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Einzelzell-RNA-Sequenzierung zur Profilierung ganglionärer und aganglionärer Kolonsegmente von Patienten mit Hirschsprung-Krankheit

DOI:

10.3791/69825

⸱

May 22nd, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Gastrointestinal Surgery, The Second Affiliated Hospital of Zunyi Medical University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll beschreibt einen Single-Cell-RNA-Sequenzierungs-Workflow, um die Immunzellinfiltration und zelltypspezifische transkriptionelle Unterschiede zwischen ganglionären und aganglionären Colonsegmenten bei der Hirschsprung-Krankheit zu analysieren.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Hirschsprung-Krankheit (HSCR) ist eine angeborene Darmmotilitätsstörung, die durch das Fehlen enterischer Neuronen im distalen Darm gekennzeichnet ist. Im Vergleich zur Bulk-RNA-Sequenzierung ermöglicht die Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) eine Genexpressionsprofilierung auf Einzelzellebene, wodurch zelluläre Heterogenität aufgelöst wird, die in populationsgemittelten Analysen maskiert wird. Ein standardisierter scRNA-seq-Workflow wurde eingerichtet, um die transkriptionelle Landschaft ganglionärer und aganglionärer Segmente von Patienten mit HSCR zu charakterisieren. Darmgewebe wurden gesammelt, und Hämatoxylin- und Eosin-Färbungen wurden durchgeführt, um ganglionäre und aganglionäre Regionen zu identifizieren. Gewebe wurden enzymatisch und mechanisch in Einzelzell-Suspensionen dissoziiert, gefolgt von Filtration, Viabilitätsbewertung und dem Aufbau einzelzelliger Transkriptombibliotheken. Bibliotheken, die die Qualitätskontrolle bestanden, wurden sequenziert, und Rohdaten wurden für Zellquantifizierung und Qualitätsfilterung verarbeitet, um minderwertige Zellen und technische Artefakte zu entfernen. Nach Normalisierung und Dimensionsreduktion wurden die Zellen gruppiert und basierend auf etablierten Markergenen annotiert. Downstream-Analysen verglichen die Zelltypzusammensetzung zwischen ganglionärem und aganglionärem Gewebe und identifizierten differenziell exprimierte Gene innerhalb wichtiger Immunzell-Subsets. Die Ergebnisse zeigen erhebliche Unterschiede in der Immunmikroumgebung zwischen ganglionären und aganglionären Segmenten im HSCR.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Hirschsprung-Krankheit (HSCR) ist eine der häufigsten angeborenen Darmmotilitätsstörungen mit einer Inzidenz von etwa 1 von 5.000 Lebendgeburten weltweit1. Die Erkrankung entsteht durch das Versagen der enterischen Neuralkammzellen (ENCCs), in den Embryonalen Wochen 5–12 in den distalen Darm zu migrieren, was zum Fehlen enterischer Ganglien in den betroffenen Segmenten2 führt. Das aganglionäre Segment weist folglich anhaltende spastische Kontraktion und eine beeinträchtigte Peristaltik auf, was zu einer proximalen Darmerweiterung führt. Klinisch äußert sich dies als funktionelle Verstopfung, die Verstopfung, Bauchdehnung und Erbrechen verursacht und in schweren Fällen lebensbedrohlich sein kann. Die chirurgische Resektion des aganglionären Segments bleibt die Hauptbehandlung für HSCR; Ein erheblicher Anteil der Patienten erlebt jedoch postoperative Komplikationen, darunter Verstopfung, Enterokolitis und Stuhlverschmutzung, was die Lebensqualität erheblich beeinträchtigt3. Zusätzlich kann das Kurzdarmsyndrom (SBS) nach einer umfangreichen Darmresektion auftreten, was zu einer beeinträchtigten Nährstoffaufnahme und erhöhten klinischen Managementproblemen führt. Daher bleiben die Aufklärung der zugrunde liegenden Mechanismen des HSCR und die Identifizierung neuartiger therapeutischer Ziele entscheidende klinische Bedürfnisse.

