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Forschungsartikel

Gegen Qinlian-Abkok dämpft Colitis ulcerosa durch Hemmung der PANoptose: Eine Multi-Omics und experimentelle Studie

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DOI:

10.3791/69858

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22. Mai 2026

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1College of Clinical Medicine, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Department of Gynaecology, Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3Department of Traditional Chinese Medicine, Henan Provincial People's Hospital, Zhengzhou University, 4College of Basic Medical Sciences, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 5College of Health and Rehabilitation, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 6State Key Laboratory of Oral Diseases, National Center for Stomatology, National Clinical Research Center for Oral Diseases, Department of Traditional Chinese Medicine, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, 7Department of Stomatology, Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein Protokoll, das Multiomics-Analyse mit in-vivo-Validierung verbindet, um zu untersuchen, wie Gegen Qinlian Decoction die Colitis ulcerosa lindert, indem es PANoptose-bezogene Ziele und entzündliche Signalwege reguliert.

Zusammenfassung

Wir präsentieren ein integriertes Protokoll für Bioinformatik und Netzwerkpharmakologie, um die therapeutischen Mechanismen des Gegen Qinlian-Abkoks (GQD) bei Colitis ulcerosa (UC) zu klären, mit besonderem Fokus auf die PANoptose-bezogene Regulation. Dieses Protokoll ist darauf ausgelegt, systematisch potenzielle bioaktive Verbindungen, therapeutische Ziele, Signalwege und immunbezogene Mechanismen durch Multi-Datenbank-Mining und transkriptomische Analyse zu identifizieren. Genexpressionsprofile aus UC-Kohorten, einschließlich GSE87466 und GSE92415 aus der GEO-Datenbank, werden mittels differentieller Expressionsanalyse und gewichteter Gen-Koexpressionsnetzwerkanalyse analysiert, um krankheitsbezogene Gene zu identifizieren. Kandidatenziele für GQD werden aus öffentlichen pharmakologischen Datenbanken gesammelt und mit UC- und PANoptosis-assoziierten Genen kombiniert, um zentrale therapeutische Ziele zu bestimmen. Anschließend werden Protein-Protein-Interaktionsnetzwerke, Anreicherungsanalysen und Modellierung von Verbindungen und Zielweg-Netzwerken durchgeführt, um die molekulare Grundlage der GQD-Aktivität aufzuzeigen. Darüber hinaus wird eine Immuninfiltrationsanalyse eingesetzt, um die Beziehung zwischen Schlüsselgenen und der intestinalen Immunmikroumgebung zu untersuchen. Das molekulare Andocken wird weiter verwendet, um das Bindungspotenzial zwischen wichtigen aktiven Verbindungen und Hub-Zielen zu bewerten. Dieses Protokoll bietet einen reproduzierbaren, systematischen Rahmen zur Untersuchung, wie GQD UC durch Modulation der PANoptose und verwandten Entzündungswege lindert, und kann als nützliche Referenz für mechanistische Studien anderer traditioneller chinesischer Medizinformeln bei komplexen entzündlichen Erkrankungen dienen.

Einleitung

Colitis ulcerosa (UC), eine der Hauptformen der entzündlichen Darmerkrankung, ist eine chronische, rückfällige Entzündungserkrankung, die hauptsächlich die Darmschleimhaut betrifft und typischerweise im Rektum mit kontinuierlicher proximaler Streckung beginnt. Seine Pathogenese ist komplex und umfasst aberrante schleimhautige Immunaktivierung, Dysfunktion der Epithelbarriere, mikrobielle Störungen und dysregulierte Wirts-Umwelt-Interaktionen, was zusammen eine erhebliche und wachsende globale Gesundheitsbelastung darstellt 1,2. Anhaltende schleimhautentzündung verursacht nicht nur wiederkehrende Symptome wie Bauchschmerzen, Durchfall und Hämatotezie, sondern erhöht auch das langfristige Risiko für kolitisassoziierten Darmkrebs, insbesondere bei Patienten mit ausgedehnter und langanhaltender Erkrankung 3,4.

Die derzeitige pharmakologische Behandlung von UC basiert hauptsächlich auf 5-Aminosalicylaten, Kortikosteroiden, Immunmodulatoren, Biologika und kleinmolekularen Wirkstoffe, abhängig von Krankheitsschwere undtherapeutischer Wirkung. Obwohl diese Strategien die klinischen Ergebnisse verbessert haben, erlebt ein beträchtlicher Anteil der Patienten weiterhin primäre Nicht-Reaktion, sekundären Wirkungsverlust, Intoleranz, Steroidabhängigkeit oder behandlungsbedingte Nebenwirkungen, was die Notwendigkeit sicherer und mechanismusorientierter therapeutischer Optionenunterstreicht 6. Daher ist es von erheblicher translationaler Bedeutung, vorgelagerte molekulare Programme zu identifizieren, die gleichzeitig Epithelschäden und intestinaler Immunregulation regulieren.

Jüngste Studien haben gezeigt, dass dysregulierter programmierter Zelltod tief in die Pathogenese von UC involviert ist. Über die klassische Apoptose hinaus sind Pyroptose und Necroptose alle mit der Zerstörung der Epithelbarriere und der Amplifikation der schleimhautartigen Entzündungin Verbindung gebracht 7. PANoptose, ein kürzlich definierter entzündlicher, programmierter Zelltodweg, der Schlüsselmerkmale von Pyroptose, Apoptose und Necroptose integriert, hat sich als besonders relevantes mechanistisches Rahmenwerk für chronisch entzündliche Erkrankungenetabliert. Dieser Prozess wird durch Multiprotein-PANoptosomen-Komplexe koordiniert und bezieht zentrale Mediatoren wie ZBP1, RIPK1/RIPK3, CASP8 sowie inflammasom-verwandte Moleküle einschließlich NLRP3 kontextabhängig9 ein. Wichtig ist, dass sich angesammelte Evidenz darauf hindeutet, dass PANoptose bei UC aktiviert ist und Schädigungen des Darmepithels, den Abbau von Barrieren und ein Immunungleichgewicht fördern kann, was so zum Krankheitsfortschritt beiträgt 10,11,12. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass PANoptose nicht nur eine nachgelagerte Folge einer Entzündung ist, sondern einen mechanistisch aktiven Knoten darstellen könnte, der die Epithelverletzung mit der schleimhautartigen Immunverstärkung in Verbindung bringt.

