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Lumbale intrathekale Injektion von SOD1-ASOs zur präzisen Zielerfassung des ZNS und prädiktiver Wirksamkeit bei menschlichen SOD1-G93A-ALS-Mäusen

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DOI:

10.3791/69788

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24. Februar 2026

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1Biogen

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieser Artikel beschreibt intrathekale Verabreichungsmethoden für ZNS-gezielte Therapeutika bei erwachsenen Mäusen, mit Fokus auf Protokollpräzision und der Ermöglichung wiederholter Injektion. Sie enthält Ergebnisse einer Validierungsstudie, in der Antisense-Oligonukleotide die mutierte SOD1-Expression in SOD1-ALS-Modellmäusen reduzierten, was den Nutzen dieses Ansatzes in der präklinischen Forschung zu neurodegenerativen Erkrankungen unterstützt.

Zusammenfassung

Die intrathekale (IT) Verabreichung gezielter Therapeutika für das zentrale Nervensystem (ZNS) bietet einen minimalinvasiven Weg zur direkten Arzneimittelabgabe in die Gehirnspinalflüssigkeit (CSF), was eine erhöhte Spezifität und Zielbindung ermöglicht. Während die IT-Katheterisation bei Ratten Standard für eine dauerhafte Verabreichung ist, ist ihre Anwendung bei Mäusen durch anatomische Einschränkungen und ein erhöhtes Risiko für verfahrensbedingte Komplikationen, einschließlich Rückenmarksverletzungen und Infektionen, eingeschränkt. Um diese Einschränkungen zu überwinden, verwendeten wir eine akute Nadelstichtechnik für die IT-Medikamentenabgabe bei erwachsenen Mäusen, die eine reproduzierbare und weniger invasive Alternative bot, die mit Einzeldosierungen oder wiederholten Dosierungen kompatibel ist. In einem transgenen Mausmodell der amyotrophen Lateralsklerose (ALS) mit der SOD1-G93A-Mutation erreichten wir eine effiziente IT-Abgabe von Antisense-Oligonukleotide (ASOs), die auf das SOD1-Gen abzielen. Dieser Ansatz reduzierte effektiv die Expression von mutiertem SOD1 und verbesserte den Krankheitsphänotyp erheblich, wie durch elektrophysiologische und Biomarker-Bewertungen nachgewiesen wurde. Diese Ergebnisse bestätigen sowohl die IT-Verabreichungsmethode als auch die therapeutische Wirksamkeit, mit Ergebnissen, die mit der intrakrärebroventrikulären (ICV) Verabreichung vergleichbar sind. Am wichtigsten ist, dass die Technik die Verfahren aus klinischen Studien am Menschen widerspiegelt und eine starke translationale Relevanz und Nützlichkeit in der präklinischen Bewertung von zenn-gesteuerten Interventionen bietet. Obwohl technische Expertise erforderlich ist, um Konsistenz sicherzustellen und Off-Target-Effekte zu vermeiden, stellt diese IT-Bereitstellungsstrategie eine robuste, reproduzierbare und klinisch relevante Methodik zur Förderung der therapeutischen Entwicklung in Kleintiermodellen dar.

Einleitung

In dieser Studie beschreiben wir ein lumbales intrathekales (IT) Injektionsprotokoll, vergleichen es mit der intrakrärebroventrikulären (ICV) Gabe und bewerten pharmakodynamische Ergebnisse und Verträglichkeit, um die Entwicklung von zentralnervensystemorientierten (ZNS) gezielten Therapien zu steuern. RNA-zielgerichtete Therapien, insbesondere Antisense-Oligonukleotide (ASOs), stellen eine vielversprechende Methode für ZNS-Erkrankungen dar, da sie eine posttranskriptionelle Modulation der Genexpression ermöglichen. Diese Ansätze sind besonders relevant für neurodegenerative Erkrankungen, bei denen fortschreitender neuronaler Verlust die Notwendigkeit präziser, lokaler und zeitnaher Interventionen unterstreicht, um den Krankheitsverlauf potenziell zu beeinflussen. Hier vergleichen wir direkt die Wirksamkeit des IT-Injektionsprotokolls mit der ICV-Verabreichung bei ASO-Therapeutika.

In präklinischen Studien wurden lumbale intrathekale Injektionen bei erwachsenen Mäusen (männlich oder weiblich, 30–70 Tage alt, 13–20 g Gewicht) eingesetzt, um pharmakologische Wirkstoffe oder biologische Vektoren direkt in die Liquorflüssigkeit (CSF) für das ZNS-Ziel 1,2 zu verabreichen. Injektionsvolumina von 5–10 μL werden typischerweise langsam verabreicht, um vorübergehende Liquordruckanstiege und Reflux zu begrenzen, wobei der intrathekale Zugang über den L5-L6-Zwischenwirbelraum 1,2 erreicht wird. Der prozedurale Erfolg hängt von einer sorgfältigen Technik ab, um neurologische Verletzungen zu vermeiden, wobei Alter und Körpergewicht das Volumen und die Handhabung des Liquors beeinflussen. Der Einsatz feiner Nadeln (z. B. eine 27-30 G-Nadel, gekoppelt mit einer 25 μL Hamilton-Spritze) ermöglicht eine zuverlässige Abgabe2. Wesentliche technische Herausforderungen sind die Minimierung von Totraumverlusten, die Verhinderung von Fehlinjektionen und Leckagen der Epiduralanästhesie sowie die Verringerung der operatorabhängigen Variabilität, die die Dosierungsgenauigkeit und die Verteilung der Liquorstoffe beeinträchtigen können.

Die Entwicklung wirksamer Therapien für ZNS-Störungen bleibt aufgrund der strukturellen Komplexität und zellulären Heterogenität des ZNS eine große Herausforderung. Diese Merkmale behindern die gezielte Arzneimittelabgabe und schränken die Bioverteilung über mehrere anatomische und physiologische Barrieren hinweg ein, was spezialisierte Verabreichungsstrategien erforderlich macht. Ein zentrales Hindernis entstehen durch physiologische und anatomische Barrieren im gesamten ZNS, die die Medikamentenpenetration einschränken. Gehirn und Rückenmark sind von drei meningealen Schichten umgeben: der Dura Mater, der Arachnoideal-Schicht und der Pia Mater, die zusammen mit der Blut-Hirn-Schranke (BBB) eine starke Abwehr gegen zirkulierende Therapeutika und andere Moleküle im Blut bieten. Obwohl diese Barrieren für die Aufrechterhaltung der ZNS-Stabilität unerlässlich sind, behindern sie erheblich die Abgabe großer, hydrophiler Moleküle wie ASOs, monoklonale Antikörper und virale Vektoren 1,2,3,4. IT-Management bietet eine Möglichkeit, diese Einschränkungen zu umgehen, indem Therapeutika direkt in den Liquor im Subarachnoidalraum eingeführt werden. Dieser Verabreichungsweg erleichtert die Arzneimittelverteilung über ZNS-Kompartimente, fördert eine breitere Gewebepenetration und ermöglicht so eine effektive Interaktion mit Zielen, die in verschiedenen Zelltypen innerhalb des ZNS exprimiert werden. Seit der ersten Verwendung durch Hylden und Wilcox im Jahr 1980 zur Morphinabgabe bei Mäusen1 sind IT-Injektionen zu einer weiter verbreiteten Methode zur Verabreichung verschiedener Therapeutika geworden, darunter kleine Moleküle, Biologika, Gentherapievektoren und ASOs 5,6,7,8,9,10.

ASOs sind chemisch manipulierte, einzelsträngige Oligonukleotiden, die darauf ausgelegt sind, komplementäre RNA-Sequenzen zu binden und die Genexpression durch Mechanismen wie RNase-H-vermittelter Abbau, Spleißmodulation und sterische Hemmung der Translation 11,12,13,14,15 zu modulieren. Chemische Verbesserungen wie Phosphorothioat-Rückgratmodifikationen, 2'-O-Methoxyethyl (2'-MOE)-Substitutionen und eingeschränkte Ethylreste erhöhen ihre Stabilität, Bindungsaffinität und Resistenz gegenüber Nukleasen6. Diese Eigenschaften haben ihre Anwendung zur Zielerfassung pathogener Gene unterstützt, die mit neurogenetischen Erkrankungen in Verbindung gebracht werden. ASO-basierte Behandlungen, die intrathekal verabreicht werden, haben klinischen Nutzen bei Erkrankungen wie spinaler Muskelatrophie (SMA) und amyotropher Lateralsklerose (ALS) gezeigt12,13,14,15. Zum Beispiel verbessert Nusinersen (Spinraza) die Exon-7-Einschlüsse in SMN2-Transkripten, um den SMN1-Verlust in SMA 7,14 auszugleichen. Ähnliche Strategien zur Zielsetzung mutierter Huntingtin-Transkripte wurden auch in Huntington-Krankheit 12,13 untersucht. Obwohl diese Studien Anfang16 eingestellt wurden, unterstreichen sie das anhaltende Interesse an CNS-gesteuerten ASO-Ansätzen.

