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Forschungsartikel
* These authors contributed equally
Diese Studie identifiziert anhand von Daten aus dem Cancer Genome Atlas eine 10-lncRNA-Signatur im Lungenplattenepithelkarzinom (LUSC). Obwohl die Validierung eine begrenzte klinische Prädiktionsleistung zeigte, unterstützten die charakteristischen differenzierten immunen Mikroumgebungsmuster und In-vitro-Tests LINC01615 als migrationsbezogenen Invasionskandidaten für weitere mechanistische Untersuchungen.
Langkettige nicht-kodierende RNA (lncRNA) beeinflusst signifikant den prognostischen Wert und die Immuninfiltration des Lungenplattenepithelkarzinoms (LUSC). Diese Studie hatte zum Ziel zu zeigen, wie oxidativ-stressbedingte lncRNAs das Lungenplattenepithelkarzinom (SCC) beeinflussen. Der Cancer Genome Atlas (TCGA) Datensatz sammelte Transkriptominformationen und zugehörige klinische Daten für LUSC. Um ein prognostisches Modell zu erstellen, wurden zehn prognostisch verwandte Gene mittels einer Reihe bioinformatischer Analysen identifiziert, die die aberrante Expression des OS-Gens in Tumoren und gesunden Geweben sowie dessen Zusammenhang mit der Malignität verglichen haben. Die Probanden wurden basierend auf dem Median-Risiko-Wert aus der 10-Gen-Signatur in Hoch- und Niedrigrisikogruppen eingeteilt. Während das mathematische Risikomodell in der Validierungskohorte eine begrenzte unabhängige Prädiktionsleistung zeigte (AUC ~ 0,5), zeigten funktionelle und immunologische Bewertungen signifikante Unterschiede im Tumormikroumfeld (TME) zwischen den Risikoschichten. Insbesondere zeigten Hochrisiko-Patienten unterschiedliche Immuninfiltrationsprofile und veränderte immunologische Werte im Vergleich zu ihren Risikominder-Risiko-Kollegen. Daher dient diese oxidative, stressbezogene lncRNA-Signatur nicht als direktes klinisches Vorhersageinstrument, sondern liefert wertvolle biologische Einblicke in die Immunlandschaft von LUSC und hebt potenzielle therapeutische Ziele für weitere mechanistische Untersuchungen hervor.
Lungenkrebs zeigt die höchste weltweite Inzidenz und Sterblichkeit unter Malignitäten1. Innerhalb der nicht-kleinzelligen Lungenkrebsvarianten (NSCLC) ist das Lungenplattenepithelkarzinom (LUSC) ein vorherrschender Subtyp, der oft mit ungünstigen klinischen Ergebnissen und einem Mangel an wirksamen zielgerichteten Behandlungen im Vergleich zum Lungenadenokarzinom2 korreliert. Während primäre therapeutische Ansätze chirurgische Eingriffe, Strahlentherapie und Chemotherapie umfassen, zeigen Patienten mit fortgeschrittenem LUSC häufig therapeutische Resistenz3. Daher besteht ein dringender Bedarf, robuste molekulare Biomarker zu identifizieren, um die prognostische Stratifizierung zu verbessern und explorative therapeutische Strategien für LUSC4 zu leiten.
Oxidativer Stress, gekennzeichnet durch die pathologische Ansammlung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS), spielt eine entscheidende Rolle bei der Tumorinitiierung, dem Wachstum und der Metastasierung. Mangels wirksamer ROS-Clearance-Mechanismen führen erhöhte ROS-Spiegel zu DNA-Schäden und Genotoxizität, was letztlich zu verschiedenen genomischen Veränderungen führt, die zur Krebsentwicklung beitragen. Bemerkenswert ist, dass Studien konsequent eine Erhöhung der ROS-Spiegel und des oxidativen Stresses speziell innerhalb der Pathogenese von Lungenkrebsgezeigt haben 5,6. Neuere Forschungen haben zudem hervorgehoben, dass Gencluster, die mit oxidativem Stress in Verbindung stehen, als prospektive prognostische Biomarker bei pulmonalen Malignitätenfungieren können 7. Lange nicht-kodierende RNAs (lncRNAs) haben sich als entscheidende Regulatoren der Genexpression etabliert und stellen vielversprechende prognostische Biomarker bei verschiedenen Malignitäten dar. Während eine frühere bemerkenswerte Studie7 erfolgreich ein oxidativ-stressbezogenes lncRNA-prognostisches Modell für Lungenadenokarzinom (LUAD) etablierte, bleiben die spezifische prognostische Landschaft und die immunen Auswirkungen solcher lncRNAs in LUSC weitgehend unerforscht.