Gegen Qinlian Decoction (GQD), ein klassisches Rezept, das erstmals in Shang Han Lun aufgezeichnet wurde, besteht aus Pueraria lobata, Scutellaria baicalensis, Coptis chinensis und Glycyrrhiza uralensis. Es wird seit langem in der traditionellen chinesischen Medizin bei Durchfall und entzündungsbedingten Darmerkrankungen verwendet. Moderne pharmakologische Studien haben gezeigt, dass GQD experimentelle Kolitis lindern kann, indem es entzündliche Reaktionen unterdrückt, die Integrität der Darmbarriere wiederherstellt, die Darmmikrobiota umgestaltet und die Immunhomöostase moduliert, einschließlich Th17/Treg-bezogener Signalübertragung und Inflammasomenaktivität13,14. Diese Multitarget-Aktionen machen GQD zu einem plausiblen Kandidaten für ein Eingreifen in PANoptosis-bezogene pathologische Prozesse in UC15. Trotz wachsender Belege für seine antikolitische Wirksamkeit bleibt jedoch unklar, ob GQD durch koordinierte Regulierung von PANoptosis-assoziierten molekularen Netzwerken therapeutische Effekte bewirkt.

Derzeit bestehen zwei große Lücken. Erstens konzentrieren sich bestehende Studien zu UC-Zelltodmechanismen hauptsächlich auf isolierte Signalwege wie Apoptose, Pyroptose oder Ferroptose, während die integrierte Rolle der PANoptose bei der Vermittlung der therapeutischen Wirkung pflanzlicher Formeln noch nicht ausreichend geklärt wurde 7,10,11. Zweitens eignet sich die Netzwerkpharmakologie zwar gut zur Charakterisierung der "Multi-Komponenten-Multi-Ziel-Multi-Pathway"-Natur traditioneller Formeln, aber Vorhersagen, die allein auf Verbindungen und Zieldatenbanken basieren, können an Krankheitskontext-Spezifität fehlen und eine transkriptomische Priorisierung sowie experimentelle Validierung erfordern, um die biologische Plausibilität und translationale Zuverlässigkeit zu verbessern 16,17,18,19. Daher könnte eine integrierte Strategie, die Krankheitstranskriptomik, Netzwerkpharmakologie und In-vivo-Verifikation kombiniert, einen strengeren Rahmen zur Aufklärung des Mechanismus von GQD bei UC bieten.

Im Vergleich zu Ansätzen, die ausschließlich auf histopathologischer Beobachtung, molekularen Assays mit einem einzelnen Signalweg oder datenbankgesteuerter Netzwerkpharmakologie basieren, ist der derzeitige Arbeitsablauf besser geeignet für diese Frage, da er eine Kreuzvalidierung zwischen krankheitskontextbezogenen transkriptomischen Signalen, Formel-Ziel-Vorhersage und biologischer Verifikation in einem experimentellen Kolitismodell ermöglicht. Allein histologische oder molekulare Auslesungen können nur begrenzte Dimensionen der UC-Pathologie erfassen, während die Netzwerkpharmakologie allein möglicherweise nicht ausreichend Krankheitsspezifität und experimentelle Unterstützung bietet. Durch die Integration der transkriptomischen Priorisierung mit der In-vivo-Validierung verbessert dieser Workflow die biologische Plausibilität der Zielidentifikation und bietet einen kohärenteren Rahmen für die Verknüpfung der GQD-Intervention mit PANoptosis-assoziierten Mechanismen bei UC.

Dieses Protokoll eignet sich am besten für mechanistische Studien, die darauf abzielen, zu untersuchen, wie mehrkomponentenbasierte Interventionen die Epithelverletzung, entzündliche Reaktionen und PANoptose-bezogene Signalwege in experimentellen UC regulieren. Sie ist besonders nützlich, wenn das Ziel darin besteht, rechnergestützte Vorhersage mit biologischer Validierung auf Tierebene in einem standardisierten Arbeitsablauf zu verknüpfen. Es ist jedoch nicht dazu gedacht, klinische diagnostische Ansätze zu ersetzen, noch behandelt es umfassend alle Dimensionen der UC-Pathogenese, wie die langfristige Heterogenität der Patienten, mikrobiomweite kausale Interaktionen oder einzellige und räumlich aufgelöste Immunkartierung. Daher lässt sich ihr Anwendungsbereich am besten als reproduzierbares präklinisches Rahmenwerk für mechanismusorientierte und therapeutische Evaluation definieren.

Wir haben daher die Hypothese aufgestellt, dass GQD UC verbessert, indem es PANoptosis-bezogene Signalnetzwerke moduliert, wodurch die Schädigung des Darmepithels abgeschwächt und die entzündliche Mikroumgebung umprogrammiert wird. Um diese Hypothese zu testen, integrierten wir die transkriptomische Analyse von UC mit der Netzwerkpharmakologie, um gemeinsame therapeutische Ziele und Schlüsselwege von GQD zu identifizieren, mit besonderem Fokus auf PANoptosis-assoziierte Regulatoren. Wir validierten die vorhergesagten Mechanismen in einem von Dextran Sulfate Natrium (DSS)-induzierten Modell der Maus-Kolitis. Durch die Kombination der rechnergestützten Zielpriorisierung mit biologischer Verifikation zielte diese Studie darauf ab, eine stärker krankheitsrelevante und mechanistisch fundierte Erklärung für die anti-UC-Effekte von GQD zu liefern und neue Belege zu liefern, die PANoptosis als potenzielle therapeutische Achse bei UC unterstützen.

