cholinerge ligandabhängige Modulation der oxidativen Phosphorylierungskopplung in Digitonin-permeabilisierten BE(2)-C-Neuroblastomzellen

Summary

Wir präsentieren ein Protokoll zur selektiven Permeabilisierung der Plasmamembran, wodurch gezielte Abgabe von Substraten und Inhibitoren ermöglicht wird, um die mitochondriale oxidative Phosphorylierung (OXPHOS) in kultivierten Zellen zu bewerten und so die Transportbarrieren der Plasmamembran zu überwinden, die diese Analyse typischerweise behindern. Mit dieser Technik zeigten wir, wie die Funktion von OXPHOS durch muscarinische Agonisten und Antagonisten moduliert wird.

Abstract

Ziel dieser Studie war es, die Funktion der oxidativen Phosphorylierung (OXPHOS) in kultivierten Zellen mit definierten Substrat-Inhibitor-Kombinationen zu bewerten, wobei zelluläre Struktur und zytosolischer Kontext erhalten bleiben, die bei isolierten mitochondrialen Präparaten verloren gingen. Da intakte Zellen für mehrere Krebszyklus-Intermediare schlecht durchlässig sind, ist die direkte Beurteilung der substratunterstützten Atmung durch spezifische Elektronentransportketten-(ETC)-Eintrittspunkte begrenzt. Um dies zu überwinden, führten wir Digitonin-vermittelte selektive Plasmamembranpermeabilisierung durch und führten extrazelluläre Flussanalysator-basierte Kopplungs- und Elektronenflusstests in BE(2)-C-Neuroblastomzellen durch. Zur Bestimmung der Zelltypabhängigkeit wurde Digitonin empirisch in HEK293-Zellen und primären Ratten-Dorsalwurzelganglion-(DRG)-Neuronen unter Verwendung von Succinat + Rotenon getitert, um die vom Komplex II–IV gesteuerte Atmung zu isolieren.

Succinatunterstützte Atmung mit Komplex-I-Hemmung zeigte eine erhöhte Sauerstoffaufnahme (O₂) durch Komplex II–IV in permeabilisierten Zellen im Vergleich zu nicht-permeabilisierten Zellen, was mit einem verbesserten Zugang eines membranimpermeant Substrats zu den Mitochondrien übereinstimmt. Im Gegensatz dazu zeigte die Atmung, die von Substraten unterstützt wird, die über endogene Transportwege (z. B. Pyruvat/Malat) eintreten, kleinere Unterschiede zwischen den Zuständen. Mit dieser Plattform zur Untersuchung muskarinischer Liganden beobachteten wir Agonisten- zu Antagonisten-assoziierte Unterschiede im O₂-Verbrauch im Kopplungsassay, während der Elektronenflussassay unter den getesteten Bedingungen minimale ligandassoziierte Effekte zeigte. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass nachweisbare Ligandeffekte auf der Ebene der kopplungsdefinierten Atemzustände stärker ausgeprägt waren als die maximale Elektronentransferkapazität. Insgesamt erweitert die selektive Permeabilisierung die Substratzugänglichkeit in kultivierten bioenergetischen Assays und ermöglicht die Analyse der pharmakologischen Modulation der mitochondrialen Atmung.

Introduction

Eine Fehlfunktion oder Umprogrammierung des mitochondrialen Energiestoffwechsels ist zentral für ein breites Spektrum von Erkrankungen, darunter Neurodegeneration, Krebs, entzündliche Erkrankungen, kardiometabolische Erkrankungen und verschiedene genetische Erkrankungen. Um die Rolle des mitochondrialen Stoffwechsels bei der Krankheitspathogenese besser zu verstehen, wurden mehrere analytische Strategien entwickelt. Dazu gehören Messungen_der O2-Verbrauchsrate (OCR), der extrazellulären Versauerungsrate (ECAR), ATP-Quantifizierung, Substratnutzung, Profilierung oder Krebszyklus-Metabolitenanalyse sowie Isotopenverfolgung¹. Unter diesen Techniken dient OCR als wichtiger Indikator für die mitochondriale Atmung und kann mit Instrumenten wie der Hochauflösungs-Respirometrie (HRR; z. B. Oroboros O₂k)², einer Clark-Elektrode oder dem extrazellulären Flussanalysator bewertet werden

