Methodenartikel

Chromatin-Barriereprofilierung bei ganzen L4-Larven von Caenorhabditis elegans

DOI:

10.3791/69791

⸱

17. April 2026

 ,  , 
1Departamento de Biología Celular y Desarrollo, Instituto de Fisiología Celular (IFC), Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM)

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier stellen wir ein schnelles und einfaches ATAC-seq-Protokoll vor, das im L4-Stufen-Caenorhabditis elegans-Ganzwurm mit nur 30 μL Wurmpellet implementiert werden kann.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Chromatin-Zugänglichkeit spielt eine wesentliche Rolle bei der Transkription, DNA-Reparatur und Chromosomensegregation. Hyperzugängliche Regionen korrelieren üblicherweise mit aktiven Promotoren und Enhancern, was die Bindung an Transkriptionsfaktoren und regulatorische Aktivität erleichtert. Der Test für transposase-zugängliches Chromatin mittels Sequenzierung (ATAC-seq) ermöglicht eine genomweite Profilierung der Chromatinzugänglichkeit mit sehr wenigen Zellen. Seine Umsetzung bei Caenorhabditis elegans ist jedoch durch die reiche kollagenhaltige Kutikula des Nematoden begrenzt, die die Zelldissoziation erschwert. Hier präsentieren wir ein optimiertes Protokoll zur Durchführung von ATAC-seq in ganzen Würmern in der L4-Stufe. Das Verfahren beginnt mit synchronisierten Kulturen und umfasst eine Schädigung der Nagelhaut, enzymatische Dissoziation und die Herstellung von Zellsuspensionen. Permeabilisierte Kerne werden anschließend einer Tn5-Transposition unterzogen, gefolgt von einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-Amplifikation und Reinigung von Next-Generation-Sequenzierungsbibliotheken (NGS). Dieses Protokoll benötigt 30 μL Wurmpellet, kann an einem Tag abgeschlossen werden und erzeugt 5.000–9.000 Zugänglichkeitsspitzen im Bristol N2-Referenzstamm. Dieser optimierte Arbeitsablauf kann an andere Entwicklungsstadien oder FACS-gereinigte Zellpopulationen angepasst werden. Durch die Reduzierung technischer Hürden für ATAC-seq in C. elegans erweitert diese Methode die Möglichkeiten, genomweite Chromatin-Zugänglichkeit als Reaktion auf genetische und Umweltstörungen im Kontext des gesamten Organismus zu untersuchen.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eukaryotische Genome sind dicht im Zellkern gepackt. Um räumliche Einschränkungen zu bewältigen, ist die DNA eng um Nukleosomen gewickelt, Multiproteinkomplexe, die aus acht Histonen bestehen, die über verschiedene Phyla1 hochkonserviert sind. Die Chromatin-Zugänglichkeitsmuster variieren je nach zellulärem Zustand im Gewebe und genspezifischen Mustern 2,3,4. Die Zugänglichkeit von Nukleosomen korreliert stark mit aktiver Transkription, insbesondere an Promotoren und distalen regulatorischen Regionen wie Enhancern, die für Transkriptionsfaktoren5 zugänglich sind. Offene Chromatinregionen spielen ebenfalls eine wichtige Rolle bei der DNA-Reparatur, Replikation und Chromosomensegregation3. Im Gegensatz dazu korreliert die verminderte Zugänglichkeit meist mit gedämpftem Heterochromatin und wiederholenden Sequenzen 6,7.

Die Kartierung der Chromatin-Zugänglichkeit war ein wirkungsvoller Ansatz zum Verständnis der Genregulation. Verschiedene Techniken wurden eingesetzt, um die Zugänglichkeit von Chromatinen zu hinterfragen. Zu den frühesten Methoden gehörten die Mikrokokkalnuklease (MNase) und die DNase-I-Verdauung, um die Nukleosomenposition und -zugänglichkeit an bestimmten Loci 8,9 zu kartieren. Diese Techniken wurden später für genomweite Studien implementiert, wenn sie mit Next-Generation-Sequenzierung (NGS) kombiniert wurden10,11. Diese Techniken erfordern jedoch eine sorgfältige Kalibrierung der Enzymkonzentration und Reaktionszeit sowie einer beträchtlichen Anzahl von Zellen für eine erfolgreiche Umsetzung.

