Method Article

Laser-Capture-Mikrodissektion von paraformaldehydfixiertem Mauslebergewebe zur RNA-Analyse

DOI:

10.3791/69814

⸱

April 17th, 2026

 ,  ,  , 
1Biomedical Research Center, Southern Medical University, 2School of Traditional Chinese Medicine, Southern Medical University, 3School of Pharmaceutical Science, Southern Medical University, 4Leica Microsystems (Shanghai) Trading Co., Ltd., 5The Seventh Affiliated Hospital, Southern Medical University

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Isolierung von RNA aus definierten histologischen Regionen von paraformaldehydfixiertem, mit Optimal Cutting Temperatur eingebettetem Mauslebergewebe mittels Laser-Capture-Mikrodissektion, was eine gezielte nachgeschaltete Genexpressionsanalyse ermöglicht.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Lasererfassungsmikrodissektion (LCM) ermöglicht durch In-situ-Visualisierung und Isolierung räumlichen Zugang zu spezifischen Zellpopulationen innerhalb komplexer Gewebe. Um eine transkriptomische Analyse histologisch definierter Regionen im fixierten Gewebe zu ermöglichen, wird ein detailliertes LCM-Protokoll für die RNA-Extraktion aus paraformaldehydfixierten (PFA)-fixierten, Optimal Cutting Temperature (OCT)-Verbindungen eingebetteten Mausleberschnitten vorgestellt. Das Protokoll beschreibt die Identifikation und Entnahme mikroskaliger Proben (etwa 1.000 Zellen) durch einen Ablauf, der Gewebefixierung, Saccharosedehydrierung, OCT-Einbettung, Kryosektion, Hämatoxylinfärbung und Laseraufnahme gezielter histologischer Bereiche umfasst. Mit dieser Methode wurde eine hochreine RNA (A260/A280: 1,9-2,1) erhalten. Die RNA-Integritätszahl (RIN) betrug 6,7 ± 0,9, was die erwartete Fragmentierung der PFA-Fixierung widerspiegelt. Quantitative PCR für β-Actin ergab jedoch CT-Werte von 17-19, und RNA-Sequenzierung mit fragmentationsoptimierter Bibliotheksvorbereitung erzeugte hochwertige Lesungen, wobei >90 % der Basen die Q20- und Q30-Schwellenwerte erfüllten, was bestätigt, dass die RNA für sensible nachgelagerte Analysen geeignet ist. Daher ermöglicht dieses Protokoll räumlich aufgelöste, gezielte Genexpressionsanalyse, indem RNA mit definierter Reinheit und Integrität aus spezifischen histologischen Regionen des PFA-fixierten Lebergewebes bereitgestellt wird.

Introduction

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Eine genaue Erfassung räumlich aufgelöster Genexpressionsprofile ist entscheidend, um die Gewebeheterogenität in Gesundheit und Krankheit zu verstehen. Die Single-Cell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) bietet eine hohe zelluläreAuflösung 1,2, verliert jedoch den nativen räumlichen Kontext und kann während der Gewebedissoziation die transkriptionellen Profile verändern 3,4. Für Zelltypen ohne öffentlich identifizierte spezifische Marker bleibt es schwierig, reine Populationen mittels immunfluoreszenzbasierter Sortierung oder immunmagnetischer Isolierung zu erhalten 5,6. Räumliche Transkriptomik-Technologien wie Visium und GeoMx ermöglichen eine in-situ-Erfassung von hochdurchgängigen Genexpressionsdaten, aber ihre räumliche Auflösung ist auf Einzelzell- oder subzellulärerEbene 7,8 begrenzt. Umgekehrt kann bildgebende räumliche Transkriptomik eine Nanometer-Auflösung erreichen, weist jedoch eine begrenzte Gendetektionsdurchsatzvon 9 auf. Dies zeigt eine anhaltende Lücke bei hypothesenbasierter Analyse spezifischer morphologischer Regionen.

Die Lasererfassungsmikrodissektion (LCM) ermöglicht mikroskopgesteuerte Selektion und Isolierung spezifischer Zellen aus Gewebeschnitten oder lebenden Zellkulturen basierend auf beobachtbarem Phänotyp. Dieser Ansatz bewahrt zelluläre Struktur und räumliche Informationen10. Diese Technik wurde umfangreich in der Lebererkrankungsforschung für nachgelagerte Analysen angewandt. So wurde beispielsweise LCM verwendet, um gallenepitihelzellen aus Leberbiopsien zu entnehmen, um deren immunregulatorische Rolle bei primärer galliärer Cholangitis11 aufzuklären. Darüber hinaus wurde es verwendet, um γ-Glutamyltransferase (GGT)-positives Gewebe aus experimentellen Modellen zu isolieren, um die ortsspezifische Ggt1-Genexpression 12 zu bestätigen. Diese Studien konzentrierten sich jedoch größtenteils auf frisch gefrorenes Gewebe, das oft keine klinischen Anmerkungen oder langfristige Nachbeobachtungenthält. Im Gegensatz dazu bieten chemisch fixierte Gewebe Vorteile für die histopathologische Diagnose14. Obwohl LCM-basierte RNA-Sequenzierung (RNA-Seq) erfolgreich auf archivierte, großflächige formalinfixierte und paraffin-eingebettete (FFPE) Leberproben angewandt wurde,15. Es fehlt jedoch ein robustes, auf LCM basierendes Genexpressionsprofiling-Protokoll, das speziell für mikroskalige Proben aus paraformaldehydfixierten (PFA)-fixierten und Optimal Cutting Temperature (OCT)-Verbindungen eingebetteten Lebergeweben dient.