ALS ist eine tödliche neurodegenerative Erkrankung, die durch eine fortschreitende Degeneration sowohl der oberen als auch der unteren motorischen Neuronen gekennzeichnet ist. Die Krankheit, die weltweit zwischen 6 und 9 Personen pro 100.000 betrifft und mit einer Rate von etwa 2 Fällen pro 100.000 Personenjahre auftritt, zeigt eine allmählich verschlechternde Muskelschwäche und Spastizität, wobei die meisten Patienten innerhalb von 2 bis 3 Jahren nach Beginn derSymptome 17 an neuromuskulärem Atemversagen erliegen. Während die meisten Fälle sporadisch (sALS) sind, sind etwa 10 % familiär (fALS), was Einblicke in genetische Ursachen der Krankheit bietet. Eines der am häufigsten untersuchten Gene ist Cu/Zn-Superoxiddismutase 1 (SOD1), die fast 15 bis 20 % des fALS, weniger als 2 % des sALS ausmacht und autosomal dominant18 vererbt wird. SOD1 codiert ein zytoplasmatisches Antioxidansenzym, das reaktive Sauerstoffspezies entgiftet, indem es Superoxidradikale in Wasserstoffperoxid umwandelt. Mutante Formen von SOD1 wie G93A, A4V und H46R zeigen konformationale Instabilität, was zu Proteinaggregation und einem toxischen Funktionszuwachs führt, der zu oxidativem Stress, mitochondrialer Dysfunktion und Exzitotoxizität beiträgt 19,20,21,22,23,24,25. Darüber hinaus wird die ALS-Pathologie durch nicht-zellautonome Mechanismen mit Mikroglia und Astrozyten verschärft, welche zu einem chronisch entzündlichen Milieu und fortschreitender neuronaler Verletzung beitragen. Die Stilllegung der SOD1-Expression mit ASOs bietet daher eine vielversprechende therapeutische Möglichkeit zur Minderung der Krankheitspathogenese.

Das transgene Mausmodell SOD1-G93A (Jax Strain #: 004435), das die humane G93A-mutierte Form von SOD1 unter der Kontrolle eines endogenen menschlichen SOD1-Promotors exprimiert, wiederholt genau die klinischen Merkmale von ALS, darunter frühe motorische Defizite, Rückenmarksneurodegeneration und verkürzteÜberlebensrate 30. Frühere präklinische Studien haben gezeigt, dass die Verabreichung von SOD1-spezifischen ASOs durch anhaltende intraventrikuläre Verabreichung mit osmotischen Pumpen bei SOD1-G93A-Ratten am postnatalen Tag 65 mit einer Tagesdosis von 100 μg über 28 aufeinanderfolgende Tage zu einer signifikanten Unterdrückung der SOD1-Spiegel, einer Reduktion neuroinflammatorischer Reaktionen, einem verzögerten Auftreten klinischer Symptome und einer verbesserten motorischen Leistungsfähigkeitführt 31. Darüber hinaus wurde die ASO-vermittelte Knockdown von SOD1 bei Menschen mit SOD1-ALS mit einer Reduktion der Neurofilament-Lichtketten-(NfL)-Spiegel in Verbindung gebracht, einem blutbasierten Biomarker, der auf axonale Schäden32 hinweist. In dieser Untersuchung verabreichten wir SOD1-zielgerichtete ASOs mittels IT-Injektion in SOD1-G93A-Mäusen und bewerteten deren Auswirkungen auf molekulare, elektrophysiologische und Biomarker-Messungen. Quantitative Analyse des Rückenmarkgewebes zeigte signifikante Reduktionen der SOD1-mRNA-Spiegel. Elektrophysiologische Bewertungen der zusammengesetzten Muskelaktionspotenziale (CMAPs) zeigten eine erhaltene neuromuskuläre Funktion. Gleichzeitig sanken die Serum-NfL-Spiegel, was eine Linderung der anhaltenden neuronalen Verletzung widerspiegelt.

Um die räumliche Verteilung und relative Wirksamkeit alternativer ZNS-Verabreichungsmethoden zu bewerten, bezogen wir eine vergleichende Gruppe ein, die eine intrazerebroventrikuläre (ICV) Injektion verwendet, bei der das therapeutische Mittel in die lateralen Ventrikel eingebracht wird, um über den Liquorfluss entlang der ependymalen und perivaskulären Räume verteiltzu werden 33. Durch den Vergleich der IT- und ICV-Administrationswege wollten wir Unterschiede in pharmakodynamischen Ergebnissen und Gewebetargeting abgrenzen und so die Verabreichungsstrategien für ZNS-gesteuerte ASO-Therapien verfeinern. Zusätzlich führten wir zur Bewertung der translationalen Machbarkeit unabhängige Tolerabilitätsstudien durch, bei denen bis zu vier IT-Injektionen pro Tier mit acht Wochen Abstand durchgeführt wurden. In allen getesteten Behandlungsschemas wurden keine offensichtlichen Anzeichen von Stress oder Morbidität beobachtet, was die Verträglichkeit der IT-ASO-Dosierung im Kontext des Überlebens unterstützt. Diese Ergebnisse stimmen mit früheren Berichten überein, die die Verträglichkeit wiederholter intrathekaler Injektionen bei Mäusen34 zeigen.

Die klinische Relevanz der IT-ASO-Abgabe wird zudem durch die jüngsten behördlichen Zulassungen von Tofersen (QALSODY)® für SOD1-assoziiertes ALS35 bestätigt. Klinische Studien zeigten eine robuste Zielanbindung, was sich in Reduktionen des CSF-SOD1-Proteins widerspiegelt, gefolgt von Absenkungen der Neurofilament-Lichtkettenniveaus, einem Biomarker für neuroaxonale Verletzungen. Obwohl der primäre Endpunkt in der ursprünglichen Phase-3-Valor-Studie nicht erreicht wurde, deuteten integrierte Analysen einschließlich der offenen Verlängerung potenzielle Vorteile eines früheren Behandlungsbeginns35 an.

Zusammenfassend zeigen die hier genannten Daten, dass die IT-Bereitstellung von SOD1-zielgerichteten ASOs im SOD1-G93A ALS-Mausmodell eine effektive molekulare Knockdown, Verbesserung der Biomarker und funktionelle Erhaltung mit günstiger Verträglichkeit erreicht. Diese Ergebnisse unterstützen die IT-ASO-Bereitstellung als rationalen und klinisch tragfähigen Ansatz für genetische Erkrankungen des ZNS und bieten einen robusten präklinischen Rahmen für die fortgesetzte translationale Entwicklung.

Protokoll

Alle hier genannten Verfahren wurden genehmigt und gemäß IACUC-zugelassenen Protokollen sowie institutionellen Richtlinien zur chemischen Hygiene und Biosicherheit durchgeführt.
HINWEIS: Führen Sie Studien an C57BL/6J (JAX #000664) und SOD1-G93A transgenen Mäusen (JAX #004435) unter Standardbedingungen durch (12-Stunden-Hell/Dunkel-Zyklus, 22-24 °C, ad libitum Zugang zu Nahrung und Wasser).

1. Anwendung chemisch modifizierter ASOs zur Zielerfassung menschlicher SOD1

  1. Validierte Antisense-Oligonukleotide (ASOs) verwenden, um gezielt die Nukleotide 613-629 innerhalb der 3' untranslierten Region (UTR) des menschlichen SOD1-Gens anzuvisieren (RefSeq: NM_000454.5)36: A*GoToG*T*T*T*A*A*A*T*G*T*ToToA*T*C
  2. Integrieren Sie validierte chemische Modifikationen zur Verbesserung der Stabilität und Wirksamkeit, indem MOE (2'-O-Methoxyethyl) (in regulärer Schrift angegeben), cEt (Constrained Ethyl) (kursiv), DNA (fett), Phosphatbindungen (o) und Phosphorothioatverbindungen (*) verwendet werden, wie zuvor berichtet36. Supplementary File 1 präsentiert die ASO-Chemie mit entsprechender Farbcodierung.
  3. Bereiten Sie eine nicht-zielgerichtete Kontroll-ASO vor, die keine Komplementarität zu menschlichen oder Nagetierengenomen hat, und folgt demselben Modifikationsschema für die Verwendung als Kontrolle: C*CoToAoT*A*G*G*A*C*T*A*T*C*C*C*AoGoGoA*A

2. Vorbereitung und Handhabung von ASO-Lösungen unter sterilen Bedingungen

  1. Rekonstruiert ASO in steriler künstlicher Gehirnspinalflüssigkeit (aCSF; Tabelle 1) auf eine Konzentration von 10 mg/mL unter sterilen Bedingungen mit Ziel eines finalen Injektionsvolumens von 10 μL (100 μg) pro Tier.
  2. Rühren Sie die Lösung vorsichtig mit einer sterilen Pipette an, um die molekulare Integrität zu erhalten, und lassen Sie sie dann 5-10 Sekunden leicht vortexen, um sicherzustellen, dass sie gut vermischt ist.
  3. Filtern Sie die verdünnte Lösung durch einen sterilen 0,2-mm-Spritzenfilter, um Partikel und Schadstoffe zu entfernen.
  4. Die wird aseptisch in sterile Mikrozentrifugenröhren eingelagert und bis zu einer Woche bei 4 °C in einer überwachten, temperaturkontrollierten Einheit gelagert, wobei Gefrier-Tau-Zyklen zur Stabilität vermieden werden.