Das Oroboros O2-k-Systemmisst_die O2-Konzentration in einer verschlossenen Kammer mit einem Clark-Typ polarographischen_O-2-Sensor (POS)^3,4,5 und eignet sich für Proben wie isolierte Mitochondrien, permeabilisierte Zellen und Gewebehomogenate. Sie besteht aus einer Gold-/Platinkathode, einer Silberanode und einem KCl-Elektrolytreservoir, das durch eine 25 μm_O2 permeable und chemisch resistente fluorierte Ethylenpropylenmembran (FEP) von der Probe getrennt ist. Die Clark-Elektrode³ arbeitet ebenfalls in einer geschlossenen Kammer, erkennt Änderungen der_{O2-Konzentration} über eine_{O2-empfindliche} Elektrode und wird häufig für isolierte Mitochondrien oder Zellsuspensionen verwendet. Im Gegensatz dazu quantifiziert der extrazelluläre Flussanalysator OCR und ECAR in lebenden, adhärenten Zellen oder isolierten Mitochondrien mithilfe von in Mikroplatten eingebetteten fluoreszierenden Sensoren, was eine Hochdurchsatz-Stoffwechselprofilierung ermöglicht. Ein praktischer Vorteil der extrazellulären Flussanalysatorplattform ist die automatisierte, multiparametrische Bewertung über mehrere Bedingungen parallel hinweg, während geschlossene Kammersysteme (z. B. HRR- oder Clark-Elektroden) typischerweise einen geringeren Durchsatz bieten und mehr manuelle Handhabung erfordern.

Der extrazelluläre Flussanalysator ist besonders nützlich zur Bewertung der mitochondrialen Funktion intakter adhärenter Zellen oder Suspensionszellen, die sich am Boden der Mikroplatte absetzen. In Assays mit intakten adhärenten Zellen kann der mitochondriale Energiestoffwechsel mit Substraten wie Glukose oder Pyruvat⁶ profiliert werden. Alternativ ermöglichen Assays mit kleinen Mengen angereicherter mitochondrialer Fraktionen sequentielle Messungen der basalen Atmung, ADP-stimulierter Atmung (Zustand 3), Ruheatmung (Zustand 4) und unkopplerstimulierter Atmung unter Verwendung von Kombinationen von Substraten und Inhibitoren⁷. In intakten Zellsystemen können jedoch Trikarboxylsäure-(TCA)-Stoffwechsel, die nicht zelldurchlässig sind, nicht direkt zur Beurteilung ihres Stoffwechsels verwendet werden. Während isolierte Mitochondrien die Nutzung solcher Metabolite aufgrund des Fehlens von Plasmamembranbarrieren ermöglichen. Die Analyse des Ansatzes der isolierten angereicherten mitochondrialen Bioenergetik weist Einschränkungen auf: Die mitochondriale Struktur kann während der Isolation verändert werden, und zytosolische Faktoren, die den mitochondrialen Stoffwechsel und den Transport von Metaboliten beeinflussen, sind reduziert oder fehlen. Dementsprechend werden selektive Permeabilisierungsansätze oft als Kompromiss verwendet, der Aspekte der zellulären Architektur beibehalten und gleichzeitig einen kontrollierten Zugang zu Mitochondrien ermöglicht. Um die Einschränkungen der Verwendung intakter Zellen oder isolierter Mitochondrien für metabolische Tests zu überwinden, beschreibt dieses Protokoll eine Methode zur Permeabilisierung adhärenter Neuroblastomzellen (BE(2)-C) mit Digitonin. Dieser Ansatz erleichtert den Import von ansonsten nicht zell-permemittierten Metaboliten über die Plasmamembran, während funktionelle mitochondriale Antworten auf definierte Substrate und Inhibitoren erhalten bleiben.

