Ein Protokoll zur Entnahme von Einzelzell-Suspension aus Maushornhäuten

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Gewinnung hochwertiger Einzelzell-Suspensionen aus ganzen Maushornhäuten durch sequentielle Verdauung mit Kollagenase A und Trypsin. Diese Methode liefert lebensfähige Einzelzellen mit hoher RNA-Integrität, wodurch sie mit nachgelagerten Anwendungen wie der Einzelzell-RNA-Sequenzierung und FlowzytometrieY kompatibel sind.

Zusammenfassung

Als äußerste Schicht des Augapfels spielt die Hornhaut eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der Homöostase und des Sehvermögens der Augenoberfläche. Jüngste Fortschritte in der Single-Cell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) haben eine hochauflösende Analyse der Hornhautzellheterogenität ermöglicht, doch die Herstellung hochwertiger Einzelzellsuspensionen aus Hornhautgewebe bleibt aufgrund ihrer dichten und komplexen Struktur eine Herausforderung. In dieser Studie etablieren wir ein robustes Protokoll zur Erzeugung von Einzelzellsuspensionen aus ganzen Maushornhäuten. Das Verfahren beinhaltet das Zerkleinern der Hornhäute in feine Fragmente, gefolgt von einer sequentiellen enzymatischen Verdauung mit Kollagene A und Trypsin. Die resultierende Zellsuspension wurde anhand mehrerer Kennzahlen auf Qualität geprüft: Trypan-Blau-Färbung wurde verwendet, um die Lebensfähigkeit und Anzahl der Zellen zu bewerten; Immunfluoreszenzfärbung für Pancytokeratin und Keratocan ermöglichte die Identifizierung und Quantifizierung wichtiger Hornhautzelltypen; und die RNA-Integrität wurde mit einem Bioanalysator überprüft. Dieses Protokoll liefert durchweg Einzelzellpräparate mit hoher Zellanzahl, ausgezeichneter Lebensfähigkeit (≥ 94,6 %) und einem hohen Anteil an Einzelzellen (96,3 %), die die Anforderungen erfüllen, die mit anspruchsvollen nachgelagerten Anwendungen einschließlich scRNA-seq kompatibel sind.

Einleitung

Die Hornhaut, die sich in der äußersten Schicht des Augapfels befindet, ist für ihre Barriere- und Brechungsfunktionen unerlässlich, da sie eine hochstrukturierte Architektur mit fünf unterschiedlichen Schichten hat: das Epithel, die Bowman-Schicht, das Stroma, die Descemet-Membran und das^{Endothel 1}. Das Hornhautepithel ist eine nicht keratinisierte, geschichtete Plattenepithelstruktur, die eine physische Barriere gegen äußere Krankheitserreger bietet und robuste antimikrobielle und regenerative Fähigkeiten aufweist. Das Stroma, das aus präzise ausgerichteten Kollagenfibrillen besteht, behält die Hornhauttransparenz und einen einheitlichen Brechungsindex². Das Endothel, eine einzellige Schicht, reguliert den Flüssigkeitstransport zwischen Stroma und Wasserhumor und erhält so die Hydrierung der Hornhaut sowie die Nährstoffversorgung³. Dennoch stellte diese komplexe strukturelle und zelluläre Komplexität historisch erhebliche Herausforderungen bei der Untersuchung der hornhautbiologischen Funktionen und zugrunde liegenden Mechanismen^dar.

Um interzelluläre Interaktionen zu untersuchen und zelltypspezifische Marker zu identifizieren, werden Techniken wie Flowzytometrie-Sortierung⁵ und Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq)⁶ weit verbreitet eingesetzt. Ein großes technisches Hindernis, das beiden Ansätzen gemeinsam ist, ist jedoch die Herstellung hochwertiger Einzelzell-Suspensionen. Parameter wie die Gesamtzellausbeute, der Anteil einzelner Zellen und die Zellviabilität sind entscheidend für die Zuverlässigkeit von nachgelagerten Anwendungen, die darauf abzielen, die Funktion der Hornhaut und die Expression des Oberflächenmarkers zu charakterisieren⁷. Trotz ihrer Bedeutung fehlen weiterhin standardisierte und effiziente Protokolle zur Herstellung von Einzelzell-Suspensionen aus ganzen Maushornhäuten.

