Visualisierung von Blatt- und Braktealnektaren von Baumwolle mittels digitaler Mikroskopie zur Verbesserung der Punktgenauigkeit und Datenerhaltung

Summary

Hier zeigen wir Schritt-für-Schritt-Prozesse zur Phänotypisierung von Blatt- und Braktealnektarien in Baumwollpflanzen anhand von Bildern, die durch digitale Mikroskopie erzeugt wurden. Dies ist eine effektive Methode, um die Nektaren sowohl von Blättern als auch von Baumwollblättern zu ritzen, da die Informationen gesammelt und in Form von digitalen Bildern erhalten werden können.

Abstract

Nektare sind eigenständige, nektarproduzierende Drüsen, die in vielen Pflanzenarten vorkommen. Nektarien weisen vielfältige Strukturen und Funktionen auf. Bei Baumwolle ist die traditionelle Bewertung des nektarischen Merkmals fehleranfällig, unzuverlässig und hat Einschränkungen, da Phänotypen dieses Merkmals oft mit bloßem Auge nicht sichtbar sind. Die Expression der nektarischen Eigenschaften wird durch Gene Ne1 und/oder Ne2 gesteuert. Darüber hinaus kann die Merkmale-Expression von der Umgebung und den Wachstumsstadien beeinflusst werden, was die Notwendigkeit genauer Bewertungsmethoden betont. Insbesondere führt die phänotypische Bewertung durch digitale Bilder zu einer genaueren Bewertungsmethode für Nektaries. Diese Methode überwindet die Einschränkungen der traditionellen Bewertung, indem sie hochauflösende Bilder erzeugt. Darüber hinaus erleichtert es die Identifizierung und Differenzierung feiner Unterschiede der Expression der nektaren Merkmale, während diese digitalen Bilder für zukünftige Referenzzwecke erhalten bleiben. Diese hier beschriebene Phänotypisierungsmethode lässt sich leicht anpassen, um andere Pflanzenmerkmale wie Drüsen, Haare und Farbe zu bewerten. Diese Bewertungsmethoden können auf andere Pflanzenarten angepasst werden. In diesem Artikel erklären wir Schritt-für-Schritt-Verfahren, wie man Proben aus dem Feld oder Gewächshaus entnimmt, sie mit digitaler Mikroskopie analysiert und diese Bilder für zukünftige Bewertungsanalysen bewahrt. Für diese Methode verwenden wir zum Beispiel die Wertung von Blatt- und Braktealproben von Baumwollpflanzen, um das Vorhandensein von Nektaren (vollständig entwickelt, reduziert und rudimentär) und das Fehlen von Nektaren zu unterscheiden.

Introduction

Pflanzen besitzen spezialisierte Drüsen, sogenannte Nektar, die bei den meisten Angiospermen, einigen Farnen und einigen Gymnospermen 1,2,3,4 Nektar synthetisieren und produzieren. Nektare werden in drei Typen eingeteilt, nämlich mesophylläre, trichomatische und epitheliale Typen, basierend auf dem Ursprung der Zellen, die Nektar⁵ produzieren. Nektaren in Baumwolle sind modifizierte Spaltöffnungen, die aus drüsenartigen Trichomen bestehen, die als Papillen bekannt sind und als trichomatischer Typ ^5,6 eingestuft werden. Die meisten Gossypium-Arten haben Nektaries; Die Anzahl der Nektaren in dieser Gattung variiert jedoch von Art zu Art⁷. Florale Nektiere (FNs) sind häufiger als extraflorale Nektaris (EFNs) bei Pflanzen⁸. Diese Nektaren können überall auf der Pflanze vorkommen, außer bei den Wurzeln ^1,2. Zum Beispiel zeigt Gossypium hirsutum sowohl florale als auch extraflorale Nektaren⁹. Hausbaumwollpflanzen zeigen drei zusätzliche Blüten und einen blütigen Nektar¹⁰. Die drei zusätzlichen floralen Nektare sind Blatt-, Brakteal- und Circumbracteal-Nektare¹¹. Der Blattnektar ist vegetativ und befindet sich typischerweise auf Blättern an der unteren Seite der Mittelrippe, während Braktea- und Circumbraktea-Nektare sich fortpflanzen und sich an der Basis des Hochblatts sowie an der abaxialen Kelchoberfläche entwickeln. Blütennektar ist mit einer Blüte verbunden, die sich an der adaxialen (oberen) Oberfläche des Kelchs entwickelt. Dieses nektarische Merkmal wird von einem einzelnen Genlocus¹² gesteuert. Studien von zwei unabhängigen Forschungsgruppen ergaben, dass das nektarische Merkmal von einem Gen, Ne1 des A-Genoms oder Ne2 des D-Genoms, gesteuert wird, das auf die Chromosomen 12 bzw. 26,^{also 12,13}, abgebildet ist. Dieses Merkmal wird nur in einer doppelt rezessiven Bedingung ausgedrückt, was bedeutet, dass nur eine homozygot rezessive Bedingung das nektarlose Merkmal ausdrückt.