Die Selektivität von Digitonin basiert auf Unterschieden in der Lipidzusammensetzung der Membran: Die Plasmamembran ist reich an Cholesterin, während mitochondriale Membranen – insbesondere die innere mitochondriale Membran – sehr wenig Cholesterin⁸ enthalten. Bei niedrigen Konzentrationen permeabilisiert Digitonin (oder Saponin) selektiv und vollständig die Plasmamembran aufgrund ihres hohen Cholesteringehalts, während mitochondriale Membranen nur bei höheren^{Konzentrationen (9,10}) betroffen sind. Digitonin bindet an Cholesterin und bildet Poren in der Plasmamembran, wodurch kleine Moleküle wie TCA-Zyklus-Intermediate in das Zytosol gelangen können, ohne die mitochondriale Struktur oder Funktion zu stören, wenn sie richtig optimiert sind. Dieser Ansatz eignet sich am besten für kultivierte Zellen, die reproduzierbar als adhärente Monoschichten in einer extrazellulären Flussanalysator-Mikroplatte verplatten werden können, und erfordert eine empirische Titration der Digitoninkonzentration für jeden Zelltyp und jede Samendichte. Operative Indikatoren für die erhaltene mitochondriale Integrität umfassen robuste, inhibitorsensitive OCR-Reaktionen (z. B. erwartete Abnahme mit Rotenon/Antimycin A und intakte Complex-IV-gesteuerte Atmung mit Ascorbat/TMPD) sowie das Ausbleiben eines OCR-Kollaps, der auf Überpermeabilisierung hinweisen würde. Daher sollte die Digitonin-Optimierung vor experimentellen Vergleichen durchgeführt und immer wiederholt werden, wenn sich Kulturbedingungen oder Zelldichte ändern. Darüber hinaus variiert die optimale Digitoninkonzentration je nach Zelltyp und muss empirisch bestimmt werden, um ein Permeabilisierungsfenster zu etablieren, das den Eintritt imperenter Substrate (z. B. Succinat) erlaubt, während die inhibitorsensitive mitochondriale Funktion erhalten bleibt. In dieser Studie illustrieren wir dieses Prinzip, indem wir Digitonin nicht nur in BE(2)-C-Zellen, sondern auch in HEK293-Zellen und primären Ratten-Dorsalwurzelganglion-(DRG)-Neuronen optimieren.

Dieses Protokoll wurde mit BE(2)-C-Neuroblastomzellen demonstriert, die ursprünglich aus dem Gehirn eines männlichen Patienten mit Neuroblastom isoliert wurden. BE(2)-C-Zellen exprimieren verschiedene muskarinische Rezeptoren, insbesondere den cholinergen Rezeptor muscarinischen Typ-1 (CHRM1). In unseren früheren Studien haben wir gezeigt, dass CHRM1 sowohl in den Zellkörpern als auch in Neuriten kultivierter Ratten-Dorsalwurzelganglien-Neuronen sowie in CHRM1-transfektierten HEK293-Zellen¹¹ mit Mitochondrien assoziiert ist. Darüber hinaus verändert die genetische Deletion von Chrm1 bei Mäusen mehrere Aspekte der mitochondrialen Struktur und Funktion^12,13. Daher vermuten wir, dass BE(2)-C-Zellen verwendet werden können, um die modulatorischen Effekte muskarinischer Liganden auf die OXPHOS-Funktion zu untersuchen. In dieser Demonstration untersuchten wir die Auswirkungen muskariner Wirkstoffe – darunter den Agonisten Acetylcholin, den verzerrten Antagonisten Pirenzepine¹⁴ und den Antagonisten Atropin – auf die mitochondriale Atmung in Anwesenheit von entweder Succinat oder Pyruvat/Malat als Substrate und verglichen deren Auswirkung.

Protocol

1. Auftauen und Anfangsplatten

HINWEIS: Das Basismedium für BE(2)-C-Zellen ist eine 1:1-Mischung aus vom ATCC formuliertem Eagle's Minimum Essential Medium und F12 Medium, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum (FBS).