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Protokoll

Alle Tierverfahren wurden gemäß institutionellen Richtlinien durchgeführt und vor Studienbeginn vom Ethischen Ausschuss der Chengdu-Universität für Traditionelle Chinesische Medizin genehmigt (Genehmigungsnummer 2022-126). Für die bioinformatischen Analysen wurden nur öffentlich verfügbare GEO- und GWAS-Datensätze verwendet; Daher war für den rechnerischen Teil dieser Studie keine zusätzliche informierte Zustimmung oder ethikische Zustimmung erforderlich. Alle Verfahren zu gefährlichen Chemikalien, biologischen Proben und tierischen Abfällen wurden gemäß institutionellen Laborsicherheitsvorschriften und institutionellen Verfahren zur Entsorgung gefährlicher Abfälle durchgeführt.

Erfassung und Vorverarbeitung von GEO-Datensätzen

Humane transkriptomische Datensätze im Zusammenhang mit Colitis ulcerosa (UC) wurden aus der GEO-Datenbank mit dem Schlüsselwort "Colitis ulcerosa" abgerufen. Nach Screening auf Expressionsprofiling-Datensätze mit klar definierten UC- und gesunden Kontrollgruppen sowie ausreichender Stichprobengröße wurden GSE8746620 und GSE9241521, beide auf der GPL13158 Plattform generiert, als Trainingskohorte ausgewählt. Diese Datensätze enthielten 87 UC-Proben und 21 gesunde Kontrollpersonen sowie 53 UC-Proben bzw. 21 gesunde Kontrollpersonen. Für externe Validierung GSE8747322 (106 UC-Proben und 21 gesunde Kontrollpersonen) und GSE1687923 (48 UC-Proben und 12 gesunde Kontrollpersonen; GPL570-Plattform) enthalten waren. Roh- oder Serienmatrixdateien wurden heruntergeladen und zur Vorverarbeitung in R importiert. Probe-Identifizierer wurden gemäß den entsprechenden Plattform-Annotationsdateien in Gensymbole umgewandelt. Wenn mehrere Sonden auf dasselbe Gensymbol abgebildet wurden, blieb der durchschnittliche Expressionswert erhalten. Proben ohne klare Gruppeninformationen wurden vor der nachgelagerten Analyse ausgeschlossen. Die beiden Trainingsdatensätze wurden durch gemeinsame Gensymbole zusammengeführt. Ausdruckswerte wurden bei Bedarf log2-transformiert, mit einem standardisierten Zwischen-Array-Normalisierungsverfahren normalisiert und nach Definition des Datensatz-Ursprungs als Batch-Variable mittels einer Batch-Anpassungsmethode korrigiert. Die Hauptkomponentenanalyse und die Boxplot-Inspektion wurden vor und nach der Normalisierung/Chargenkorrektur als Qualitätskontrollpunkte verwendet. Erfolgreiche Vorverarbeitung wurde durch eine verbesserte Überlappung der Stichprobenverteilungen über Datensätze und die Abschwächung datensatzgetriebener Clusterung definiert. Insgesamt wurden 902 PANoptosis-bezogene Gene aus der veröffentlichten Literatur zusammengestellt und als Referenzgenset für die integrative Analyse verwendet.

Identifikation unterschiedlich exprimierter Gene und Konstruktion des WGCNA-Netzwerks

Die zusammengeführte Trainingsmatrix wurde in R mittels eines Differential-Expression-Workflows analysiert. Gene mit |log2-facher Veränderung| ≥ 0,585 und adjustierte P < 0,05 wurden als differentiell exprimierte Gene (DEGs) definiert. Vulkandiagramme und Heatmaps wurden als Zwischenausgaben generiert, um zu bestätigen, dass die Filterkriterien biologisch interpretierbare Expressionsunterschiede zwischen UC und Kontrollgruppen liefern. Bei der Analyse des gewichteten Gen-Koexpressionsnetzwerks (WGCNA) wurden Gene nach Varianz über die Stichproben hinweg bewertet, und die obersten 25 % der variablesten Gene wurden als Eingabe beibehalten. Ein Probenclusterbaum wurde zunächst untersucht, um potenzielle Ausreißerproben zu identifizieren; Für den Netzbau wurden keine offensichtlichen Ausreißer beibehalten, es sei denn, die Entfernung wurde durch Qualitätskontrollkriterien gerechtfertigt. Eine Soft-Thresholding-Potenz wurde basierend auf dem skalenfreien Topologie-Fit-Index ausgewählt, und die kleinste Potenz, die ein annähernd skalenfreies Netzwerk erreichte, wurde verwendet, um die Adjazenzmatrix zu konstruieren. Die Adjazenzmatrix wurde dann in eine topologische Überlappungsmatrix umgewandelt, und hierarchisches Clustering wurde unter Verwendung von TOM-basierter Dissimilarity durchgeführt. Module wurden durch dynamischen Baumschnitt mit einer Mindestmodulgröße von 100 Genen identifiziert. Eng verwandte Module wurden zusammengeführt, wenn ihre Eigengenkorrelation das vorgegebene Zusammenführungskriterium überschritt. Modul-Eigengene, Modul-Signifikanz und Gen-Signifikanzwerte wurden berechnet, um Module zu identifizieren, die am stärksten mit dem UC-Phänotyp assoziiert sind. Ein erfolgreicher WGCNA-Schritt wurde durch stabile Modultrennung, biologisch plausible Modulgrößen und ein oder mehrere Module mit klarer Korrelation zum Krankheitsstatus definiert.

Identifikation von Kandidatenzielen in GQD

Kandidatenverbindungen und Zielgruppen, die den vier pflanzlichen Komponenten des Gegen Qinlian Decoction (GQD) entsprechen – Pueraria lobata, Scutellaria baicalensis, Coptis chinensis und Glycyrrhiza uralensis – wurden aus TCMSP24 und BATMAN-TCM25 gesammelt. Die Screening-Schwellenwerte wurden wie folgt festgelegt: orale Bioverfügbarkeit ≥ 30 % und Arzneimittelähnlichkeit ≥ 0,18 für Datensätze aus einer Datenbank; Der Konfidenzwert ≥ 0,84 und bereinigte P < 0,05 für Datensätze aus einer anderen Datenbank. Zusätzliche Verbindungen wurden aus einer Datenbank für Kräutermedizin ergänzt, wenn relevante Datensätze bei der ersten Suche nicht erfasst wurden. Kanonische SSMILES-Strings der zurückgehaltenen Verbindungen wurden einer Online-ADME-Bewertungsplattform vorgelegt. Verbindungen blieben erhalten, wenn sie eine hohe gastrointestinale Absorption zeigten und mindestens zwei Arzneimittelähnlichkeitsregeln bei Lipinski, Ghose, Veber, Egan und Muegge erfüllten. Vermutete Ziele wurden dann mittels einer Zielvorhersageplattform mit einer Wahrscheinlichkeit > 0,1 vorhergesagt und mit einer Proteinannotationsdatenbank auf offizielle Gensymbole standardisiert. Duplikate Verbindungen und doppelte Ziele wurden nach der Datenbankzusammenlegung entfernt. Die erwartete Ausgabe dieses Schritts war ein nicht redundanter GQD-Compound-Target-Datensatz, der für Überlappungsanalysen geeignet ist.