In dieser Untersuchung analysierten die Autoren systematisch TCGA-Datensätze, um eine neuartige, oxidative, stressbedingte lncRNA-Signatur speziell für LUSC zu konstruieren. Darüber hinaus integriert die vorliegende Studie im Gegensatz zu rein bioinformatischen Analysen eine in-vitro-experimentelle Validierung, um die biologische funktionelle Rolle wichtiger identifizierter lncRNAs zu bestätigen (z. B. Linc01615). Anstatt eine unmittelbare klinische Anwendbarkeit für Diagnose- und Behandlungsentscheidungen zu beanspruchen, zielt diese Forschung in erster Linie darauf ab, die möglichen Mechanismen des oxidativen Stresses in LUSC und dessen Korrelation mit dem Tumorimmunmikroumfeld zu untersuchen. Diese Ergebnisse sollen wertvolle biologische Erkenntnisse liefern und potenzielle therapeutische Ziele für zukünftige mechanistische Untersuchungen hervorheben.
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Datenerfassung und Vorverarbeitung
Alle in dieser Studie analysierten Daten stammen aus der öffentlich zugänglichen TCGA-Datenbank , die in der Materialtabelle aufgeführt ist. Diese Studie hielt sich strikt an die Genomic Data Sharing Policy des National Institutes of Health (NIH) und die von TCGA vorgegebenen Publikationsrichtlinien. Da die Datensätze aus nicht identifizierten, öffentlich zugänglichen klinischen und Multi-Omics-Daten bestehen, war diese Studie von einer weiteren Genehmigung durch das Institutional Review Board (IRB) ausgenommen. Transkriptomdaten und entsprechende klinische Informationen für LUSC wurden aus der Cancer Genome Atlas (TCGA)-Datenbank heruntergeladen. Anfangs umfasste die Kohorte 551 Proben (502 Tumor und 49 normal). Um die Robustheit dieses prognostischen Modells zu gewährleisten, wurden Patienten ohne vollständige Gesamtüberlebensdaten (OS), Überlebensstatus oder wesentliche klinische Merkmale aus der nachgelagerten Überlebensanalyse ausgeschlossen. Nach diesem strengen Filterprozess wurde eine abschließende analytische Kohorte von 470 LUSC-Patienten eingerichtet. Diese 470 Patienten wurden anschließend zufällig in ein Trainingsset (n = 235) und ein Testset (n = 235) für den Aufbau und die Validierung von Risikomodellen eingeteilt. Insgesamt wurden 792 Gene mit oxidativem Stress über die GeneCards-Datenbank gesammelt, die in der Materialübersicht aufgeführt ist, unter Verwendung eines Einschlusskriteriums mit einem Relevanzscore ≥ 7. Das Limma-Paket (Version 3.66.0) wurde verwendet, um auf unterschiedlich exprimierte oxidative Stressgene zu screenen. Vulkandiagramme wurden mit dem ggplot2-Paket (Version 4.0.2) erstellt. Zwischen der Ausbildungsgruppe und der Testgruppe gab es keine nennenswerten Unterschiede in den klinischen Merkmalen (p > 0,05). Der Trainingssatz wurde für den Modellbau verwendet, der Testsatz für die interne Validierung.