Um diesem ungedeckten Bedarf gerecht zu werden, wurde ein umfassendes Protokoll mit PFA-fixierten, OCT-eingebetteten Kryosektionen optimiert. Dieses Protokoll adressiert die Einschränkungen von FFPE-Arbeitsabläufen (z. B. verlängerte Verarbeitung und aggressive Chemikalien) für empfindliche LCM-RNA-Anwendungen16. Im Gegensatz dazu ist der Fixierungs- und Einbettungsprozess für PFA-fixierte, OCT-eingebettete Proben relativ einfacher und flexibler, was eine schnelle Vorbereitung hochwertiger Schnitte ermöglicht, die sowohl die RNA-Integrität als auch die Gewebemorphologie erhalten. Darüber hinaus wird dieses Protokoll mit einem ultravioletten (UV) laserbasierten LCM-System durchgeführt. Im Vergleich zu Infrarotsystemen bietet UV-LCM eine feinere Schnittauflösung und ermöglicht direkte, kontaktlose Probenentnahme, wodurch Kontaminationen minimiert und für die präzise Isolierung von mikroskaligen Regionen von komplexen Gewebearchitekturengeeignet ist. Daher liegt der operative Wert dieses Protokolls in seiner Fähigkeit, morphologieerhaltende Aufnahmen von mikroskaligen Regionen (~1.000 Zellen) aus PFA-fixierten Leberschnitten durchzuführen. Sie liefert RNA, die für gezielte Genexpressionsanalysen geeignet ist und eine direkte Korrelation zwischen histopathologischen Merkmalen und lokalen transkriptomischen Profilen ermöglicht.

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Laser-Erfassungsmikrodissektion von Mikrogewebe (~1.000 Zellen) aus PFA-fixierten, OCT-eingebetteten Mausleberschnitten, gefolgt von RNA-Extraktion und nachgelagerter Analyse mittels quantitativer Reverse-Transkriptions-PCR und RNA-Sequenzierung. Diese Verfahren können innerhalb von fünf Tagen abgeschlossen werden.

Um die Leser bei der Beurteilung der Anwendbarkeit dieses Protokolls zu unterstützen, werden der wichtigste Anwendungsbereich und die Einschränkungen unten zusammengefasst. Dieses Protokoll ist speziell für hypothesengetriebene, morphologiegesteuerte Probenahmen spezifischer histologischer Regionen aus PFA-fixiertem, OCT-eingebettetem Gewebe optimiert, mit Hauptanwendung in der Mausleber. Sie eignet sich für Forscher, die räumlich aufgelöste transkriptomische Daten mit präzisen histopathologischen Merkmalen in fixierten Proben korrelieren müssen. Der Arbeitsablauf ist besonders wertvoll bei der Arbeit mit archivierten oder klinisch annotierten festen Geweben, bei denen frisch gefrorene Proben nicht verfügbar sind. Dieses Protokoll ist jedoch nicht ideal für Studien, die hochintegre, nicht-fragmentierte RNA (z. B. RNA-Integritätszahl (RIN) > 8) benötigen, da die inhärente Fragmentierung durch chemische Fixierung seine Verwendung in Anwendungen einschränkt, die auf vollständige Transkripte angewiesen sind.

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Protocol

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Alle Verfahren für den Umgang und die Pflege von Tieren wurden gemäß ethischen Richtlinien durchgeführt und vom Animal Ethics Committee der Southern Medical University genehmigt. Die beschriebene Methode verwendete erwachsene männliche C57BL/6J-Mäuse und wurde auf einer fettreichen, zuckerreichen, cholinarmen Ernährung gehalten, um metabolisch assoziierte Steatohepatitis (MASH) zu modellieren. Vor der Entnahme von Lebergewebe wurden die Tiere durch Enthauptung eingeschläfert.

