Phytochemische Profilierung, Gaschromatographie–Massenspektrometrie-Analyse und in-vivo-Aktivität von Terminalia mantaly bei Ratten

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein Protokoll, das phytochemische Analysen, Gaschromatographie–Massenspektrometrie-Charakterisierung und validierte In-vivo-Assays integriert, um die entzündungshemmende, analgetische und fiebersenkende Wirkung von Terminalia mantaly zu bewerten und so einen reproduzierbaren Rahmen für die pharmakologische Bewertung von Heilpflanzen bietet.

Zusammenfassung

Synthetische Medikamente gegen Entzündungen, Schmerzen und Fieber sind wirksam, verursachen aber oft Nebenwirkungen, was das Interesse an pflanzlich abgeleiteten therapeutischen Alternativen steigert. Terminalia mantaly H. Perrier, traditionell in der afrikanischen Medizin verwendet, hat nur begrenzte wissenschaftliche Validierung. Diese Studie präsentiert ein integriertes experimentelles Protokoll, das phytochemische Screening, quantitative Analyse von phenolischen und flavonoiden Verbindungen, Gaschromatographie–Massenspektrometrie (GC-MS) Charakterisierung und pharmakologische Tests in vivo kombiniert, um das therapeutische Potenzial des methanolischen Extrakts von T. mantaly zu bewerten. Phytochemische Untersuchungen bestätigten das Vorhandensein mehrerer bioaktiver Klassen, und die GC–MS-Analyse identifizierte zwanzig Bestandteile, darunter Fettsäuren, Phytosterole, Tocopherole und andere bioaktive Verbindungen mit bekannten entzündungshemmenden und antioxidativen Eigenschaften. Die pharmakologische Untersuchung in vivo bei Ratten zeigte dosisabhängige antiinflammatoriske Aktivität im Carrageenan-induzierten Pfotenödem-Modell, eine signifikante Verlängerung der Schmerzentzugslatenz im Schwanztauchtest und eine Reduktion der hefe-induzierten Fieberexie. Bei höheren Dosen zeigte der Extrakt Effekte, die mit Standardmedikamenten wie Diclofenac und Paracetamol vergleichbar waren. Akute Toxizitäts- und Zytotoxizitätsbewertungen zeigten ein günstiges Sicherheitsprofil innerhalb des getesteten Dosierungsbereichs. Zusammen bestätigen diese Ergebnisse die ethnomedizinische Anwendung von T. mantaly und zeigen einen reproduzierbaren experimentellen Rahmen zur Verbindung der phytochemischen Zusammensetzung mit pharmakologischer Aktivität. Das Protokoll bietet Forschern, die Heilpflanzen untersuchen, eine praktische methodologische Referenz und unterstützt die Entwicklung pflanzlicher Wirkstoffe zur Behandlung entzündlicher und fieberbedingter Erkrankungen.