1. Taue gefrorene BE(2)-C-Zellen aus einem Kryovial in einem 37 °C Wasserbad auf. Nach dem Auftauen zentrifugieren Sie die Zellen mit 200 × g für 5 Minuten, um das Kryoprotektion zu entfernen.
2. Das Zellpellet in einem vollständigen Wachstumsmedium wieder suspendieren und die Zellen in einer 10 cm großen Zellkulturschale plattieren. Inkubieren Sie die Kultur bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO₂ in der Luft, bis die Zellen eine Subkonfluenz erreichen.

2. Subkultivierung

1. Subkulturieren Sie die Zellen für 2–3 Durchgänge, um sicherzustellen, dass sie eine stabile exponentielle Wachstumsphase erreichen.

3. Trypsinisierung und Einzelzell-Suspensionsvorbereitung

1. Wenn die Kultur eine Konfluenz von 60–80 % erreicht, tripsinisieren Sie die Zellen. Führen Sie die Zellsuspension mehrmals durch Feinspitzen-Transferpipetten mit polierten Spitzen, um Klumpen zu dissoziieren und eine Einzelzellsuspension zu erreichen.
2. Fügen Sie frisches Medium mit FBS hinzu, um das Trypsin zu neutralisieren. Zentrifugiere die Zellen bei 200 × g für 5 Minuten, um sie zu pelletieren.

4. Zell-Seeding-Protokoll für 24-Well-Zellkultur-Mikroplatten, die in extrazellulären Flussanalysatoren verwendet werden

1. Setzen Sie das Pellet in einem vollständigen Medium mit einer Endkonzentration von 10.000 Zellen pro 100 μL pro Bohrloch wieder auf.
2. Säen Sie die Zellen mit optimierter Dichte aus, damit sie innerhalb von 1–2 Tagen vollständig konfluenzieren. Lassen Sie entweder die vier Eckbrunnen oder einen einzelnen Eckbrunnen leer, abhängig vom experimentellen Design. Diese Brunnen dienen als Hintergrundkontrollen.
   HINWEIS: Dies kann Ausprobieren erfordern, einschließlich Anpassungen von Medienvolumen und -timing.
3. Überwachen Sie die Kultur auf Veränderungen der Medienfarbe – Gelbfärbung zeigt einen pH-Abfall an und erfordert einen sofortigen Ersatz durch frisches Medium, um die Zellgesundheit zu erhalten.

5. Vorbereitung für den extrazellulären Flussanalysator-Assay

HINWEIS: Die hier verwendeten Kopplungs- und Elektronenfluss-Assay-Formate folgen etablierten mikroplattenbasierten mitochondrialen Atmungsworkflows⁷, mit Modifikationen einschließlich Permeabilisierung von BE(2)-C-Zellen mittels Digitonin-Titration und Behandlung von muscarinischen Liganden.

1. Bereite Serienlösungen und 2x mitochondriale Assay-Lösung (MAS) vor. Bereiten Sie im Voraus 2x MAS-Mischungen und Arbeitsreagenzlösungen (Substrate und Inhibitoren) vor (siehe Tabelle 1, Tabelle 2 und Tabelle 3).
2. Lagern Sie alle Lagerlösungen und MAS bei -20 °C für die spätere Verwendung auf, was eine effiziente Assay-Einrichtung ermöglicht.
   SICHERHEIT: Rotenon, Antimycin A, Oligomycin, FCCP, Digitonin und TMPD sind gefährlich und sollten gemäß institutionellen Sicherheitsrichtlinien behandelt werden. Alle Inhibitor-Lagerlösungen sollten in einer zertifizierten chemischen Abzugshaube vorbereitet und gehandhabt werden, wobei geeignete persönliche Schutzausrüstung (Laborkittel, Nitrilhandschuhe und Augenschutz) getragen wird. Lösungen, die diese Reagenzien enthalten, sowie DMSO-haltige Abfälle, sollten gemäß institutionellen und lokalen Vorschriften als gefährlicher chemischer Abfall gesammelt und entsorgt werden. Arbeitsflächen sollten nach der Nutzung dekontaminiert werden.
3. Hydrierung der Sensorkartusche
   1. In der Nacht vor dem Experiment hydratisieren Sie die extrazelluläre Flussanalysator-Sensorpatrone, indem Sie 1 ml Kalibrierungspuffer oder phosphatgepuffertes Kochsalzmittel (PBS, pH 7,4) zu jedem Bohrloch hinzufügen. Lassen Sie die Sensorpatrone über Nacht (12–18 H) bei Raumtemperatur (20–25 °C) stehen.
      HINWEIS: Eine Inkubation in einem Nicht-CO₂-Inkubator bei 37 °C ist nicht erforderlich, da die Kartusche während des Ladevorgangs auf Raumtemperatur anpasst. Sobald die Kartusche zur Kalibrierung in den extrazellulären Flussanalysator gelegt wurde, erreicht sie innerhalb von etwa 15 Minuten 37 °C.