Neben diesen Genen spielen Umweltbedingungen und Wachstumsstadien eine Rolle bei der Steuerung des Ausprägungsgrades. Daher muss es eine genaue Methode geben, um dieses Merkmal zu bewerten. Die aktuelle Studie konzentriert sich auf die Phänotypisierung von Blatt- und Braktealnektaren in Baumwolle. Pflanzen mit sichtbaren nektarproduzierenden Nektarn werden als nektarisch bewertet, während Pflanzen ohne dieses Merkmal als nektarlos^mit 1,2,3,4 bewertet werden. Das Hauptziel dieses Artikels ist es, genaue Bewertungsmethoden des Nektarmerkmals mittels digitaler Mikroskopietechnologie darzustellen. Die traditionelle Bewertung durch direkte visuelle Beobachtung kann mit bloßem Auge nicht leicht Unterschiede in der Expressionsvariation des nektarischen Merkmals in situ erkennen. Diese subtilen Unterschiede in den Expressionen der nektaren Merkmale lassen sich mit digitaler Mikroskopie visualisieren. Zur Veranschaulichung folgt im Baumwollblattnektar die Bewertungsrubrik einer Standardskala von 1 bis 4, wobei 1 keinen Nektar darstellt, 2 einen Ausstoß im Venenotyp, 3 unterentwickelte Pads oder Ridges ohne Nektar und 4 vollständig gebildete/vollständige Nektarplatten mit klaren Pads und Ridges¹³. Diese Phänotyp-Bewertung wurde mithilfe digitaler Bilder der Blattnektarien erstellt [unter Verwendung digitaler Bilder der abaxialen (unteren) Seite der Blattmittelrippe]. Im Allgemeinen wird das Fehlen von Nektaren mit 0 bewertet, aber für statistische Signifikanz kann der Wert 0 nicht verwendet und durch den Wert 1 ersetzt werden. Daher wurde der Phänotypisierungsbereich von der standardisierten Klassifikation 0-4¹³ auf 1-4 geändert. Die Bewertungsrubrik für Blumen folgt einem ähnlichen Muster von 1 bis 4, wobei 1 für nektarlose steht, keine auffälligen Drüsen ohne Polster oder Kämme, 2 für verschleierte Drüsen, bei denen Nektarmarkierungen nur subtile Polstermarkierungen und keinen Nektar haben, 3 für schlecht geformte Drüsen mit schwachen oder fehlenden Rippen und/oder Polster und 4 für vollständig ausgebildete Nektaren mit Nektar. Dieses Bewertungsmuster zeigt 4 für nektarierte Phänotypen (homozygot/heterozygot dominant für eines der Gene), 3, 2 für differenzielle Expression eines nektarischen Merkmals wie bei heterozygoten und 1 für nektarlose (homozygot rezessiv für beide Gene).

Ebenso werden Blumen wie Schritt für Schritt in diesem Artikel beschrieben gesammelt und seziert, um digitale Bilder für das Erzielen von Bracteal-Nektaren zu sammeln. Dieser Phänotyp kann mit dem Mikroskop visualisiert werden, um eine genaue Bewertung zu erzielen, die in Form digitaler Bilder gespeichert werden kann. Bei Baumwolle ziehen Nektarmerkmale nicht nur Bestäuber an, sondern auch Schädlinge, die Ertragsverluste verursachen¹⁴. Um dieses Problem zu lösen, wählten Züchter Pflanzen ohne nektarlose (nektarlose) Eigenschaften als Alternative zur natürlichen Schädlingsbekämpfung ohne den Einsatz chemischer Pestizide aus^9,15. Das Merkmal Nektarlosigkeit wurde ursprünglich eingeführt aus Gossypium tomentosum zu Gossypium hirsutum (kultivierte Upland-Baumwolle)⁸. Diese Bewertungsmethode ist besonders nützlich, um die Trennung der nektarlosen Eigenschaften in Populationen zu identifizieren, die durch das Kreuzen von nektarlosen Eltern mit nektarlosen Eltern entstehen. Als Folge dieser Kreuzungen verschiedener Eltern ist F₂ (Zweite Filialgeneration) zeigt verschiedene Genotypen homozygot nektarisch, heterozygot nektarisch und homozygot nektarlos. Für die Expression eines nektaren Merkmals ist nur ein dominantes Gen erforderlich, das dem Segregationsverhältnis von 15:1 (9:3:3:1) folgt. Daher zeigt 1 von 16 das nektarlose Merkmal in homozygoter rezessiver Bedingung mit Genotyp ne1ne1ne2ne2. Forscher in Zuchtprogrammen beobachteten jedoch mehr nektarlose Linien als das erwartete Verhältnis von 1 zu 16. Das bedeutet, dass das nektarische Merkmal exprimiert wird, wenn die Gene wie folgt exprimiert werden. Ne1Ne1Ne2Ne2, Ne1ne1Ne2ne2, ne1ne1Ne2Ne2, ne1ne1Ne2ne2, Ne1ne1ne2ne2, and ne1ne1ne2Ne2. Das vielfältige Muster der nektarischen Merkmale-Expression in solchen Populationen homozygoter nektarisierter (Ne1Ne1Ne2Ne2), heterozygot nektarisch (Ne1ne1Ne2ne2), und homozygot nektarlos (ne1ne1ne2ne2) können Pflanzen perfekt bewertet werden, indem die in den digitalen Bildern sichtbaren Veränderungen erkannt werden^12,13. Da heterozygoute Pflanzen mit reduziertem Nektar möglicherweise keine nektarartige Eigenschaft zeigen und dem nektarlosen Merkmal ohne Nektar ähneln, stellt die visuelle Phänotypisierung Schwierigkeiten bei der zuverlässigen Auswahl dieses Merkmals dar. Diese Probleme verstärken sich in der späten Wachstumssaison, in der Nektaris in bestimmten Baumwollsorten nicht vorhanden sind. Unterschiede zwischen heterozygoten Pflanzen und homozygoten nektarlosen Pflanzen lassen sich leicht mit digitaler Bildgebung erkennen, da heterozygote Pflanzen kleine oder reduzierte Nektaren zeigen können, während homozygote Pflanzen dieses Merkmal komplett vermissen. Phänotypisch wird das Vorhandensein von Nektar als nektarisch (homozygot/heterozygot mit mindestens einem dominanten Gen) klassifiziert, das Vorhandensein kleiner oder rudimentärer Nektaren als heterozygot und das Fehlen von Nektaren als homozygot nektarlose Pflanzen. Die digitale Bildbewertung reduzierte die ungenaue Bewertung von heterozygoten Pflanzen als nektarlose Pflanzen. Ebenso wird die mittlere Blütephase bevorzugt, wenn das Merkmalsausdruck maximal vorhanden ist. Daher wurden in dieser Phase Blatt- und Blumenproben gesammelt, um diese Phänotypisierungs-Scoring-Experimente für eine genaue und zuverlässige Bewertung der Nektarmerkmale durchzuführen. Darüber hinaus verhindert oder reduziert die Visualisierung von Nektarmerkmalen mittels digitaler Mikroskopie Fehlalarme von Populationen ohne Nektarmerkmale. Diese phänotypische Bewertung des nektarlosen Merkmals wird auch in Kartierungsstudien verwendet, um DNA-Marker zu identifizieren, die mit nektarlosem Merkmal assoziiert sind und die Züchter für die markerunterstützte Selektion (MAS) des nektarlosen Merkmals nutzen können¹³. Diese Bewertungstechnik kann auf andere Pflanzenarten ausgeweitet werden, zusätzlich zur Untersuchung anderer Eigenschaften wie Drüsen, Haare und Farbe. Insgesamt löst die digitale Bildbewertung nicht nur das Problem der ungenauen Nektarmerkmalebewertung durch hochauflösende Bilder, sondern erkennt auch subtile Ausdrucksänderungen und speichert die digitalen Bilder für die spätere Nutzung. Baumwolle mit nektarloser Eigenschaft kann zur Biokontrolle von Schädlingen verwendet werden und beantwortet Forschungsfragen darüber, wie dieses Merkmal vorteilhafte Insekteninteraktionen fördert.