3. Mausvorbereitung vor der intrathekalen Injektion

  1. Jede Maus mit einer digitalen Waage auf die nächsten 0,1 g wiegen, dann in einen Nasenkegel übertragen und eine Anästhesie mit Isofluran mit einer Konzentration von 2–2,5 % Sauerstoff induzieren; Überwachen Sie kontinuierlich die Tiefe und bestätigen Sie die Operationsebene durch Verlust des Pedalreflexes.
  2. Bereiten Sie ein thermostatisch gesteuertes Heizkissen vor und stellen Sie es auf 37 °C ein, um Mäuse während der Vorbereitung und Erholung zu unterstützen.
  3. Tragen Sie unmittelbar nach der Einleitung der Anästhesie ein augenhohes Gleitmittel auf beide Augen auf, um eine Hornhauuttrocknung zu verhindern. Dann positionieren Sie die Maus in ventraler Rückenordnung auf dem Heizkissen, um Unterkühlung zu verhindern, physiologischen Stress zu minimieren und während des gesamten Eingriffs normale kardiovaskuläre und respiratorische Funktionen zu unterstützen.
  4. Geben Sie Buprenorphin mit verlängerter Injektion (1,3 mg/mL) subkutan bei 3,25 mg/kg mit einer sterilen Spritze mit einer 25-G-Nadel und injizieren Sie vor dem Eingriff 0,05 mL pro 20 g Körpergewicht.
  5. Rasieren Sie den Lendenbereich von der Mitte der Flanke bis zum Beckengürtel, desinfizieren Sie dann den Bereich mit abwechselnden Abstupfern von Isopropylalkohol und Povidon-Jod, wiederholen Sie das dreimal und lassen Sie die Stelle vollständig an der Luft trocknen.

4. Direkte intrathekale Injektion

  1. Nach der Anästhesie und der Vorbereitung der Operationsstelle werden die Maus in einen sauberen Injektionsbereich gebracht und in ventraler Rückenposition auf das Heizkissen gelegt.
  2. Stellen Sie die Maus in eine Position, die die Wirbelsäule durchwölbt, um das Abtasten und die Injektion zu erleichtern.
    1. Setzen Sie einen gebogenen Pfannenwender unter den Bauchbereich vom unteren Thorax- bis oberen Lendenwirbelbereich ein, um eine leichte Wirbelsäulenbeugung zu induzieren und die lumbalen Intervertebralräume zwischen dem fünften und sechsten (L5-L6, bevorzugt) oder vierten und fünften (L4-L5) Laminae zu erweitern.
    2. Schieben Sie die Nadelschrägung zwischen die Laminae, um in die lumbale Zisterne einzutreten und den Subarachnoidalraum zu erreichen, wobei Sie direkten Kontakt mit Knochen vermeiden, um die Injektionssicherheit und Genauigkeit zu verbessern.
  3. Stabilisieren Sie den Beckengürtel, indem Sie den Beckengürtel sanft zwischen Daumen und Zeigefinger einer Hand greifen und mit der anderen Hand die dorsale Mittellinie abtasten, um den Zielzwischenwirbelraum zwischen L4-L5 oder L5-L6 zu lokalisieren.
  4. Richten Sie eine sterile 0,3-ml-Insulinspritze aus, die mit einer 29-G, 1/2-Zoll-Nadel senkrecht zur dorsalen Hautoberfläche oder in einem Winkel von 70–80° versehen ist, wobei die Fase kranial ausgerichtet ist. Schieben Sie die Nadel vor, bis beim Eindringen in die Dura Mater ein leichter Widerstand auftritt, und setzen Sie sich dann in den intrathekalen Raum fort.
  5. Regelmäßig einführen, bis die Spitze in den intrathekalen Raum eintritt, bestätigt durch einen Schwanz-Flick-Reflex, der einen erfolgreichen intrathekalen Eintritt anzeigt.
  6. Wenn erheblicher Widerstand auftritt oder kein Schwanz-Schnipp-Reflex festgestellt wird, ziehen Sie die Nadel zurück, identifizieren Sie die anatomischen Orientierungspunkte erneut und passen die Nadelposition an, bevor Sie die Injektion erneut versuchen. Wenn der erste Versuch im L5-L6-Zwischenwirbelraum durchgeführt wurde, wird der anschließende Versuch im L4-L5-Zwischenwirbelraum durchgeführt.
  7. Injizieren Sie 10 μL der ASO-Lösung langsam (über 10 s), um Druckänderungen zu minimieren und Liquor-Reflux zu vermeiden. Die Nadel kann nach der Injektion weitere 10 Sekunden an Ort und Stelle gehalten werden.
  8. Ziehen Sie die Nadel vorsichtig vertikal und sanft heraus, um Gewebeschäden und Rückfluss zu vermeiden.
  9. Überwachen Sie die Maus während der Erholungsphase kontinuierlich und beobachten Sie Atmung, motorische Funktion, Haltung sowie Anzeichen von Schmerz oder Beschwerden.
  10. Stellen Sie sicher, dass die Maus ihre normale Mobilität und ihr Verhalten wiedererlangt, bevor sie in ihren Heimatkäfig zurückkehrt.
  11. Dokumentieren Sie alle relevanten Verfahrensdetails, einschließlich der Injektionsstelle, der ASO-Dosis, dem Injektionsvolumen sowie etwaigen Verhaltens- oder physiologischen Beobachtungen während und nach dem Eingriff, gemäß den IACUC-Protokollen.

5. Überwachung von Mäusen und Unterstützung der Genesung nach der Injektion

  1. Platzieren Sie jede Maus in ein einzelnes oder gut platziertes Fach innerhalb einer vorgewärmten Erholungskammer, die bei 37 °C gehalten wird.
  2. Halten Sie die Temperatur der Kammer während der Anästhesie-Erstarkung unter Kontrolle, um Unterkühlung zu verhindern.
  3. Überwachen Sie kontinuierlich die Atemfrequenz und das Muster, die Haltung sowie die Reaktionsfähigkeit auf taktile Reize.
  4. Beobachten Sie die Maus, bis sie den Aufrichtreflex wiedererlangt und koordinierte Bewegungen zeigt.
  5. Vermeiden Sie Überfüllung, um eine klare Sicht zu gewährleisten und Störungen zu vermeiden.

6. Festlegung der Kriterien für die Rückkehr in den Hauskäfig

  1. Bestätigen Sie mit koordinierter spontaner Bewegung, dass die Maus stabil ist.
  2. Stellen Sie sicher, dass keine Anzeichen von Belastung auftreten, einschließlich schwerer oder unregelmäßiger Atmung, Lautäußerungen und anhaltender Nichtreaktion.
  3. Bieten Sie weiche Nährstoffunterstützung an, wie zum Beispiel ein ernährungsphysiologisch vollständiges Gel-Diätsupplement, um die Flüssigkeitszufuhr und die Kalorienzufuhr mit minimalem Aufwand aufrechtzuerhalten.

7. Durchführung von Beobachtungen nach der Genesung von Mäusen

  1. Überprüfen Sie normales Verhalten wie Erkundung, Pflege und soziale Interaktion, wenn die Mäuse in Gruppen untergebracht sind.
  2. Überwachen Sie kontinuierlich das Auftreten von Anzeichen einer abnormalen Genesung, wie ungewöhnliche Haltung, Schwäche oder Lähmung, unregelmäßige Atmung oder verminderte Reaktionsfähigkeit, und überprüfen Sie umgehend, wenn diese Symptome auftreten.
  3. Suchen Sie tierärztliche Hilfe, wenn die Genesung verzögert oder beeinträchtigt ist.

8. Intrazerebroventrikuläre Injektion im Seitenventrikel mittels stereotaxischer Chirurgie und postoperativer Versorgung

HINWEIS: Integrieren Sie eine vergleichende Armgruppe, die eine intrazerebroventrikuläre (ICV)-Injektion verwendet, um die räumliche Verteilung und relative Wirksamkeit zu bewerten, wobei ASOs in die lateralen Ventrikel zur Liquor-vermittelten Dissemination und zum Vergleich mit der intrathekalen Übertragung abgegeben. Führen Sie die ICV-Injektionen nach gut etablierten, standardisierten Protokollen für Mäuse37 durch.