Identifikation überlappender Gene und Durchführung funktionaler Analysen

Potenzielle therapeutische Ziele wurden definiert als die Schnittstelle zwischen GQD-bezogenen Zielen, UC-bezogenen Genen, die durch unterschiedliche Expression und WGCNA identifiziert wurden, sowie dem PANoptosis-bezogenen Genset. Überlappungsbeziehungen wurden mithilfe eines Venn-Diagramms visualisiert. Die sich überschneidenden Gene wurden dann einer Protein-Protein-Interaktionsdatenbank (PPI) übermittelt, und Interaktionspaare mit einem Konfidenzwert ≥ 0,4 wurden beibehalten. Das resultierende PPI-Netzwerk wurde exportiert und in einer Netzwerkanalyseplattform visualisiert. Ein erfolgreicher PPI-Schritt wurde durch das Vorhandensein eines verbundenen Netzwerks definiert, das die Mehrheit der sich überschneidenden Gene enthielt, anstatt nur isolierte Knoten. Die funktionelle Anreicherungsanalyse, einschließlich der Genontologie (GO) und der Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)-Analyse, wurde in R durchgeführt, wobei q < 0,05 als Signifikanzschwelle war. Begriffe oder Wege, die diese Schwelle nicht erfüllten, wurden ausgeschlossen. Die oben angereicherten biologischen Prozesse und Signalwege wurden zusammengefasst, um den potenziellen Mechanismus abzuleiten, durch den GQD UC regulieren kann. Bar-Plots und Blasendiagramme wurden als Zwischenausgaben generiert, um zu überprüfen, ob die Anreicherungsergebnisse von entzündungs-, immunitäts- oder epithel-verletzungsbezogenen Wegen dominiert wurden, wie aus biologischem Kontext zu erwarten.

Analyse von Expressionsmustern, chromosomaler Lokalisation und Korrelationen

Die Expressionsniveaus der geteilten Gene wurden zwischen UC- und Kontrollgruppen mit einem standardisierten Visualisierungs-Workflow für differenzielle Expression in R verglichen. Boxplots und Heatmaps wurden erstellt, und P < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen. Nur Gene mit interpretierbarer Expressionsrichtung und konsistentem Verhalten innerhalb der Trainingskohorte wurden für die anschließende mechanistische Bewertung beibehalten. Die chromosomale Lokalisierung ausgewählter Kerngene wurde nach der Formatierung der Genannotationsdateien in die erforderliche Eingabestruktur kartiert, und die genomischen Positionen wurden mithilfe eines zirkularen Chromosomen-Plotting-Workflows visualisiert. Korrelationsmatrizen zwischen Kerngenen wurden anschließend mittels paarweiser Korrelationsanalyse berechnet. Das erwartete Ergebnis dieses Schrittes war die Identifikation von Genpaaren mit koordinierten Expressionsmustern, die eine gemeinsame Regulation oder funktionelle Interaktion unterstützen könnten.

Aufbau und Bewertung von Machine-Learning-Modellen

Die Entwicklung diagnostischer Modelle erfolgte mit der fusionierten Trainingskohorte (GSE87466 + GSE92415), während GSE16879 und GSE87473 als unabhängige externe Validierungsdatensätze verwendet wurden. Zwölf maschinelle Lernalgorithmen – Lasso, Ridge, Stepglm, XGBoost, Random Forest, Enet, plsRglm, GBM, NaiveBayes, LDA, glmBoost und SVM – wurden verwendet, um 113 Modellkombinationen zu erzeugen,davon 26. Innerhalb der Trainingskohorte wurde eine zehnfache Kreuzvalidierung angewendet. In jedem Fold wurden Modelltraining, Merkmalsauswahl und Leistungsschätzung mit derselben Trainings-/Testpartitionierungslogik durchgeführt, um Informationslecks zu vermeiden. Die Modellleistung wurde hauptsächlich anhand der Fläche unter der Empfänger-Betriebscharakteristik (AUC) bewertet. Das optimale Modell wurde definiert als das Modell mit dem höchsten durchschnittlichen AUC über die Trainings- und Validierungsdatensätze hinweg, nicht als das höchste Trainings-AUC allein. Modelle mit sehr hohem Trainings-AUC, aber schlechter externer Validierungsleistung wurden nicht erhalten. Für jedes erhaltene Modell wurden ROC-Kurven generiert, und aus den finalen ausgewählten Biomarkern wurde ein Nomogramm erstellt. Ein erfolgreicher Modellierungsschritt wurde durch stabile Kreuzvalidierungsleistung und die Erhaltung der Diskriminierungsfähigkeit in den externen Datensätzen definiert.

Leistung von GSVA und Profil-Kerngenexpression

Die Gene Set Variation Analysis (GSVA) wurde durchgeführt, um die Signalweganreicherung zwischen Hochexpressions- und Niedrigexpressionsgruppen zu vergleichen, definiert durch den Median-Expressionswert jedes Kerngens. Angepasstes P < 0,05 wurde als Grenzwert für signifikante Unterschiede in den Signalwegen verwendet. Wege, die diese Schwelle nicht erfüllten, wurden von der Auslegung ausgeschlossen. Heatmaps und Korrelationsdiagramme wurden erstellt, um die Aktivität der Pfade und Koexpressionsmuster zu veranschaulichen. Der mittlere Erfolg dieses Schrittes zeigte sich durch Anreicherungsprofile, die mit einer entzündungsbedingten, immunen oder metabolischen Dysregulation übereinstimmen, die für UC relevant sind.