Protocol

1. Gewächshaus-/Feldproben der Blätter (Abbildung 1)

1. Bereiten Sie Musterbeutel mit Zip-Lock-Beuteln mit Musterausweisen vor. Bewahren Sie die Probenbeutel bis zur Verwendung bei Zimmertemperatur auf.
2. Stellen Sie die Kühlbox einen Tag vor der Probenentnahme in den Kühlschrank. Legen Sie ein Kühlpack aus dem Gefrierschrank auf den Boden der Kühlbox. Stellen Sie ein Plastiktablett auf das Kühlpack in der Kühlbox.
   HINWEIS: Jeder tragbare Kühler kann für diesen Zweck verwendet werden. Bevor der Kühler zum Entnahmeort transportiert wird, in den Kühler gefolgt von einem Kunststoffbehälter (diese Trennung verhindert Einfrierschädigungen, die durch direkten Kontakt der Probe mit Eis entstehen).
3. Transporte Kühlboxen und beschriftete Ziplock-Beutel zum Gewächshaus/Feld zur Probenentnahme. Regelmäßige Sprüharbeiten für Feldpflanzen wurden geplant, um schädlingsfreie Proben zu sammeln. Ähnlich wurden bei Gewächshauspflanzen regelmäßige Sprüh- und Düngepläne für gesunde Pflanzen eingehalten.
4. Sammeln Sie junges Blattgewebe aus einem einzelnen, 8 bis 12 Wochen alten Gewächshaus oder aus dem Feld gezüchteten Baumwollpflanzen in den beschrifteten Probenbeuteln.
   1. Wählen Sie die mittlere Blütephase für die Probenauswahl aus, da die Nektar-Eigenschaft in diesem Stadium am höchsten ausgeprägt ist. Wähle junge Blätter aus allen Pflanzen in dieser Entwicklungsphase aus. Neben genetischen und Umwelteinflüssen wird das Nektarmerkmal auch vom Entwicklungsstadium beeinflusst.
   2. Um das Entwicklungsstadium konstant zu halten, um_{verschiedene Genotypen} innerhalb der F2-Population zu vergleichen, entnehmen Sie Blattproben gleichmäßig in einem Stadium, um den Vergleich auf dieses Stadium zu beschränken. Verwenden Sie die Blattgröße von 5 bis 7 cm als Maßstab, aber aus allen Proben können junge Blätter in gleicher Größe entnommen werden. Alte Blätter zeigen die Expression des nektarischen Merkmals, aber in einigen Linien wird das Nektarmerkmal in späteren Entwicklungsstadien nicht mehr gezeigt. Um diese Variation zu vermeiden und die Konsistenz der Datenerhebung zu verbessern, befolgen Sie diese Anweisungen beim Probenentnehmen.
5. Sammeln Sie das Blattgewebe und legen Sie es in den entsprechenden Beutel. Sammeln Sie mindestens 2 Blätter pro Pflanzenprobe.
6. Für das Blattgewebe wählen Sie gesunde Blätter mit 5 bis 7 cm Länge quer über die Blattklinge vom oberen Ast der Pflanze aus.
   HINWEIS: Junge Blätter auf den oberen Ästen werden für alle Proben bevorzugt. Diese Art der Probenentnahme beschränkt nicht nur die Probenahme auf eine bestimmte Entwicklungsphase, sondern reduziert auch Fehler in der Phänotypisierung, indem die Art der Probe konstant bleibt. Weitere Parameter sind leichter Zugang und gesunde Blätter. Ein konsistenter Datenvergleich wird angestellt, wenn mehrere Pflanzenblätter aus derselben Entwicklungsphase gesammelt werden, um genotypbasierte phänotypische Unterschiede in der Population zu identifizieren.
7. Legen Sie jeden versiegelten Probenbeutel zusammen mit dem Blattgewebe in die Kühlbox. Transportiere die Kühlbox ins Labor.
8. Überführen Sie einzelne Proben in den Kühlschrank, um die Kühlbedingungen von 4 °C zu gewährleisten. Bewahren Sie die Proben im Kühlschrank auf, bis die digitale Bildgebung des Nektars erfolgt. Blätter können für die digitale Bildgebung bis zu 2 Tage aufbewahrt werden, aber es ist ideal, am selben Tag oder am folgenden Tag Bilder zu machen.
9. Um eine große Anzahl von Blattproben zu screenen, werden Proben in Chargen gesammelt, um die Bildgebung innerhalb eines Tages nach der Entnahme abzuschließen. Proben in Chargen zu je 10–20 Exemplaren entnehmen oder mehrere Kühler verwenden, um Gewebeschäden oder Faltungen des Gewebes zu verhindern. Bei der Sammlung von Proben sollte auf gute digitale Bilder geachtet werden.