Entwicklung und Verifikation des Risikomodells
Zur Identifizierung von lncRNAs, die mit oxidativem Stress assoziiert sind, wurde eine Pearson-Koexpressionsanalyse durchgeführt. Die Autoren bewerteten die Korrelation zwischen den Expressionsprofilen der identifizierten differenziell exprimierten oxidativ-stressbezogenen Gene und allen annotierten lncRNAs im TCGA-LUSC-Datensatz. Die Korrelationskriterien zur Auswahl ko-exprimierter lncRNAs wurden auf einen Korrelationskoeffizienten |R| > 0,4 und ein p-Wert < 0,001. Basierend auf diesen Schwellenwerten wurden insgesamt 6.088 Kandidaten für oxidative, stressbezogene lncRNAs gewonnen und extrahiert. Anschließend wurden diese 6.088 Kandidaten-lncRNAs mittels LASSO-Regression und komplementären analytischen Ansätzen bewertet, um das prognostische Risikomodell zu erstellen. Mit Hilfe der verarbeiteten Daten wurden die Patiententeilnehmer in Hoch- und Niedrigrisiko-Schichten eingeteilt.
Unabhängige Faktoren und ROC-Kurven
Univariate und multivariate Cox-Regressionsmodelle wurden verwendet, um unabhängige prognostische Variablen zu identifizieren. Konkret wurde zur Kontrolle der familienweisen Fehlerrate während der multiplen univariaten Cox-Regressionsanalysen (n = 236 Tests) die Bonferroni-Korrektur angewendet, wobei die streng angepasste Signifikanzschwelle auf p < 0,00021 (berechnet als 0,05 / 236) gesetzt wurde.
Überlebensanalyse und Hauptkomponentenanalyse
Das Überlebenspaket (Version 3.8-6) wurde zur Berechnung der Gesamtüberlebensraten (OS) verwendet, und die Hauptkomponentenanalyse (PCA) wurde verwendet, um die Robustheit des Risikomodells zu bewerten.
Nomogramm
Der Fit-Index wurde mit dem RMS-Paket in R bewertet, um die Zuverlässigkeit des Nomogramms zu bewerten. Die Tumormutationslast (TMB) wurde mit dem maftools-Paket (Version 2.22.0) bewertet und visualisiert. Algorithmen, darunter ssGSEA, wurden verwendet, um Immuninfiltration zu erkennen. Zusätzlich wurde das ggpubr-Paket (Version 0.6.3) verwendet, um Immunkontrollpunkte zwischen Risikogruppen zu vergleichen. Der ESTIMATE-Algorithmus wurde verwendet, um die Tumor-Mikroumgebung (TME) zu charakterisieren.
Funktionalanalyse
Das clusterProfiler-Paket (Version 4.14.6) in R wurde für die Anreicherungsanalyse verwendet. Um funktionale Wege weiter zu erforschen, wurde eine GSEA-Analyse durchgeführt. Mit Cytoscape wurde ein Koexpressionsnetzwerk zur Beobachtung erstellt.
Experimentelle Methoden
Zellkulturbedingungen und Gruppierungen
Die NCI-H520-Zelllinie des menschlichen Lungenplattenepithelkarzinoms (RRID: CVCL_1566; in der Materialtabelle aufgeführt) wurde in RPMI-1640-Medium kultiviert, ergänzt mit 10 % (v/v) fetalem Rinderserum und 1 % Penicillin-Streptomycin. Die Logaritam-Phasenzellen wurden in 6-Well-Kulturplatten eingesät. Nach erfolgreicher Adhärenz wurden die Zellen zufällig in drei verschiedene experimentelle Gruppen eingeteilt: eine blanke Kontrollgruppe, die unter Standardkulturbedingungen aufrechterhalten wurde, eine negative Kontrollgruppe (si-NC), die mit nicht-zielgerichteter siRNA transfiziert wurde, und eine experimentelle Knockdown-Gruppe (si-LINC01615), die mit LINC01615-spezifischer siRNA transfektiert wurde.
Zelltransfektion
Die si-LINC01615 - und si-NC-Reagenzien wurden auf Eis aufgetaut. Für die Präparation des Transfektionskomplexes wurden 95 μL serumfreies RPMI-1640-Medium in sterile Zentrifugenröhren pipettiert, gefolgt von sequentieller Zugabe von 3 μg der jeweiligen siRNA und 5 μL des Transfektionsreagens Lipo3000. Das gleiche Verfahren wurde sowohl für diesi-LINC01615 - als auch für siNC-Gruppen angewandt. Die Lösungen wurden vorsichtig gemischt und bei Raumtemperatur 5 Minuten inkubiert, um die Komplexbildung zu erleichtern, was zu einem Gesamtvolumen von etwa 200 μL pro Röhre führte. Anschließend wurde dieses Gemisch gleichmäßig in die vorgesehenen Kulturbrunnen verteilt, die 800 μL RPMI-1640 Basalmedium enthalten. Nach einer 6-stündigen Brutzeit bei 37 °C wurde das Transfektionsmedium sorgfältig aspiriert und durch frisches, vollständiges Kulturmedium ersetzt.