Im Jahr 2013 etablierte das Greenleaf-Labor den Test für transposase-zugängliches Chromatin mittels Sequenzierung (ATAC-seq), um die Chromatinzugänglichkeit auf genomweiter Ebene mit einer geringen Anzahl von Zellennahtlos zu kartieren. ATAC-seq nutzt die kommerziell verfügbare Tn5-Transposase, um bevorzugt kurze DNA-Sequenzen (d. h. Barcodes) in offene Chromatinbereiche einzufügen, typischerweise ohne Nukleosomen, und korreliert mit aktiven Promotoren und Enhancern. Das Protokoll erfordert Zellpermeabilisierung und Kernisolierung, gefolgt von einer begrenzten Verdauung mit Tn5 zur Tagmentation von hyperzugänglichem Chromatin. Später werden während der PCR komplementäre Indizes integriert, was das Sample-Multiplexing vor NGS13 erleichtert. ATAC-seq hat sich als robustes Protokoll erwiesen, das auch in silico Transkriptionsfaktor-Fußabdrückung ermöglicht und für Einzelzell-Auflösung 14,15,16,17 implementiert wurde. Neben Mäus- und Menschenproben wurde ATAC-seq in verschiedenen Systemen implementiert, darunter Zebrafische und wirbellose Tiere wie Drosophila und der Nematode Caenorhabditis elegans 18,19,20.

Seit Jahrzehnten ist C. elegans ein leistungsstarkes Modellsystem in Bereichen wie Entwicklung, Zellbiologie und Neurowissenschaften und hat zu bahnbrechenden Entdeckungen geführt, darunter die Identifikation von Mikro-RNAs und der RNA-Interferenz (RNAi)21,22. Es besitzt ein kompaktes Genom von 100 MB mit ~20.000 proteinkodierendenGenen 23. Die Genregulation erfolgt sowohl durch Promotoraktivität als auch durch distale Enhancer, die über ATAC-seq über verschiedene Gewebe, Entwicklungsstadien und Alterungszeitpunkte24,18 kartiert wurden. Das Profil der Chromatin-Zugänglichkeit ist somit zu einem wertvollen Werkzeug geworden, um die Genregulation bei C. elegans zu verstehen. Daher bietet ATAC-seq besonderes Potenzial für die Untersuchung epigenetischer Landschaften unter verschiedenen Umweltbedingungen oder wilden Isolaten, um vielfältige transkriptionelle Antworten zu entdecken. Darüber hinaus könnte es Einblicke in die Chromatinarchitektur anderer pathogener und nicht-pathogener Nematoden liefern.

Eine der wichtigsten methodischen Herausforderungen bei C. elegans ist das Vorhandensein einer kollagenreichen Cuticula, die dissoziiert werden muss, um eine homogene Zellsuspension aus ganzen Würmern25 zu erhalten. Um diese Herausforderung zu bewältigen, haben wir verschiedene Protokolle kompiliert und optimiert, um die Nematoden zu zerlegen und dann ATAC-seq in C. elegans18,26 durchzuführen. Die Verwendung des L4-Larvenstadiums wird bevorzugt, da Tiere an diesem Entwicklungsstadium eine transkriptionell aktive Keimbahn besitzen, die sich in offenes Chromatin übersetzt und eine konstante und informative Quelle für Chromatin-Zugänglichkeit in somatischen Zellen bietet. Hier präsentieren wir ein schnelles und effizientes Protokoll zur Wurmdissoziation und Zellsuspensionsbildung, das ATAC-seq in C. elegans ermöglicht. Unsere Methode ist für L4-Stufen-Würmer optimiert und benötigt nur 30 μL Wurmpellet, mit dem Potenzial, für andere Entwicklungsstadien oder für kleinere Proben wie FACS-gereinigte Zellen angepasst zu werden. Dieses Protokoll kann unter verschiedenen C. elegans-Stämmen und -Bedingungen durchgeführt werden, was die Identifizierung von 5.000–9.000 Chromatin-Accessibility-Peaks im Bristol-N2-Referenzstamm ermöglicht und so die Grundlage für spätere Chromatin-Accessibility-Analysen legt.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Es wird empfohlen, jederzeit Handschuhe zu tragen.