2. Gewächshaus-/Feldproben von Blumen (Abbildung 1)

1. Befolge die Schritte 1.1 bis 1.6. Sammeln Sie Blumen aus einem 8 bis 12 Wochen alten Gewächshaus oder einer Feldbaumwolle. Sammeln Sie mindestens 2 Blumen pro Pflanzenprobe.
   1. Sammeln Sie Blüten, meist von den oberen Ästen, wenn die Pflanzen sich in der Mitte der Blüte befinden. Das Nektarmerkmal zeigt den höchsten Ausdruck in der mittleren Blütephase.
2. Pflücke gesunde Blumen. Leg jede versiegelte Probetüte mit mindestens zwei Blumen in die Kühlbox. Transportiere die Kühlbox ins Labor.
3. Überführen Sie einzelne Proben in den Kühlschrank, um die Kühlbedingungen von 4 °C zu gewährleisten. Bewahren Sie die Proben im Kühlschrank auf, bis die digitale Bildgebung der Bracteal-Nektare erfolgt.
   1. Proben werden am selben Tag oder am folgenden Tag nach der Entnahme verarbeitet. Sammeln Sie Blumenproben, lagern Sie sie bei 4 °C und verarbeiten Sie am selben Tag Braktealnektar. Sammeln Sie Blüten, die später am nächsten Tag oder später in der Woche produziert werden, und verarbeiten Sie sie am selben Tag für die digitale Bildgebung von Bracteal-Nektarien.

3. Erstaufbau des digitalen Mikroskops (Ergänzende Abbildung 1)

HINWEIS: Andere vergleichbare Mikroskope können zur digitalen Aufnahme und Speicherung der Bilder verwendet werden.

1. Schalten Sie das Mikroskop (VHX 600) ein und führen Sie die ersten Schritte durch. Legen Sie ein halb gefaltetes A4-weißes Blatt, das der Größe der Mikroskopbühne entspricht.
2. Stellen Sie das Licht auf der Mikroskopplattform/Bühne mit den kleinen Lichtknöpfen am Konsolencontroller ein.
3. Drehe den Lichtschalter (kleiner Knopf an der Mischpult) auf maximales Licht und den Helligkeitsschalter (großer Knopf am Mischpult) auf mittlere Leistung, indem du den Knopf an der Konsole zu drei Vierteln drehst.
4. Die eingebaute VHX 600-Software zeigt Optionen zur Objektiveinstellung auf dem Computerbildschirm. Stellen Sie das Objektiv auf 10-fache Vergrößerung ein, indem Sie auf dem Bildschirm die 10-fache Objektivoption auswählen. Schalten Sie den Monitor-Powerschalter auf dem Computerbildschirm ein, und das Hauptmenü erscheint, das Optionen für Objektiv und Bildaufnahme anzeigt.
5. Nehmen Sie eine kleine Anzahl von Proben (3 bis 5) aus dem Kühlschrank in die Kühlbox für die digitale Bildgebung. Stelle die Kühlbox mit Proben neben das Mikroskop.
6. Halte das Schneidebrett und die sterile Klinge auf der Werkbank in der Nähe des Mikroskops. Nehmen Sie eine Probe aus dem Kühlraum und nehmen Sie das Gewebe heraus, um mit der digitalen Bildgebung fortzufahren (Abbildung 1).