Einleitung

Entzündungen, Schmerzen und Fieber sind miteinander verbundene pathologische Prozesse, die einer Vielzahl akuter und chronischer Krankheiten zugrunde liegen. Obwohl synthetische Medikamente wie nichtsteroidale Antirheumatika, Kortikosteroide und Paracetamol weiterhin das Hauptmittel der Therapie sind, ist ihre langfristige Anwendung oft mit Magen-Darm-Reizungen, Nierenkomplikationen, Hepatotoxizität und anderen Nebenwirkungen verbunden¹. Diese Einschränkungen haben ein wachsendes Interesse an Heilpflanzen als sicherere und nachhaltigere Alternativen zur Behandlung von entzündlichen und fieberbedingten Erkrankungen ausgelöst. Naturprodukte sind für ihre reiche Vielfalt bioaktiver Moleküle bekannt, von denen viele als führende Quelle für die moderne Arzneimittelentwicklung dienen. In diesem Zusammenhang hat T. mantaly, ein Mitglied der Familie Combretaceae, aufgrund seiner ethnomedizinischen Verwendung in afrikanischen traditionellen Systemen zur Behandlung von Infektionen, Magen-Darm-Erkrankungen und entzündlichen Erkrankungen^{Aufmerksamkeit} erregt. Trotz ihrer traditionellen Relevanz bleiben systematische pharmakologische Studien, die ihr therapeutisches Potenzial bestätigen, begrenzt. Insbesondere gibt es einen Mangel an umfassenden Untersuchungen, die phytochemische Screening, biologische Bewertungen in vivo und fortschrittliche chemische Profilierungsmethoden wie GC–MS integrieren. Die Schließung dieser Lücke ist entscheidend, um ihre folkloristischen Anwendungen wissenschaftlich zu belegen und potenzielle Leadverbindungen für den pharmazeutischen Einsatz zu identifizieren⁴. In der vorliegenden Studie wurde der methanolische Extrakt von T. mantaly einer detaillierten phytochemischen und pharmakologischen Untersuchung unterzogen. Vorläufige Analysen bestätigten das Vorhandensein wichtiger Metaboliten, darunter Phenole, Flavonoide, Tannine, Saponine und Terpenoide, von denen alle bekannt sind, dass sie zu entzündungshemmenden, analgetischen und antioxidativen Wirkungen beitragen⁵. Quantitative Tests zeigten außerdem, dass der Extrakt erhebliche Mengen an phenolischen und flavonoiden Verbindungen enthielt, mit Werten, die mit Referenzstandards vergleichbar sind, was auf ein starkes antioxidatives Potenzial hindeutet.

Tiermodelle wurden verwendet, weil die untersuchten pharmakologischen Reaktionen integrierte entzündliche, neuronale und thermoregulatorische Signalwege umfassen, die in vitro nicht reproduziert werden können. Die in-vivo-Tests lieferten eindeutige pharmakologische Belege für Bioaktivität. Die entzündungshemmenden (durch Carrageenan induzierten Pfotenödem), schmerzlindernden (Schwanzimmern) und fiebersenkenden (durch Hefepilz induzierte) Eigenschaften wurden bei Ratten getestet und zeigten eine dosisabhängige entzündungshemmende Wirkung, die der von Diclofenac-Natrium bei höheren Dosen ähnelt. Ähnlich erhöhte der Extrakt die Schwanzimmer-Latenzen bei Ratten und bestätigte seine schmerzlindernde Wirksamkeit, während hefe-induzierte Feuer-Modelle deutliche fiebersenkende Effekte zeigten, die denen von Paracetamol⁶ nahe kamen. Chemische Profilierung durch GC–MS-Analyse lieferte tiefere Einblicke in die bioaktive Zusammensetzung. Insgesamt wurden 20 Verbindungen identifiziert, darunter 3,5-Dihydroxy-6-methyl-2,3-dihydro-4H-pyran-4-on, Linolsäure, γ-Sitosterol, Squalen und Vitamin E. Diese Verbindungen sind gut dokumentiert für ihre antioxidativen, entzündungshemmenden und kardioprotektiven Eigenschaften und unterstützen die beobachteten pharmakologischen Ergebnisse ^7,8. Wichtig ist, dass Toxizitätsbewertungen vernachlässigbare zytotoxische Effekte zeigten, was die Sicherheit bei den getesteten Dosierungen unterstreicht. Zusammengenommen schließt diese Studie eine kritische Lücke, indem sie sowohl phytochemische als auch pharmakologische Belege für den medizinischen Wert von T. mantaly liefert. Die Ergebnisse untermauern nicht nur seine traditionellen Anwendungen, sondern heben auch sein Potenzial als natürliche Quelle für Bleiverbindungen zur Entwicklung neuartiger Therapien gegen Entzündungen und verwandte Erkrankungen hervor. Die in dieser Studie verwendeten experimentellen Modelle spiegeln in erster Linie akute entzündliche und nozizeptive Reaktionen wider und liefern daher vorläufige pharmakologische Belege statt einen direkten Hinweis auf chronische therapeutische Wirksamkeit.

