Tiefenlernen-basiertes Mehrgelenk-Synchrontracking zur objektiven Quantifizierung der Hintergliedmaßen-Lokomotor-Kinematik bei Ratten

Summary

Dieses Protokoll etabliert eine kinematische Bewertungspipeline für Ratten-Hintergliedmaßen mittels eines markerlosen Laufbandtests mit Deep-Learning-gesteuerter Auto-Labeling, die eine reproduzierbare Bewegungsquantifizierung ermöglicht.

Abstract

Eine genaue und objektive Bewertung des Rattengangs ist für neurowissenschaftliche und kinesiologische Forschungsfelder unerlässlich. Konventionelle Systeme verlassen sich häufig auf Fußabdruckbildgebung für die indirekte Ganginferenz, die die Mehrgelenk-Kinematik der Hintergliedmaßen nicht vollständig erfassen kann. Diese Studie etabliert ein markerloses, auf dem Laufband basierendes Ganganalysesystem für Nagetieren, das maßgeschneiderte Deep-Learning-Algorithmen mit einem programmierbaren Gewichtsstützlaufband integriert, um eine Echtzeitverfolgung mehrerer Untergliedmaßengelenke und multidimensionale kinematische Quantifizierung zu ermöglichen. Das System extrahiert automatisch Gang-Zyklus-Parameter, Gelenkbahnen, Kraftverteilungsmuster und Bewegungsglätte unter modulierter Geschwindigkeit (0–300 mm/s), Steigung (±30° Steigung) und graduierter Gewichtsstütze (0–500 g) und bietet so ein objektives Bewertungsinstrument für die Forschung zum neuromuskulären Verhalten. Mit Hilfe von Rückenmarksverletzungsmodellen (SCI) zeigen die Ergebnisse die Empfindlichkeit des Systems bei der Erkennung multidimensionaler Unterschiede in Gelenkbewegungsumfang, Flugbahnkontinuität, Antriebskraft und Bewegungsglätte zwischen gesunden und verletzten Nagetieren, was seine Krankheitsdiskriminierung und Bewertungsfähigkeiten bestätigt. Im Vergleich zu traditionellen subjektiven Scores oder Fußabdruckmethoden eliminiert diese Plattform persönliche Verzerrungen und geringdimensionale Datenbeschränkungen und kombiniert gleichzeitig eine Deep-Learning-basierte Architektur und Vorteile bei der Datenerhebung mit hoher Durchsatzleistung. Sie ist auf Forschung anwendbar, die sich mit zentralen oder peripheren Nervenverletzungen, neurodegenerativen Erkrankungen, muskuloskelettalen Erkrankungen und Alterungsprozessen befasst. Durch die synchrone Integration der neuroelektrophysiologischen Module ermöglicht das System zudem die temporale Kopplung von Gang- und neuronalen Signalen, wodurch ein methodischer Rahmen zur Analyse zentral-peripherer Kontrollmechanismen und zur Entwicklung neuromodulatorischer Strategien geschaffen wird.

Introduction

In der zeitgenössischen Neurowissenschaft und der Lokomotorikforschung ist die objektive Gangquantifizierung heute unerlässlich, um neuronale Muskelfunktionen zu analysieren, Krankheitsmechanismen aufzuklären und Rehabilitationsstrategien zu bewerten¹. Seine hohe raumzeitliche Auflösung ermöglicht die Erfassung subtiler Variationen in Synergien zwischen neuronalen Befehlen, Muskelaktivierungsprofilen und skelettaler Mechanik und schafft so eine empirische Grundlage für die Untersuchung der Koordination supraspinaler Bahnen, peripherer Rückkopplung und mechanischer Kontexte. Reproduzierbare kinematische Metriken erhöhen die Erkennungsempfindlichkeit für Läsionen, degenerative Veränderungen und therapeutische Effekte und beschleunigen so die Entwicklung von Medikamenten und Geräten².