Analyse der Immunlandschaft und Konstruktion des ceRNA-Netzwerks

Die Zusammensetzung der Immunzellen wurde mit einem Dekonvolutionsalgorithmus mit 1.000 Permutationen geschätzt. Proben, die das interne Dekonvolutionssignifikanzkriterium nicht erfüllten, wurden von der anschließenden Immunkorrelationsanalyse ausgeschlossen. Zur Ergänzung dieser Analyse wurde auch die Single-Sample-Genset-Anreicherungsanalyse (ssGSEA) eingesetzt, um Immuninfiltrationsmuster zu bewerten. Korrelationen zwischen Immunzellfraktionen und der Kerngenexpression wurden anschließend berechnet und visualisiert. Für den Aufbau von ceRNA-Netzwerken wurden miRNAs, die auf die Kern-mRNAs abzielen, aus öffentlich zugänglichen Interaktionsdatenbanken identifiziert, und Kandidaten-lncRNAs, die mit diesen miRNAs interagieren, wurden anschließend gescreent. Nur Interaktionen, die durch Datenbankvorhersage- oder Annotationsdatensätze unterstützt werden, wurden beibehalten. Das mRNA-miRNA-lncRNA-Regulationsnetzwerk wurde in einer Netzwerkanalyseplattform visualisiert. Das erwartete Ergebnis dieses Schrittes war ein strukturiertes ceRNA-Netzwerk mit biologisch plausiblen Upstream-Regulatoren, die mit den Kerngenen verbunden sind.

Leistung der Einzelzellanalyse

Der Einzelzell-Datensatz wurde GSE214695 in R importiert und mithilfe eines standardisierten Einzelzellanalyse-Workflows in Einzelzellobjekte umgewandelt. Die Qualitätskontrolle erfolgte, indem Zellen nach Standardmetriken gefiltert wurden, darunter Low-Feature-Zellen, potenzielle leere Tröpfchen und Zellen mit schlechter Transkriptqualität. Zellen, die die Qualitätskontrolle bestanden, wurden normalisiert, und die 2.000 höchst variablen Gene wurden für die Analyse der Hauptkomponenten ausgewählt. Hauptkomponenten, die eine sinnvolle biologische Varianz beitrugen, wurden für unüberwachtes Clustering beibehalten, und UMAP wurde für die zweidimensionale Visualisierung verwendet. Clustermarker-Gene wurden mittels differentieller Expressionsanalyse über Cluster hinweg identifiziert. Die Zelltyp-Annotation wurde dann durch referenzbasierte Klassifikation durchgeführt, und Annotationen wurden, wenn möglich, mit kanonischen Markerausdrücken abgeglichen. Ein erfolgreicher Einzelzellschritt wurde durch eine klare Trennung der Hauptzellpopulationen auf dem UMAP-Plot, interpretierbare Markergene für jedenCluster 27 und eine konsistente Annotation der wichtigsten Immun- und stromalen Zelltypen, die für UC relevant sind, definiert.

Durchführung der Mendelschen Randomisierungsanalyse

Eine zweistichprobige Mendelsche Randomisierung (MR) wurde durchgeführt, um mögliche kausale Zusammenhänge zwischen der Kerngenexpression und der UC-Anfälligkeit zu bewerten. Instrumentelle Variablen wurden aus den quantitativen Expressionsdatensätzen extrahiert, und UC-genomweite Assoziationsstudien-Zusammenfassungsstatistiken wurden als Ergebnisdatensatz verwendet. SNPs wurden nach standardisierten MR-Qualitätskontrollkriterien gescreent, einschließlich der Relevanz für das Expositionsmerkmal und der Entfernung mehrdeutiger oder doppelter Varianten, wenn dies durch Harmonisierung erforderlich ist. Als primärer kausaler Schätzer wurde die inverse Varianz gewichtete Methode verwendet. Cochrans Q-Test wurde angewandt, um Heterogenität zu beurteilen. MR-Egger- und MR-PRESSO-Analysen wurden als Sensitivitätsanalysen verwendet, um horizontale Pleiotropie zu bewerten und bei Bedarf zu korrigieren. Ein erfolgreicher MR-Schritt wurde durch gültige Instrumentharmonisierung, das Fehlen einer großen Heterogenität oder Pleiotropie28 und richtungskonsistente Schätzungen über komplementäre MRT-Methoden hinweg definiert.

Leistung des molekularen Andockens von Kandidatenverbindungen

Dreidimensionale Strukturen von Zielproteinen wurden aus der Protein Data Bank gewonnen, und Ligandenstrukturen aus einer öffentlichen Datenbank mit kleinen Molekülen. Vor dem Andocken wurden Proteine und Liganden vorverarbeitet, indem Wassermoleküle bei Bedarf entfernt wurden, Wasserstoff hinzugefügt, Atomtypen definiert und Dateiformate für das Andocken konvertiert wurden. Das Andocken erfolgte anschließend mittels eines molekularen Andock-Workflows, und für jedes Liganden-Ziel-Paar wurden die Bindungsenergien berechnet. Bindungsaffinitäten unter -5 kcal/mol wurden als günstige Bindung interpretiert, während Werte unter -7 kcal/mol als relativ starke Bindung interpretiert wurden. Andock-Heatmaps wurden erstellt, um globale Bindungsmuster zwischen Zielen zu vergleichen. Die bestbewerteten Konformationen wurden in drei Dimensionen visualisiert, um Wasserstoffbrücken, hydrophobe Wechselwirkungen und die Nähe der Reste zu untersuchen. Der erfolgreiche Abschluss dieses Schrittes wurde durch stabile Andock-Ausgabedateien, plausible Ligandenpositionen im Zielbindungsbereich und Bindungsenergien definiert, die mit der Kandidatenpriorisierung übereinstimmen.