HINWEIS: Tag 1: Vorbereitung der synchronisierten Wurmpopulation. Alle Würmer wurden auf NGM-Platten gezüchtet, die mit E. coli OP50 ausgesät waren. Dinge, die vor dem Start benötigt werden: (pro Probe oder Stamm), eine 90 mm oder zwei 60 mm erwachsene Wurmplatten, eine 90 mm oder zwei 60 mm Platten mit Futter, M9 sterile Puffer27 (3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O bis 1 L. Sterilisieren durch Autoklavierung)

1. Sammlung von Würmern

  1. Nehmen Sie eine 90 mm (oder zwei 30 mm) große Platten mit der erwachsenen Population des Wurms.
  2. Die Würmer werden mit M9-Puffer geholt und in ein 15-mL Zentrifugenrohr übertragen.
  3. Wiederhole den vorherigen Schritt, um alle Würmer von der Platte(n) zu bergen.
  4. Lass die Würmer eine Minute im 15-mL-Rohr absinken und entferne vorsichtig den M9-Puffer.
  5. Achten Sie darauf, ~1 ml Würmer zu sich zu nehmen.

2. Bleichen

  1. Fügen Sie 5 ml M9-Puffer + 650 μL NaOH 5M + 1.300 μL Haushaltsbleichmittel (5 % NaClO-Lösung) hinzu.
  2. Vortex mit maximaler Geschwindigkeit für 1–2 Minuten (nicht länger als 2,5 Min).
  3. Zentrifugiere bei 1.000 x g für 1 Minute bei RT (Raumtemperatur).
  4. Entferne das Supernatant und gib 9 ml M9-Puffer hinzu.
  5. Wiederhole die Abschnitte 2.3 und 2.4 noch fünfmal.
  6. Die Embryonen werden in 7 ml M9-Puffer wieder suspendiert.
    HINWEIS: Das Bleichprotokoll kann je nach Temperatur und Art des kommerziellen Bleichmittelsin der Effizienz variieren.

3. M9 (flüssiges) Schlüpfen der Eier über Nacht

  1. Achten Sie darauf, dass das Sammelrohr mit den gebleichten Eiern richtig geschlossen ist.
  2. Stellen Sie das Rohr bei 20 °C in Langsambewegung (z. B. in einem Shaker in einem Raum bei 20 °C).
  3. Würmer schlüpfen über Nacht und bleiben in L1 stehen.
    HINWEIS: Lassen Sie das Rohr nicht länger als 12 Stunden stehen.

4. Tag 2: Wachstum der Würmer: Genesung von L1-Würmern .

  1. Nimm das Rohr aus dem Shaker und untersuche unter dem Mikroskop, dass es L1-Würmer gibt.
  2. Lass das Rohr etwa 1 Stunde vertikal bei RT absinken.
  3. Entfernen Sie das Supernatant und übertragen Sie ~300 L1-Würmer auf eine 90 mm große oder zwei 30 mm große Platten mit Futter.
  4. Setzen Sie sie in einen 20 °C Inkubator und lassen Sie sie 26 Stunden wachsen, bis sie das L4-Stadium erreichen.

5. Tag 3: Vorbereitung der Lagerlösungen: Die nächsten Lösungen müssen vorbereitet werden, um am Tag 4 frische Lösungen herzustellen

HINWEIS: Dies kann am zweiten oder dritten Tag erfolgen.

  1. 1 ml 10% SDS.
  2. 50 ml 1M HEPES pH 8 (Autoklav).
  3. 250 ml 20 % Sackrarose (Autoklav).
  4. 100 mL 2M NaCl: Vorbereitung (Autoklav).
  5. 50 mL 2M KCl (Autoklav).
  6. 10 mL 1M CaCl2 (Autoklav).
  7. 10 ml 1M MgCl2 (Autoklav).
  8. 100 ml 1 Million Tris, pH 7,4.
  9. 5 mL 5M NaCl (Autoklav).
  10. 500 μL 10% Tween-20.
  11. 500 μL 10 % Nonidet P40/IGEPAL.
  12. 100 μL 5 % Digitonin (muss auf 65 °C erhitzt werden, um sich aufzulösen).
  13. 500 μL 10 % BSA (Filter mit 0,22 μm), gespeichert bei 4 °C.
    Tag 4: L4-Stadium Würmer für ATAC
    HINWEIS: Bevor Sie beginnen, sollten Sie unbedingt einen Inkubator bei 25 °C haben, eine 4 °C-Zentrifuge bereithalten, Digitonin auf 65 °C erhitzen (für frische Puffervorbereitung), sterile M9-Puffer, sterile H2O- und 20-μm-Filter haben.