  1. Betäuben Sie die Maus mit Isofluran in einer Konzentration von 2–2,5 % Sauerstoff zur Immobilie, positionieren Sie die Maus in ventraler Rückenposition auf dem Heizkissen und verabreichen Sie anschließend buprenorphin mit verlängerter Freisetzung (1,3 mg/mL Buprenorphinhydrochlorid) subkutan bei 3,25 mg/kg mit einer sterilen 1-mL-Spritze mit einer 25-G-Nadel bei 0,05 mL pro 20 g Körpergewicht vor dem Eingriff. Rasieren Sie die Kopfhaut der Maus mit dem Haarschneider.
  2. Führen Sie alle chirurgischen Eingriffe unter Narkose durch. Halten Sie während der gesamten ICV-Operation ein steriles aseptisches Feld aufrecht. Verwenden Sie nur sterile Instrumente und führen Sie sie vorsichtig, um Kontakt mit nicht-sterilen Oberflächen zu vermeiden.
  3. Sichern Sie die Maus in einem stereotaxischen Rahmen mit einer digitalen Displaykonsole in der Standard-Bauchlage. Setzen Sie die Vorderzähne in die Zahnstange des Mausadapters, um den Kopf zu immobilisieren, und sichern Sie den Adapter dann mit den Atmungs- und Abluftschläuchen, die Isofluran liefern. Stecken Sie die Ohrstangen in die Ohren und ziehen Sie die Schrauben fest, um den Kopf fest zu stabilisieren.
  4. Desinfizieren Sie den Bereich mit abwechselnden Abstrichen von Isopropylalkohol und Povidon-Jod, wiederholen Sie dreimal und machen Sie mit einem sterilen Skalpell einen Mittellinienschnitt, um den Schädel freizulegen. Verwenden Sie eine sterile Baumwollspitze, um weiches Gewebe zu entfernen und sicherzustellen, dass das Bregma deutlich sichtbar ist.
  5. Markiere das Bregma auf dem Schädel. Positioniere die ASO-haltige Spritze mit der Nadel (26-G, 26s/2"/2, Spitzenform) direkt über dem Bregma. Richte die Nadel auf die Zielkoordinaten aus: AP -0,3 mm, ML ±1,0 mm, DV -3 mm von der Schädeloberfläche. Markiere den Schädel an den AP- und ML-Koordinaten.
  6. Erzeugen Sie an den markierten Koordinaten ein Bohrloch und verwenden Sie dann einen stereotaktischen Rahmen, um die Spritzennadel auf eine Tiefe von -3 mm von der Schädeloberfläche abzusenken. Injizieren Sie die Lösung mit einer Geschwindigkeit von 10 μL/min, bis ein Gesamtvolumen von 10 μL abgegeben wurde. Nach Abschluss der Injektion halten Sie die Nadel 4 Minuten lang fest und ziehen Sie sie dann langsam zurück, um den Reflux zu minimieren.
  7. Nähen Sie den Kopfhautschnitt, legen Sie die Maus in eine vorgewärmte 37 °C-Erholungskammer, bis sie vollständig wach ist, und bringen Sie sie nach Bestätigung der Stabilität zurück in den Stammkäfig. Geben Sie ein ernährungsphysiologisch vollständiges Gel-Nahrungsergänzungsmittel bereit und überwachen Sie kontinuierlich Anzeichen einer abnormalen Genesung, wie ungewöhnliche Haltung, Schwäche oder Lähmung, unregelmäßige Atmung oder verminderte Reaktionsfähigkeit; Beurteilen Sie umgehend nach, falls eines dieser Symptome auftritt.

9. Elektrophysiologische Bewertungen der zusammengesetzten Muskelaktionspotenziale (CMAP)

  1. Stellen Sie sicher, dass die Experimentatoren sowohl auf den Genotyp als auch auf die Behandlungsgruppe jeder Maus geblendet sind, um Verzerrungen bei der Datenerhebung und -analyse zu eliminieren.
  2. Betäuben Sie die Maus mit Isofluran für Unbeweglichkeit und Komfort und halten Sie die Körpertemperatur bei 37 °C.
  3. Überprüfen Sie eine ausreichende Anästhesie, indem Sie den Verlust des Pedalreflexes sicherstellen.
  4. Verwenden Sie Einweg-Elektroden mit 28-G-Monopolar-Nadeln sowohl zur Stimulation als auch zur Aufzeichnung. Führe die Aufzeichnungselektrode 1 mm in den vorderen Musculus tibialis ein.
  5. Stimulieren Sie den Ischiasnerv in der Nähe der Ischiasnotch mit 0,1 ms monophasischen quadratwelligen Pulsen, die alle 2 Sekunden abgegeben werden, beginnend bei 1,0 mA und in 0,5 mA-Schritten zunehmend, bis eine supramaximale Antwort (typischerweise 1,5–3,5 mA) erreicht wird.
  6. Sobald der supramaximale Schwellenwert bestimmt ist, werden CMAP-Antworten 0,5 mA über diesem Niveau aufgezeichnet. Messen Sie die CMAP-Amplitude (Peak-to-Peak) 0,8 ms nach dem Reiz, um die Latenz auszuschließen, und mitten Sie die Amplituden von linken und rechten Beinen für jede Maus.

10. Messung der serum-pNFH-Werte

  1. Nehmen Sie 100 μL Vollblut durch eine Gesichtsvenenpunktion mit Kapillarblut-Sammelröhrchen mit Gerinnungsaktivator und Serumtrenngel zu festgelegten Zeitpunkten ab.
  2. Zentrifugiere Blutproben bei 2000 g für 10 Minuten bei 4 °C, um das Serum zu isolieren.
  3. Quantifizierung der serumphosphorylierten neurofilamenten schweren Kettenwerte (pNFH) mit validierten Immunoassay-Reagenzien zur Messung von pNFH in biologischen Proben auf einem vollautomatischen, kartuschenbasierten mikrofluidischen Immunoassay-Analysator.

11. RNA isolieren und RT-qPCR durchführen

  1. Zerkleinern Sie das Gewebe des halshemmenden und thorakalen Rückenmarks der Maus mit einer 6-mm-Stahlperle in einer kryogenen, programmierbaren, hochenergetischen oszillatorischen Perlenmühle zur Probenzerkleinerung mit 1.000–1.200 Schlägen/Minute für 30–40 Sekunden.
  2. Homogenisierung des pulverisierten Gewebes (15 mg) mit 2,8 mm keramischen Perlen in 700 μL phenol-guanidiniumthiocyanatbasierter Lyse und RNA-Extraktionsreagenz mit einem programmierbaren, hochgeschwindigkeitsbasierten mechanischen Homogenisator mit 5,62 m/s für zwei 30-Sekunden-Zyklen.
  3. Entfernen Sie die gesamte RNA mittel, einschließlich der On-Column DNase-Behandlung, gemäß den Anweisungen des Herstellers.
  4. Synthetisieren von cDNA mit einem hochleistungsfähigen Reverse-Transkriptionsreagenzsystem für die cDNA-Synthese.
  5. Für die qPCR-Detektion entwerfen Sie individuelle Primer-/Sondensets, die das Gen von Interesse bestimmen, das auf das Exon 4 des menschlichen SOD1-Gens abzielt:
    vorderer Zündhütte (5′-TGGTGTGGCCGATGTGTCTA-3′),
    Rückwärtszündung (5′-ATGATGCAATGGTCTCCTGAGA-3′)
    Sonde (5′-6FAM-TGAAGATTCTGTGATCTCA-MGB/NFQ-3′)
  6. Verwenden Sie Maus-GAPDH (TaqMan Assay ID: Mm99999915_g1) als Haushaltsgen.
  7. Durchführung von qPCR auf einem hochdurchsatzfähigen Echtzeit-Quantitativen PCR-(qPCR)-Instrument mit 20 ng cDNA pro Reaktion, einem schnell zyklierenden probenbasierten qPCR-Mastermix, genspezifischen Primern und fluoreszierend markierten Hydrolyseproben zur Detektion von Housekeeping- (VIC/MGB)- und Zieltranskripten (FAM/MGB).

12. Statistische Analyse der Daten

  1. Präsentieren Sie Daten aus In-Life-Messungen (CMAP), Serum-pNFH und Genexpressionsanalyse als Mittelwert ± Standardabweichung (SD).
  2. Bewerten Sie die statistische Signifikanz zwischen Gruppenmittelwerten mit Einweg-ANOVA, gefolgt von Tukeys Mehrfachvergleichstest, wobei p < 0,05 als statistisch signifikant betrachtet wird.
  3. Verwenden Sie geeignete Statistikanalysesoftware, um Diagramme zu erstellen und alle Analysen entsprechend den in der Studie durchgeführten Analysen durchzuführen.

Ergebnisse

Um die Präzision und Effizienz der intrathekalen (IT) Verabreichung bei erwachsenen Mäusen streng zu charakterisieren, führten wir zunächst grundlegende Validierungsexperimente mit Evans Blue Farbstoff (0,5 %) als visuellen Tracer für den Liquorfluss und die Gewebedurchdringung durch. Erwachsene Wildtyp-C57BL/6J-Mäuse (Stamm #000664; Gewicht 25–30g) wurden mit Isofluran (2–2,5 %) in Sauerstoff betäubt, um Bewegungsartefakte zu eliminieren, und der Lendenbereich wurde unter aseptischen Bedingungen vorbereitet. IT-Injektionen wurden durch Lumbalpunktion in den Subarachnoidalraum bei einzelnen aufsteigenden Dosen von 20 μL, 30 μL und 50 μL durchgeführt, um Dosis/Volumen und die Beziehung der Färbungsintensität zu beurteilen. Die korrekte Nadelplatzierung wurde durch das Beobachten eines Schwanz-Schlags oder eines negativen Widerstands während der Injektion bestätigt.