Leistung der in vivo experimentellen Validierung

GQD-Vorbereitung

GQD wurde aus vier traditionellen chinesischen Heilkräutern in folgenden rohen Arzneimittelanteilen hergestellt: 24 g Puerariae Lobatae Radix (Gegen), 9 g Scutellariae Radix (Huangqin), 9 g Coptidis Rhizoma (Huanglian) und 6 g Glycyrrhizae Radix et Rhizoma (Gancao). Details zu den botanischen Materialien und ihren Quellen sind in der Materialtabelle enthalten. Die Kräuter wurden zu feinem Pulver gemahlen, gründlich vermischt und 1 Stunde lang in 390 ml destilliertem Wasser eingeweicht. Die Mischung wurde zweimal dekoktiert. Für den ersten Suk wurden die Kräuter bei hoher Hitze gekocht und dann 30 Minuten bei niedriger Hitze köcheln lassen. Nach der Filtration durch Gaze wurden die Rückstände mit einem zehnfachen Volumen Wasser wieder aufgekocht. Die beiden Filtrate wurden kombiniert und in einem Wasserbad auf eine endgültige Rohstoffkonzentration von 5 g/ml konzentriert. Der Extrakt wurde dann gefiltert, abgekühlt und bis zur Verwendung bei 4 °C gelagert.

Etablierung des DSS-induzierten UC-Mausmodells

In dieser Studie wurden achtzehn männliche BALB/c-Mäuse (8 Wochen alt) verwendet, und alle Tierverfahren wurden vom Ethikkomitee der Chengdu University of Traditional Chinese Medicine genehmigt (Genehmigungsnummer 2022-126). Details zur tierischen Herkunft finden Sie in der Materialtabelle. Mäuse wurden unter spezifischen, pathogenfreien Bedingungen bei 20–22 °C und 55 % Luftfeuchtigkeit unter einem 12-Stunden-Hell/Dunkel-Zyklus gehalten. Nach einer einwöchigen Akklimatisierungsphase wurden die Tiere zufällig in drei Gruppen eingeteilt (n = 6 pro Gruppe): NC, UC und GQD. Die NC-Gruppe erhielt während des gesamten Experiments steriles Trinkwasser, während den UC- und GQD-Gruppen 1,5 % (w/v) Dextransulfatnatrium (MW 36-50 kDa) für 5 aufeinanderfolgende Tage im Trinkwasser verabreicht wurden, gefolgt von 2 Tagen normalem Wasser. Dieser Zyklus wurde dreimal wiederholt, um chronische Kolitis zu etablieren. Während der Interventionsphase wurden die NC- und UC-Gruppen zweimal täglich mit 200 μL 0,5 % Natriumcarboxymethylcellulose geschädigt, während die GQD-Gruppe das GQD zweimal täglich durch orale Gavage erhielt.

Die klinische Verschreibung von GQD bestand aus 24 g Gegen, 9 g Huangqin, 9 g Huanglian und 6 g Gancao, was einer Gesamtmenge von 48 g pro Tag für Erwachsene entspricht. Bei einem Standardgewicht von 60 kg für Erwachsene betrug die entsprechende Dosis für Erwachsene 0,8 g/kg/Tag. Basierend auf dem konventionellen Mensch-zu-Maus-Umrechnungskoeffizienten von 1:12 betrug die entsprechende Mausäquivalent-Dosis 9,6 g/kg/Tag. Nach dem voreingestellten Niedrig-, Mittel- und Hochdosisverhältnis von 1:2:4 lagen die berechneten Dosen bei 9,6, 19,2 bzw. 38,4 g/kg/Tag. Unter Berücksichtigung der Schwere und Persistenz der Darmentzündung im wiederholten DSS-induzierten Kolitismodell wurde das Hochdosisregime ausgewählt, um eine angemessene pharmakologische Intervention während der In-vivo-Validierung sicherzustellen. Um eine ausreichende pharmakologische Exposition während der aktiven Entzündungsphase zu unterstützen, wurde die Gesamtdosis von 38,4 g/kg/Tag in zwei gleich viele Dosen aufgeteilt. Während des gesamten Experiments wurden täglich Körpergewicht, Stuhlkonsistenz und rektale Blutungen überwacht. Am Ende des Protokolls wurden die Mäuse eingeschläfert und Darmgewebe für weitere Analysen entnommen.

Bewertung des Körpergewichts und des Krankheitsaktivitätsindex

Das Körpergewicht wurde täglich erfasst und als Prozentsatz des ursprünglichen Körpergewichts am Tag 0 angegeben. Die Schwere der Krankheit wurde anhand des Krankheitsaktivitätsindex (DAI) bewertet, der drei Parameter umfasste: Körpergewichtsverlust, Stuhlkonsistenz und rektale Blutungen. Jeder Parameter wurde unabhängig auf einer Skala von 0–4 je nach Schwere der klinischen Manifestationen bewertet, wobei höhere Werte auf eine stärkere Krankheitsaktivität hindeuten. Der endgültige DAI wurde als Durchschnitt der drei Einzelpunktzahlen berechnet, was eine Gesamtpunktzahl von 0 bis 4 ergab. Kurz gesagt zeigte ein Wert von 0 keine Auffälligkeit, während Werte von 1–4 einen zunehmend größeren Gewichtsverlust, lockerere Stuhlkonsistenz und stärkere rektale Blutungen widerspiegelten. Die detaillierten Bewertungskriterien sind in Tabelle 1 dargestellt.