6. Tag des Experiments

HINWEIS: Alle Lösungen frisch vorbereiten, den pH-Wert bei Bedarf anpassen und bis zum Gebrauch auf Eis legen.

1. Taue gefrorene Substratbrühe und 2x MAS bei Raumtemperatur (20–25 °C) für 15–30 Minuten oder in einem 37 °C Wasserbad 5–10 Minuten auf.
2. Bereiten Sie alle Substrat- und Injektionslösungen vor (siehe Tabelle 4, Tabelle 5, Tabelle 6 und Tabelle 7) und überprüfen Sie, dass der pH-Wert bei 7,4 liegt. Passen Sie bei Bedarf an und lassen Sie die Lösungen bis zur Anwendung auf Eis. Verwenden Sie Tabelle 4 und Tabelle 5 für den Kopplungsassay. Für den Elektronenflusstest verwenden Sie Tabelle 6 und Tabelle 7.
3. Laden Sie die Inhibitoren und Substrate in die entsprechenden Sensorkartuschenports und bereiten Sie den Test vor. Je nach Art des Tests – Kopplungstest oder Elektronenfluss-Assay ⁷ – verweisen Sie je nach Bedarf auf Tabelle 4 und Tabelle 5 bzw. Tabelle 6 bzw . Tabelle 7.
4. Bereiten Sie alle Substrat- und Inhibitor-Arbeitslösungen auf definierte Endvolumina vor (Bulkmischungen: 15 mL; Kartuscheninjektionsmischungen: 2 mL pro Port). Berechnen Sie die Konzentrationen, um die gewünschten Endkonzentrationen im Bohrloch nach der Injektion zu erreichen (Endbohrlochvolumen: 700 μL nach Port D).
5. Fügen Sie 450 μL der vorbereiteten Assay-Lösung zu jedem Bohrloch der 24-Brunnen-Extrazellulär-Flussanalysatorplatte mit muskarinischen Liganden hinzu (Endkonzentration von Liganden: 1 μM; Gesamtvolumen des Brunnens: 500 μL). Stellen Sie sicher, dass jeder Brunnen bereits 50 μL 1x MAS-Puffer und untergetauchte Zellen enthält.
   HINWEIS: Führen Sie diesen Schritt unmittelbar vor dem Einladen der Platte in den Analysator durch.
6. Laden Sie 50 μL jedes vorbereiteten Reagens in den entsprechenden Einspritzanschluss der Sensorpatrone.

7. Instrumentenprogrammierung und Assay-Ausführung

1. Schalten Sie den extrazellulären Flussanalysator mindestens 1–2 Stunden vor dem Experiment ein, damit sich der interne Inkubator bei 37 °C stabilisiert. Halten Sie die Kammer während der gesamten Kalibrierung und des Tests bei 37 °C.
2. Programmieren Sie den Analysator so, dass er gemäß Tabelle 8 die entsprechenden Mischungs-, Warte- und Messzyklen durchführt.
3. Beschrifte Brunnen und experimentelle Gruppen in der Software entsprechend dem experimentellen Design.
4. Starte den Testlauf. Lassen Sie das Instrument die Sensorpatrone kalibrieren (~15 Min).
5. Bereiten Sie die Prüfplatte für das Laden während der Kartuschenkalibrierung vor. Verzögern Sie das Laden bei Bedarf weiter; die Sensorpatrone bleibt im Inneren des Instruments stabil bei 37 °C.
6. Schließen Sie den Test ab, wenn der letzte Messzyklus nach der Port-D-Injektion abgeschlossen ist. Beginnen Sie sofort mit der Post-Assay-Normalisierung und Datenanalyse.