Innerhalb von 5 Minuten nach der Verabreichung des Farbstoffs wurden die Mäuse transkardial mit kalt-phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) perfundiert, um den Restfarbstoff aus dem Gefäß zu entfernen. Die Rückenmarke wurden dann vorsichtig entnommen und unter normaler Beleuchtung vor neutralem Hintergrund fotografiert. Die visuelle Inspektion zeigte eine gleichmäßige und gleichmäßige dorsal-zu-ventrale Verteilung von Evans Blue bei allen Mäusen, die Farbstoff erhielten. Höhere Injektionsmengen korrelierten mit verstärkter Farbstoffsättigung über die rostrocaudale Achse, obwohl selbst die Maus, die mit dem 20-μL-Volumen injiziert wurde, ebenfalls eine robuste Färbung zeigte. Im Gegensatz dazu zeigten Mäuse, die keinen Evans-Blue-Farbstoff erhielten (Kontrollgruppe, die mit steriler Kochsalzlösung injiziert wurde), keine sichtbare Färbung oder Hintergrundfärbung im Rückenmarksgewebe (Abbildung 1). Diese Ergebnisse zeigen, dass IT-Injektionen bei Mäusen eine schnelle, reproduzierbare Abgabe von gelösten Stoffen entlang des Rückenmarks ermöglichen. Einschränkungen dieser Experimente sind das Fehlen einer quantitativen Bewertung der Farbstoffverteilung und das Fehlen einer Farbstoffverteilungsanalyse am 10-μL-Injektionsvolumen, das für die ASO-Verabreichung verwendet wird. Die Quantifizierung erfolgte jedoch in nachfolgenden Ziel-Engagement-Messungen auf Genexpressionsniveau bei humanen SOD1-G93A-Mäusen mittels humaner SOD1-spezifischer Genexpressionsanalyse. Das 10-μL-Injektionsvolumen, das in späteren Experimenten zur ASO-Verabreichung verwendet wurde, wurde ausgewählt, um eine sichere und gut verträgliche Dosierung bei Mäusen zu gewährleisten und soll laut früheren Studieneine ausreichende ZNS-Exposition ermöglichen.

Aufbauend auf dieser anatomischen Validierung evaluierten wir anschließend die funktionelle Relevanz der IT-Bereitstellung mit ASOs, die auf mutierte SOD1 abzielen, eine validierte therapeutische Strategie in SOD1-ALS-Modellen. Hemizygote SOD1-G93A-transgene Mäuse, die das humane mutierte SOD1-Gen tragen, zeigen vorhersehbare Degeneration von Motoneuronen und neuromuskulären Abbau, was sie zu einem etablierten präklinischen Modell macht. Im Alter von 5 Wochen, vor Beginn der symptomatischen Symptome, erhielten Mäuse einen einzelnen IT-Bolus eines SOD1-spezifischen ASO in einer Konzentration von 100 μg in 10 μL. Diese Dosis wurde auf Grundlage früherer Optimierungsstudien mit ICV-Verabreichung bei Mäusen ausgewählt, wie von McCampbell et al. (2018)36 berichtet. Um die Wirksamkeit zwischen IT- und ICV-Verabreichung zu vergleichen, erhielt eine separate Gruppe ICV-Injektionen derselben ASO-Dosis mittels stereotaktischer Verabreichung. Die Kontrolle erhielt über den IT-Weg Inactive ASO (Non-Targeting Control).

Fünf Wochen nach der Behandlung (im Alter von 10 Wochen) unterzogen sich die Mäuse einem CMAP-Test auf das Compound Muscle Action Potential (CMAP) unter leichter Isofluran-Anästhesie. CMAP-Aufnahmen von der Hintergliedmaßenmuskulatur, die durch standardisierte Ischiasnervstimulationsprotokolle hervorgerufen wurden, zeigten eine signifikante Amplitudenerhaltung sowohl in IT- als auch in ICV-behandelten Gruppen im Vergleich zu inaktiven, ASO-behandelten Kontrollen (S. < 0,0001 per Einweg-ANOVA mit Tukeys Post-hoc-Test). Wichtig ist, dass sich die Amplitudenerhaltung zwischen IT- und ICV-Verabreichungsmethoden nicht signifikant unterschied (S. > 0,05), was auf einen vergleichbaren neuromuskulären Schutz hinweist (Abbildung 2A).

Um systemische Biomarker der neuronalen Integrität zu bewerten, wurden die Serumspiegel der phosphorylierten Neurofilament-Schwerkette (pNFH) mittels eines hochsensitiven elektrochemilumineszenztesten Tests gemessen. Blutproben, die zur 5-wöchigen Zeit nach der Injektion entnommen wurden, zeigten eine Reduktion der pNFH-Konzentration von >40 % bei ASO-behandelten Mäusen im Vergleich zu vehikelbehandelten Kontrollen (p < 0,0001), wobei kein signifikanter Unterschied zwischen IT- und ICV-Modalitäten beobachtet wurde (Abbildung 2B). Die einheitliche molekulare Biomarkerantwort bestätigt die elektrophysiologischen Daten und legt nahe, dass die IT-Bereitstellung neurodegenerative Prozesse in diesem ALS-Modell effektiv abmildert.

Um die Zielbindung von SOD1-ASO auf molekularer Ebene zu bewerten, führten wir eine quantitative Reverse Transcription PCR (RT-qPCR) an dissektionierten zervikalen und thorakalen Rückenmarksgeweben durch. Die Gesamt-RNA wurde mittels eines säulenbasierten Protokolls extrahiert, das eine hohe Reinheit (A260/A280>1,8) sicherstellte, gefolgt von cDNA-Synthese mit zufälliger Hexamer-Priming. Die quantitative PCR-Amplifikation, die auf menschliche SOD1-Transkripte abzielte und auf GAPDH normalisiert wurde, zeigte einen durchschnittlichen Knockdown von 60 % nach der IT-Lieferung und 35 % nach der ICV-Abgabe, beide signifikant im Vergleich zu inaktiven ASO-Kontrollen (p < 0,0001 für beide). Der direkte Vergleich der Lieferwege zeigte signifikant eine stärkere Knockdown mit der IT-Lieferung (S. < 0,0001), was auf eine effektivere Zielerfassung im Rückenmark durch direkten Rückenzugang hindeutet (Abbildung 3). Weitere Studien sind erforderlich, um das Zielengagement in anderen ZNS-Regionen zu bewerten.

Zusammen bieten diese umfassenden Daten eine überzeugende Validierung von IT-Injektionen als präzise, reproduzierbare und minimalinvasive Technik zur Verabreichung von ASOs in das zentrale Nervensystem (ZNS) in Mausmodellen. Die IT-Verwaltung zeigte eine therapeutische Wirksamkeit, die mit der ICV-Abgabe über ein breites Spektrum von Ergebnismaßen vergleichbar ist, darunter nachhaltige Erhaltung der neurologischen Funktion (CMAP), Normalisierung krankheitsrelevanter Biomarker (pNFH) und robuste molekulare Knockdown menschlicher SOD1-Transkripte innerhalb der gezielten ZNS-Regionen. Diese Ergebnisse unterstreichen die Vielseitigkeit der IT-Bereitstellung als klinisch übertragbarer Weg für auf das ZNS ausgerichtete ASO-Therapien, die eine Wirksamkeit bieten, die der ICV entspricht, während gleichzeitig die prozedurale Einfachheit und die geringere Invasivität gewahrt werden. Daher sind IT- und ICV-Versorgung gleichermaßen praktikable Ansätze für auf das ZNS zugeschnittene Interventionen, die Flexibilität in präklinischen Umgebungen je nach anatomischer Zugänglichkeit, prozeduraler Machbarkeit und therapeutischem Kontext bieten. Dies positioniert die IT-Bereitstellung als vielversprechende Übersetzungsplattform für zukünftige CNS-gezielte Therapien. Zur Unterstützung translationaler Bemühungen empfehlen wir, weitere präklinische Studien durchzuführen, um die pharmakokinetische Verteilung in der Gehirnspinalflüssigkeit, verschiedenen ZNS-Regionen und der Aufnahme der Zielzellen mit Techniken wie Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung oder Immunfluoreszenz zu untersuchen.