6. Lösungsvorbereitung

  1. Bereite frische Lösungen vor (siehe Tabelle 1). Behandle L-15 10% FBS und Egg Buffer immer unter sterilen Bedingungen und halte sie kalt.

Tabelle 1: Brühe zur Herstellung frischer Lösungen. Rezepte zur Zubereitung von Brühen zur Nematodendissoziation und Zellsuspensionsprotokoll (Abschnitte 6 und 7). Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

7. Nematodendissoziation und Zellsuspensionsprotokoll

HINWEIS: Eine 90-mm- oder zwei 30-mm-Platten mit einer L4-synchronisierten Schneckenpopulation werden benötigt.

  1. Nach 26 Stunden im 20 °C-Inkubator bestätigen Sie unter dem Mikroskop, dass sich die Mehrheit der Würmer im L4-Stadium befindet.
  2. Alle Würmer aus den Platten mit einem M9-Puffer zurückgewinnen und in ein 1,5-mL-Zentrifugenrohr geben.
  3. Wasche fünfmal mit 1 ml sterilem H2O, indem dudie Würmer durch die Schwerkraft setzen lässt.
  4. Bringen Sie den Schlauch mit den Würmern für 30 Minuten in einen 25 °C Inkubator, um Darmreste zu entfernen.
  5. Nimm 50 μL des Wurmpellets und gib es in ein neues Rohr.
  6. Füge 200 μL SDS-DTT Fresh Buffer hinzu und mische einen Röhrenrotator für genau 5 Minuten (nicht länger) dazu.
  7. Füge 1 ml Cold Egg Buffer hinzu und drehe einen Picofuge, um Supernatant zu entfernen. Wiederhole das 6 Mal.
  8. Fügen Sie 80 μL frisch zubereitete Pronase (15 mg/mL) hinzu.
  9. Mit einer 200-μL-Pipette (mit gefilterten Spitzen) mische 70-mal so viel Wurm-Pronase-Mix und inkubiere 15 Minuten bei RT.
  10. Fügen Sie 800 μL L-15 10% FBS-Medium hinzu und zentrifugieren Sie 5 Minuten bei 500 x g bei 4 °C.
  11. Fügen Sie 1 ml L-15 10% FBS-Medium hinzu und wiederholen Sie die Zentrifugation.
  12. Wiederhole den vorherigen Schritt noch zweimal.
  13. Entferne das Supernatant und suspendiere es in 900 μL L-15 10% FBS-Medium.
  14. Filter mit einem 20-μm-Filter.

8. Kernisolierung und Chromatin-Tagmentation

HINWEIS: Verwenden Sie Pipettengefilterte Spitzen. Vor dem Start: Tn5-Puffer herausnehmen, auftauen lassen, einen Thermoblock auf 37 °C stellen, PCR-Produktreinigungsset herausnehmen (Materialtabelle), EB-Puffer auf 37 °C versetzen, die Zentrifugation der Säulen sollte bei RT erfolgen.