Konventionelle Bewertungsplattformen wie CatWalk, DigiGait oder vereinfachte Fußabdruckanalysen schließen indirekt Gelenkkinematik anhand von Plantarkontaktmustern ab. Diese Ansätze liefern niedrigauflösende und inkonsistente Metriken, die die Mehrfach-kinematische Komplexität der Hintergliedmaßen^{nicht erfassen 3,4}. Das übergeordnete Ziel unserer Methode ist es, ein hochpräzises, markerloses und gewichtsgestütztes Ganganalysesystem zu etablieren, das speziell für Nagetiermodelle entwickelt wurde. Daher schaffen wir einen neuartigen Rahmen, der: (i) Nagetiere während kontinuierlicher Mehrgelenkbildgebung in aufrechter Haltung unter kontrollierter axialer Belastung (0–100 % Körpergewicht) hält, (ii) anatomische Orientierungspunkte der sagittalen Ebene direkt lokalisiert – durch laterale Sichtanalyse und Deep Learning zur Erzeugung von 2D-räumlichen Trajektorien –, (iii) zeitaufgelöste Gelenkwinkel und segmentale Kinematik für statistische Modellierung^{exportiert 5}. Grundsätzlich basiert dieses Framework auf der Anwendung von Deep Learning auf Computer-Vision-Aufgaben, was eine robuste gemeinsame Feature-Extraktion aus Videodaten ermöglicht.

Im Vergleich zu bestehenden Systemen bietet diese Plattform vier zentrale Vorteile. Sein markerloser Betrieb eliminiert reflektierende oder implantierte Tags und reduziert gleichzeitig die prozedurale Komplexität und Bewegungsartefakte^{erheblich 6}. Das integrierte Force-Feedback-Aufhängungssystem ermöglicht eine präzise, graduierte Körpergewichtsunterstützung (0–100 %), was eine umfassende Gangbewertung über das gesamte Belastungs-Entlast-Kontinuum ermöglicht, was bei kommerziellen Laufbändern⁷ fehlt. Die Deep-Learning-Architektur ermöglicht ein schnelles Umschulen für neuartige Stämme, Altersgruppen oder pathologische Bedingungen und übertrifft dabei manuelles Tracking in Bezug auf Skalierbarkeit⁸. Und hochpräzise Mehrgelenk-Raumkoordinaten ermöglichen eine feine Analyse der Kinematik zwischen den Gelenken in Verbindung mit quantitativer Profilierung abweichender Gangmuster.

Dieses Protokoll ist weit verbreitet anwendbar. Es ermöglicht die Untersuchung der supraspinalen Kontrolle, propriozeptiver Rückkopplungsschleifen und Muskelsynergien unter modulierten mechanischen Anforderungen⁹. Pathophysiologisch liefert es empfindliche lokomotorische Biomarker für Rückenmarksverletzungen (SCI), Schlaganfall, Neurodegeneration, periphere Neuropathien und neuromuskuläre Erkrankungen ^8,10. Therapeutisch unterstützt es die longitudinale Bewertung pharmakologischer oder gerätebasierter Interventionen mit erhöhter statistischer Stärke durch hochauflösende Kinematik¹¹. Die modulare Architektur ermöglicht eine nahtlose Integration mit komplementären Plattformen, zum Beispiel Elektromyogrammen (EMG) oder Gehirnsignalen, wodurch die mechanistische Dekodierung neuronaler Korrelate in der Bewegung der unteren Gliedmaßen erleichtert wird.

Protocol

Alle Tierverfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee des Beijing Institute for Brain Research genehmigt und entsprachen den Richtlinien für die Pflege und Nutzung von Labortieren. Es wurden keine verfahrensbedingten unerwünschten Ereignisse festgestellt.