1. Herstellung eines PFA-fixierten Probens

  1. Frische Lebergewebeproben (einzelne Lappen, 5 mm Dicke oder weniger) in 30 ml kalten 4%-PFA (frisch vorbereitet) bei 4 °C für 24 Stunden fixieren.
    HINWEIS: Es wird empfohlen, die Leber mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, 1×, typischerweise bestehend aus 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄ und 1,8 mM KH₂PO₄, pH 7,4) Lösung bei 1× Konzentration für 5 Minuten zu perfundieren, gefolgt von einer Perfusionsfixierung mit 4 % PFA für 5 Minuten. Alternativ kann das Gewebe auch in 10%iger Formalinlösung fixiert werden.
    VORSICHT: PFA-Fixativ ist giftig. Alle PFA-Abfälle müssen in einem ausgewiesenen, ordnungsgemäß gekennzeichneten Chemikalienabfallbehälter gesammelt werden, der den institutionellen und lokalen Vorschriften entspricht.
  2. Waschen Sie die fixierten Gewebeproben 3× Mal für 5 Minuten mit RNase-freier 1× PBS-Lösung.
  3. Setzen Sie das fixierte Lebergewebe in ein 50-ml-Rohr mit 50 ml 30%-Saccharose (frisch in steriler 1× PBS vorbereitet). Halten Sie die Proben 10–12 Stunden bei 4 °C.
  4. Entferne die Gewebeproben aus der Saccharoselösung. Schneiden Sie die Proben, um leicht handhabbare Blöcke zu erhalten (ca. 5 mm × 3 mm × 5 mm), und betten sie dann in eine Kryomold (7 mm × 7 mm × 5 mm) ein, die OCT-Substanz enthält.
    HINWEIS: Passen Sie die Gewebeausrichtung bei Bedarf mit einer Zange an.
  5. Fügen Sie die OCT-Verbindung darauf hinzu, um die Gewebeproben vollständig zu bedecken, und legen Sie den in OCT eingebetteten Gewebeblock sofort auf flüssigen Stickstoff oder Trockeneis, um die OCT-Verbindung schnell einzufrieren und einen festen Block zu bilden. Dieses schnelle Einfrieren ist unerlässlich, um hochwertige Kryosektionen zu erhalten.
    VORSICHT: Tragen Sie kryogen-resistente Handschuhe, um die Hände beim Umgang mit kryogenen Materialien zu schützen.
  6. Platzieren Sie die in OCT eingebetteten Blöcke bei -80 °C bis zur Kryosektion.

2. Kryosektion zur Lasererfassungsmikrodissektion

  1. Setzen Sie die Polyethylen-Naphthalat-(PEN)-Objektträger 30 Minuten lang UV-Licht aus, dann beschichten Sie die Objektträger mit 0,1 mg/mL Poly-L-Lysin und anschließend an der Luft trocknen. Dann versiegeln Sie die Kanten des PEN-Membranschlitten mit einem neutralen Montagemedium.
    HINWEIS: UV-Bestrahlung und Poly-L-Lysin-Behandlung von PEN-Membranobjektträgern können die Haftung von Gewebeproben an den PEN-Membranobjektträgern verbessern. Das Abdichten des Umrandes mit einem neutralen Montagemedium verhindert das Eindringen von Wasser oder die Bildung von Blasen unter der Membran, was für die Aufrechterhaltung der LCM-Effizienz entscheidend ist.
    VORSICHT: Haut und Augen vor UV-Licht schützen. Tragen Sie UV-blockierende Schutzbrillen oder einen Gesichtsschutz (für UV-Schutz zugelassen) sowie einen Laborkittel, Nitrilhandschuhe und lange Ärmel, um die freiliegende Haut zu bedecken.
  2. Wischen Sie alle zugänglichen Oberflächen des Kryostats und alle Werkzeuge mit einem RNase-Dekontaminationsmittel ab und reinigen Sie die Bürste mit 75 % Ethanol.
    VORSICHT: Entsorgen Sie gebrauchte Ethanoltücher und -lösungen gemäß den örtlichen institutionellen Umweltschutz- und Sicherheitsvorschriften.
  3. Lassen Sie das Instrument bei −20 °C erreichen und stabilisieren.
  4. Entnehmen Sie die Leberproben bei -80 °C und legen Sie sie mindestens 15 Minuten in den Kryostat.
  5. Tragen Sie eine dünne Schicht (2–3 mm) der OCT-Verbindung auf die Oberfläche der Probestufe auf. Stellen Sie die Probenstufe auf ein Schnellgefrierregal (oder in die Kryostatkammer), um die OCT-Schicht vorab zu verfestigen.
  6. Trage eine kleine Menge OCT auf die vorverfestigte OCT-Schicht im Probestadium auf. Holen Sie den ausgeglichen Gewebeblock (aus Schritt 2.4) heraus und legen Sie den Block sofort horizontal auf diesen OCT, halten Sie ihn 10–15 Sekunden an Ort und Stelle, um partielles Einfrieren und Haftung zu ermöglichen. Sobald es befestigt ist, montiert man die Probenstufe (mit dem befestigten Gewebeblock) auf den Kopf des Kryostatprobens.
  7. Führe die Klinge vorsichtig zwischen die Klemmplatten und die Rückplatten von einer Seite des Kryostats ein und klemme dann den Klemmhebel.
  8. Stellen Sie die Dickeneinstellung des Kryostats auf 10 μm ein.
    HINWEIS: Passen Sie die Schnittdicke für das Gewebe nach Bedarf an, halten Sie die Dicke jedoch zwischen 5 und 15 μm19.
  9. Schneiden und montieren Sie die Abschnitte direkt auf die vorbehandelten PEN-Membran-Objektträger in der Kryostatkammer, die bei -20 °C gehalten wird.
    HINWEIS: Jeder PEN-Membran-Objektträger kann 6–8 Gewebeschnitte aufnehmen. Es wird empfohlen, den gesamten Schnittvorgang innerhalb von 1 Stunde abzuschließen. Die Begrenzung der Schnittzeit minimiert die Gewebeexposition gegenüber Umgebungsbedingungen und verringert so das Risiko von RNA-Abbau, Gewebedehydration und morphologischen Artefakten, die entscheidend für die Erhaltung der RNA-Qualität und der histologischen Integrität für LCM- und nachgelagerte Analysen sind.