Abbildung 1
Abbildung 1: Visualisierung der Evans-Blau-Farbstoffverteilung nach intrathekaler Injektion bei erwachsenen Mäusen. Evans Blue Dye (0,5 %) wurde durch direkte intrathekale (IT) Injektion bei erwachsenen Mäusen verabreicht, um die Verteilung des Rückenmarks qualitativ zu bewerten. Drei verschiedene Farbstoffvolumen: 20 μL, 30 μL und 50 μL wurden in separaten experimentellen Gruppen (n = 1 Maus pro Volumen-Bedingung) geliefert. Nach der Injektion wurden Rückenmarke entnommen und gespült, um die Farbstoffpenetration anhand der Färbungsintensität entlang des Gewebes zu beurteilen. Bilder des Rückenmarksgewebes zeigen das Ausmaß der Farbstoffverteilung, das mit jedem Injektionsvolumen verbunden ist, und zeigen eine dosisvolumenabhängige Zunahme der Abdeckung und Färbintensität im gesamten Rückenmark. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 2
Abbildung 2: SOD1-zielgerichtete Antisense-Oligonukleotidtherapie stellt die motorische Funktion wieder her und senkt die pathologischen Neurofilamentspiegel bei Mäusen. Erwachsene transgene Mäuse von SOD1-G93A erhielten eine Einzeldosis entweder des aktiven SOD1-zielgerichteten Antisense-Oligonukleotids (SOD1-ASO) über intrathekale (IT) oder intrazerebroventrikuläre (ICV) Injektion im Alter von 5 Wochen oder eine inaktive kontrollierte ASO per IT-Injektion. Die therapeutische Wirkung wurde im Alter von 10 Wochen bewertet, entsprechend 5 Wochen nach der Behandlung. (A) CMAP-Messungen wurden aufgenommen, um die neuromuskuläre Funktion bei behandelten Tieren zu bewerten. SOD1-ASO-behandelte Gruppen (n = 5 - 6 pro Gruppe) zeigten eine Umkehr des CMAP-Rückgangs im Vergleich zur Kontrollgruppe, was auf eine funktionelle Erholung hinweist. (B) Periphere Spiegel der phosphorylierten Neurofilament-Schwerkette (pNFH), einem Biomarker der Neurodegeneration, wurden aus Serum in Woche 10 quantifiziert (n = 5 - 8 pro Gruppe). Die SOD1-ASO-Behandlung führte zu einer signifikanten Senkung der zirkulierenden pNFH-Werte im Vergleich zur Kontrolle, was auf eine Abschwächung der krankheitsassoziierten neuronalen Schäden hindeutet. Alle Daten werden als Mittelwert ± SD präsentiert. Die statistische Signifikanz wurde mittels Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) bestimmt, gefolgt vom Tukey-Mehrfachvergleichstest, wobei p-Werte ≤ 0,0001 robuste Unterschiede zwischen den Behandlungsgruppen anzeigen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 3
Abbildung 3: Die Verabreichung von SOD1-ASO unterdrückt signifikant die humane SOD1-mRNA-Expression im transgenen SOD1-G93A-Mausrückenmark. Zur Bewertung der Zielgenauigkeit des SOD1-zielgerichteten Antisense-Oligonukleotids (SOD1-ASO), das durch intrathekale (IT) oder intratrebroventrikuläre (ICV) Injektion verabreicht wurde, wurde der zervikale/thorakale Abschnitt des Rückenmarksgewebes von SOD1-G93A-transgenen Mäusen, die im Alter von 10 Wochen (5 Wochen nach der Verabreichung) eingeschläfert wurden, auf die humane SOD1-mRNA-Expression mittels der quantitativen Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR) analysiert. Die Transkriptwerte des humanen SOD1 wurden in der inaktiven, ASO-behandelten Gruppe quantifiziert und normalisiert. Die Abbildung zeigt die Falteränderung der humanen SOD1-mRNA (normalisiert auf GAPDH) für jede Behandlungsgruppe (n = 5–7 Mäuse pro Gruppe) und zeigt eine erhebliche Downregulation als Reaktion auf die SOD1-ASO-Verabreichung. Die Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt. Statistische Unterschiede zwischen den Gruppen wurden mittels Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) bestimmt, gefolgt vom Tukey-Mehrfachvergleichstest, wobei p-Werte ≤ 0,0001 robuste Unterschiede zwischen den Behandlungsgruppen anzeigen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

KomponenteFWAdditionsmenge (pro L oder kg)Einheiten
Natriumphosphat-monobasisches Dihydrat0.034g
Natriumphosphat dibasisisch anhydriert1420.111g
Natriumchlorid58.448.766g
Kaliumchlorid74.560.224g
Calciumchlorid-Dihydrat147.020.206g
Magnesiumchloridhexahydrat0.163g
Wasser (Milli-Q)993g
Poloxamer 1880.01g

Tabelle 1: aCSF-Zusammensetzung.

Ergänzende Abbildung 1: Mausposition bei der lumbalen intrathekalen Injektion. Ein gebogener Pfannenwender oder Scoopula, der unter dem Bauchraum platziert wird, beugt die Wirbelsäule und erweitert den Zwischenwirbelraum. Die Injektion zielt auf das L4-L5- oder L5-L6-Niveau ab, mit der richtigen Ausrichtung entlang der medialen Achse der Wirbelsäule, wie gezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Ergänzungsakte 1: ASO-Sequenz und Chemie. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Die hier vorgestellte direkte intrathekale (IT) Injektionstechnik stellt eine minimalinvasive, aber sehr effektive Methode dar, um therapeutische Wirkstoffe in das zentrale Nervensystem (ZNS) einzuführen, insbesondere in kleinen Nagetiermodellen wie Mäusen. Dieses Blindstick-Verfahren ist technisch anspruchsvoll, hat sich aber als sowohl reproduzierbar als auch klinisch relevant erwiesen, wenn es von einem geschulten Injektor durchgeführt wird. Diese Methode nutzt präzise Anatomie und effiziente Techniken, um einen schnellen Zugang zum ZNS ohne Katheterisierung zu ermöglichen – eine wichtige Vereinfachung mit erheblichen Vorteilen für die Erweiterung präklinischer Studien; seine translationale Relevanz wird jedoch von weiteren quantitativen Bewertungen und standardisierter methodischer Validierungprofitieren.

Eine erfolgreiche IT-Injektion hängt von mehreren wichtigen Schritten ab. Eine sorgfältige Tierpräparation ist unerlässlich: Die Anästhesie wird zunächst in einer Kammer eingeleitet und mit einem Nasenkegel gepflegt, gefolgt vom Rasieren des Lendenbereichs und der Verabreichung von Schmerzmitteln zur Gewährung des Tierkomforts. Die richtige Positionierung der Maus wird erreicht, indem ein gebogener Spatel unter den Bauchbauch gelegt wird, wobei die Wirbelsäule gebeugt wird, um den Zwischenwirbelraum zu vergrößern (ergänzende Abbildung 1). Das Ziel der hier beschriebenen intrathekalen Injektion ist es, den Fasen der Nadel innerhalb der lumbalen Zisterne zu positionieren, indem sie zwischen den Laminae auf entsprechender Wirbelfläche vorgeschoben wird. Eine genaue Zielerfassung des Zwischenwirbelraums zwischen den L4- und L5-Laminae oder vorzugsweise der L5- und L6-Laminae ist entscheidend für den Zugang zum Subarachnoidalraum 5,10. Der Subarachnoidalraum, auch intrathekaler Raum genannt, liegt zwischen Arachnoid und Pia Mater39. Da das Rückenmark kürzer ist als der Wirbelkanal, befinden sich die Segmente des Kaudalrückenmarks rostraler im Verhältnis zu ihren entsprechenden Wirbelsäulenniveaus. Um Mehrdeutigkeiten zu vermeiden, werden die Injektionsstellen anhand des Zwischenwirbelraums und nicht nach Rückenmarksniveau bestimmt. Bemerkenswert ist, dass eine erhebliche Variabilität bei der Segmentierung des lumbalen Wirbels bei Mäusen sowohl innerhalb als auch zwischen Stämmen40 besteht. Die Injektion muss entlang der Mittellinie der Wirbelsäule erfolgen, um eine seitliche Abweichung zu vermeiden, die zu einer Parese der Hintergliedmaßen oder in schweren Fällen zu einer Lähmung durch Rückenmarksverletzungen führen kann. Wenn es an der richtigen anatomischen Stelle durchgeführt wird, ist das Risiko einer direkten Rückenmarksverletzung minimal. Es besteht jedoch ein geringes Risiko für Nervenwurzelreizungen oder -schäden, was die Bedeutung einer angemessenen Bedienerschulung und verfahrenstechnischer Kompetenz unterstreicht, um negative Folgen zu minimieren. Der Schwanz-Flick-Reflex dient als hilfreicher Indikator für das erfolgreiche Eindringen der Nadel, indem er es dem Injektor ermöglicht, die Tiefe einzuschätzen und oberflächliche oder übermäßig tiefe Penetration zu vermeiden. Diese Technik erfordert Übung, um sie zu meistern, da eine stetige Kontrolle von Tiefe, Winkel und Einspritzvolumen erforderlich ist, um Rückfluss und Austritt in das umliegende Gewebe zu vermeiden. Obwohl wir empfehlen, das Injektionsvolumen ≤10 μL zu halten, haben wir bis zu 20 μL ohne Nebenwirkungen bewertet. Frühere Studien haben ein intrathekales Injektionsvolumen von 10 μL als optimal für die Medikamentenabgabe38 identifiziert. Obwohl dies 25–30 % des gesamten Liquorvolumens beiMäusen 41,42 entspricht, wurde das maximal tolerierbare intrathekale Injektionsvolumen bei erwachsenen Mäusen mit 30 μL10 angegeben. Injektionsvolumen, die die empfohlenen Grenzen überschreiten, können die Dynamik der Gehirnspinalflüssigkeit (CSF) stören, was zu verändertem Liquordruck und einem erhöhten Risiko für Nebenwirkungen führt. Das gesamte Liquorvolumen bei Mäusen wird auf 35–40 μL geschätzt und dreht sich 12–13 Mal pro Tag41,42, was einer vollständigen Erneuerung etwa alle 1,8 Stundenentspricht. Unter Berücksichtigung der schnellen Liquor-Umlaufzeit und empirischer Beobachtungen sowie früherer Studien, die die sichere Anwendung intrathekaler Injektionsvolumina bis zu 20–30 μL ohne Komplikationen zeigen, wird ein Injektionsvolumen von 10 μL nicht erwarten, dass es Nebenwirkungen von10,44 gibt.