Protokoll

Alle Tierversuche wurden gemäß internationalen Richtlinien für die Pflege und Nutzung von Labortieren durchgeführt und wurden den Empfehlungen der OECD entsprechen. Das Studienprotokoll wurde vom Animal Care and Use Committee (IACUC) der Bahauddin Zakariya Universität in Multan genehmigt. (Genehmigungsnummer: 3 /UREC/2025). Alle Anstrengungen wurden unternommen, um Tierleiden zu minimieren und die Anzahl der eingesetzten Tiere zu reduzieren.

1. Herstellung von T. mantaly Ganzemethanolextrakt (TMWM)

1. Sammeln Sie frische Stängel, Wurzeln und Blätter von T. mantaly, authentifizieren Sie das Pflanzenmaterial und deponieren Sie ein Gutscheinexemplar in einem anerkannten Herbarium.
   HINWEIS: Das in dieser Studie verwendete Pflanzenmaterial wurde am 12. November 2023 in der Punjab Nursery, Mattital Road, Multan, gesammelt. Die geographischen Koordinaten der Sammelstelle sind 30,2236° N, 71,4755° O. Die Pflanze wurde taxonomisch vom Taxonomen Prof. Dr. Zafar Ullah Zafar, Professor für Botanik an der Bahauddin Zakariya Universität in Multan, und ein Gutscheinexemplar (www.theplantlist.org/tpl1.1/record/kew-2434420) wurden im Herbarium der Bahauddin Zakariya Universität in Multan deponiert. Die Pflanze wurde aus ihrem natürlichen Lebensraum unter geeigneten Umweltbedingungen gesammelt, und der Sammelort wurde mit Fotos dokumentiert.
2. Waschen Sie das Pflanzenmaterial mit Leitungswasser, gefolgt von destilliertem Wasser, um Verunreinigungen zu entfernen, und trocknen Sie anschließend 7–10 Tage lang bei 25–30 °C, bis ein konstantes Gewicht erreicht ist.
3. Mahlen Sie das getrocknete Material zu grobem Pulver und wiegen Sie 500 g mit einer analytischen Waage. Das Pulver in einen sauberen Glasbehälter geben und 2,5 L Methanol hinzufügen.
4. Macerieren Sie die Mischung bei Raumtemperatur für 72 Stunden mit intermittierendem Schütteln alle 6–8 Stunden. Filtere das Whatman No.1 Filterpapier.
5. Konzentrieren Sie das Filtrat unter reduziertem Druck mit einem Rotationsverdampfer bei 39 °C und lagern Sie den getrockneten Extrakt dann in luftdichten Behältern bei Raumtemperatur bis zur Verwendung.
   VORSICHT: Methanol ist giftig und entflammbar. Führen Sie die Handhabung in einer Abzugshaube aus, während Sie Handschuhe und Schutzbrille tragen. Entsorgen Sie Lösungsmittelabfälle gemäß institutionellen Richtlinien zur chemischen Sicherheit.
   HINWEIS: Der getrocknete Extrakt kann mehrere Wochen in luftdichten Behältern bei Zimmertemperatur gelagert werden, bevor weitere Analysen durchgeführt werden.

2. Schätzung des gesamten phenolischen Gehalts (Folin–Ciocalteu-Methode)

1. Galliensäure-Lagerlösung (100 μg/mL) wird hergestellt, indem 10 mg Gallensäure in 100 mL Methanol gelöst wird und Serienverdünnungen zwischen 1–10 μg/mL hergestellt wird.
2. 10 mg Extrakt in 10 mL Methanol auflösen, um eine 1 mg/mL Lösung zu erhalten. Übertragen Sie 0,5 ml jeder Norm oder Probe in Reagenzgläser.
3. Fügen Sie 2,5 ml Folin–Ciocalteu-Reagenz hinzu, das 1:1 mit Wasser verdünnt ist, und dann 2,0 ml 7,5 % Natriumcarbonatlösung. Mischen und inkubieren bei 25 ± 2 °C für 30 Minuten.
4. Missen Sie die Absorption bei 765 nm gegenüber einem Reagenzblank und berechnen Sie den gesamten phenolischen Gehalt als mg Gallensäureäquivalente pro g Extrakt.