1. Ausrüstungsvorbereitung

1. Schalten Sie die Stromversorgung des Laufbandsystems ein und wählen Sie die Geschwindigkeitskontrolltaste auf dem Touchscreen.
2. Lass den Riemen 30 Sekunden mit niedriger Geschwindigkeit laufen, um zu beobachten, ob der Laufbandriemen abweicht.
3. Wählen Sie die Taste für die Steigungskontrolle , stellen Sie die Steigung auf 0°, klicken Sie auf Null und bestätigen Sie, dass der angezeigte Wert mit der Levelblase übereinstimmt.
4. Betreten Sie die Aufhängungsoberfläche , hängen Sie ein 10-g-Gewicht auf und prüfen, ob die Spannungsanzeige nahe 0,10 N liegt.
5. Schalten Sie den Industrial Personal Computer (IPC) ein und geben Sie die Videoaufnahme- und Analysesoftware ein.
6. Erstellen Sie ein Verzeichnis für das Experiment des Tages, einschließlich Informationen wie Experimentsnamen, Tier-ID, Versuchsgruppe, Geschwindigkeit, Steigung und Gewichtsreduktionsprozentsatz.
7. Befestigen Sie die Hochgeschwindigkeits-Industriekamera (UC70, Auflösung: 1280X1024, Bildrate: 60 fps), ausgestattet mit einem manuellen Fokusobjektiv (f = 12 mm), auf eine Aluminiumhalterung. Positionieren Sie das Kameraobjektiv senkrecht zur Längsachse des Laufbands, um eine rein seitliche Ansicht zu erhalten, wobei ein horizontaler Arbeitsabstand von 15 cm zur Ebene des Laufbands gehalten wird.
8. Stellen Sie das Objektiv horizontal mit einem Blasenniveau ab und stellen Sie sicher, dass der Oberkörper der Ratte die mittleren zwei Drittel des Bildrahmens einnimmt. Stellen Sie Fokus und Blende an, bis die Skalenlinien auf dem Rücken (1 cm Gitter) deutlich sichtbar sind.
9. Klicken Sie auf die Vorschau , um zu bestätigen, dass keine Schatten vorliegen und die Hintergrundhelligkeit gleichmäßig ist. Wenn das Bild zu dunkel ist, verwenden Sie eine Lichtdiode (LED)-Hintergrundbeleuchtung, um die Helligkeit zu erhöhen; Bei Überbelichtung reduzieren Sie den Gain und verengen Sie die Blende entsprechend.
10. Klicken Sie auf Start Recording, um die Qualität der Datenaufnahme zu testen. Klicken Sie auf Aufnahme stoppen und stellen Sie den Speicherpfad ein. Nach Abschluss der oben genannten Gerätetests beginnen Sie mit Tierversuchen.