Wundheilungstest (Scratch-)Assay
Für den Wundheilungstest wurden logarithmisch wachsende NCI-H520-Zellen (RRID: CVCL_1566) in 6-Well-Kulturplatten mit einer Dichte von 5,6 × 105-Zellen pro Bohrloch ausgesaat. Nach Erreichen von 95–100 % Konfluenz wurde eine lineare Wunde künstlich erzeugt, indem die Zellmonoschicht vertikal über die Mitte des Brunnens mit einer sterilen 200-μL-Pipettenspitze gekratzt wurde. Die Brunnen wurden anschließend dreimal mit PBS gewaschen, um abgetrennte Zellen und Zellreste zu entfernen, und anschließend in serumfreiem RPMI-1640-Medium inkubiert. Bilder der identischen verletzten Bereiche wurden bei 0, 24 und 48 Stunden mit einem umgekehrten Mikroskop aufgenommen. Der Wundheilungsbereich wurde durch Messung der Lückenentfernung mit ImageJ (RRID: SCR_003070; in der Materialtabelle aufgeführt) quantifiziert, und die Migrationsrate wurde relativ zur anfänglichen Wundfläche bei 0 Stunden berechnet.
Transwell-Migration und Invasionstests
Zelluläre Migrations- und Invasionskapazitäten wurden unter Verwendung von 24-Well-Transwell-Kammern bewertet, die mit 8,0 μm porengroßen Polycarbonatmembran-Einsätzen ausgestattet sind, die in der Materialtabelle aufgeführt sind. Für den Invasionstest wurden die apikalen Kammern mit 50 μL Matrigel (1:8 im serumfreien Medium verdünnt; in der Materialtabelle aufgeführt) vorbeschichtet und bei 37 °C für 2 Stunden inkubiert, während der Migrationstest unbeschichtete Einsätze verwendete. Nach der Zelltransfektion und einer 24-stündigen Serum-Hungerphase wurden NCI-H520-Zellen entnommen, in serumfreiem RPMI-1640-Medium wieder suspendiert und mit einer Dichte von 1,8 × 105 Zellen /Brunnen in 200 μL in die apikalen Kammern eingesät. Die Basalkammern wurden mit 600 μL RPMI-1640-Medium gefüllt, ergänzt mit 10 % FBS als Chemomagnet. Nach einer 48-stündigen Inkubation bei 37 °C mit 5 % CO₂ wurden die Einsätze entfernt und dreimal mit PBS gewaschen. Zellen auf der apikalen Oberfläche der Membran wurden vorsichtig mit einem feuchten Wattestäbchen entfernt. Die Zellen, die die basolaterale Oberfläche gewandert oder invadiert hatten, wurden 20 Minuten lang mit 4 % Paraformaldehyd fixiert und bei Raumtemperatur 30 Minuten mit Giemsa-Lösung aus der Materialtabelle gefärbt. Die migrierten und invadierten Zellen wurden visualisiert und über drei zufällig ausgewählte optische Felder pro Insert mit einem umgekehrten Mikroskop mit 40-facher Vergrößerung aufgezählt.
Statistische Analyse
Alle statistischen Analysen und Datenvisualisierungen wurden mit R-Software (Version 4.1.2; RRID: SCR_001905; aufgeführt in der Materialtabelle). Die spezifischen Versionsnummern aller in dieser Studie verwendeten R-Pakete wurden in ihren jeweiligen methodischen Unterabschnitten explizit detailliert dargestellt. Ein signifikanter Wert wurde konventionell als p < 0,05 definiert, sofern nicht anders angegeben. Wo mehrere Vergleiche durchgeführt wurden (z. B. die multiplen univariaten Cox-Regressionen), wurde die Bonferroni-Methode streng angewandt, um die familienweise Fehlerquote (FWER) aufrechtzuerhalten, wobei die exakt angepasste Schwelle (z. B. p < 0,00021) im jeweiligen methodologischen Unterabschnitt detailliert dargestellt wurde. Quantitative In-vitro-Daten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung angegeben und je nach Bedarf mit Student's t-Test oder Einweg-ANOVA analysiert.