Leistung der H&E-Färbung und Berechnung des histologischen Aktivitätsindex

Für die histologische Bewertung wurden die Darmgewebe in 4 % Paraformaldehyd fixiert, durch klassifiziertes Ethanol dehydriert, in Paraffin eingebettet und mit 4 μm Dicke geschnitten. Die Abschnitte wurden deparaffinisiert, rehydriert, mit Hämatoxylin gefärbt, mit Eosin kontrafärbt, dehydriert, gereinigt und montiert. Histologische Bilder wurden mit einem Hellfeldmikroskop beobachtet und mit einem Dia-Scan-System gescannt. Spezifische Geräteinformationen sind in der Materialtabelle aufgeführt. Die histopathologische Schädigung wurde anhand von drei Parametern bewertet, darunter die Erschöpfung der Kelch-Zellen, Schäden an der Krypt-Architektur und die Infiltration von entzündlichen Zellen. Jeder Parameter wurde entsprechend dem Ausmaß der Gewebeverletzung bewertet, und die Summe der drei Parameterwerte wurde als histologischer Aktivitätsindex (HAI) definiert, der von 0 bis 10 reicht, wie in Tabelle 2 zusammengefasst. Für die Quantifizierung von Becherzellen wurden pro Abschnitt fünf zufällig ausgewählte, nicht überlappende Felder mit 400× Vergrößerung analysiert. Die Anzahl der Kelchzellen pro Feld wurde manuell und blind gezählt, und die durchschnittliche Anzahl pro Feld wurde für jeden repräsentativen Darmschnitt berechnet.

Leistung der immunhistochemischen Färbung

Nach der Deparaffinisierung und Rehydrierung wurden Gewebeschnitte mit 0,1 % Trypsin bei 37 °C für 30 Minuten entnommen, gefolgt von einer Inkubation mit 3 % Wasserstoffperoxid zur Blockierung der endogenen Peroxidase-Aktivität. Die Schnitte wurden dann über Nacht bei 4 °C mit Kaninchen-Primärantikörpern gegen STAT3 (1:200, HUABIO, ET1605-45), TIMP1 (1:1000, Proteintech, 26847-1-AP), SPHK2 (1:500, Proteintech, 17096-1-AP) und HSPA5 (1:1000, Cell Signaling Technology, #3177) inkubiert, verdünnt in 1 % BSA. Details zu den Antikörpern und ihren Quellen sind in der Materialtabelle enthalten. Nach dem Waschen mit PBS wurden die Abschnitte mit dem entsprechenden sekundären Antikörper (1:2000) bei Raumtemperatur für 1,5 Stunden inkubiert. Die Immunreaktivität wurde mit einem chromogenen Nachweisreagenz visualisiert, und die Kerne wurden mit Hämatoxylin gegenfärbt. Die quantitative Bildanalyse wurde mit Bildanalysesoftware durchgeführt, die in der Materialtabelle aufgeführt ist.

Leistung der qRT-PCR-Analyse

Total RNA wurde mit einem phenolbasierten RNA-Extraktionsreagenz extrahiert und rückwärts transkribiert mit einem Erststrang-cDNA-Synthesekit. Die Reverse Transkription erfolgte bei 25 °C für 10 Minuten, 55 °C für 15 Minuten und 85 °C für 5 Minuten. qRT-PCR wurde anschließend mit einem Echtzeit-PCR-System und einem SYBR Green qPCR-Mix durchgeführt. Die Verstärkungsbedingungen waren wie folgt: erste Denaturierung bei 95 °C für 60 Sekunden, gefolgt von 40 Zyklen bei 95 °C für 15 Sekunden, 60 °C für 15 Sekunden und 72 °C für 45 Sekunden. Die Primer-Sequenzen wurden mit Primer-Design-Software entworfen und sind in Tabelle 3 aufgeführt. GAPDH wurde als interne Referenz verwendet, und die relativen mRNA-Expressionsniveaus wurden mit der 2^-ΔΔCt-Methode berechnet. Jede Probe wurde dreifach analysiert, und jedes Experiment wurde mindestens dreimal wiederholt. Details zu den Reagenzien, Instrumenten und Software sind in der Materialtabelle bereitgestellt.

Leistung der Western-Blot-Analyse

Dickdarmgewebe wurden in einem Lysepuffer mit Proteaseinhibitor auf Eis homogenisiert und 2 Stunden lang gründlich lysiert. Die Proteinkonzentrationen wurden mit einem Protein-Assay-Kit bestimmt. Gleiche Mengen Protein wurden mit einem Ladepuffer gemischt, vor der Elektrophorese denaturiert, durch 10 % SDS-PAGE getrennt und für 1 Stunde auf PVDF-Membranen bei 100 V übertragen. Nach 1 Stunde Blockierung mit 5 % fettarmer Milch bei Raumtemperatur wurden die Membranen über Nacht bei 4 °C mit primären Kaninchenantikörpern gegen STAT3 (1:200, HUABIO, ET1605-45), TIMP1 (1:1000, Proteintech, 26847-1-AP), SPHK2 (1:500, Proteintech, 17096-1-AP), HSPA5 (1:1000, Cell Signaling Technology, #3177) und GAPDH bei der entsprechenden Arbeitsverdünnung inkubiert. Nach dem Waschen mit TBST (20 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,1 % Tween-20; pH 7,4) wurden die Membranen mit dem entsprechenden sekundären Antikörper (1:5000) bei Raumtemperatur für 1 Stunde inkubiert. Die Proteinbänder wurden mit einem chemilumineszenten Detektionsreagenz visualisiert. Bandintensitäten wurden mit Bildanalysesoftware analysiert, und die Expressionsniveaus der Zielproteine wurden auf GAPDH normalisiert. Die erwarteten Molekulargewichte der detektierten Proteine betrugen etwa 88 kDa für STAT3, 21 kDa für TIMP1, 28 kDa für SPHK2, 70 kDa für HSPA5 und 36 kDa für GAPDH. Details zu den Antikörpern, Membranen, Reagenzien und Software sind in der Materialtabelle enthalten. Spezifische Produktnamen, Hersteller, Katalognummern, Instrumentenmodelle und Softwaredetails werden in der Materialtabelle angegeben, während im Haupttext allgemeine Beschreibungen verwendet werden, um Neutralität und allgemeine Anwendbarkeit zu verbessern.

Durchführung statistischer Analysen

Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung präsentiert. Statistische Tests wurden mit Statistiksoftware durchgeführt. Einseitige ANOVA, gefolgt von Tukeys Post-hoc-Test, wurde für Multigruppenvergleiche verwendet. Ein P-Wert ≤ 0,05 galt als statistisch signifikant.