3. Schätzung des gesamten Flavonoidgehalts (Aluminiumchlorid-Methode)

1. Bereite eine Rutin-Stocklösung (1000 μg/mL) durch Auflösen von Rutin in Methanol vor und bereite dann serielle Verdünnungen im Bereich von 10–80 μg/mL vor.
2. Geben Sie 0,5 ml der Standard- oder Extraktlösung in Reagenzgläser und fügen Sie 1,5 ml Methanol, 0,1 ml 10% Aluminiumchlorid (AlCl₃)-Lösung, 0,1 ml 1 M Kaliumacetatlösung und 2,8 ml destilliertes Wasser hinzu.
3. Inkubieren Sie bei Raumtemperatur 30 Minuten und messen Sie die Absorption bei 415 nm. Ergebnisse werden als mg Rutin-Äquivalente pro g Extrakt⁹ ausgedrückt.

4. Gaschromatographie–Massenspektrometrie-(GC–MS)-Analyse

1. Lösen Sie 10 mg Extrakt in 1 ml HPLC-Qualitäts-Methanol auf und filtern Sie durch einen 0,22 μm Spritzenfilter in ein GC-Fläschchen.
2. Führen Sie eine Analyse mit einem Agilent 7890B GC in Kombination mit einem 5977A MS durch, das mit einer HP-5MS-Kapillarsäule (30 m × 0,25 mm × 0,25 μm) ausgestattet ist. Verwenden Sie Helium als Trägergas bei 1,0 mL/min bei einer Injektortemperatur von 250 °C.
3. Halten Sie die Ionenquellentemperatur bei 230 °C und die Quadrupoltemperatur bei 150 °C. Programmieren Sie den Ofen von 60 °C (2 Minuten Halt) auf 180 °C bei 10 °C/min und dann auf 280 °C bei 5 °C/min mit einem letzten Halt von 10 Minuten.
4. Injizieren Sie 1 μL des gefilterten Extrakts im Split-Modus (10:1) und nehmen Sie Chromatogramme über einen m/z-Bereich von 40–600 auf. Führe vor der Probeinjektion einen Lösungsmittel-Blank durch.
5. Identifizieren Sie Verbindungen durch Vergleich der Spektren mit der NIST-Massenspektralbibliothek und bestätigen Sie die Identitäten unter Verwendung von Retentionszeit und Normalisierung der Spitzenfläche.

5. Entzündungshemmende Aktivität (durch Carrageenan induziertes Pfotenödem)

1. Verwenden Sie gesunde Albino Wistar-Ratten mit einem Gewicht von 180–220 g und gewöhnen Sie sich 7 Tage lang. Schnelle Tiere über Nacht vor dem Experiment mit freiem Zugang zu Wasser.
2. Tiere werden zufällig in fünf Gruppen unterteilt (n = 5 pro Gruppe). Verabreichen Sie den Kontrollen normales Kochsalzlösung; orale Verabreichung von 100, 200 und 300 mg/kg an die Behandlungsgruppen; und der Standardgruppe Diclofenac-Natrium (40 mg/kg, subkutan) verabreichen.
3. Nach 1 Stunde injizieren Sie 0,1 ml frisch zubereitetes 1%-Carragenan in den subplantaren Bereich der rechten Hinterpfote.
4. Misse die Pfotendicke bei 0, 1, 2, 3 und 4 H mit einem digitalen Vernier-Bremssättel und berechne die Zunahme relativ zum Ausgangswert.
5. Bestimmen Sie den prozentualen Hemmungsgrad des Ödems im Vergleich zur Kontrollgruppe¹⁰.
   VORSICHT: Carragenan-Pulver kann Reizungen verursachen. Vermeiden Sie Einatmen und Hautkontakt und entsorgen Sie biologische Abfälle gemäß institutionellen Biosicherheitsvorschriften.