  1. Zentrifugiere die gefilterte Zellensuspension für 5 Minuten bei 500 x g bei 4 °C.
  2. Entferne das Supernatant und verlasse ~50 μL.
  3. Fügen Sie 45 μL Lysis Buffer (frisch zubereitet) hinzu und lassen Sie es vorsichtig wieder suspendieren.
  4. Gib vorsichtig 50 μL Wash Buffer hinzu (nicht mischen).
  5. Zentrifugiere für 5 Minuten alle 500 x g bei 4 °C. Entferne Supernatant. Lass es im Eis.
  6. Während des Drehens bereitet man für jede Reaktion (Rx) folgende Tn5-Mischung pro Probe vor: 25 μL Tn5-Puffer29, 24,8 μL nukleasefreies H2-O-Enzym, 0,2 μL Tn5-Enzym. Bereite einen Mastermix für mehrere Samples vor.
  7. Nach der Zentrifugation entfernen Sie das Überlagerungsmittel. Lass die Kerne auf Eis. Gib 50 μL Tn5-Gemisch zum Kernpellet und pipettiere langsam siebenmal langsam. Inkubieren Sie bei 37 °C für 30 Minuten auf einem Thermoblock. Gib jedem Rohr alle 10 Minuten kleine Klopfen.
    HINWEIS: Entfernen Sie das PCR-Reinigungskit und legen Sie den EB-Puffer in einen 37 °C Inkubator. Die nächsten 5 Schritte verwenden die Puffer dieses Kits.
  8. Nach der Tn5-Inkubation fügen Sie 300 μL PB-Puffer (Gelb) aus dem Kit hinzu und mischen Sie einen Wirbel mit maximaler Geschwindigkeit für 25 Sekunden.
  9. Nehmen Sie das gesamte Volumen aus dem Rohr und übertragen es in die Spin-Säule (lila, bei 4 °C gelagert) und zentrifugieren Sie 1 Minute mit Höchstgeschwindigkeit bei RT.
    HINWEIS: Die Säule enthält die DNA, sodass der Supernatant vertrauensvoll entsorgt werden kann.
  10. Fügen Sie 750 μL PE-Puffer zur Spin-Säule hinzu und zentrifugieren Sie 1 Minute bei maximaler Geschwindigkeit bei RT.
  11. Entsorge das Überstandsmittel zusammen mit dem Sammelrohr. Setzen Sie die Säule in ein neues 1,5-mL-Rohr und wiederholen Sie die Zentrifugation; Werfen Sie die 1,5-mL-Röhre weg.
  12. Setzen Sie die Säule in ein neues, beschriftetes 1,5-mL-Rohr und fügen Sie 10 μL EB Buffer bei 37 °C in die Mitte der Säule hinzu. Achte darauf, die Säule nicht zu berühren. Lass es 1 Minute auf RT stehen.
  13. Zentrifugieren für 1 Minute bei Höchstgeschwindigkeit bei RT; nie bei 4 °C.
  14. Wiederholen Sie die letzten zwei Schritte für insgesamt 20 μL Elution im EB-Puffer.
    HINWEIS: Optionale Pause: Beim Stoppen können Proben bei -20 °C gelagert werden. Hier befindet sich das tagmentierte Chromatin in einem 20-μL-Volumen.

9. Bibliotheksverstärkung

  1. Für die ATAC-Bibliotheksverstärkung muss eine Echtzeit-PCR durchgeführt werden, um die korrekte Zyklusverstärkungszahl zu schätzen (siehe Tabelle 2). Führen Sie dies auf einer PCR-Platte durch.
  2. Um die Zyklenzahlen für die endgültige Verstärkung zu schätzen, muss die Zykluszahl, die dem ersten Drittel der Verstärkungskurve entspricht, genommen werden. Es ist ideal, dass die Zykluszahl 15 nicht überschreitet. Die Zykluszahl muss für jede Probe geschätzt werden.
    HINWEIS: Nach qPCR befindet sich die markierte DNA in einem 18-μL-Volumen. Optionale Pause: Wenn man stoppen möchte, können die Proben bei -20 °C gelagert werden.
  3. Endverstärkung der ATAC-Bibliothek:
    1. Jede Probe muss einen anderen Wohnmobil-Primer haben (Notizen machen).
    2. Jede Probe muss für die geschätzte Zykluszahl (N) für jede verstärkt werden.
    3. Führen Sie diese PCR in 200-μL-Röhren durch (siehe Tabelle 3).
    4. Hier gibt es 8 μL taggmentierte DNA und 50 μL amplifizierte ATAC-Bibliotheken
    5. Optionale Pause: Wenn Sie stoppen möchten, können Probe(n) bei -20 °C gespeichert werden.