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Ergebnisse

Erfassung von GEO-Datensätzen und UC-bezogene Gen-Identifikation

Zur Untersuchung von Genexpressionsänderungen bei UC wurden zwei transkriptomische Datensätze – GSE87466 und GSE92415 – aus der GEO-Datenbank unter Verwendung des Suchbegriffs "Colitis ulcerosa" gewonnen, mit Auswahlkriterien wie Datensatztyp, klarer Krankheits-/Kontrollannotation und ausreichender Stichprobengröße. Diese Datensätze umfassten 140 UC-Fälle und 42 gesunde Kontrollp...

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Diskussion

Colitis ulcerosa (UC) ist eine chronische, idiopathische entzündliche Darmerkrankung, die hauptsächlich die Darmschleimhaut betrifft und durch anhaltende oder episodische Entzündungen gekennzeichnet ist. Die Krankheit verringert die Lebensqualität der Patienten erheblich und erhöht das Risiko, an einem Darmkarzinom zu erkranken. Obwohl ihre weltweite Verbreitung stetig steigt, sind die genaue Ätiologie und zugrundeliegenden Mechanismen nur teilweise bekannt. Aktuelle Behandlungsoptionen ...

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Offenlegungen

Die Autoren geben an, dass sie keine bekannten konkurrierenden finanziellen Interessen oder persönlichen Beziehungen haben, die die in diesem Artikel berichtete Arbeit beeinflusst haben könnten.

Danksagungen

Die Autoren danken außerdem der GEO-Datenbank für den offenen Zugang zu den Daten und den Gutachtern für ihre konstruktiven Kommentare.

FINANZIERUNG: Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (81973684, 82174358), der Natural Science Foundation der Provinz Sichuan (2023NSFSC1760, 2025ZNSFSC1834), dem Sonderprojekt zur Forschung in traditioneller chinesischer Medizin der Provinzverwaltung der Sichuan-Provinzverwaltung für traditionelle chinesische Medizin (2023MS365, 2020JC0094) sowie dem gemeinsamen Innovationsfonds der Gesundheitskommission von Chengdu und der Chengdu University of Traditional Chinese Medicine (WXLH202402019, WXLH202403012, WXLH202501238, WXLH202501201).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Puerariae Lobatae RadixSichuan Neautus Traditional Chinese Medicine Co., Ltd.NTC-001Kräutermaterial für die GQD-Zubereitung
Scutellariae RadixSichuan Neautus Traditional Chinese Medicine Co., Ltd.NTC-002Kräutermaterial für die GQD-Zubereitung
Coptidis RhizomaSichuan Neautus Traditional Chinese Medicine Co., Ltd.NTC-003Kräutermaterial für die GQD-Zubereitung
Glycyrrhizae Radix et RhizomaSichuan Neautus Traditional Chinese Medicine Co., Ltd.NTC-004Kräutermaterial für die GQD-Zubereitung
BALB/c-Mäuse, männlich, 8 Wochen altBeijing HFK Bioscience Co., Ltd.N/AVersuchstiere
Dextransulfatnatrium (DSS), MW 36-50 kDaMP Biomedizin160110Kolitis auslösende Reagenz
NatriumcarboxymethylcelluloseSigma-Aldrich, St. Louis, MO, USAC5678Fahrzeug für orale Gavage
ParaformaldehydSigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA158127Gewebefixativ
HämatoxylinSigma-Aldrich, St. Louis, MO, USAH9627Nuklearverfärbung
EosinSigma-Aldrich, St. Louis, MO, USAE4009Gegenfarbe für Histologie
HellfeldmikroskopNikonEclipse 80iHistologische Beobachtung
Objektträger-Scansystem3DHISTECH Ltd.Panoramic 250Digitale Bildaufnahme für ganze Folien
TrypsinGibco, Carlsbad, CA, USA25200-056Antigen-Rückgewinnungsreagenz
WasserstoffperoxidSigma-Aldrich, St. Louis, MO, USAH1009Blockierung der endogenen Peroxidase-Aktivität
Rinderserumalbumin (BSA)Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USAA7906Antikörperverdünner / blockierendes Reagenz
Anti-STAT3 Primärantikörper, KaninchenZell-Signaltechnik9139Primärer Antikörper gegen IHC/WB
Anti-TIMP1 Primärantikörper, KaninchenAbcamab211925Primärer Antikörper gegen IHC/WB
Anti-SPHK2 Primärantikörper, KaninchenAbcamab187030Primärer Antikörper gegen IHC/WB
Anti-HSPA5 Primärantikörper, KaninchenZell-Signaltechnik3177Primärer Antikörper gegen IHC/WB
Anti-GAPDH Primärantikörper, KaninchenAbcamab9485Laderegelung für WB
Sekundärer Anti-Kaninchen-AntikörperYeasen Biotechnologie33201Sekundärer Antikörper gegen IHC/WB
Chromogenes DetektionsreagenzBeyotime Biotechnology [Shanghai] Co., Ltd., Shanghai, ChinaP0202Signalentwicklung für die Immunhistochemie
Bildanalyse-SoftwareMedienkybernetikImage-Pro Plus 7.0Quantifizierung der Färbung und Bandintensität
Phenolbasiertes RNA-ExtraktionsreagenzInvitrogenTrizol-Reagenz, 15596026Totale RNA-Extraktion
Erststrang-cDNA-SynthesekitBeyotime BiotechnologieDRR047AUmgekehrte Transkription
Echtzeit-PCR-SystemAngewandte BiosystemeABI Prism 7300Quantitative PCR-Amplifikation
SYBR Green qPCR-MixBeyotime BiotechnologieDRR420AqPCR-Detektionsreagenz
Primer-Design-SoftwarePremier Biosoft International, Palo Alto, CA, USAPrimer 5.0Primer-Design
RIPA-LysepufferBeyotime BiotechnologieP0013BProteinextraktionsreagenz
Proteashemmer (PMSF)Beyotime BiotechnologieST506Proteinschutz während der Lyse
BCA-Protein-Assay-KitBeyotime BiotechnologieP0010Proteinquantifizierung
PVDF-MembranMerck MilliporeIPVH00010Proteintransfermembran
Chemilumineszente Detektionsreagenz / -systemThermo Fisher Scientific32106Signalerkennung für Western Blot
StatistiksoftwareIBMSPSS 23.0Statistische Analyse

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