Es wurden mehrere Methoden entwickelt, um Einzelzell-Suspensionen aus Hornhautgewebe zu gewinnen. Die sequentielle enzymatische Verdauung mit Kollagen A, Trypsin oder TrypLE wurde eingesetzt, um Einzelzellen sowohl aus menschlichen als auch aus Maushornhauten zu isolieren⁸. Wiederholte Trypsinisierung wurde auch für die Hornhautdissoziation eingesetzt⁷. Zusätzlich wurden kommerzielle Multi-Gewebe-Dissoziationskits, wie die von Miltenyi Biotec, erfolgreich eingesetzt, um hornhaut-Einzelzell-Suspensionen zu erzeugen⁹. In unserer früheren vergleichenden Studie verschiedener Hornhautverdauungsmethoden zeigten wir, dass eine sequentielle Behandlung mit Kollagenase und Trypsin der optimale Ansatz darstellt. Diese Methode führt durchweg zu hohen Zellzahlen, ausgezeichneter Lebensfähigkeit (≥94,6 %), einem hohen Anteil an Einzelzellen (96,3 %) und einer gut erhaltenen RNA-Integrität¹⁰.

In diesem Protokoll bieten wir ein detailliertes, schrittweises Verfahren zur Erzeugung hochwertiger Einzelzell-Suspensionen aus ganzen Maushornhäuten mit dieser optimierten enzymatischen Verdauungsstrategie, basierend auf unseren etablierten Erfahrungen und vorherigen Ergebnissen.

Protokoll

Weibliche C57BL/6 (B6) Mäuse im Alter von 6 bis 8 Wochen wurden vom Versuchszentrum der Guizhou Medical University bereitgestellt. Die Tiere wurden in einem 12-Stunden-Licht/12-Stunden-Dunkelzyklus untergebracht, mit Ad-Libitum-Zugang zu Futter und Wasser. Alle Verfahren wurden vom Ethischen Ausschuss für experimentelle Tiere der Guizhou Medical University (Genehmigungsnummer 2305185) genehmigt und in Übereinstimmung mit der ARVO-Erklärung für den Einsatz von Tieren in der Augen- und Sehforschung durchgeführt.

1. Vorbereitung

1. Vorbereitung von chirurgischen Instrumenten: Reinigen Sie zwei Paar Augenscheren, zwei Paare Augenzangen, ein Paar Gewebezangen und ein 2-ml-Zentrifugenröhrchen zweimal mit doppelt destilliertem Wasser (DDW). Sterilisieren Sie die Instrumente und das Rohr mit einem Dampfautoklaven. Alle Gegenstände über Nacht in einem herkömmlichen Ofen bei 65 °C trocknen.
2. Lösungsvorbereitung
   1. Ergänzendes hormonelles Epithelmedium (SHEM): Stellen Sie SHEM vor, indem Sie das DMEM/F12-Medium mit folgenden Komponenten ergänzen: 5 % (v/v) fetales Rinderserum (FBS), 0,5 % (v/v) Dimethylsulfoxid (DMSO), 10 ng/mL Maus-epidermalen Wachstumsfaktor, 5,5 μg/mL Transferrin, 0,5 μg/mL Hydrocortison, 1% (v/v) Penicillin-Streptomycin (100 U/mL Penicillin, 100 μg/mL Streptomycin).
      HINWEIS: SHEM wird verwendet, um die Zelllebensfähigkeit während der Verarbeitung aufrechtzuerhalten. Es kann durch alternative Medien wie basales DMEM oder phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) ersetzt werden, die mindestens 10 % (v/v) FBS enthalten.
   2. Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)
      1. Lösen Sie 22,4 g PBS-Pulver unter Rühren mit einem magnetischen Rührer in 2 L doppelt destilliertes Wasser (DDW) auf, um 1× PBS zu erhalten.
      2. Autoklavieren Sie die PBS-Lösung einen Tag im Voraus und lassen Sie sie abkühlen.
      3. Unter sterilen Bedingungen werden 47,5 ml steriles 1× PBS in ein 50 mL Zentrifugenrohr übertragen und 2,5 ml 1 % (v/v) Penicillin-Streptomycin hinzugefügt.
         HINWEIS: Die 1× PBS-Formulierung (2 L) enthält 137 mM NaCl, 8 mM Na₂HPO₄ und 2 mM NaH₂PO₄, pH 7,2.
   3. Kollagenase-A-Lösungen
      1. Grundlösung: 1 g Kollagenase A-Pulver in 40 ml DDW auflösen. Filtersterilisieren Sie durch einen 0,2-μm-Filter und lagern Sie bei -20 °C.
      2. Arbeitslösung: Verdünnen Sie 1 ml Kollagenase, eine Grundlösung in 4 ml steriler DDW, um eine Endkonzentration von 5 mg/mL zu erhalten.
   4. Trypsinlösung: Tauen Sie vor der Verwendung kommerziell erhältliche 0,25% (w/v) Trypsin/EDTA-Lösung (mit 0,91 mM EDTA) auf Eis.
   5. Trypan Blue Lösung (0,4 %): 0,4 g Trypan Blue in 100 ml DDW auflösen. Filtern Sie mit Filterpapier und lagern Sie bei 4 °C.
      HINWEIS: Die 0,4%ige Trypan Blue-Lösung wird zur Bewertung der Gesamtzellanzahl, des Einzelzellanteils und der Lebensfähigkeit verwendet. Es kann durch kommerzielle lebende/tote Färbungssets oder automatisierte Zellzählsysteme ersetzt werden.