In den letzten Jahren wurde die Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) weit verbreitet zur Untersuchung krankheitsassoziierter molekularer Mechanismen eingesetzt. Im Gegensatz zur herkömmlichen Bulk-RNA-Sequenzierung ermöglicht scRNA-seq eine Genexpressionsanalyse mit Einzelzellauflösung, wodurch zelluläre Heterogenität und seltene Subpopulationen identifiziert werden können, die in Massenanalysen maskiert werden4. Folglich hat sich scRNA-seq als mächtiges Werkzeug zur Analyse zellulärer Heterogenität und interzellulärer Kommunikation etabliert und so die Forschung in Biologie und Medizin vorangebracht5. Dieser Ansatz hat neuartige pathogene Mechanismen und therapeutische Ziele bei komplexen Krankheiten aufgedeckt, darunter Alzheimer6, rheumatoide Arthritis7, Lungenkrebs8 und Typ-2-Diabetes9.

In dieser Studie wurde scRNA-seq angewendet, um die Transkriptionslandschaft und Infiltrationsmuster der Immunzellen in ganglionären und aganglionären Dickdarmgeweben von Patienten mit HSCR zu charakterisieren. Der Arbeitsablauf bestand aus drei Hauptschritten: Vorbereitung und Qualitätsbewertung von Einzelzellsuspensionen, Aufbau von 3′-Einzelzell-RNA-Seq-Bibliotheken sowie nachgelagerte bioinformatische Analysen. Gewebeproben wurden unmittelbar nach der Resektion in einer speziellen Einzelzell-Konservierungslösung konserviert und innerhalb von 48 Stunden enzymatisch in Einzelzellsuspensionen dissoziiert. Die Zelllebensfähigkeit überstieg 80 %, und die Endkonzentration der Zellen wurde vor der Bibliotheksvorbereitung auf 700–1.500 Zellen/μL angepasst. Die Infiltration von Immunzellen zwischen ganglionären und aganglionären Segmenten wurde verglichen, und Immunzellsubpopulationen mit ausgeprägten transkriptionellen Unterschieden wurden identifiziert. Diese Analysen zeigen Immunzellveränderungen, die mit der Colonpathologie im HSCR verbunden sind.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Studie wurde vom Institutional Ethics Committee des angeschlossenen Krankenhauses der Zunyi Medical University genehmigt (Genehmigungsnummer: KYLL-2024-030). Die Studie entspricht der Erklärung von Helsinki. Eine informierte Zustimmung (mündlich und schriftlich) wurde von allen Teilnehmern und deren Erziehungsberechtigten eingeholt. Tabelle 1 präsentiert die Informationen zu HSCR-Patienten.

Sammelt Darmgewebe, einschließlich ganglionärer und aganglionärer Segmente, von HSCR-Patienten, die diagnostiziert und operiert werden, in der Abteilung für Kinderchirurgie des angeschlossenen Krankenhauses der Zunyi Medical University. Includere ganglionäre und aganglionäre Segmente von zwei männlichen HSCR-Patienten. Detaillierte klinische Informationen finden sich in Tabelle 1. Alle Reagenzien, Chemikalien, Ausrüstungen und Software sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Färbung von Hämatoxylin und Eosin