3. Hämatoxylin-Färbung für Laser-Capture-Mikrodissektion

  1. Tauen Sie die Objektträger 20 Minuten bei Raumtemperatur (RT) auf, bevor Sie sie verwenden.
  2. Wasche die Objektträger mit RNase-freiem 1× PBS (3 Mal, jeweils 10 Sekunden).
  3. Tauchen Sie die Gewebeobjektträger für 5–10 Sekunden in gefilterte Mayer'sche Hämatoxylinlösung (bestehend aus 1,0 g/L Hämatoxylin, 0,2 g/L Natriumiodat, 50 g/L Aluminiumammoniumsulfatdodecahydrat, 50 g/L Chloralhydrat und 1,0 g/L Zitronensäure).
    HINWEIS: Führen Sie die Hämatoxylin-Arbeitslösung vor der Färbung durch eine 0,22 μm große Spritzenfiltermembran.
  4. Waschen Sie die Objektträger mit RNase-freiem Wasser (3 Mal, jeweils 10 Sekunden), um die restliche Hämatoxylinlösung zu entfernen.
  5. Beurteilen Sie die Färbungsqualität unter dem Mikroskop.
    HINWEIS: Optimal gefärbte Kerne sollten vor klarem Hintergrund klar blau-violett erscheinen. Unzureichende Färbung führt zu schwachen Kernen, während Überfärbung zelluläre Details verdeckt. Nur Objektträger, die diese optimalen Färbungskriterien erfüllen, sollten zum nächsten Schritt übergehen.
  6. Trockne die Objektträger mit saugfähigem Papier und trockne sie dann vollständig an der Luft (10–15 Minuten).
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Objektträger vollständig getrocknet sind, bevor Sie mit LCM beginnen. Dann werden die Objektträger in die 50-mL-Zentrifugenröhren gelegt und vorübergehend auf Eis gelagert, bis LCM durchgeführt wird.

4. Lasererfassungsmikrodissektion

HINWEIS: Die Dauer des LCM-Experiments für jeden Objektträger sollte zwischen 30 Minuten und 1 Stunde gehalten werden. Es wird empfohlen, das gesamte LCM-Experiment innerhalb von 4 Stunden abzuschließen. Diese Grenze wird so gesetzt, dass die RNA-Degradation bei RT minimiert und das Verdampfen des Sammelpuffers in der Röhrenkappe verhindert wird, was für eine effiziente Probenentnahme entscheidend ist. In der Praxis kann die Zielerträge von etwa 1.000 Zellen aus morphologisch definierten Regionen zuverlässig innerhalb von 4 Stunden entnommen werden.