2. Vorbereitung der Maushornhauta

1. Sterilisieren Sie das Seziermikroskop und den Arbeitsbereich, indem Sie mit 75 % Ethanol abwischen, und setzen Sie den Bereich dann 30 Minuten lang UV-Licht in einem biologischen Sicherheitsschrank aus.
2. Bereiten Sie Folgendes unter sterilen Bedingungen zu: Eine 60 mm Petrischale mit 5 mL SHEM-Medium, drei 60 mm Petrischalen mit jeweils 5 ml 1× PBS ergänzt mit 5 % Penicillin-Streptomycin (P-S), drei 60 mm Petrischalen mit jeweils 5 mL 1× PBS und eine sterile 2 mL Zentrifugenröhre
3. Eliminieren Sie die Maus mittels CO-2-Erstickung, gefolgt von einer zervikalen Verrenkung.
4. Spülen Sie den Mauskopf und die geschlossenen Augenlider gründlich durch dreimaliges Eintauchen in PBS mit 5 % P-S, bevor Sie mit der Enukleation beginnen.
5. Mit einer Augenschere wird ein Schnitt entlang des hinteren Pols jedes Auges gemacht und die isolierten Augen vorsichtig in die Petrischale mit eiskaltem SHEM-Medium gelegt (Abbildung 1A).
   HINWEIS: Um die Zelllebensfähigkeit zu maximieren, sollten alle Lösungen auf 4 °C vorgekühlt und alle Sektionsschritte auf Eis durchgeführt werden.
6. Sofort die Petrischale mit den Augen in einen biologischen Sicherheitsschrank überführen. Waschen Sie die Augenäpfel dreimal in 1× PBS mit 5 % P-S, während Sie pro Wasch 5 Minuten inkubieren.
7. Unter einem Seziermikroskop wird das Hornhautgewebe sorgfältig getrennt: Mit einer ophthalmischen Schere und einer Zange wird ein Schnitt vom hinteren Pol zum Hornhautlimbus gemacht. Lösen Sie die Hornhaut vorsichtig von der Sklera und der Bindehaut entlang des Limbalrandes. Entfernen Sie die Linse und die Iris vollständig mit zwei Paar Pinzetten (Abbildung 1B).
8. Mit einer Augenzange wird das Hornhautgewebe in eine Petrischale mit 1× PBS übertragen und dreimal (jeweils 5 Minuten) gewaschen, um restliches nicht-hornhautiges Gewebe und Antibiotika zu entfernen.
   HINWEIS: Die Iris haftet oft eng an der Hornhaut. Stellen Sie sicher, dass es vorsichtig und vollständig mit einer Pinzette entfernt wird, um eine Kontamination zu vermeiden, sodass nur klares Hornhautgewebe übrig bleibt.
9. Mit einer ophthalmischen Pinzette wird das gereinigte Hornhautgewebe in ein 2-ml-Zentrifugenrohr übertragen und 1 ml Kollagenase A-Arbeitslösung (5 mg/ml) hinzugefügt.
10. Mit einer Augenschere wird das Hornhautgewebe in etwa 0,5 mm × 0,5 mm Fragmente direkt im Inneren des Röhrchens zerkleinert.
11. Inkubieren Sie das Rohr mit den Hornhautfragmenten und der Kollagenase A-Lösung in einem Zellkulturinkubator bei 37 °C für 1 Stunde (Abbildung 2A-C).
12. Während der Kollagenase-A-Verdauung sollte das Gewebe alle 10 Minuten überwacht werden. Beenden Sie die Verdauung, wenn keine großen Gewebefragmente mehr übrig sind, indem Sie mit der Zentrifugation beginnen. Zentrifugieren Sie die Probe bei 300 x g für 5 Minuten bei Raumtemperatur mit einer Zentrifuge. Atmen Sie vorsichtig das Überwassermittel ab.
13. Setzen Sie das Pellet in 200 μL 0,25%ige Trypsin/EDTA-Lösung wieder auf.
14. Inkubieren Sie das Röhrchen in einem Zellkulturinkubator bei 37 °C für 10 Minuten, um die verbleibenden Gewebefragmente zu verdauen.