Tabelle 2: Anweisungen zur ersten Bibliotheksverstärkung. Rezept- und PCR-Programm für die erste Bibliotheksverstärkung (Abschnitt 9). Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 3: Anweisungen für die Endverstärkung der ATAC-Bibliothek. Rezept und PCR-Programm für die endgültige Bibliotheksverstärkung (Abschnitt 9). Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

10. Bibliotheksreinigung

HINWEIS: Bevor Sie beginnen, nehmen Sie die Größengrößenperlen (AMPure, SPRIselect oder selbstgemachte kalibrierte Perlen) aus dem Kühlschrank, damit sie sich auf Zimmertemperatur anpassen. Mischen Sie die Perlen jedes Mal kräftig mit dem Wirbel, bevor Sie sie verwenden.

  1. Bereiten Sie 1 ml 80% Ethanol (molekulare Qualität) her.
  2. Fügen Sie 25 μL (0,5 Vol) Perlen in das Probenröhrchen (wo 50 μL vorhanden sind) hinzu und mischen Sie sie mit der Pipette.
  3. 10 Minuten im RT inkubieren.
  4. Stelle die Röhren für 5 Minuten ins Magnetregal.
  5. Übertragen Sie das Überstandsmittel (70 μL) auf ein neues, sauberes 200-μL-Rohr.
    HINWEIS: In diesem Schritt werden die <200 bp großen DNA-Fragmente entsorgt.
  6. Füge 65 μL (1,3 Bänder) Perlen hinzu und mische zehnmal.
  7. 10 Minuten im RT inkubieren.
  8. Stelle die Röhren für 5 Minuten ins Magnetregal.
  9. Entsorge den Überstandsstoff (ohne das Rohr vom Magnetregal zu nehmen).
    HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt enthalten die Perlen die >200 bp und <1000 bp DNA-Fragmente.
  10. Während das Rohr noch auf dem Magnetgestell ist, gib 200 μL frisch vorbereitetes 80%-Ethanol direkt über die Perlen und pipettiere sie mehrmals auf und ab, um sie zu waschen.
  11. Entferne Ethanol und wiederhole das Waschen mit 200 μL Ethanol.
  12. Entsorge das Ethanol und lasse die Perlen mit offenem Deckel ~2–5 Minuten trocknen (lass sie nicht zu stark trocknen).
  13. Nimm die Probe(n) aus dem magnetischen Rack. Wieder in 50 μL sterilem H2Oaufhängen. Waschen Sie alle Perlen von den Wänden des Rohrs.
  14. Zum Schluss inkubieren Sie die Röhren(n) für 5 Minuten im Magnetrack.
  15. Übertragen Sie das Überdachungsmittel in ein neues, sauberes Rohr. Hier werden die verstärkten und gereinigten ATAC-Bibliotheken gespeichert.
    HINWEIS: Bibliotheken können für kurze Zeit (bis zu vier Wochen) bei -20 °C oder länger bei -80 °C gelagert werden.

11. Fragmentgrößenverteilung

  1. Nach der endgültigen Verstärkung ist es ratsam, einen Teil der Probe durch eine Kapillarelektrophorese zu leiten, um das Verteilungsmuster der Fragmentgröße erkennen zu können.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qualitätskontrolle nach der Tagmentation gewährleistet eine genaue Bibliotheksvorbereitung
Während des Protokolls ist es wichtig, besonders auf die nach der Chromatin-Tagmentation durchgeführte qPCR zu achten (Abschnitt 9), da dies ein entscheidender Schritt zur Bewertung der DNA-Qualität und der Leistung des Experiments ist. Abbildung 1A zeigt zwei Verstärkungskurven; Die linke (unter 15 Zyklen) repräsentiert qualitativ hochwertiges Material, das zeigt, dass bis zu diese...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschreiben wir ein optimiertes Protokoll zur Profilierung der genomweiten Chromatin-Zugänglichkeit mittels ATAC-seq bei ganz-L4-Stufen Caenorhabditis elegans-Würmern . Die Chromatin-Zugänglichkeit beeinflusst direkt die Genexpression, DNA-Reparatur, Replikation und Rekombination, und obwohl ATAC-seq zu einem Standardansatz für Zell- und Gewebeproben geworden ist, stellt seine Anwendung auf intakte Organismen einzigartige technische Herausforderungen dar, insbesondere bei N...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren erklären, dass sie keinen Interessenkonflikt haben. Für das Schreiben, die Analyse oder die Vorbereitung dieses Manuskripts wurde keine generative KI verwendet.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