4. Digitale Bildgebung und Wertung von Blattnektaren (Abbildung 2)

1. Befolge die Schritte 1 und 3. Öffnen Sie den Ziplock-Beutel der Probe und legen Sie die Blattprobe auf das Schneidebrett. Schneiden Sie den Blattstiel mit einer sterilen Klinge ab.
   HINWEIS: Für den sicheren Gebrauch der Klingen tragen Sie Handschuhe und halten Sie die scharfen Kanten der Klinge von Ihren Fingern weg, wobei das Gewebe zwischen den Fingern liegt, während Sie Schnitte machen.
2. Übertragen Sie das Blattgewebe auf das vorgeschnittene weiße Blatt, das auf der Bühne liegt. Drehen Sie das Blattgewebe in der Mitte des Mikroskops mit der abaxialen Seite nach oben.
3. Konzentrieren Sie sich auf die Mittelrippe des Blattes, indem Sie die groben und feinen Einstellungen der Mikroskopknöpfe sanft drehen. Passen Sie weiter an, bis das Bild unscharf ist.
4. Da der Nektar am unteren Ende der Mittelrippe vorhanden ist, halten Sie ihn zentriert dort, wo die Mittelrippe und die sich abweichenden späteren Venen beobachtet wurden. Halte das Blatt zentriert und fokussiert auf der Bühne.
   HINWEIS: Nur ein Blattnektar wird bei Hausbaumwolle beobachtet, während Wildhunde drei Nektar zeigen, einen an der Mittelrippe und einen an jeder Seitenvene auf jeder Seite der Mittelrippe (Gesamtzahl Nektarien: 3).
5. Stellen Sie die groben und feinen Einstellungen des Mikroskops ein, um die Klarheit des digitalen Bildes zu verbessern. Mach alle Bildanpassungen, um das Nektarbild des Blattes einzufangen und zu speichern.
   1. Um Lichtreflexionen auf dem digitalen Bild zu vermeiden, schalten Sie alle Lichter aus und nehmen Sie das Bild auf dem Computerbildschirm auf. Schalten Sie alle Lichter im Raum aus und verwenden Sie eine Tischlampe, um jede Probe zu verarbeiten. Nachdem alle Schritte durchgeführt sind, schalten Sie die Lampe aus, lassen Sie nur das Mikroskoplicht an und nehmen Sie das Bild auf.
6. Speichern Sie das Bild, sobald das Programm ein Fenster mit mehreren Speicheroptionen anzeigt. Speichern Sie das Bild (indem Sie jedes Bild beschriften) mit der ID-Nummer der Probe. Bewerten Sie das digitale Bild des Nektars mit 1, 2, 3 und 4 basierend auf dem Phänotyp des Nektars. Aktualisieren Sie Ihr Bewertungsblatt für jede Muster-ID.

5. Digitale Bildgebung und Bewertung des Bracteal-Nektars (Abbildung 3)

1. Befolge die Schritte 2 und 3. Übertragen Sie eine kleine Anzahl von Blumenproben (2-3) zur Bildgebung. Nimm die Blumenprobe aus dem Zip-Lock-Beutel.
2. Entfernen Sie Hochblätter von der Blüte mit einer Pinzette oder manuell von Hand. Lege die Blume auf das saubere Schneidebrett. Verwenden Sie eine sterile Klinge, um den Stängel der Blüte abzuschneiden. Verwenden Sie eine sterile Klinge, um einen geraden Schnitt entlang der Kante der entfernten Hochblätter zu machen.
3. Legen Sie das Gewebe kopfüber (mit dem Blattstiel nach oben) auf das vorgefertigte weiße Blatt, das auf der Mikroskopbühne liegt.
4. Verwenden Sie grobe und feine Anpassungen, um die Klarheit des auf dem Bildschirm angezeigten Bildes zu verbessern. Mach alle Bildanpassungen und klicke auf den Aufnahme-Button am Konsolencontroller, um das Bild des Blattes aufzunehmen.
   1. Mach Bildanpassungen, indem du den kleinen Knopf/Lichtschalter auf Maximum und den großen Knopf/Helligkeitsschalter auf mittlere Hochstufe stellst (indem du den Knopf auf 3/4^drehst). Dann verbessert man die Bildauflösung, indem man die groben und feinen Einstellungen des Mikroskops dreht. Halten Sie diese Einstellungen konstant und wechseln Sie die Samples, bis die Bilder für die gesamte Sample-Menge aufgenommen wurden. Um Lichtreflexionen auf dem digitalen Bild zu vermeiden, schalten Sie alle Lichter aus und nehmen Sie das Bild am Computer auf.
5. Dann fordert das Programm ein Fenster auf, das alle Computerstandorte anzeigt, um das Bild zu speichern. Speichere das digitale Bild im Computer mit der ID-Nummer der Probe.
6. Bewerten Sie die Braktealnektare (ergänzende Abbildung 2) mit 1, 2, 3 und 4 basierend auf dem Phänotyp, der in den aufgenommenen digitalen Bildern beobachtet wird. Aktualisieren Sie das Bewertungsblatt mit der Beispiel-ID und der entsprechenden Punktzahl für die zukünftige Analyse