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Identifikation unterschiedlich exprimierter Gene für oxidativen Stress
Der Arbeitsablauf ist in Abbildung 1 dargestellt. Die klinischen Merkmale der finalen analytischen Kohorte mit 470 LUSC-Patienten sind in Tabelle 1 dargestellt. Basierend auf dem definierten Schwellenwert eines Relevanzscores ≥ 7 konnten die Autoren insgesamt 792 oxidative-stressbezogene Gene aus der GeneCards-Datenbank (
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Das Lungenplattenepithelkarzinom (LUSC) ist ein vorherrschender und hochaggressiver histologischer Subtyp des nicht-kleinzelligen Lungenkrebses, der oft durch schlechte Überlebensraten und eine Resistenz gegen konventionelle therapeutische Verfahren gekennzeichnet ist 8,9. Neue Belege unterstreichen oxidativen Stress als entscheidenden Treiber für die Entstehung und das Fortschreiten verschiedener Malignitäten. Die pathologische ...
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Die Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen. Bei der Manuskripterstellung wurden keine Werkzeuge für künstliche Intelligenz (KI) oder KI-unterstützte Technologien verwendet; Alle wissenschaftlichen Inhalte, Analysen, Rohdaten und Schlussfolgerungen wurden unabhängig erstellt, überprüft und von den Autoren genehmigt.
Diese Arbeit wurde von der Nationalen Naturwissenschaftlichen Stiftung Chinas unterstützt (Fördermittel Nr. 8200430). Wir danken den beteiligten Mitwirkenden und Institutionen, darunter der Hunan University of Traditional Chinese Medicine und dem Hunan Academy of Traditional Chinese Medicine Affiliated Hospital, aufrichtig für ihre Ressourcen und ihre Unterstützung. Wir danken auch allen Forschern und Teilnehmern, die zu dieser Studie beigetragen haben.
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| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 4% Paraformaldehyd | Beyotime | P0099 | Zum Fixieren von Zellen verwendet |
| Cytoscape | Cytoscape Consortium | https://cytoscape.org/ | Zur Erstellung von Co-Expressionsnetzwerken verwendet |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10099-141 | Endkonzentration 10% (v/v) |
| GeneCards-Datenbank | GeneCards Human Gene Datenbank | https://www.genecards.org/ | Oxidativer Stress-bezogene Gene-Screening |
| Giemsa-Färbung | Sigma-Aldrich | GS500 | Zum Färben von migrierten/invadierten Zellen verwendet |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | Zur Quantifizierung der Wundspalte verwendet |
| Lipo3000 Transfektionsreagenz | GLPBIO | GK20006 | Zur siRNA-Transfektion verwendet |
| Matrigel | Corning | 356234 | 1:8 in serumfreiem Medium verdünnt |
| NCI-H520 menschliches Lungenplattenepithelkarzinom | ATCC | HTB-182 | Zur In-vitro-Validierungsassays verwendet |
| PBS (Phosphat-gepufferte Saline) | Gibco | 10010-023 | Zum Waschen der Zellen verwendet |
| Penicillin-Streptomycin (1%) | Gibco | 15140-122 | Antibiotisches Ergänzungsmittel für Zellkultur |
| R-Software (v4.1.2) | R Foundation | https://www.r-project.org/ | Statistische Analyse und Visualisierung |
| RPMI-1640 Medium | Gibco | 11875-093 | Zellkulturmedium |
| The Cancer Genome Atlas (TCGA) | Genomic Data Commons | https://portal.gdc.cancer.gov/ | Transkriptom & klinische Datenquelle |
| Transwell-Kammern (8,0 μm) | Corning | 3422 | Zur Migration und Invasionsassays verwendet |