2. Tiervorbereitung und Durchführungstest

1. Bring die Ratte zusammen mit ihrem ursprünglichen Käfig in den Versuchsraum und lasse sie 10 Minuten ruhen. In dieser Zeit sollten Sie freien Zugang zu Nahrung und Wasser gewähren.
2. Erfassen Sie das Körpergewicht mit einer elektronischen Waage (genau auf 0,1 g). Ratten mit gleichem Körpergewicht (±10 g) einbeziehen, um die störenden Effekte der Körpergröße zu minimieren.
3. Wenn die Fellfarbe der Hintergliedmaßen nicht ausreichend vom Hintergrund kontrastiert, verwenden Sie einen Elektrorasierer, um vorsichtig einen 1 cm breiten Fellstreifen an der Außenseite des Oberschenkels und der Rückseite des Unterschenkels zu entfernen, um die genaue Gelenkerkennung zu verbessern.
4. Anschließend wird mit einem weichen Tape die gerade Distanz von der Hüfte bis zum Knöchel (mm) gemessen, was als Grundlage für die spätere Schrittnormalisierung dient.
5. Zieh Handschuhe an, greife die Ratte und wickle den elastischen Brustgurt um die vordere Achselhöhle, um ihn an der verstellbaren Schiebeschiene zu befestigen. Stellen Sie sicher, dass der Riemen locker genug ist, um einen Finger einzuführen, ohne die Atmung des Tieres zu beeinträchtigen.
6. Drehen Sie langsam den Hebel des Aufhängungsarms, während Sie den Spannungswert auf dem Bildschirm beobachten, und erhöhen Sie ihn allmählich zum Zielgewicht zur Gewichtsreduktion. Bestätigen Sie, dass die Hinterbeine der Ratte noch vollständig den Boden berühren.
7. Stellen Sie die Höhe des Griffstangs ein. Lockere den oberen Knopf und positioniere die vordere Griffstange beim aufrechten Stehen leicht unterhalb der Nasenspitze der Ratte, damit das Tier sie leicht greifen kann, ohne den Kopf zu stark nach hinten neigen oder sich bücken zu müssen.
8. Auf dem Touchscreen stellen Sie die Geschwindigkeit auf 150 mm/s und die Steigung auf 0° ein. Führen Sie eine 10-minütige Akklimatisierungssitzung durch, um das Tier an das spezifische Unterstützungsniveau des Körpergewichts anzupassen. Überwachen Sie die Ratte auf Stressanzeichen, z. B. Erfrieren, Defäkation.
   1. Bleibt der Gang unregelmäßig (definiert als [>3 Unterbrechungen/Min]), wird die Dauer um 2-minütige Schritte verlängert, bis zu maximal 20 Minuten.
9. Die Akklimatisierung gilt als erfolgreich, wenn die Ratte mindestens 60 Sekunden lang einen gleichmäßigen, durchgehenden Schritt ohne Pfotenschleifen hält und der Schwanz natürlich ohne Steifheit hängt. Schließen Sie Tiere aus, die diese Kriterien nach der maximalen Eingewöhnungsphase nicht erfüllen.
10. Geben Sie die für das formale Experiment erforderlichen Parameter ein. Geben Sie die gewünschte Geschwindigkeit (jeder Wert zwischen 0-300 mm/s) und Steigung (−30° bis +30°) auf dem Touchscreen fort ein und wählen Sie die Richtung des Laufbandriemens aus.
11. Nachdem Sie das Laufband gestartet haben, beobachten Sie die Gehhaltung der Ratte. Wenn er vom zentralen 1/3-Bereich abweicht, klopfen Sie sanft mit dem Knöchel auf die rechte Wand einmal. Die meisten Tiere korrigieren ihre Position von selbst. Wenn zwei aufeinanderfolgende Korrekturen wirkungslos sind, wird die Ratte neu positioniert und der Versuch erneut aufgenommen.
12. Nach der Stabilisierung klicken Sie auf Start Recording und erfassen Sie kontinuierlich mindestens fünf vollständige Gangzyklen.
13. Am Ende jeder Prüfung wird die Geschwindigkeit sofort auf 0 reduziert, der Brustgurt gelöst und die Ratte in ihren entsprechenden Käfig zurückgeführt.
14. Verabreichen Sie Wasser während der Ruhezeit, mit mindestens 3 Minuten zwischen den Versuchen.
15. Nehmen Sie mindestens drei Versuche unter denselben Bedingungen auf. Wenn ein Tier länger als sechs Versuche durchgehend läuft, fügen Sie eine zusätzliche 2-minütige Ruhepause hinzu, um kumulierte Ermüdung zu vermeiden.
16. Vortraining führen Sie fünf aufeinanderfolgende Tage vor dem formellen Experiment durch: Gehen Sie täglich 10 Minuten mit 150 mm/s, 0° Steigung und keine Gewichtsreduktion, wobei Sie den Gang beobachten.