Results

Baumwollpflanzen, die 8 bis 12 Wochen lang auf dem Feld angebaut wurden, wurden für diese Studie ausgewählt. Für jede Pflanze und Gewebetyp wurden mindestens zwei technische Replikate gesammelt. Gesunde junge Blattproben werden von den oberen Ästen mit 5 bis 7 cm langen Blattblättern entnommen. Gesunde Blütenproben werden von offenen Blüten oder Blütenknospen entnommen, die am selben Tag aufgehen. Blatt- und Blumenproben wurden aus verschiedenen Pflanzenlinien aus dem Feld entnommen, und digitale Bilder wurden im Labor für beide Gewebetypen mit einem Mikroskop erstellt (Abbildung 1). Alle Schritte wurden wie oben beschrieben im Verfahren von der Probenentnahme bis zur Bildgebung (wie in Abbildung 2 und Abbildung 3 erläutert) durchgeführt. Die repräsentativen Ergebnisse für sowohl Blatt- als auch Braktealnektar zeigen typischerweise das Fehlen eines Nektars (1), das Vorhandensein eines Nektars mit intermediären Phänotypen (2, 3) und eines vollständig entwickelten Nektars, der Nektar produziert (4). Die in Abbildung 4 erzeugten Daten sind die digitalen Bilder, die von zwei verschiedenen Baumwollpflanzen (nektariert und nektarlos) aufgenommen wurden. Die Ergebnisse der digitalen Bildwertung der abaxialen Blattfläche (an der unteren Seite der Mittelrippe) zeigten zwei Phänotypen mit den Werten 1 (ohne Nektare an der Mittelrippe) und 4 (mit voll entwickeltem Nektar mit Nektar); Abbildung 4A,B). Ähnlich wurden bei der Analyse von Blumenproben auf Braktealnektar zwei Phänotypen gezeigt: 1 (ohne Nektar) und 4 (vollständig ausgebildeter Nektar, der Nektar produziert; Abbildung 4C,D). Idealerweise sollten sowohl Blätter als auch Blüten, die von derselben Pflanze gesammelt werden, dem gleichen Muster folgen, was bedeutet, dass das nektarlose Blatt und die nektarlose Blüte einer Pflanze gehören sollten, während das nektarlose Blatt und die nektarlose Blüte derselben Pflanze angehören. Abbildung 5 wird erstellt, indem digitale Bilder sowohl von Blatt- als auch von Blatt- und Braktealnektaren von nektarischen Pflanzen mit 10x, 20x und 40x gesammelt werden, um die nektarischen Eigenschaften klar zu visualisieren. Um zudem zu verstehen, wie diese Bewertung bei den segregierenden F2-Populationen von nektar- und nektarlosen Baumwolleltern gegeben wird, wurden Blattgewebe aus einer dieser Populationen gesammelt und digitale Bilder für jede Blattnektarprobe erstellt. Ausgewählte digitale Blattbilder, die der Standardwertung 1, 2, 3 und 4 entsprechen, sind in Abbildung 6¹³ hervorgehoben. Das häufige und leicht zu erkennende Muster ist das Fehlen von Nektar und das Vorhandensein von Nektar. Das Fehlen von Nektar erhält die niedrigste Punktzahl, während ein vollständig entwickelter Nektar die höchste Punktzahl von 4 bekommt. Der Wertungsbereich zwischen 1 und 4, also 2 und 3, ist unterentwickelt und kleiner als bei normalen Nektarien. Dieses Muster ist bei homozygoten nektarlosen, also 1 (abwesenden), heterozygoten Zustand wie bei 2 und 3 Punkten (reduzierte Nektarien) und 4 (voll entwickelten) Nektaren beobachtet. Zusätzlich können nektarierte und nektarlose Elternlinien zusammen mit Populationen gezogen werden, um diese Unterschiede zu vergleichen und zu verstehen.