8. Zellplattenvorbereitung für den extrazellulären Flussanalysator-Test

1. Beginnen Sie sofort mit der Vorbereitung der Zellplatte nach dem Einlegen der Sensorkartusche in den Analysator zur Kalibrierung. Fügen Sie 700 μL 1x MAS-Puffer zu jedem Brunnen mit haftenden Zellen hinzu. Inkubieren Sie bei Raumtemperatur (20–25 °C) für 1 Minute.
2. Aspirieren Sie den Puffer vorsichtig, ohne die angeschlossenen Zellen zu stören. Wiederhole den Waschschritt mindestens 3 x 1 Minute, um das Restkulturmedium zu entfernen, und schließe alle Wascharbeiten innerhalb von 10 Minuten ab.
3. Füge 50 μL 1x MAS-Puffer zu einem vorgesehenen Hintergrundbrunnen (ohne Zellen) hinzu, um eine visuelle Volumenreferenz zu etablieren.
4. Aspiratiere Puffer aus experimentellen Bohrungen, wobei in jedem Bohrloch etwa 50 μL Restpuffer übrig bleiben.
5. Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C in einem Wasserbad und halten Sie die Platte über der Wasseroberfläche, um Verdunstung zu verhindern. Halten Sie die Temperatur 10 Minuten (maximal 20 Min) bei 37 °C vor dem Beladen.
6. Unmittelbar vor dem Laden der Platte fügen Sie jedem Bohrloch 450 μL 1x MAS-Puffer mit den passenden Substraten hinzu, um ein Endvolumen von 500 μL zu erreichen.
7. Setzen Sie die Platte in den extrazellulären Flussanalysator ein.

9. Ende des Tests und Datenanalyse

1. Entfernen Sie nach Abschluss des Durchlaufs die Zellplatte und die Sensorpatrone vom Analysator.
2. Normalisiere OCR-Werte pro Bohrloch mithilfe der Gesamtproteinquantifizierung oder der Gesamtzellanzahl. Lyseieren Sie Zellen mit einem RIPA-Puffer und quantifizieren Sie das Gesamtprotein mit dem Bradford-Test oder einem anderen spektrophotometrischen Protein-Assay.
3. Normalisieren Sie OCR-Werte mit der Analysesoftware und exportieren Sie die Daten nach Bedarf.
4. Wenden Sie folgende Akzeptanzkriterien an: Bestätigen Sie die Ausgangsstabilität der OCR (≤15 % Drift über zwei aufeinanderfolgende Messzyklen) und bestätigen Sie ≥60 % OCR-Reduktion nach Rotenon-, Oligomycin- oder Antimycin-A-Injektion.
5. Ausschließen Sie Läufe, die diese Kriterien nicht erfüllen, und optimieren Sie die Permeabilisierkonzentration oder Zellaussaatdichte nach Bedarf neu.

10. Ergebnisse exportieren

1. Stecke einen USB-Stick ins Instrument.
2. Exportiere die Assay-Daten.

11. Datenverarbeitung

1. Analysieren Sie die Daten mit der Instrumentensoftware.
2. Exportieren Sie verarbeitete Daten in Formaten, die mit der Analysesoftware der Wahl kompatibel sind, für weitere Analyse und Visualisierung.

Results

Optimierung der Digitoninkonzentration für BE(2) C-Zell-Permeabilisierung im Kopplungsassay
Zu Beginn dieses Protokolls standardisierten wir die optimale Digitoninkonzentration, die für eine effektive Zellpermeabilisierung erforderlich ist, ohne die mitochondriale Atmung zu beeinträchtigen. In diesem Protokoll testeten wir 5 μM und 10 μM Digitonin als Anfangskonzentrationen und führten einen Kopplungsassay durch. Dieser Test bewertet den Grad der Kopplung zwischen der...