6. Analgetische Aktivität (Schwanztauchtest)

1. Verwende akklimatisierte Albino-Wistar-Ratten, die unter einem 12-Stunden-Licht/Dunkel-Zyklus gehalten werden und freien Zugang zu Futter und Wasser haben.
2. Tiere werden in fünf Gruppen unterteilt (n = 5). Geben Sie destilliertes Wasser an die Kontrollgruppen, entziehen Sie das Behandlungsgruppen oral mit 100, 200 und 300 mg/kg und Paracetamol (20 mg/kg) an die Standardgruppe.
3. Halten Sie das Wasserbad bei 55 ± 1 °C aufrecht. Tauchen Sie 1–2 cm des distalen Schwanzes ein und zeichnen Sie die Ausgangs-Entzugslatenz mit einer Abgrenzungszeit von 15 Sekunden auf.
4. Wiederholen Sie die Messungen 30, 60, 90 und 120 Minuten nach der Behandlung, wobei jedes Mal derselbe Teil des Schwanzes eingetaucht wird.
5. Berechnen Sie den prozentualen Anstieg der Latenz und drücken Sie die Ergebnisse als Mittelwert ± SD aus.

7. Fiebersenkende Wirkung

1. Verwenden Sie akklimatisierte Ratten und messen Sie die normale rektale Temperatur mit einem befeuchteten digitalen Thermometer.
2. Bereiten Sie eine 20%ige Brauhefesuspension in destilliertem Wasser vor und injizieren Sie subkutan mit 10 mL/kg in den Dorsum, um Fieber zu induzieren.
3. Nach 18 Stunden wird die rektale Temperatur erneut gemessen und Tiere ausgeschlossen, die keinen Anstieg von mindestens 0,5 °C zeigen.
4. Fieberratten werden fiebrille Ratten zufällig in fünf Gruppen unterteilt (n = 5 pro Gruppe). Verabreichen Sie der Kontrollgruppe eine normale Kochsalzlösung, pflanzenextrakt oral mit 100, 200 und 300 mg/kg an die Behandlungsgruppen sowie Paracetamol (150 mg/kg) an die Standardgruppe.
5. Messen Sie die rektale Temperatur bei 0, 1, 2 und 3 Stunden nach der Behandlung und berechnen Sie die Reduktion relativ zum Ausgangswert^{von 11}.
   VORSICHT: Brauhefesuspensionen sind biologische Materialien und sollten mit standardisierten Biosicherheitsvorkehrungen behandelt werden. Entsorgen ungenutzte Suspensionen und kontaminierte Materialien als biologische Abfälle.
   HINWEIS: Nach der Hefeinjektion können die Tiere wieder in die Käfige zurückgebracht und unter Standardbedingungen gehalten werden, bis die Temperatur gemessen wird.

8. Studien zur akuten Toxizität

1. Die Studie wird gemäß der OECD-Richtlinie 423 durchgeführt, wobei gesunde Albino-Wistar-Ratten beider Geschlechter verwendet werden und 180–220 g wiegen.
2. Schnellen Tiere über Nacht vor der Dosierung und teilen sie zufällig in Gruppen auf (n = 5 pro Gruppe).
3. Geben Sie den Behandlungstieren eine einmalige orale Dosis von 5 g/kg Körpergewicht und den Kontrolltieren destilliertes Wasser (1 ml/kg).
4. Beobachten Sie die Tiere kontinuierlich in den ersten 4 Stunden nach der Dosierung, periodisch während der ersten 24 Stunden und täglich für 14 Tage.
   HINWEIS: Beobachtungskriterien umfassen Veränderungen im Haut- und Fellzustand, Augen und Schleimhäuten, Atemmuster, Speichelfluss, Zittern, Krampfanfälle, Lokomotorik und allgemeine Verhaltensreaktionen.
5. Zeichnen Sie klinische Anzeichen von Toxizität, Sterblichkeit und Körpergewicht an Tag 0, Tag 7 und Tag 14 auf.
6. Beurteile die Sicherheit anhand der Überlebensrate und beobachteten Verhaltens- oder körperlichen Veränderungen¹².
   HINWEIS: Die Verhaltensbewertung umfasst die Überwachung von Haltung, Gang, Aktivitätsniveau, Grooming-Verhalten, Reaktion auf äußere Reize sowie Anzeichen von Lethargie oder Hyperaktivität.