Abbildung 1: Überblick über die Visualisierungsschritte der Blätter- und Bracteal-Nektare, beginnend mit der Probenahme bis zur digitalen Mikroskopie. (A) Wählen Sie Baumwollpflanzen in der mittleren Blütephase für die Entnahme von Blättern und Blumenproben aus. (B) Blattproben aus dem Feld entnehmen, um Nektarmerkmale am Blatt zu beobachten. (C) Drehen Sie das Blatt so, dass die abaxiale Seite des Blattes nach oben zeigt, und beobachten Sie das nektarische Merkmal im markierten schwarzen Kastenbereich. (D) Das Blatt auf die Mikroskop-Bühne legen und den Fokus im markierten Black-Box-Bereich halten, um digitale Bilder des Blattnektars aufzunehmen. (E) Sammeln Sie Blumen in der Mitte der Blüte vom Feld (A). (F) Einen Schnitt machen, indem die Blume auf ein Schneidebrett gelegt wird und in einer geraden Linie im Bereich der weißen Box in Richtung des Pfeils eingeritzt wird, wodurch die Basis der Blume getrennt wird. (G) Legen Sie den eingeritzten Abschnitt auf die Mikroskopbühne zur digitalen Bildgebung der Braktealnektaries. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 2: Schrittweises Verfahren zur digitalen Bildgebung und Scoring der Blattnektaren in Baumwolle. 1. Sammeln Sie Blattmaterial aus dem Feld in beschrifteten Probenbeuteln und legen Sie es in eine Kühlbox 2. Transportiere den Kühler mit den Proben in Labor 3. Nimm einzelne Proben aus der Kühlbox 4. Öffnen Sie den einzelnen Probenbeutel und nehmen Sie Blatt 5 heraus. Schneide den Blattstiel manuell ab oder benutze eine Klinge. 6. Setzen Sie das Blatt auf die voreingestellte Mikroskopstufe mit der abaxialen (unteren) Seite nach oben 7. Stellen Sie den Zoom im VHX 600-Programm auf 10x ein. Stellen Sie grobe und feine Einstellungen des Mikroskops an, um die beste Bildauflösung zu erhalten. 8. Schauen Sie auf den Computerbildschirm nach Einstellungen des auf dem Computerbildschirm beobachteten Bildes (Licht und Helligkeit durch kleine und große Knöpfe einstellen, indem Sie diese drehen, verwenden Sie feine und grobe Tasten am Mikroskop für die beste Bildauflösung und schalten Sie andere Lichter aus, um Reflexion zu vermeiden usw.) im Blattnektar 9. Speichern Sie das digitale Bild für die Wertung. Der Strichkreis um das Nektar im Blatt hebt den Bereich des Blattnektars in den Bildern 8 und 9 hervor. Beobachten Sie Blattnektaren unter dem Mikroskop mit 10x (100 μm) Vergrößerung. Nur ein Blattnektar wird in Hausbaumwolle beobachtet (wie auf diesem Bild zu sehen). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 3: Schrittweises Verfahren zur digitalen Bildgebung und Scoring der Bracteal-Nektaren in Baumwolle. 1. Sammeln Sie Blumenproben vom Feld in den beschrifteten Probenbeuteln und bewahren Sie sie in der Kühlbox auf 2. Entferne eine Probe aus dem Kühlraum 3. Nimm eine Blume raus 4. Entferne Hochblätter manuell, indem du sie von der Blüte abschneidest. Einen Schnitt mit einer sterilen Klinge machen, indem man entlang der Blattklappsteinkante in einer geraden Linie schneidet (weiße Box in Abbildung 1 , bevor mit der digitalen Abbildung der Braktealnektaries fortgesetzt wird) 6. Dreh den eingeritzten Abschnitt 7 um. Platziere den eingeritzten Abschnitt mit der Blattstielseite nach oben auf die Stufe des Mikroskops Stufe 8. Mach Lichtanpassungen mit den Licht- und Helligkeitsschaltern an der am Mikroskop befestigten Konsole. Verwenden Sie grobe und feine Einstellungen am Mikroskop, um Bilder mit guter Auflösung zu machen. Alle Bilder werden unter einem Mikroskop mit 10x (100 μm) Vergrößerung beobachtet. Sammeln Sie digitale Bilder zum Erzielen der Brakteal-Nektarien. Kreise in den digitalen Bildern von Braktealnektar heben das Vorhandensein von Nektarie hervor, und es gibt 3 Brakteal-Nektaren in Hausbaumwoll. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 4: Digitale Bilder von Baumwollblattnektar und Bracteal-Nektar. (A) Blätter mit Nektar; (B) Blatt ohne Nektar; (C) Blüte mit 3 Brakteal-Nektaren und (D) Blüte ohne Brakteal-Nektarien. Beobachten Sie sowohl Blatt- als auch Blütennektaren unter dem Mikroskop mit 10x (100 μm) Vergrößerung. Strichkreise zeigen das Vorhandensein und Fehlen von Nektar in Blattnektar und Brakteal-Nektarien. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 5: Blatt- und Braktealnektare wurden auf 10x, 20x und 40x gezoomt, um Nektaren in digitalen Bildern klar zu identifizieren. (A) Blattproben entnehmen, um das Nektarmerkmal an der Mittelrippe zu beobachten. (B) Beobachten Sie den Blattnektar an der Mittelrippe unter dem Mikroskop bei 10-facher Vergrößerung. (C) Beobachten Sie das Blattnektar an der Mittelrippe unter dem Mikroskop bei 20-facher Vergrößerung. (D) Beobachten Sie den Blattnektar an der Mittelrippe unter dem Mikroskop bei 40-facher Vergrößerung. (E) Schnittblütenabschnitt für Brakteal-Nektarien. (F) Beobachten Sie Braktealnektare unter dem Mikroskop mit 10-facher Vergrößerung. (G) Beobachten Sie Braktealnektare unter dem Mikroskop bei 20-facher Vergrößerung. (H) Beobachten Sie Braktealnektare unter dem Mikroskop bei 40-facher Vergrößerung. Skalenbalken auf jedem Bild geben die Vergrößerung an, mit der die Blattnektar- oder Bracteal-Nektarbilder aufgenommen wurden (wie hier als 10x, 20x und 40x dargestellt). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 6: Standardwertungsmuster des Blattnektars nach Mustern von 1, 2, 3 und 4. (A) Blattprobe ohne Nektar, wie in den gestrichelten Kreisen hervorgehoben (Punktzahl 1 für das Fehlen von Nektar). (B) Der beobachtete kleine Blattnektar zeigt ein Muster eines der heterozygoten Zustände (gestricheltes Kreisbild des Nektars mit 2 bewertet). (C) Blattnektar mit Punktzahl 3, ein weiteres Muster des Heterozygoten. (D) Vollständig ausgebildete Nektari mit einer Punktzahl von 4. Skala 10x steht für die Vergrößerung, mit der die Bilder aufgenommen wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 7: Blattnektar und Braktealnektare ohne Mikroskop. Die Abbildung zeigt, wie Nektaren mit traditioneller Wertung aussehen. Diese Figur wurde von¹³ adaptiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 8: Mögliche Genotypen der Population Die Abbildung zeigt Genotypen der_{F2-Populationen} , die aus einer Kreuzung verschiedener Eltern, nektarischer und nektarloser Eltern, resultieren. Diese Tabelle wurde von¹³ adaptiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Ergänzende Abbildung 1: Digitales Mikroskop-Setup. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 2: Unterschiedliche Anzahl beobachteter Bracteal-Nektarien. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Discussion