3. Extraktion von Gangdaten,

1. Zuerst entnehmen Sie Segmente, die den Zielgang enthalten, meist etwa 10 s, was mindestens 10 analysierbare stabile Gangzyklen enthalten sollte.
2. Importiere die .mov-Datei in die Analysesoftware und registriere die individuellen Informationen der Ratten, einschließlich ID-Nummer, Gruppe und experimentellen Bedingungen.
   HINWEIS: Das System verwendet die YOLO-NAS Pose-Architektur, ein hochmodernes neuronales Netzwerk, das für die Hochleistungs-Pose-Schätzung optimiert ist.
   Datensatzkonstruktion: Das Modell wurde auf einem robusten Datensatz von 6.000 Videoframes trainiert. Diese Rahmen wurden manuell mit den Koordinaten von fünf wichtigsten Hintergliedmaßengelenken (Iliac-Kamm, Hüfte, Knie, Knöchel und Zehe) mit der grafischen Benutzeroberfläche von DeepLabCut annotiert, um eine Genauigkeit der Bodenwahrheit sicherzustellen.
   Training: Das Netzwerk wurde auf einer NVIDIA RTX 3080 GPU transferiert, um die YOLO-NAS Pose-Gewichte an die spezifischen Eigenschaften des Ratten-Hinterbeins anzupassen.
   Initialisierung: In der Software wählen Sie das vortrainierte 'Rat_Hindlimb_YOLO_v1'-Modell aus und setzen Sie die Konfidenzschwelle auf 0,8, um Schlüsselpunkte mit geringer Sicherheit auszuschließen.
   Während der Analysephase verarbeitet das YOLO-NAS Pose-Modell den Videostrom Bild für Bild. Im Gegensatz zu herkömmlichen Computer-Vision-Methoden, die auf Hintergrundsubtraktion beruhen, lokalisiert diese Deep-Learning-Architektur die Ratte direkt und sagt gemeinsame Koordinaten innerhalb der Begrenzungsbox voraus.
   Nachbearbeitung: Der Algorithmus extrahiert die x- und y-Koordinaten aus den Wahrscheinlichkeitsabbildungen. Um hochfrequente Jitter zu mindern, wird ein Medianfilter (Fenstergröße: 3 Frames) auf die rohen Trajektorien angewendet.
   Ausgabe: Das System erfasst erfolgreich die fünf Zielgelenke im Videobild und erzeugt zeitaufgelöste räumliche Koordinaten für die gesamte Gangfolge. Diese Daten werden automatisch als .csv Dateien für die kinematische Berechnung exportiert. Mit dem gleichzeitig erfassten Backboard-Lineal (1 cm Gitter) stellt das System eine Umrechnungsbeziehung her, berechnet automatisch den Skalierungsfaktor und wandelt die Pixelkoordinaten in Millimeter in Batch um.
3. Exportiere die räumlichen Positionskoordinaten jedes Gelenks über die Zeit als .csv-Datei für die spätere Indexberechnung.
   HINWEIS: Die Software berechnet automatisch Schrittlänge, Schrittfrequenz und Fußhöhe und exportiert die Veränderungen der räumlichen Position und Winkel der fünf unteren Gliedmaßengelenke im Laufe der Zeit. Basierend auf der Zehenhöhe teilt die Software jeden Schritt automatisch in Schwungphase und Standphase auf und berechnet den Anteil von Schwungphase und Standphase innerhalb jedes Gangzyklus.

4. Kinematische Vergleiche zwischen Gruppen

1. Normalisiere jeden Gangzyklus innerhalb der Gruppe von 0 % (Fußkontakt) bis 100 % (wieder derselbe Fußkontakt), um die verschiedenen Zykluslängen zu vereinheitlichen und die Gruppenmittelung und den Vergleich zu erleichtern. Die Arten von Bildern, die zur Veranschaulichung der Gangdynamik erzeugt werden können, sind in Supplementary File 1 bereitgestellt.

5. Statistische Analyse

1. Führen Sie alle statistischen Analysen mit der GraphPad Prism-Software durch.
2. Überprüfen Sie die Normalität der Datenverteilung mit dem Shapiro-Wilk-Test.
3. Für die kinematische Validierung und die Demonstration des Body-Mass-Index (BMI)-Demonstrationsvergleichs präsentieren Sie die Daten als Mittelwert ± SEM.
4. Bewerten Sie Unterschiede zwischen den beiden experimentellen Bedingungen mit einem ungepaarten Studenten-t-Test.
5. Definiere statistische Signifikanzschwellen als *p < 0,05, **p < 0,01 und ***p < 0,005. Beachten Sie, dass insgesamt n = 3 Ratten in diese Pilot-Validierungsstudie einbezogen wurden.