3. Isolierung von Hornhaut-Einzelzellen

1. Triturieren Sie die Mischung (Gewebe und Trypsin/EDTA-Lösung) sanft wiederholt mit einer P1000-Pipette mit breiter Bohrspitze, um das Gewebe in eine Einzelzellsuspension zu dissoziieren.
2. Zentrifugiere die Zellsuspension bei 300 x g für 5 Minuten und entsorge das Supernatant. Setzen Sie das Zellpellet in 1 ml PBS mit 0,04 % Rinderserumalbumin (BSA) wieder auf, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten.
   HINWEIS: Bei Zellen, die für die Sequenzierung oder Flusszytometrie bestimmt sind, wird in serumfreiem PBS erneut suspendiert. Für Zellen, die kultiviert werden, verwenden Sie 1x PBS mit 0,04 % BSA-Supplement.
3. Filtern Sie die Zellsuspension durch ein vorbenetztes 40-μm-Sieb in ein neues 50-mL-Zentrifugenrohr, um Zellklumpen und Ablagerungen zu entfernen.
   HINWEIS: Vorbefeuchten Sie das Zellsieb mit PBS, um den Zellverlust zu minimieren. Falls nötig, können die gefilterten Zellen erneut zentrifugiert und in einem gewünschten Volumen zur Konzentration wieder suspendiert werden.

4. Zellzählung

1. Kombinieren Sie 9 μL der Zellsuspension mit 1 μL 0,4% Trypan Blue-Lösung und mischen Sie es vorsichtig.
2. Laden Sie das Gemisch langsam über den vorgesehenen Ladekanal in eine Hämozytometerkammer. Zählen Sie die Zellen mit der Vier-Quadranten-Methode, um die Gesamtanzahl, die Lebensfähigkeit und den Anteil einzelner Zellen zu bestimmen. Führen Sie mindestens zwei technische Replikationen durch.

Ergebnisse

Die Qualität der Einzelzellsuspensionen wurde anhand der Gesamtzellausbeute, des Anteils der Einzelzellen und der Zelllebensfähigkeit bewertet. Die Suspension wurde mit Trypan Blue gefärbt und mittels Phasenkontrastmikroskopie über mehrere Felder hinweg analysiert (Abbildung 3). Von vier Mausäugen (acht Hornhäuten) wurden insgesamt 1,05 × 10⁵ Zellen gewonnen, mit einer durchschnittlichen Zelllebensfähigkeit von 94,6 % und einem Einzelzell-Verhältn...

Diskussion

Die Einführung der Einzelzell-RNA-Sequenzierung hat den Einsatz von genomischen, transkriptomischen, epigenetischen und proteomischen Technologien in der Augenforschung^deutlich erhöht 9,10,11,12. Folglich ist die Herstellung hochwertiger Einzelzellsuspensionen zunehmend kritisch geworden, da sie die Erkennung von Signalvariationen zwischen einzelnen Zellen ermö...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Alexa Fluor 594 Esel-Anti-Kaninchen	Abcam	ab150064
Antikeratin	Abcam	ab230175
Anti-Pancytokeratin	Thermo Fisher Scientific	AE1/AE3, Alexa FluorTM 488
Autoklav-Sterilisator	An Shen	LDZH-100KBS
Rinderserum Albumin V	Solarbio	A8020
Zellfilter	NEST	258369	40 μ m
Zentrifugalmaschine	Eppendorf AG	22331 Hamburg
Kollagenase A	Roche	10103578001
Konfokalmikroskop	Oberkochen	Zeiss LSM 880
Zählschild	MARIENFELD	M407859
Zentrifugalröhre	NEST	620611	2 mL, 50mL
Coverslip	MARIENFELD	M407859
DAPI	Solarbio	C0065
Seziermikroskop	Carl ZEISS	VISU150
DMEM/F12  Medien	Gibco	11320033
DMSO	Solarbio	D8371
Fetal  Bovine  Serum	Gibco	16140071
Hydrocortison	Solarbio	IH0100
ITS	Gibco	23337619
Epidermalwachstumsfaktor der Maus	Invitrogen	PMG8041
ophthalmische chirurgische  Pinzette	Dumot	0208-5-PO
Augenärztliche chirurgische Schere	FST	15021-15
Ofen	AISITE	DH6000 II
Penicillin & Streptomycin	Gibco	15070063	100 mL
Petrischale	NEST	705201	60mm
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung	Solarbio	P1010
Thermostatischer Inkubator	Thermo Fisher Scientific	3111
Triton-X 100	Solarbio	T8200
Trypan Blue	Solarbio	T8070
Trypsin/EDTA	Gibco	R001100
Ultra-Reinigungstisch	You Qi	VS-840-2
4 % Paraformaldehyd	Solarbio	P1110