J. Hersch-González erhielt ein Promotionsstipendium vom Consejo Nacional de Humanidades, Ciencias y Tecnologías, CONAHCYT (heute Secretaría de Ciencia, Humanidades, Tecnología e Innovación, SECIHTI) (#CVU 846476). J. Hersch-González wurde von einem CONAHCYT (heute SECIHTI) Stipendium (788519) unterstützt. Dieses Projekt wurde durch den PAPIIT-UNAM-Zuschuss IN217824 und den SECIHTI-Zuschuss CBF-2025-I-2275 an VJV unterstützt. Bei der IFC danken wir dem UBM: Laura Ongay-Larios, Guadalupe Códiz Huerta und Minerva Mora Cabrera; die UBMI: Augusto César Poot-Hernández und Carlos Peralta Alvarez; sowie Unidad de Cómputo, Imagenología, Taller und Biblioteca. Wir danken dem Caenorhabditis Genetics Center (CGC) für die Bereitstellung der in dieser Arbeit verwendeten Stämme. Das CGC wird vom NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440) finanziert.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
250 mL, 0,22 µm PESUltra Curzsc-200253
AgarBD214010
Agencourt AMPURE XPNalgeneA63886
Bovine Serum AlbuminMaplica200100
Calcium ChlorideSigmaC5670-100G
CellTrics 20 µmSysmex04-0042-2315
CholesterolSigmaC8503-25G
DigitoninSigmaD141-500 mg
Disposable glovesMicroflex94-243
DL-DithiothreitolsigmaD0632-10GSchädlich
Ethyl alcohol, pureSigma1003661421
Fetal Bovine SerumbiowestS181S-500
HEPESSigmaH3375-250 G
Illumina Tagment DNA Enzyme and Buffer (large Kit)Illumina20034211
Kapa Syber 50 mLSigmaKK4618
L-15 Medium (Leivobitz)sigmaL4386-10L
Magnesium Chloride anhydrousSigmaM8266-100G
Magnesium Sulfate HeptahydrateSigmaM1880-500G
Magnesium Sulfate HeptahydrateSigmaM1880-500G
MinElute PCR Purification Kit (50 preps)Qiagen28004
NEBNext® High-Fidelity 2X PCR Master MixNEBM0541S
Nonidet P40 SubstituteSigma74835-1L
Pen StrepGibco15140-122
PeptoneBD211677
Petri dish 60 mmTritechT3308
Petri dish 90 mmInterluxC9015-2C
Pipet tips 10 µL, filterCellpro800108
Pipet tips 20 µL, filterCellpro800708
Pipet tips 200 µL, filterCellpro800608
Potassium ChlorideSigmaP9541 -500G
Potassium Phosphate Dibasic PowderJ.T. Baker3252-01
Potassium Phosphate Monobasic, CrystalJ.T. Baker3246-01 500G
Sodium ChlorideJT Baker3624-01
Sodium dodecyl sulfatesigmaL4509-100G
Sodium HydroxideMacron7708-10
Sodium HypochloriteCloralex544394479
Sodium Phosphate Dibasic 7-Hydrated CrystalJ.T. Baker3824-01
SPRIselectBeckmanB23318
SucroseSigmaS0389-500G
Syringe Filter PVDF 0,22 µmUltra CurzSc-358812
Trizma baseSigmaT1503 1KG
Tween 20SigmaP9416-50ML