  1. Gewebesammlung und -fixierung
    1. Fixieren Sie Darmgewebeproben in einer 4%igen Paraformaldehydfixierungslösung für mindestens 24 Stunden.
      VORSICHT: Paraformaldehyd ist giftig und setzt Formaldehyddämpfe frei. Führen Sie alle Verfahren in einer chemischen Abzugshaube durch und verwenden Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung.
    2. Schneiden Sie das Gewebe mit einem Skalpell auf etwa 5 × 5 × 2 mm3 . Lege Taschentücher in Einbettkassetten und spüle sie 24 Stunden unter laufendem Leitungswasser.
      HINWEIS: Entfernen Sie Gewebekanten und bereiten Sie Blöcke mit mindestens einer flachen Oberfläche vor. Bei Ungleichmäßigkeit lege nach dem Abspülen ein Taschentuch zwischen die Filterpapiere.
  2. Graduierte Ethanol-Dehydration
    1. Gewebe nacheinander in Ethanollösungen eintauchen: 70 % Ethanol über Nacht, 80 % Ethanol für 3 Stunden, 90 % Ethanol für 2 Stunden, 95 % Ethanol I für 2 Stunden, 95 % Ethanol II für 1 Stunde, 100 % Ethanol I für 1 Stunde und 100 % Ethanol II für 30 Minuten.
      HINWEIS: Verdünne Ethanol (≥99,7 %) mit ultrareinem Wasser auf die angegebenen Konzentrationen.
      VORSICHT: Führen Sie Ethanolhandhabung in einer chemischen Abzugshaube durch.
    2. Entferne den Austrocknungskorb und lasse zwischen den Schritten gründlich ab.
  3. Räumung
    1. Gewebe für 30 Sekunden auf Xylol übertragen, um Transparenz zu erreichen.
  4. Paraffininfiltration und Einbettung
    1. Schmelzen Sie Paraffinwachs einen Tag im Voraus bei 60 °C. Frisches Wachs wird drei Gefrier-Tau-Zyklen unterzogen, um Blasen zu entfernen. Filtere das geschmolzene Paraffin nach dem dritten Zyklus durch Filterpapier.
    2. Gewebe in reinem Paraffinwachs (Paraffinwachs I) für 1 Stunde infiltrieren.
    3. Infiltrieren Sie Gewebe in einer Paraffinmischung (Paraffinwachs II; reines Paraffinwachs: Bienenwachs = 8:1) für 2 Stunden.
      HINWEIS: Bienenwachs komplett schmelzen und vor der Anwendung filtern.
    4. Gieße Paraffinwachs II in Einbettformen. Stellen Sie Gewebeblöcke aufrecht und flach an, setzen Sie Etiketten ein und lassen Sie sie fest werden.
  5. Sektionierung
    1. Paraffinblöcke schneiden, um glatte Oberflächen zu erhalten, ohne ins Gewebe zu schneiden.
    2. Blöcke auf ein Mikrotome montieren. Passe die Ausrichtung an und entferne überschüssiges Paraffin. Serielle Schnitte mit 4 μm Dicke schneiden. Schwimmteile auf ein 50 °C Wasserbad bringen und auf Glasrutschen übertragen.
    3. Trockne Folien in einem 60 °C Ofen, um Restfeuchtigkeit zu entfernen.
      HINWEIS: Trockene Abschnitte für 12–48 Stunden.
  6. Deparaffinisierung
    1. Führen Sie eine sequentielle Inkubation durch: Xylol I (15 Min), Xylen II (15 Min), 100 % Ethanol I (5 Min), 100 % Ethanol II (5 Min), 90 % Ethanol (5 Min), 80 % Ethanol (5 Min), 70 % Ethanol (5 Min) und destilliertes Wasser (5 Min).
  7. Hämatoxylin-Färbung
    1. Färbe Schnitte mit Hämatoxylin für 50 Sekunden.
    2. 10 Minuten unter laufendem Leitungswasser abspülen.
  8. Eosin-Verfärbung
    1. Beize Abschnitte 40 Sekunden lang mit Eosin.
  9. Dehydrierung
    1. Die Abschnitte werden nacheinander in 95 % Ethanol I (30 s), 95 % Ethanol II (30 s), 100 % Ethanol I (30 s) und 100 % Ethanol II (30 s) eingetaucht.
  10. Räumung
    1. Teile für 10 Minuten in Xylol I und XYLOL II für 10 Minuten übertragen.
  11. Montage und Beobachtung
    1. Fügen Sie Montagemedium hinzu. Decken Sie mit einem Glasdeckel ab und entfernen Sie Luftblasen.
    2. Lass das Montagemedium fest werden. Untersuchen Sie Schnitte unter einem Lichtmikroskop.