6. Einbettung des elektrophysiologischen Moduls

1. Nach Abschluss der Tiermodellierung implantieren Sie das elektrophysiologische Aufzeichnungsgerät.
2. Für die neuronale Aufzeichnung werden Elektroden auf der Schädeloberfläche, im epiduralen Raum oder im Großhirnrinde platziert, um Gehirnsignale aufzunehmen.
3. Für die Rückenmarksaufnahme werden Aufnahmeelektroden in den epiduralen Raum des Intervertebral-Foramens eingesetzt.
4. Für EMG-Aufzeichnungen vergraben Sie bipolare silberne Drähte in Muskeln, um die elektrische Aktivität der Muskeln aufzuzeichnen.
5. Nach der Einnistung lassen Sie das Tier 5-7 Tage lang erholen, überprüfen Sie täglich Wunde und Gangart, um keine Anzeichen von Infektionen oder Schmerzen zu zeigen, bevor Sie mit dem Laufband-Experiment beginnen.
6. Erledigen Sie die oben beschriebenen Ausrüstungs- und Tiervorbereitungen.
7. Synchronisieren Sie die Sammlung elektrophysiologischer Parameter und Bewegungsvideos, um sicherzustellen, dass die elektrophysiologischen und Videodaten denselben Zeitstempel teilen.
8. Nach der Datenerhebung werden die neuronalen Signale während der Analyse mit Videobildern ausgerichtet, um die elektrophysiologischen Muster in verschiedenen Phasen des Gangzyklus intuitiv zu beobachten und so direkte Hinweise auf die Erforschung des zentral-peripheren Kopplingsmechanismus zu liefern.

Results

Das schematische Diagramm und das tatsächliche Foto der Struktur des Laufbandsystems sind in Abbildung 1A,B jeweils dargestellt. Das Gerät ist in der Lage, hochkontrastige laterale Bilder ohne Marker zu erstellen. Das Laufband unterstützt Anpassungen für Geschwindigkeit, Steigung, Richtung und Gewichtsreduzierung und ist mit einem numerischen Bedienfeld ausgestattet. Die begleitende Softwareoberfläche umfasst eine Echtzeit-Überwachungs- und ...

Discussion

Dieses Protokoll definiert ein laufbandbasiertes Ganganalysesystem für Ratten und dessen operative Verfahren und bietet ein multidimensionales und objektives Bewertungsinstrument für neuromuskuläre Verhaltensforschung. Wie in den Intergruppenvergleichen der Gangparameter zwischen SCI und gesunden Ratten in der Exemplarstudie gezeigt wird, ermittelt das System rohe räumliche Bewegungskoordinaten der Subjekten durch kontinuierliche Hochbildrate-Gait-Videografie und einen KI-gesteuerten aut...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gait AI Annotation & Akquisitionssoftware	Shanghai ClinAITrial Technology Co., Ltd.	MouseAI	MouseAI ist die integrierte Analyse -Software für das MOVEMETRICS-Laufband, die Videoaufnahme, Metadatenprotokollierung und automatisierte Ganganalyse in einem einzigen Workflow vereint.
Mechanische Wirkung	RWD Life Science, Shenzhen, China
Mehrkanal-elektrophysikalisches logisches Aufzeichnungssystem	Kedou (Suzhou) Gehirn – Computer Technology Co. ,	KedouBC RHD128A	KedouBC RHD128A ist ein kompaktes, 128-Kanal in vivo elektrophysiologisches Erfassungssystem, das für hochauflösende neuronale Aufzeichnungen bei kleinen bis großen Labortieren entwickelt wurde. Durch die Integration von leichten, Plug-and-Play-Headstages (&le), 16-Bit-A/D-Konvertierungen und programmierbaren Verstärkern erfasst er EEG-, ECoG-, LFP-, Spikes-, EMG- und EKG-Signale von 0,1 Hz bis 30 kHz mit ≤ 2.4 &Mikro; V-Systemrauschen und > 10 GΩ Eingangsimpedanz. RHD128A liefert robuste, benutzerskalierbare neuronale Daten, um Studien zu Gehirn-Maschine-Schnittstellen zu beschleunigen, Neurodegeneration und Rehabilitation.
Laufband	Shanghai ClinAITrial Technology Co., Ltd.	MOVEMETRICS	MOVEMETRICS ist ein hochpräzises instrumentiertes Laufband für fortgeschrittene Nagetier-Ganganalyse.