  1. Wischen Sie die Oberflächen des Laborwerks mit dem RNase-Dekontaminationsmittel ab.
  2. Schalten Sie den Controller ein und lassen Sie das Mikroskop seinen Initialisierungsprozess abschließen.
  3. Drehen Sie die Taste im Uhrzeigersinn von der Aus- zur Ein-Position , um das Lasersystem zu starten.
    HINWEIS: Das Lasersystem benötigt etwa 10 Minuten zum Aufwärmen.
  4. Schalte den Computer ein und öffne die LCM-Software, warte dann, bis der Initialisierungsprozess abgeschlossen ist.
  5. Führen Sie ein steriles 0,2-ml-PCR-Röhrchen (Sammelröhrchen) in das Sammelgerät ein.
  6. Fügen Sie 10 μL eines Proteinase-K-Verdauungspuffers (siehe Materialtabelle) an die Kappe des PCR-Röhrchens hinzu.
    HINWEIS: Das Gesamtvolumen des Proteinase-K-Verdauungspuffers wird in einem weiteren Schritt (siehe Schritt 5.4.1) im Rahmen des vollständigen Lyseprozesses auf 150 μL erhöht.
  7. Laden Sie das Sammelgerät in den Probenhalter des Mikroskops.
  8. Im Fenster "Sammler ändern " wählen Sie zunächst die Schaltfläche "Zum Referenzpunkt verschieben " aus. Als Nächstes stellen Sie den Kamerafokus an, um eine klare Sicht auf den Referenzpunkt zu gewährleisten. Falls nötig, verwenden Sie die Pfeile im Fenster, um den Referenzpunkt im Sichtfeld zu zentrieren.
  9. Laden Sie einen Gewebeschnitt in den Probenhalter, achten Sie darauf, dass der Gewebeschnitt mit der Vorderseite nach unten ausgerichtet ist und das Etikett rechts angebracht ist.
  10. Wählen Sie die 10× Objektivlinse, identifizieren und markieren Sie Interessenbereiche mit spezifischen pathologischen Merkmalen, wie etwa mikrovesikulärer Steatose (gekennzeichnet durch Hepatozyten mit zahlreichen kleinen, klaren zytoplasmatischen Vakuolen und zentral gelegenen Zellkernen). Dann gehe ich zum Lasermenü und klicke auf die Schaltfläche Kalibrieren . Bestätigen Sie die Meldung auf dem Bildschirm, indem Sie Ja auswählen, und fahren Sie mit der Kalibrierung fort.
    HINWEIS: Die 10×-Objektivlinse ist nicht ausschließlich für die Mikrodissektion geeignet; Andere Vergrößerungsobjektive (z. B. 20×) können basierend auf der Probenschärfe und der gewünschten Auflösung ausgewählt werden.
  11. Im Laserbedienfeld stellen Sie die Schneidparameter ein: Laserleistung = 50, Apertur (Laserstrahldurchmesser) = 5 und Geschwindigkeit = 9.
    HINWEIS: Die oben aufgeführten Parameterwerte dienen als Referenz für das UV-LCM-System mit den in diesem Protokoll verwendeten Gewebeproben. Nutzer anderer UV-LCM-Systeme sollten diese als Ausgangspunkt betrachten und werden wahrscheinlich die Einstellungen empirisch anpassen müssen. Optimale Einstellungen können je nach Gewebetyp, Schnittdicke und anderen LCM-Systemen variieren.
  12. Zeichne einen Kreis um den Zielbereich mit der Grafikleiste. Wählen Sie die Einzelform aus, klicken Sie auf die Schaltfläche Start Cut, um LCM durchzuführen, und positionieren Sie dann das Sammelgerät, um das dissektionierte Gewebe zu sammeln.
    HINWEIS: Eine erfolgreiche Ablösung wird durch eine Trennung des ausgewählten Bereichs angezeigt, oft mit einer sichtbaren Lücke oder Fragmentbewegung. Zur Konsistenz sammeln Sie aus einer vordefinierten Anzahl von Regionen ähnlicher Größe pro Stichprobe. Wenn sich der Zielbereich nicht automatisch löst, klicken Sie auf die Schaltfläche "Bewegen und Schneiden ", um das Exemplar manuell mit der Maus zu schneiden. Für eine genauere Schätzung der Zellenzahl kann LCM-Software automatisch die gesamte Schnittfläche aufzeichnen. Dieser Wert kann durch die durchschnittliche Querschnittsfläche einer Zielzelle geteilt werden, um die Gesamtzahl der erfassten Zellen ungefähr zu bestimmen.
    VORSICHT: Während des LCM-Prozesses sollten Sie nicht direkt auf den Laserstrahl starren, um einer Laserstrahlenbelastung zu entgehen.
  13. Optional können Sie ein Vorher-Nachher-Bild der Sektionsstätte aufnehmen, indem Sie im Dateimenü den Befehl "Bild speichern" auswählen. Im Dialogfeld wählen Sie einen Speicherort, einen Dateinamen und speichern Sie in einem bevorzugten Format (z. B. .tif).
  14. Nachdem die gewünschte Anzahl von Zellen gesammelt ist, klicke auf die Entladungs-Schaltfläche, um den Kollektor aus der Stufe zu entfernen. Vor dem Abschließen des PCR-Röhrchens sollte geprüft werden, dass das Puffervolumen der Proteinase-K-Vergärung in der Kappe bei 10 μL bleibt; den Puffer auffüllen, falls während der LCM Verdunstung aufgetreten ist (siehe Schritt 4.6).
    HINWEIS: Das Hinzufügen von 10 μL des Puffers stellt sicher, dass die Kappenoberfläche vollständig benetzt ist, was den effizienten Transfer des mikrodissektionierten Gewebepellets während der Zentrifugation in Schritt 4.16 erleichtert.
  15. Wirbel die Sammelröhren gründlich aus.
  16. Drehen Sie die Sammelröhren kurz und lagern Sie die Probenröhren bei -80 °C bis zur RNA-Extraktion.
    HINWEIS: Wiederholen Sie die Schritte 4.5 bis 4.16 für die nächste Probe. Das Protokoll kann bis zur RNA-Extraktion pausiert werden.