9. Statistische Analyse

1. Sammeln Sie alle experimentellen Daten und geben Sie die Ergebnisse als Mittelwert ± Standardabweichung mit n = 5 Tieren pro Gruppe dar.
2. Geben Sie die Daten im Spaltenformat in die GraphPad Prism-Software ein.
3. Bewerten Sie die Datennormalität mit dem Shapiro–Wilk-Test, bevor Sie vergleichende Analyse anwenden.
4. Führen Sie statistische Analysen mit der GraphPad Prism-Software durch, indem Sie auswählen: Analysieren Sie → Einweg-ANOVA → Tukey-Mehrfachvergleiche.
5. Führen Sie eine Einweganalyse der Varianz durch, gefolgt von Tukeys Post-hoc-Mehrfachvergleichstest, um die statistische Signifikanz zwischen den Gruppen zu bestimmen.
6. Betrachten Sie statistisch signifikante Unterschiede bei p < 0,05.

Ergebnisse

Die in dieser Studie beschriebenen experimentellen Ansätze erzeugten reproduzierbare in vitro- und in vivo-Daten, die die Bewertung sowohl der phytochemischen Zusammensetzung als auch der pharmakologischen Aktivitäten des methanolischen Extrakts von T. mantaly ermöglichten. Alle experimentellen Messungen wurden in Replikaten durchgeführt, und die Ergebnisse werden als mittlere ± Standardabweichung (SD) dargestellt. Die statistische Signifikanz zwischen den Gruppen wurde mittels Einweg-ANOVA bestimmt, gefolgt von...

Diskussion

In dieser Studie wurde eine Kombination aus phytochemischer Charakterisierung und etablierten pharmakologischen Modellen in vivo verwendet, um das entzündungshemmende, analgetische und fieberhemmende Potenzial des methanolischen Extrakts von T. mantaly zu bewerten. Die verwendeten experimentellen Modelle werden in der Forschung zu Naturprodukten weit verbreitet verwendet und bieten einen praktischen Rahmen für die vorläufige Bewertung biologischer Aktivitäten.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Albino-Wistar-Ratten	Institutionelles Tierhaus	N/A	Versuchstiere
Aluminiumchlorid	Sigma-Aldrich	237051	Flavonoid-Assay
Brewer S-Hefe	Sigma-Aldrich	YSC2	Pyrexie-Induktion
Carrageenan	Sigma-Aldrich	C1013	Induktion von Pfotenödem
Zentrifuge	Eppendorf	5810R	Probenverarbeitung
Diclofenac-Natrium	Sigma-Aldrich	D6899	Anti-Entzündungs-Standard
Digitales rektales Thermometer	Omron	MC-246	Rektale Temperaturmessung
Digitaler Vernier-Bremssättel	Mitutoyo	500-196-30	Messung der Pfotendicke
Destilliertes Wasser	Intern	N/A	Lösungsmittel
Folin– Ciocalteu-Reagenz	Sigma-Aldrich	F9252	Phenolischer Assay
Gallische Säure	Sigma-Aldrich	G7384	Phenolischer Standard
GC–MS-System	Agilent Technologien	7890B– 5977A	Phytochemische Profilierung
GraphPad-Prisma	GraphPad-Software	Version 8.0	Statistische Analysesoftware
Methanol (HPLC-Qualität)	Merck	106009	Extraktionslösungsmittel
Orale Gavage-Nadel	Instech	FTP-20-38	Mündliche Verabreichung
Paracetamol	Sigma-Aldrich	P0300000	Analgetikum und antipyretischer Standard
Kaliumacetat	Merck	104820	Flavonoid-Assay
Rotationsverdampfer	Bü chi	R-200	Extraktkonzentration
Rutin	Sigma-Aldrich	R5143	Flavonoid-Standard
Natriumcarbonat	Merck	106392	Phenolischer Assay
UV– Sichtbares Spektrophotometer	Shimadzu	UV-1800	Absorptionsmessung
Wasserbad (thermostatisch)	Memmert	WNB14	Schwanzimmersionstest