Skalierbarkeit ist ein bedeutender Vorteil dieser Technik. Einmal gemeistert, können ausgebildete Injektoren 10–12 Tiere pro Stunde behandeln und so größere präklinische Studien ermöglichen, ohne die logistischen Belastungen einer Katheterimplantation oder invasivere chirurgische Ansätze. Das Verfahren vermeidet komplexe Instrumentierungen, reduziert den Tierstress und verkürzt die Erholungszeiten im Vergleich zur chronischen Katheterisation, was es für Längsstudien mit wiederholter Dosierung geeignet macht. Um klinische Dosierungsregimes zu simulieren, validierten wir serielle IT-Verabreichungen bei Mäusen und verabreichten bis zu vier Dosen im Abstand von acht Wochen. Diese Injektionen wurden gut vertragen, ohne Anzeichen von Stress, Verhaltensänderungen oder Krankheitssymptomen, was mit früheren Studien übereinstimmt, die keine signifikanten Veränderungen in der Liquordynamik oder der Rückenmarksarchitektur nach mehreren IT-Behandlungen berichteten34,45. Daher bestätigen unsere Studien, dass eine wiederholte IT-Dosierung mit angemessenen Abständen möglich ist, was mit menschlichen Behandlungsparadigmen übereinstimmt, bei denen eine nachhaltige Zielbindung für den therapeutischen Nutzen notwendig ist. Nach unserer Erfahrung wurden diese wiederholten IT-Injektionen erfolgreich in einem breiten Altersbereich von 5 bis 29 Wochen durchgeführt. Obwohl zunehmendes Alter und Körpergewicht die Zugänglichkeit des Rückenmarks durch größeres subkutanes Gewebe leicht beeinflussen können, bleibt eine erfolgreiche Anwendung mit einem erfahrenen Bediener möglich, der mit der Technik vertraut ist und mit dem Gefühl der Nadeleinsetzung vertraut ist. Wir stellen jedoch fest, dass mehrere Faktoren über Injektionsstelle und Bolusvolumen, insbesondere die Injektionsgeschwindigkeit und die physikalischen Eigenschaften der injizierten Lösung, wie die Dichte im Verhältnis zum Liquor, die Verteilung der gelösten Stoffe im ZNS erheblich beeinflussen können. Obwohl diese Parameter in der vorliegenden Studie nicht direkt gemessen oder manipuliert wurden, zeigen neuere Arbeiten von Linninger et al. (2023) anhand eines mechanistischen pharmakokinetischen Modells, dass solche Faktoren die intrathekale Antisense-Oligonukleotid-(ASO)-Biodistribution und das Gewebeziel46 signifikant beeinflussen. Dementsprechend erkennen wir dies als Einschränkung unserer Studie an und heben Injektionsgeschwindigkeit und Lösungseigenschaften als wichtige Variablen für zukünftige Untersuchungen hervor, um die ZNS-Versorgung und die translationale Relevanz zu optimieren. Zusammen unterstreichen diese Ergebnisse die Zuverlässigkeit und Machbarkeit wiederholter IT-Dosierung in mehrfachdosierten präklinischen Paradigmen und unterstützen deren Anwendung für nachhaltige Zielbindung und translationale Modellierung menschlicher Therapietherapien.

Der IT-Ansatz bietet zudem Flexibilität bei therapeutischen Tests. Es beherbergt eine breite Palette von Modalitäten, darunter ASOs, kleine Moleküle, Peptide und virale Vektoren, was eine direkte Bewertung von ZNS-gezielten Interventionen ermöglicht. Die Fähigkeit, präzise, kontrollierte Mengen von Therapeutika in die lumbale Zisterne zu verabreichen, gewährleistet eine effektive Rückenmarks- und eine breitere ZNS-Exposition und begrenzt systemische Überlagerungen. Der Schwanz-Flick-Reflex und andere prozedurale Hinweise ermöglichen eine Echtzeitverifizierung einer erfolgreichen intrathekalen Abgabe, was die Reproduzierbarkeit weiter verbessert und die experimentellen Ausfallratenreduziert 5,6,8,47.

Frühere Studien an SOD1-G93A-Mäusen zeigten, dass die Krankheitspathologie das Rückenmark, insbesondere den lumbalen Bereich, stärker betrifft als im Kortex29,48. Daher ist diese Technik besonders relevant im Zusammenhang mit SOD1-ALS, einer genetischen Form von ALS, die durch Mutationen im Superoxiddismutase-1-(SOD1)-Gen verursacht wird. Diese Mutationen erzeugen fehlgefaltete SOD1-Proteinaggregate, die zu einem toxischen Funktionszuwachs innerhalb der Motoneuronen führen und zu einem fortschreitenden neuromuskulären Rückgang49,50 führen. In dieser Studie setzten wir SOD1-gezielte ASOs ein, um eine erfolgreiche Bindung an Ziel-mRNA und funktionelle Erholung nachzuweisen. Die RT-qPCR-Analyse zeigte eine signifikante Unterdrückung menschlicher SOD1-Transkripte im Rückenmark nach der IT-Verabreichung, während CMAP-Aufnahmen eine Umkehrung der Motoneuronfunktionsstörung zeigten. Darüber hinaus zeigte die Serumanalyse einen Rückgang der phosphorylierten Neurofilament-Schwerkettenspiegel (pNFH), einem Biomarker der Neurodegeneration, was die Wirksamkeit der therapeutischen Strategie verstärkt.

Die klinische Relevanz dieses Modells wird durch die kürzliche FDA-Zulassung von Tofersen (QALSODY)® betont, einem ASO, das entwickelt wurde, um SOD1-mRNA für die Behandlung von SOD1-ALS35 gezielt zu behandeln. Tofersen wird intrathekal bei Menschen mit SOD1-ALS verabreicht und zeigte eine klare pharmakodynamische Aktivität, einschließlich Reduktionen des gesamten CSF-SOD1-Proteinspiegels (indirekter Marker für Zielengagement) und des Plasma-NfL (Marker für axonale Verletzung und Neurodegeneration). In integrierten Analysen der Phase-3-VALOR-Studie und ihrer OLE war der frühere Beginn der Behandlung mit Tofersen mit einer Verringerung des Rückgangs der Maße für klinische Funktion, Stärke und Lebensqualität sowie mit einer Verringerung des Risikos sterbägleicher Ereignisse35 assoziiert. Diese Daten bestätigen den intrathekalen Weg als wirkungsvollen Weg für die auf das ZNS gezielte ASO-Therapie und verleihen präklinischen Studien mit ähnlichen Verabreichungsstrategien ein starkes translationales Gewicht.

Neben ihrem Nutzen bei ALS hat der IT-Weg auch bei spinaler Muskelatrophie (SMA)14,51,52 Erfolg gezeigt, wobei das von IT verabreichte ASO Nusinersen (Spinraza®) die erste zugelassene Therapie 14,51,52 war. IT-Injektionen umgehen die Blut-Hirn-Schranke und ermöglichen eine weitverbreitete ZNS-Biodistribution53, was für Erkrankungen mit diffuser neuronaler Pathologie entscheidend ist. Obwohl die Wiederholung der Dosierung logistische und tolerierbare Herausforderungen darstellt, machen Fortschritte in der Formulierung und Verabreichung die IT-Verwaltung weiterhin tragfähiger für die Langzeitbehandlung.