5. Gesamt-RNA-Extraktion mikrodissektionierter Proben

  1. Wischen Sie die Oberflächen des Laborwerks mit dem RNase-Dekontaminationsmittel ab.
  2. Übertragen Sie die LCM-Proben aus dem -80 °C Gefrierschrank in ein Eisbad. Falls gewünscht, können verschiedene Chargen derselben aufgenommenen Proben zusammengelegt werden.
  3. Inkubieren Sie die mikrodissektionierten Probenröhrchen kopfüber bei 42 °C für 30 Minuten.
    HINWEIS: Diese Inversion stellt sicher, dass nach kurzer Zentrifugation (Schritt 4.16) noch an der Kappe haftendes Gewebe in den Verdauungspuffer freigesetzt wird. Dies gewährleistet den maximalen Probentransfer in den Puffer vor der Volumenanpassung und der Hochgeschwindigkeitszentrifugation in Schritt 5.4.1.
  4. Isolieren Sie Gesamt-RNA aus LCM-Proben mit einem Standard-RNA-Extraktionsset, das für fixierte Gewebe optimiert ist (siehe Materialtabelle).
    1. Stellen Sie das Volumen in jedem Probenröhrchen mit dem Proteinase-K-Verdauungspuffer auf 150 μL an (siehe Materialtabelle). Drehen Sie die Röhren bei 11.000 × g (1 Min) und übertragen Sie die Proben dann in ein steriles 1,5-mL-Rohr.
    2. Fügen Sie pro Tube 10 μL Proteinase K (20 mg/mL) hinzu und mischen Sie die Proben dann vorsichtig durch wiederholtes Pipetteren. Dies führt zu einem Endvolumen von 160 μL und einer endgültigen Proteinase-K-Konzentration von etwa 1,25 mg/mL in der Verdauungsreaktion pro Probe.
    3. Führen Sie eine zweistufige Probeinkubation durch: zuerst bei 56 °C für 15 Minuten, gefolgt von 15 Minuten bei 80 °C. Während jeder Inkubation sollten die Röhren alle 5 Minuten kurz vortexen.
      HINWEIS: Für den optimalen Arbeitsablauf verwenden Sie zwei vorgeheizte Wasserbäder. Wenn Sie ein einzelnes Bad verwenden, pausieren Sie nach der 56 °C Inkubation: Halten Sie die Proben auf RT, während das Bad auf 80 °C erhitzt, und fahren Sie dann fort.
    4. Stellen Sie die Proben für 3 Minuten auf Eis, gefolgt von einer Zentrifugation bei 20.000 × g (15 Minuten).
    5. Saugen Sie das geklärte Supernatant in ein neues 1,5-ml-Rohr und achten Sie darauf, das Pellet zu vermeiden.
    6. Fügen Sie jeder Probe 16 μL DNase-Inkubationspuffer und 10 μL DNase-I-Enzym (2,73 Einheiten/μL, siehe Materialtabelle) hinzu. Dann mischen Sie den Inhalt gründlich, indem Sie die Röhrchen sanft umdrehen. Dies führt zu einem Endvolumen von 186 μL und einer endgültigen DNase-I-Konzentration von etwa 0,15 Einheiten/μL in der Verdauungsreaktion pro Probe.
    7. Führe eine schnelle Drehung durch, um Restflüssigkeit aus den Rohrwänden aufzufangen.
    8. Inkubiere die Probenröhrchen bei RT für 15 Minuten.
    9. Übertragen Sie 320 μL eines Salzgehalts-Waschpuffers (siehe Materialtabelle) auf jede Probe und mischen Sie die Proben gründlich. Dies führt zu einem Endvolumen von 506 μL pro Probe.
    10. Übertragen Sie 720 μL absolutes Ethanol auf jede Röhre, mischen Sie die Proben durch Pipettieren (keine Zentrifugation) und fahren Sie sofort fort. Dies ergibt ein Endvolumen von 1.226 μL pro Probe.
      VORSICHT: Absolutes Ethanol ist hochentflammbar. Sammeln Sie Abfallethanol in einem ausgewiesenen, nicht halogenierten organischen Lösungsmittelbehälter zur ordnungsgemäßen Entsorgung.
    11. Übertragen Sie 700 μL der Probenmischung in eine Reinigungssäule (in einem 2-mL-Sammelrohr platziert, siehe Materialtabelle). Schließen Sie vorsichtig den Deckel und zentrifugieren Sie bei 8.000 × g (15 s).
    12. Entsorge den Durchfluss des Sammelrohrs. Behalte die Reinigungssäule bei.
    13. Wiederholen Sie die Schritte 5.4.11 bis 5.4.12.
    14. Füge 500 μL ethanolbasierten Waschpuffer (siehe Materialtabelle) zu jedem Probenröhrchen hinzu. Schließen Sie die Deckel vorsichtig und zentrifugieren Sie bei 8.000 × g (15 s). Dann entsorgt man den Durchfluss des Sammelrohrs.
    15. Wiederholen Sie Schritt 5.4.14 in seiner Gesamtheit, mit der einzigen Änderung, die Zentrifugationszeit auf 2 Minuten bei 8.000 × g zu erhöhen.
    16. Übertragen Sie jede Reinigungssäule auf ein neues 2,0-mL-Rohr. Zentrifugiere bei 14.000 × g (5 min) mit geöffnetem Deckel und entsorge dann das Rohr und die Restflüssigkeit.
    17. Übertragen Sie jede Reinigungssäule auf ein neues 1,5-mL-Rohr. 16 μL RNase-freies Wasser auf die Membran pipetten, die Kappe schließen und bei 14.000 × g (5 min) zentrifugieren, um die Eluation der gesamten RNA zu erleichtern.
      HINWEIS: Bewahren Sie alle eluierten RNA-Proben für die Schritte 5.5 und 5.6 auf Eis, um den Verfall zu verhindern.
  5. Quantifizieren Sie die RNA-Proben und überprüfen Sie die Reinheit (A260/A 280-Verhältnis ) mittels Spektrophotometrie.
    HINWEIS: Die Messung von Konzentration und Reinheit (A260/A 280-Verhältnis ) in diesem Schritt zusammen mit der Integritätsbewertung in Schritt 5.6 dient als maßgebender quantitativer Prüfpunkt für eine erfolgreiche RNA-Wiederherstellung. Ein klares RNA-Eluat wird erwartet.
  6. Führen Sie eine Agarosegel-Elektrophorese mit einer Gelkonzentration von 1 % durch und bestimmen Sie die RNA-Integritätszahl (RIN) mit einem Bioanalyzer-System zur Bewertung der RNA-Qualität.
  7. Lagern Sie die RNA-Proben bei -80 °C bis zur Durchführung von qRT-PCR oder RNA-Seq.