2. Einzelzell-RNA-Sequenzierung

  1. Herstellung der Einzellensuspension
    1. Zerkleinere Darmgewebe in ~1 mm3 Fragmente mit einer Schere.
    2. Inkubieren Sie Gewebefragmente in Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM), das 1 mg/mL Kollagenase II und 0,1 mg/mL DNase I enthält, bei 37 °C für 30 Minuten mit sanfter Bewegung auf einer Schaukelplattform (60 U/min).
    3. Beenden Sie die Verdauung, indem Sie ein gleiches Volumen kalten DMEM mit 10 % fetalem Rinderserum (FBS) hinzufügen.
    4. Filtern Sie die Federung durch ein 70-μm-Zellsieb. Zentrifugiere bei 300 × g für 5 Minuten bei 4 °C.
    5. Entsorgen Sie das Supernatant und behalten Sie das Zellpellet. Waschen Sie einmal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), die 0,04 % Rinderserumalbumin (BSA) enthält.
    6. Zellklumpen werden durch sanftes Pipettern getrennt, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten.
    7. Filtern Sie die Suspension durch ein 40 μm Zellsieb.
    8. Zentrifugiere bei 300 × g für 5 Minuten bei 4 °C. Entsorge das Supernatant und sammle das Pellet.
    9. Resuspendiere Zellen in DMEM, die 10 % FBS und 1 % Penicillin–Streptomycin (P/S) enthalten.
    10. Bestimmen Sie die Lebensfähigkeit und Dichte der Zellen mithilfe des Trypan-Blau-Ausschlusses. Proben mit Viabilität >80 % verwenden und die Konzentration auf 700–1.500 Zellen/μL anpassen.
      HINWEIS: Mische Zellsuspension mit Trypan-Blau (1:1) und zähle lebensfähige Zellen mit einem Hämozytometer.
  2. Vorbereitung der Bibliothek
    1. Laden Sie pro Durchgang etwa 15.000 Zellen zur Vorbereitung der Bibliothek ein.
      HINWEIS: In Gelperlen-in-Emulsion (GEM)-Mikrotropfen hybridisiert mRNA zu Poly(dT)-Oligonukleotide auf Gelperlen.
    2. Durchführung von Reverse-Transkription und Amplifizierung von cDNA mittels PCR (95 °C für 10 Minuten; 40 Zyklen à 95 °C für 15 S, 60 °C für 35 S, 72 °C für 25 S; letzte Verlängerung bei 72 °C für 25 S). Verwenden Sie amplifizierte cDNA für den Aufbau von 3′ scRNA-seq-Bibliotheken.
      HINWEIS: Während der cDNA-Synthese wird ein CCC-Überhang hinzugefügt und mit der Template Switching Oligonukleotid-(TSO)-Sequenz kombiniert.
    3. Emulsionen brechen und cDNA aus GEMs wiederherstellen.
  3. Bibliotheks-QC und Sequenzierung
    1. Quantifizieren Sie die Genexpression und bewerten Sie die Fragmentgrößenverteilung.
    2. Führen Sie eine genaue Quantifizierung mit einem fluoreszierenden qPCR-Gerät durch.
      HINWEIS: Stellen Sie eine Bibliothekskonzentration ≥10 nM sicher.
    3. Sequenzbibliotheken mit einem Sequenzierungsinstrument.
      HINWEIS: Lesestruktur: Lesen 1 (26 Basispunkte), Lesen 2 (91 Basispunkte), i7-Index (8 Basispunkte); Zieltiefe ~50.000 Lesungen pro Zelle.
  4. Daten-QC
    1. Richten Sie die Rohlesungen auf die Referenzdatenbank aus. Führen Sie UMI-Zählung durch und erstellen Sie eine Zell-für-Gen-Matrix.
    2. Importergebnisse im AnnData-Format (Annotated Data) für nachgelagerte Analysen durchzuführen.
    3. Führen Sie QC-Filterung basierend auf UMIs, Genzählungen und mitochondrialen Lesungen durch.
      HINWEIS: Doublets entfernen (Scrublet); Zellen mit <200 oder >5.000 Genen ausschließen, total_counts >40.000 oder mt_ratio >20 %.
  5. Dimensionsreduktion und Annotation
    1. Normalisiere die Unique Molecular Identifier (UMI)-Zählungen auf 10.000 pro Zelle.
    2. Identifizieren Sie sehr variable Gene.
    3. Führen Sie eine Hauptkomponentenanalyse (PCA) durch.
    4. Konstruiere einen k-nächstgelegenen Nachbargraphen.
    5. Führe das Einbetten von UMAP durch.
    6. Clusterzellen mit dem Leiden-Algorithmus in Scanpy (v1.9.3).
      HINWEIS: Verwenden Sie sc.pp.neighbors und sc.tl.leiden (Auflösung = 0,5).
    7. Annotieren Sie Zelltypen mit einem Werkzeug, das für die automatisierte, hochpräzise Annotation von Zelltypen in Einzelzell-RNA-Sequenzierungsdaten (scRNA-seq) entwickelt wurde.
  6. Differentialanalyse
    1. Führen Sie eine differentielle Genexpressionsanalyse in R (v4.2.2) mit Seurat (v4.3.0) durch.
      HINWEIS: Verwenden Sie die FindMarkers-Funktion mit dem Wilcoxon-Rangsummentest.
    2. Führen Sie eine GO-Anreicherungsanalyse mit clusterProfiler (v4.8.1) mit EnrichGO durch.
      HINWEIS: Beinhaltet die Kategorien CC, MF und BP.
    3. Führen Sie die KEGG-Signalweg-Anreicherungsanalyse mit clusterProfiler (v4.8.1) mit EnrichKEGG10 durch.