Die IT-Verwaltung bietet eine größere translationale Relevanz für die klinische Praxis des Menschen als ICV-Injektionen. ICV- und IT-Injektionen bei erwachsenen Mäusen unterscheiden sich hauptsächlich in ihrem Zielort im ZNS sowie in der daraus resultierenden Verteilung und Wirkung der verabreichten Substanz. ICV-Injektionen geben Substanzen direkt in die Rückenmarksflüssigkeit (CSF) innerhalb der lateralen Ventrikel des Gehirns ab und zielen dabei hauptsächlich auf die supraspinalen Stellen ab. Im Gegensatz dazu liefern IT-Injektionen Substanzen in den Liquor innerhalb des subarachnoidalen Raums des Rückenmarks, wobei sie hauptsächlich das Rückenmark angreifen. Während beide Methoden die Blut-Hirn-Schranke umgehen und eine direkte ZNS-Übertragung ermöglichen, kann die IT-Administration zu einer längeren Wirkungsdauerfür einige Verbindungen führen und typischerweise zu einer stärkeren Transduktion im Rückenmark führen, während ICV hohe lokale Konzentrationen in den Hirnregionen neben dem lateralen Ventrikel54 erreichen kann. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass in den spinalen Liquor verabreichten Verbindungen das Gehirn erreichen können, obwohl die Transportgeschwindigkeitsehr langsam ist. Diese Unterschiede spiegeln sich auch in den Verfahrensrisiken wider. ICV-Injektionen bergen ein höheres Kontaminationspotenzial, wenn die Sterilität beeinträchtigt wird, während IT-Injektionen, obwohl nicht risikofrei, weniger gerätebezogene Schwachstellen aufweisen. Nach dem Eingriff können IT-Injektionen vorübergehende Beschwerden oder Reaktionen auf die Hintergliedmaßen hervorrufen, während ICV-Injektionen mit weniger unmittelbarem Unbehagen verbunden sind, obwohl lokale Schädelreizungen weiterhin möglich sind.

Zukünftige Anwendungen dieser Technik gehen über die aktuellen präklinischen Studien hinaus. IT-Bereitstellung kann genutzt werden, um nächste Generation von CNS-gezielten Therapeutika zu evaluieren, einschließlich Gen-Editierungswerkzeugen (z. B. CRISPR/Cas-Systeme), RNA-Interferenzmodalitäten und viralvektorbasierten Gentherapien. Der Ansatz ist anpassungsfähig für Kombinationstherapien, die mehrere ZNS-Signalwege ansprechen, und ermöglicht eine Echtzeitbewertung pharmakodynamischer Interaktionen55,56. Darüber hinaus kann die IT-Verwaltung mit Bildgebungsmodalitäten integriert werden, um die Verteilung und Zielerfassung in vivo zu verfolgen und so translationale Pipelines zu beschleunigen. Die Technik bietet zudem eine Plattform zur Untersuchung von Präzisionsmedizinstrategien in genetisch definierten Mausmodellen neurologischer Erkrankungen und erleichtert so die Entdeckung von Biomarkern, longitudinale funktionelle Bewertungen und Sicherheitsbewertungen vor der klinischen Übersetzung.

Zusammenfassend stellt die direkte Lumbal-IT-Injektionstechnik mit Isofluran-Anästhesie eine minimalinvasive, schnelle und klinisch übertragbare Methode zur Verabreichung von Therapeutika in das zentrale Herznervensystem der Maus dar. Seine erfolgreiche Anwendung in SOD1-ALS-Modellen und die Kompatibilität mit serieller Dosierung bilden eine solide Grundlage für einen breiteren Einsatz in der translationalen neurowissenschaftlichen Forschung. Da das Fachgebiet mit wachsendem Fokus auf ZNS-Genmodulation, RNA-gezielte Therapien und Präzisionsmedizin wächst, bleibt der IT-Weg eine zentrale Wirkstoffabgabestrategie, die präklinische Modelle mit klinischem Erfolg verbindet.

Offenlegungen

SM und S-C L sind aktuelle Mitarbeiter von Biogen, Inc., während TC, DF, YL, JD und MZ ehemalige Mitarbeiter des Unternehmens sind. Die in diesem Artikel behandelten Antisense-Oligonukleotide wurden den Autoren von Ionis Pharmaceuticals zur Verfügung gestellt. Tofersen (QALSODY) ist ein gemeinsam entwickeltes Produkt von Biogen und Ionis Pharmaceuticals.

Danksagungen

Wir möchten Ionis Pharmaceuticals für die Lieferung der im Artikel beschriebenen ASOs danken. Wir sind Ryan Gamble, Steve Garafalo, Adria Martig, Isabel Isaza, Taras Tuczkewycz und David Koske von Biogen dankbar für ihre fachkundigen Beiträge, die das Manuskript durch ihre inhaltlichen Überarbeitungen erheblich verbessert haben.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,3 mL 29 G, 1/2 Zoll Insulinspritze für IT-InjektionSmiths Medical4429-3
0,5 mm Durchmesser steriler BohrerFine Science Tools (FST) oder ein Äquivalent1900705
5-0 Prolene-Monofilament-NahtEthicon 8870H 
AlkoholabstöckerDynarex1203
AlkoholabstöckerDynarex1203
Analgetikum – Buprenorphin VerlängerungsfreisetzungRezeptpflicht
Animal ClipperWahl08787-450A
Angewandtes Biosystems High-Capacity cDNA Reverse Transcription KitFisher Scientific43-688-14
Bead Ruptor 24 HomogenisatorOmni International, Inc.19-070
Blutentnahme und SerumtrennungsröhrchenBeckton Dickinson (BD)365967
Calciumchlorid-DihydratJT Baker1335
Digitale SpritzenpumpeHarvard-Apparat70-4507
Ella Automatisiertes Immunoassay-SystemR& D-Systeme600-100
Augensalbe – PuralubeDecra17033-211-38
Geno/GrinderSPEX SamplePrep2010
Keimer 500 TrockensterilisatorBraintree Scientific oder ein ÄquivalentGER 5287-120V
Hamilton-Spritze mit Nadel (26s/2"/2" (Spitzen-Stil)Hamilton8030026s/2"/2:                                                                                              26 Stollen: 26 Tore;                                                                                                             2" Länge;                                                                                                                             2: Punktstil
Hartgewebehomogenisierungsmischung 2,8 mm Keramik (2 mL verstärkte Röhren) (50/pk)Fisher Scientific50-280-9286Lieferant: Revvity Health Sciences Inc
HeizpolsterK& H-Herstellung1060
ICV-PlattformStoelting502063
Isoflurankammer mit SchädelsystemVetEquip901820
MagnesiumchloridheahydratEMD Chemicals1.05832
Metzenbaum-SchereFine Science Tools (FST) oder ein Äquivalent14016-14
Maus GAPDH TaqMan Assay ID Mm99999915_g1ThermoFisher Scientific4331182
Nadelelektroden für CMAP, 28 GNatus Medical (Marke Teca)#902-DMF25-TP
NutraGel: Vollständige ErnährungBio ServNGB-2
Olsen-Hegar-NadelhalterFine Science Tools (FST) oder ein Äquivalent12502-12
Poloxamer 188Mutchler
KaliumchloridJT Baker3045
Vorverstärker (für CMAP)Weltpräzisionsinstrumente (WPI)SYS-DAM50
ProteinSimple pNFH-KitR& D-SystemeSPCKB-PS-000519
Providon-Jodid-SwabsticksDynarex1201
QIAzol Lysis Reagent Qiagen79306
QuantStudio 12K Flex SystemAngewandte Biosysteme4471087
ScoopulaFisherbrand01-257-567
Signal v6.04Cambridge ElektronikdesignSeriennummer 061144CMAP Software 
Bergungskammer für kleine TiereThermocare tragbare Tierintensivstationen Modell FW-1FW-1 
Kleintier-Stereotaktikrahmen mit digitaler DisplaykonsoleKOPFModell 940 
SOD1 G93A-MäuseDas Jackson-LaborAktien # 004435
NatriumchloridEMD Chemicals1.16224
Natriumphosphat dibasisisch anhydriertSigma Aldrich55136
Natriumphosphat-monobasisches DihydratSigma Aldrich3819
Steriles EinwegskalpellMed Vet International oder gleichwertigMIL4410
Sterile VorhängeDynarex4410
Sterile MullpadsDynarex oder ein ÄquivalentDRX-3354
Sterile KochsalzlösungThermoFisher Scientific14190094
Sterile OP-HandschuheAnsell oder ein gleichwertiges Pendant20277290
Stimulus-Isolator (für CMAP)Weltpräzisionsinstrumente (WPI)SYS-A365D
Stoelting Micro Drill Stoelting58610
Chirurgische gebogene Zange (Graefe-Zange – Titan)Fine Science Tools (FST) oder ein Äquivalent11652-10
Chirurgische Rettzange (Graefe Forceps – Titanium)Fine Science Tools (FST) oder ein Äquivalent11650-10
OperationsbandDynarex oder ein Äquivalent3572
Spritze für subkutane Injektion von SchmerzmittelBD309582
TaqMan Fast Advanced Master MixThermoFisher Scientific4444556
Wasser (Milli-Q)
WaageMettler Toledo                                        Modell XSR2002S23-112795
Wildtyp-C57BL/6J-MäuseDas Jackson-LaborAktie # 000664

Referenzen

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SOD1 Antisense OligonukleotideALS MausmodellApplikation in die Zerebrospinalfl ssigkeitR ckenmarksinjektionintrazerebroventrikul re Injektionelektrophysiologische UntersuchungNeurofilament Biomarkerquantitative PCR
Lumbale intrathekale Injektion von SOD1-ASOs zur präzisen Zielerfassung des ZNS und prädiktiver Wirksamkeit bei menschlichen SOD1-G93A-ALS-Mäusen
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