6. RNA-Analyse

HINWEIS: qRT-PCR wird in den Schritten 6.1 und 6.2 beschrieben, und RNA-Seq in Schritt 6.3.

  1. Bereite die Umkehr-Transkriptionsreaktionsmischung vor und gib pro Reaktion auf Eis 50 ng Gesamt-RNA hinzu. Führen Sie die Reverse-Transkriptionsreaktion mit einem thermischen Zyklus gemäß den bereitgestellten Anweisungen aus (siehe Materialtabelle).
  2. Auf Eis bereiten Sie quantitative PCR-Mastermischung für β-Actin gemäß den Anweisungen des Herstellers vor (siehe Materialtabelle für Grundierungen). Führen Sie eine Echtzeit-PCR-Amplifikation auf einem quantitativen PCR-System nach dem vom Hersteller empfohlenen Zyklusprotokoll mit 10 ng cDNA pro Reaktion durch.
  3. Mit einem Low-Input-Stranged Kit (siehe Materialtabelle) konstruieren Sie RNA-Seq-Bibliotheken aus 50 ng Gesamt-RNA. Bestimmen Sie die Bibliotheksgröße und -konzentration mit einem Bioanalysator-System (siehe Materialtabelle) und führen Sie dann eine gepaarte Endsequenzierung auf einer Hochdurchsatzplattform durch (siehe Materialtabelle).

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Der experimentelle Workflow, der PFA-Fixierung, 30%ige Saccharosedehydrierung, OCT-Einbettung und Kryosektion, Hämatoxylinfärbung, Identifikation und präzise Erfassung der Zielregion (~1.000 Zellen) durch LCM, Zelllyse, RNA-Isolierung, RNA-Qualitätskontrollmetriken und die beiden wichtigsten analytischen Anwendungen umfasst, ist in Abbildung 1 dargestellt. Der mit Hämatoxylin gefärbte Leberschnitt auf dem PEN-Objektträger ist unter dem Mikroskop vor (