Discussion

Diese Studie stellt ein schnelles und kostengünstiges Protokoll zur Bewertung der muskarinischen Liganden-vermittelten Modulation von OXPHOS in kultivierten Neuroblastomzellen vor. Durch den Einsatz des selektiven Plasmamembran-Permeabilisierers Digitonin in Kombination mit definierten Substrat-Inhibitor-Paaren ermöglichten wir eine gezielte Abgabe von metabolischen Substraten wie Succinat direkt an Mitochondrien in situ. Dieser Ansatz überwindet die Einschränkungen intakter Zel...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetylcholinchlorid	MilliporeSigma	A6625	Muskarinischer Agonist
ADP	MP Biomedicals, Inc	ICN19014901	Elektronenakzeptor, Substrat für die ATP-Synthese.
Antimycin A	AAJ63522MA	Thermowissenschaftlich	Hemmt den mitochondrialen Komplex III
Atropin	MilliporeSigma	1044990	Muskarinischer Antagonist
Be2C-Zellen	Sammlung der amerikanischen Typkultur	CRL-2268	Eine Neuroblastenzelle, die aus dem Gehirn eines männlichen Patienten mit Neuroblastom isoliert wurde, exprimiert den muskarinen Rezeptor
Digitonin	MilliporeSigma	D141	Mildes Waschmittel, Membranpermeabilizer.
D-Mannitol	Thermowissenschaftliche Chemikalien	AA3334236	Ein nicht metabolisierbarer Zuckeralkohol, der zur osmotischen Stabilisierung und zum Schutz der Membran verwendet wird
EGTA	MilliporeSigma	E0396	Calciumchelation, verhindert die Aktivierung von calciumabhängigen Proteasen und anderen Enzymen, die mitochondriale Proteine abbauen könnten.
Fettsäurefreies BSA	MilliporeSigma	126575	Verhindert unkontrollierte Fettsäureeffekte, stabilisiert Mitochondrien
FCCP	Cayman Chemical	NC0904863	Ein Protonophor und Entkoppler der oxidativen Phosphorylierung in Mitochondrien
HEPES	MilliporeSigma	391340	pH-Pufferung, Kompatibilität mit mitochondrialer Funktion
L-Ascorbat	TCI Amerika	A053925G	TCA-Zyklus-Intermediat, Substrat von OXPHOS
Magnesiumchlorid	MilliporeSigma	M8266	Für das Ionengleichgewicht, Unterstützung für die enzymatische Aktivität
N1,N1,N1,N1-Tetramethyl-1,4-Phenylengdiamin (TMPD)			Elektronenspender an Cytochrom c, Bewertung der komplexen IV-Funktion durch Umgehen von Komplex I und II, TMPD/Ascorbat ermöglicht eine direkte Messung des komplex-IV-abhängigen Sauerstoffverbrauchs
Oligomycin	MilliporeSigma	1404-19-9	Hemmt die mitochondriale ATP-Synthese, Komplex V
Pirenzepin-Dihydrochlorid	MilliporeSigma	P7412	Muskarinischer voreingenommener Agonist
Pyruvinsäure	Thermowissenschaftliche Chemikalien	AC132155000	TCA-Zyklussubstrat
Rotenon	MilliporeSigma	557368	Hemmt mitochondrialen Komplex I
Seahorse XF24 V7 PS Zellkultur-Mikroplatten	Agilent	102340-100	Zellkultur-Mikroplatten
Seahorse XFe24 Analysator	Agilent	S7801BR	Agilent Seahorse XFe24-Analysatoren messen die Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) und die extrazelluläre Versauerungsrate (ECAR) lebender Zellen in einem 24-Well-Plattenformat.
Succininsäure	Fisher Chemical	AC158742500	TCA-Zyklus-Intermediat, Substrat von OXPHOS
XFe24-Sensor-Cartridge-Kalibrierungspuffer	Agilent	102340100	PBS-Puffer pH 7,2
XFe24-Sensorpatronen	Agilent	102340-100	Sensor für OCR- und ECAR-Messungen