3. Abfallentsorgung

  1. Sammeln Sie paraformaldehyd- und xylenghaltige Abfälle getrennt ein.
  2. Neutralisieren Sie saure Lösungen, wenn es angemessen ist, oder entsorgen Sie sie als gefährliche Abfälle.
  3. Befolgen Sie institutionelle Umwelt-, Gesundheits- und Sicherheitsvorschriften (EHS).

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Results

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Die Färbung von Hämatoxylin und Eosin (HE) (Abbildung 1) zeigte deutliche histologische Unterschiede zwischen ganglionären und aganglionären Segmenten. Im Vergleich zu ganglionären Segmenten zeigten aganglionäre Segmente eine erhöhte schleimhautige Exfoliation, eine deutliche Reduktion der Kelchzellen und submukosalen Neuronen sowie verschwommene Grenzen zwischen Schleimhaut und Muskelschicht. In einer Teilmenge der Schnitte war die Gewebekonservierung subop...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Einzelzell-RNA-Sequenzierung wurde angewandt, um transkriptionelle Merkmale chirurgisch entfernter Colongewebe (ganglionische und aganglionäre Segmente) von Patienten mit Hirschsprung-Erkrankungen 4,5 zu profilieren. Besondere Aufmerksamkeit wurde der Gewebedissoziationsstrategie gewidmet, da Dissoziationsparameter die Zellwiederherstellung, die Zelltyprepräsentation und die RNA-Integrität beeinflussen. Die enzymatischen Verd...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde durch das Guizhou Science and Technology Project (Guizhou Science and Technology Cooperation - Foundation - ZK - [2024] General 344) (an X.F. Yang) und das Zunyi Science and Technology Project Contract (Science and Technology Cooperation) (Zunyi Science and Technology Cooperation HZ (2023) Nr.) unterstützt. (zu Y. Qu).

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Materials

List of materials used in this article
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BienenwachsSinopharm Chemical Reagent CO., Ltd.8012-89-3  https://www.reagent.com.cn/ProductSearch/8012-89-3
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RinderserumalbuminThermofisher30066575  https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/30066575? SID=srch-srp-30066575
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CellTypistN/ANAhttp://celltypist.org/tutorials/onlineguide
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Cluster-Profiler-PaketBioleiterv4.8.1https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/clusterProfiler.html
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Kollagenase IIThermofisher17101015  https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/17101015? SID=srch-srp-17101015
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DNase IThermofisher18047019  https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/18047019? SID=srch-srp-18047019
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TrocknungsofenBORUKDHG-9140A  http://www.shboruike.com/sys-pd/84.html
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Dulbecco' s Modifizierte Eagle MediumThermofisher12491015  https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/12491015
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EthylalkoholSinopharm Chemical Reagent CO., Ltd.10009218  https://www.reagent.com.cn/ProductSearch/10009218
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Fetales RinderserumThermofisherA5669801https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/A5669801
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MontagemediumBeyotimeC0173-100ml  https://m.beyotime.com/mobilegoods.do?method=code& Code=C0173-100ml
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Optisches MikroskopNikonECLIPSE SI  https://www.microscope.healthcare.nikon.com/ja_JP/products/upright-microscopes/eclipse-si
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Paraffinwachs Sinopharm Chemical Reagent CO., Ltd.8002-74-2  https://www.reagent.com.cn/ProductSearch/8002-74-2
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Penicillin– StreptomycinThermofisher15140122  https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/15140122? SID=srch-srp-15140122
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Phosphatgepufferte KochsalzlösungThermofisher10010023  https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/10010023
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Qualitatives FilterpapierSolarbioYA0166https://www.solarbio.com
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R-SoftwarepaketR-Stiftung für statistische Berechnungv4.2.2https://www.r-project.org/
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Rotatorisches MikrotomLeicaLeica RM2125 RTShttps://www.leicabiosystems.com/en-jp/histology-equipment/microtomes/histocore-biocut/
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GewebedehydratorWuhan Junjie Electronics Co., LTDJT-12H  http://www.whjjbl.com/front/page/126495/product_id/46166.html
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GewebeeinbettungsmaschineWuhan Junjie Electronics Co., LTDJB-L8  http://www.whjjbl.com/front/page/126495/product_id/46064.html
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XylenSinopharm Chemical Reagent CO., Ltd.10023418  https://www.reagent.com.cn/ProductSearch/10023418
XylenSinopharm Chemical Reagent CO., Ltd.10023418  https://www.reagent.com.cn/ProductSearch/10023418

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