808-S3/5EU
Parodontale SondeMEDESY548/9PT
PREP-GS PLUSDNA-TechnologieP-003/2EUDNA-Extraktionskit 
Echtzeit-SoftwareDNA-TechnologieVersion 7.9
Natriumchlorid 0,9 %VIOSER

Referenzen

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