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Poulet, A., et al. Identification and characterization of histones in Physarum polycephalum evidence a phylogenetic vicinity of mycetozoans to the animal kingdom. NAR Genom. Bioinform. 3 (4), lqab107(2021).
  2. Meléndez-Ramírez, C., et al. Dynamic landscape of chromatin accessibility and transcriptomic changes during differentiation of human embryonic stem cells into dopaminergic neurons. Sci. Rep. 11 (1), 16977(2021).
  3. Mansisidor, A. R., Risca, V. I. Chromatin accessibility: methods, mechanisms, and biological insights. Nucleus. 13 (1), 236-276 (2022).
  4. Koyanagi, K. O. Inferring chromatin accessibility during murine hematopoiesis through phylogenetic analysis. BMC Res. Notes. 16 (1), 222(2023).
  5. Gómora-García, J. C., Furlan-Magaril, M. Pioneer factors outline chromatin architecture. Curr. Opin. Cell Biol. 93, 102480(2025).
  6. Boivin, A., Dura, J. M. In vivo chromatin accessibility correlates with gene silencing in Drosophila. Genetics. 150 (4), 1539-1549 (1998).
  7. Penagos-Puig, A., Furlan-Magaril, M. Heterochromatin as an important driver of genome organization. Front. Cell Dev. Biol. 8, 579137(2020).
  8. Escamilla-Del-Arenal, M., Recillas-Targa, F. G. GATA-1 modulates the chromatin structure and activity of the chicken alpha-globin 3′ enhancer. Mol. Cell. Biol. 28 (2), 575-586 (2008).
  9. Zhong, J., et al. Mapping nucleosome positions using DNase-seq. Genome Res. 26 (3), 351-364 (2016).
  10. Johnson, S. M., et al. Flexibility and constraint in the nucleosome core landscape of Caenorhabditis elegans chromatin. Genome Res. 16 (12), 1505-1516 (2006).
  11. Boyle, A. P., et al. High-resolution mapping and characterization of open chromatin across the genome. Cell. 132 (2), 311-322 (2008).
  12. Buenrostro, J. D., et al. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins, and nucleosome position. Nat. Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
  13. Buenrostro, J. D., et al. ATAC-seq: A method for assaying chromatin accessibility genome-wide. Curr. Protoc. Mol. Biol. 109, 21.29.1-21.29.9 (2015).
  14. Corces, M. R., et al. The chromatin accessibility landscape of primary human cancers. Science. 362 (6413), eaav1898(2018).
  15. Shema, E., Bernstein, B. E., Buenrostro, J. D. Single-cell and single-molecule epigenomics to uncover genome regulation at unprecedented resolution. Nat. Genet. 51 (1), 19-25 (2019).
  16. Cao, J., et al. A human cell atlas of fetal gene expression. Science. 370 (6518), eaba7721(2020).
  17. Ma, S., et al. Chromatin potential identified by shared single-cell profiling of RNA and chromatin. Cell. 183 (4), 1103-1116.e20 (2020).
  18. Jänes, J., et al. Chromatin accessibility dynamics across C. elegans development and ageing. eLife. 7, e37344(2018).
  19. Dhillon-Richardson, R. M., et al. Fishing for developmental regulatory regions: Zebrafish tissue-specific ATAC-seq. Methods Mol. Biol. 2599, 271-282 (2023).
  20. Huynh, K., et al. Genetic variation in chromatin state across multiple tissues in Drosophila melanogaster. PLoS Genet. 19 (5), e1010439(2023).
  21. Lee, R. C., Feinbaum, R. L., Ambros, V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell. 75 (5), 843-854 (1993).
  22. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
  23. Hillier, L. W., et al. Genomics in C. elegans: so many genes, such a little worm. Genome Res. 15 (12), 1651-1660 (2005).
  24. Daugherty, A. C., et al. Chromatin accessibility dynamics reveal novel functional enhancers in C. elegans. Genome Res. 27 (12), 2096-2107 (2017).
  25. Johnstone, I. L. The cuticle of the nematode Caenorhabditis elegans: a complex collagen structure. Bioessays. 16 (3), 171-178 (1994).
  26. Zhang, S., Banerjee, D., Kuhn, J. R. Isolation and culture of larval cells from C. elegans. PLoS One. 6 (4), e19505(2011).
  27. Stiernagle, T. Maintenance of Caenorhabditis elegans. WormBook. , The C. elegans. Research Community. (2006).
  28. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. JoVE. (64), e4019(2012).
  29. Corces, M. R., et al. An improved ATAC-seq protocol reduces background and enables interrogation of frozen tissues. Nat. Methods. 14 (10), 959-962 (2017).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Schlagwörter

ATAC SeqAufbrechen der KutikulaZelldissoziationTn5 TranspositionPermeabilisierung von ZellkernenNext Generation Sequencingsynchronisierte Kulturen

Verwandte Artikel