Nektaren sind spezialisierte drüsenartige Trichome, die Nektar in Pflanzen für eine erfolgreiche Kreuzbestäubung produzieren. Sowohl vegetative als auch reproduktive Nektare sind in Pflanzen vorhanden. Die Gattung Gossypium (Baumwolle) umfasst mehr als 50 Arten, und die Mehrheit davon enthält¹⁶ Blattnektar. Dieses Merkmal bei Baumwolle zieht jedoch auch Schädlinge an, was zu^{zusätzlichen} Ertragsverlusten führt. Züchter wählten natürlich vorhandene nektarlose Eigenschaften (Fehlen von Nektarien), die erstmals bei G. tomentosum entdeckt wurden, um dieses Problem zu lösen. Aus diesem Grund führten sie dieses nektarlose Merkmal in die kultivierte Upland-Baumwolle¹⁷ ein. Schließlich entstanden mehrere Populationen durch die Auswahl von nektarisierten und nektarlosen Linien als Eltern. Da homozygot nektarlose und heterozygot nektarlose Populationen bei bloßem Auge keine Unterschiede zeigen, braucht es ein spezielles Werkzeug, um diese Pflanzen zu unterscheiden. Daher visualisiert diese Bewertungsmethode mittels digitaler Mikroskopie, im Gegensatz zur traditionellen Bewertung (wie in Abbildung 7 dargestellt), nicht nur reduzierte Nektarien, sondern verhindert auch eine ungenaue Bewertung heterozygoter nektarloser Pflanzen als homozygote nektarlose Pflanzen.

Die phänotypische Bewertung mit digitalen Bildern hängt von mehreren Schlüsselfaktoren ab, wie dem genauen Zeitpunkt der Probenentnahme, der Auswahl der Probe, der Verwendung einer Standardbewertungsskala für Blatt- und Brakteal-Nektarien, möglichem Genotyp und wie die Bewertungsdaten für nachgelagerte Anwendungen interpretiert werden können. Zunächst ist es wichtig, Blätter und Blüten während der Wachstumsperiode zu sammeln, wenn die Nektarsekretion am höchsten ist, meist in der Mitte der Blüte im Juli. Zweitens spielt die Auswahl der Blätter oder Blüten in der richtigen Größe und Stufe eine entscheidende Rolle bei der Phänotypbewertung. Für die Blätter wurden obere Äste mit 5 bis 7 cm langen Blattblättern bevorzugt, um Blattnektaren zu ritzen. Ähnlich wurden für das Scoren von Bracteal-Nektaren gesunde Blüten aus den oberen Zweigen ausgewählt. Die Auswahl der Stichproben in bestimmten Entwicklungsstadien hilft, selbst wenn alle Pflanzen innerhalb einer Population verglichen werden, indem entwicklungsstadiumabhängige Merkmalsausdrücke (wie in Abbildung 8 dargestellt) ausgeschlossen werden. Um zu überprüfen, ob die Bewertung wiederholbar ist, wurden digitale Bilder für mindestens zwei Proben pro Gewebe und Pflanze erstellt. Das Sammeln mehrerer Replikate derselben Pflanze hilft bei einer konsistenten Datenerhebung.

Die mögliche Einschränkung der Methode besteht darin, bis zur Probenentnahme schädlingsfreie Pflanzen zu erhalten. Schädlingsbefallsgebiete lassen sich an Gewebe- oder Eierflecken erkennen, die in den Geweben gelegt wurden, oder an Schäden an den Nektarregionen mit schwarzen Bereichen, die keinen sichtbaren Nektarverzehr haben, da sie von Blattläusen oder anderen Insekten verzehrt werden. Dies wurde während der Screening von Hunderten von Proben beobachtet. In solchen Fällen wurden gesunde Blätter und Blüten erneut gesammelt und auf konsistente Daten aus diesen Proben analysiert. Dies lässt sich durch regelmäßige Schädlingsbekämpfungspläne und die Ergänzung von Düngemitteln beheben, um gesunde Pflanzen zu erreichen. Das Befolgen aller kritischen Schritte, wie beschrieben, hilft bei der Fehlersuche bei der Phänotypbewertung.

Diese Technik hat mehrere Anwendungsbereiche, wie etwa die Kartierung zur Identifizierung von DNA-Markern, die Züchtern helfen, Genotypen für die markerunterstützte Selektion zu identifizieren. Diese Phänotyp-Bewertung erfordert eine Bestätigung durch DNA-Marker aufgrund der Umwelt- und Entwicklungsphaseneinflüsse sowie der Gene, die dieses Merkmal steuern. Daher ist die Phänotypisierung dieses Merkmals mittels digitaler Mikroskopie ein Ausgangspunkt, um eine große Anzahl von Pflanzen aus mehreren Populationen auf eine kleine Anzahl mutmaßlich nektarloser Linien einzugrenzen. Mit DNA-Markern werden diese Linien weiter validiert, um in Züchtungsprogrammen eine nektarlose Krankheitsresistenz mit Eigenschaft in neu entwickelten Sorten zu entwickeln. Diese Methode kann Forschern auch helfen, die Rolle des Nektarmerkmals bei Pflanzen und nützliche Insekteninteraktionen zu verstehen.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Digitales Mikroskop	Keyence VHX	VHX 600	Andere Mikroskope können verwendet werden
Farberware-Schneidebrett	Farberware	Modellnummer 78892-10	14''L x 11'' B x 0,5''Th, jede Marke kann verwendet werden, diese ist ab amazon.com
Igloos Laguna kleiner 9-QT-Kühler	Iglu	Teilenummer 00043567	Jede Marke/ jede Größe basierend auf dem Projektbedarf kann verwendet werden
Plastiktüten (400 Stück), 3 x 4 Zoll	Marke Aubeco	NA	4''L X 3''B X 0,01''H, jede Marke kann verwendet werden, bevorzugte Kunststoff mit klaren Farbtönen
Single  Rasierklingen, 100er-Pack	Weupe	NA	Jede Marke kann verwendet werden, diese hier ist erhältlich bei amazon.com