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Stärke von LCM liegt in der präzisen, in situ Erfassung ausgewählter Zellen oder Geweberegionen, was die Untersuchung spezifischer Bereiche innerhalb eines heterogenen Gewebes erleichtert. Doch der geringe Probenertrag, der zeitaufwändige Prozess, die hohen Kosten und der Bedarf an spezieller Ausrüstung schränken die weitverbreitete Anwendung dieser Technik in Laborenein. In dieser Studie wurde das LCM-RNA-Protokoll etabliert, um wichtige historische ...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde teilweise durch Fördermittel der National Natural Science Foundation of China (82070589), der Guangdong Natural Science Foundation (2022A1515010218) und des Guangzhou Science and Technology Plan Project (206077078001) an Prof. Yan Wang unterstützt. Wir sind dem Biomedical Research Center der Southern Medical University für die technische Unterstützung und den Zugang zum Laser-Capture-Mikrodissektionssystem dankbar.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Material
0,2 ml DünnwandröhrenAxygenPCR-02-CRöhren zur LCM-Sammlung
1,5 mL ZentrifugenröhreAxygen339653
4 % ParaformaldehydLeageneDF0135
50 mL ZentrifugenrohrThermoFisher Scientific339653
DEPC (Diethylpyrocarbonat)SigmaD-5758
DNase-I-VerdauungssetQiagen73504Ein Bauteil des RNeasy FFPE Kit enthält DNase I Standardlösung und DNase Booster Buffer
Ethanol (100 %)Thermo Fisher ScientificBP2818Gereinigt für Molekularbiologie
Ethanolbasierter WaschpufferQiagen73504Puffer-RPE (Komponente des RNeasy FFPE Kits)
HochsalzwasserpufferQiagen73504Puffer-RBC (Komponente des RNeasy FFPE Kits)
Niedrigprofilige Mikrotom-KlingenLeica Biosystems819
Mayer' s HämatoxylinLeageneDH0001
OCT-VerbindungSakura4583
PEN-membranbeschichtete RutscheLeica11505188
Phosphatgepufferte KochsalzlösungLeageneCC0010DNase/RNase-frei
Poly-L-lysinMacklinP875131S
Proteinase-K-VerdauungspufferQiagen73504Puffer-PKD (Komponente des RNeasy FFPE Kits)
ReinigungssäuleQiagen73504RNeasy MinElute-Spin-Säule (Komponente des RNeasy FFPE Kits)
Quantitativer PCR-MastermixTakara-BiografieRR820ATB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)
Reverse-Transkriptions-KitQiagen205411QuantiNova Reverse-Transkriptions-Kit
RNA-ExtraktionskitQiagen73504RNeasy FFPE-Kit
RNA-Sequenzierungs-Kit (Niedrig-Input, Strang)Takara-Biografie634412SMARTer-Strang-Total-RNA-Seq-Kit – Pico-Eingabe-Säugetier-V2
RNase-DekontaminationsmittelSolarbioSR0040Reinigung
SucroseMacklinS818049
Tiere und Futter
Maus: C57BL/6JLabortierzentrum der Provinz Guangdong03
Spezialdiät & Trinkwasser
Fettreiche, cholinarme Ernährung (Basisdiät)TROPHIC Animal Feed High-Tech Co., Ltd.TP36310MMakronährstoffe: Protein, 14 kcal%; Kohlenhydrate, 26 kcal%; Fett, 60 kcal%)
Zuckerhaltiges TrinkwasserMacklinN/A (intern vorbereitet)Eine Mischung aus D-Glukose (Macklin, Cat# F87500) und D-Fruktose (Macklin, Cat# S818049) wurde dem autoklavierten Trinkwasser mit einer Endkonzentration von 42 g/L zugesetzt, mit einem Glukose-Fructose-Verhältnis von 55:45 (w/w)
Mausprimer
β-actin (Vorwärts: AGAGGGAAATCGTGCGTGAC )BGI-SequenzierungAngepasstHPLC gereinigt
β-actin (Rückwärts: CAATAGTGATGACCTGGCCGT)BGI-SequenzierungAngepasstHPLC gereinigt
Ausrüstung
Kryostat-MikrotomLeica BiosystemsCM3050 S
Bioanalysator-SystemAgilentG2939BA
Hochdurchsatz-SequenzierungsplattformIllumina; Inc.NovaSeq 6000 System
Lasererfassungs-MikrodissektionssystemLeica MicrosystemsLeica LMD6500
Quantitatives PCR-SystemAngewandte BiosystemeQuantStudio 5 Echtzeit-PCR-System
SpektrophotometerThermoFisher ScientificNP80NanoDrop
Thermischer ZyklerBioRadT100
Software
Adobe Illustrator CC 2019 (Version 23.0.2)Adobehttps://www.adobe.com/products/illustrator.html
GraphPad Prism (Version 8.3.0)GraphPad-Softwarehttps://www.graphpad.com

References

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