Forschungsartikel

Computergestützte Identifikation von Purinnukleosidphosphorylase und Östrogenrezeptor 1 als Biomarker für Paracetamol-induzierte Leberschäden

DOI:

10.3791/69887

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6. Februar 2026

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1School of Chinese Materia Medica, Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, 2College of Integrative Chinese and Western Medicine, Tianjin University of Traditional Chinese Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Wir analysieren computergestützt die Netzwerktoxikologie und die transkriptomischen Daten, um Biomarker der durch Paracetamol induzierten Leberschäden zu identifizieren und zeigen Östrogenrezeptor 1 und Purinnukleosidphosphorylase als diagnostische Ziele.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Durch Paracetamol verursachte Leberschädigung ist ein erhebliches Problem für die öffentliche Gesundheit, doch es fehlen zuverlässige frühe Biomarker. Diese Studie hatte zum Ziel, potenzielle Biomarker für paracetamolinduzierte Hepatotoxizität mithilfe eines rechnergestützten Ansatzes zu identifizieren, der Netzwerktoxikologie, Transkriptomik und maschinelles Lernen integriert. Potenzielle Paracetamol-Ziele wurden über Online-Plattformen vorhergesagt und lieferten 140 Kandidaten. Hepatotoxizitätsbezogene Gene (n = 657) wurden von GeneCards gewonnen, und 38 überlappende Gene wurden identifiziert. Differenziell exprimierte Gene aus dem GSE74000-Datensatz (n = 1.978) wurden analysiert. Eine funktionelle Anreicherung wurde durchgeführt, um relevante Wege zu identifizieren. Ein Zufallswaldmodell priorisierte 20 Merkmalsgene, und molekulares Andocken bewertete die Bindungsaffinitäten mit Paracetamol. DEGs waren hauptsächlich mit mitochondrialer Dysfunktion und Ribosomenbiogenese assoziiert. Die funktionelle Anreicherung hob den xenobiotischen Stoffwechsel und die Signale des oxidativen Stresses hervor. Östrogenrezeptor 1 und die Purinnukleosidphosphorylase waren Top-Feature-Gene und zeigten signifikante Expressionsunterschiede sowie starke Andockungsinteraktionen mit Paracetamol. Dieses computergestützte Protokoll sagt systematisch Kandidatenbiomarker für Paracetamol-induzierte Leberschäden voraus und liefert molekulare Einblicke sowie Kandidaten für experimentelle Validierung.

Einleitung

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Paracetamol (APAP) ist ein weit verbreitetes Fiebersenker und Schmerzmittel, aber eine übermäßige Aufnahme kann zu schwerer Hepatotoxizität und möglicherweise Leberversagen führen. Der Leberschaden wird erwartet, sobald das Medikament metabolisiert ist, und der anschließende toxische Metabolit ist N-Acetyl-p-Benzochinon-Imin (NAPQI), was zu mitochondrialem oxidativem Stress, veränderter mitochondrieller Atmung und dem Übergang zur mitochondrialen Permeabilität führt und schließlich zum nekrotischen statt apoptotischen Hepatozytentodführt 3,4. Die APAP-Überdosis bleibt in vielen Ländern die Hauptursache für akutes Leberversagen (ALF). Epidemiologische Daten zeigen, dass APAP-Toxizität fast 50 % der ALF-Fälle in den Vereinigten Staaten ausmacht und jährlich für Tausende von Notaufnahmen verantwortlich ist. Ähnliche Trends wurden weltweit berichtet, wobei APAP-assoziierte Hepatotoxizität einen Großteil der medikamentinduzierten Leberschäden (DILI)-Fällemit 5,6 ausmacht. Die hohe Morbidität, das Risiko einer Lebertransplantation und die erhebliche Gesundheitsbelastung unterstreichen den dringenden Bedarf an verbesserten diagnostischen Biomarkern und einem mechanistischen Verständnis der durch APAP verursachten Leberschädigungen. Konkret wird APAP durch Glucuronidierung und Sulfatierung in der Leber aufgenommen und hauptsächlich metabolisiert, wodurch wasserlösliche Konjugate entstehen, die im Urin ausgeschieden werden. Ein kleiner Anteil (10–15 %) unterliegt einer Hydroxylierung durch Cytochrom P450 (CYP450) (mittels Enzymen wie CYP1A2, CYP2E1 und CYP3A4), um das reaktive Intermediar NAPQI zu produzieren, das an Glutathion bindet und über Galle 7,8 ausgeschieden wird. Aufgrund der begrenzten Kapazität der Glucuronidierungs- und Sulfatationswege führt eine übermäßige Dosierung zu einer erhöhten NAPQI-Bildung, während gleichzeitig die hepatischen Glutathionreserven9 erschöpft werden. Sobald das Glutathion auf kritische Werte erschöpft ist, beginnt NAPQI, kovalent an zelluläre Makromoleküle zu binden und schädigt die Hepatozyten10. Die durch APAP-Überdosierung verursachte Toxizität steigt, mit schätzungsweise 50.000 bis 80.000 Notaufnahmebesuchen pro Jahr allein in den Vereinigten Staaten –11. Da oxidativer Stress und mitochondriale Dysfunktion zentral für APAP-induzierte Hepatotoxizität sind, kann die Dysregulation von ESR1 indirekt das Überleben der Hepatozyten und die entzündlichen Reaktionen während der APAP-Verletzung beeinflussen. Die APAP-Toxizität induziert metabolischen Stress und entzündliche Aktivierung in den Hepatozyten. Veränderungen in der PNP-Expression könnten einen veränderten Nukleotidstoffwechsel und immunbezogene Reaktionen während APAP-induzierter Leberschäden widerspiegeln.

Frühe Berichte zur durch APAP induzierten Hepatotoxizität konzentrierten sich hauptsächlich auf klinische Symptome und pathologische Veränderungen in Leber und Nieren und bildeten die Grundlage für spätere Studien zu den Mechanismen des Zelltodes und der Entzündung bei APAP-Toxizität12,13. Ein wichtiger Durchbruch war die Identifizierung von Serum-Aminotransferasen (z. B. ALT und AST) als Biomarker für Leberschädigungen. Mit dem Aufkommen von Zellkulturmodellen und bioinformatischen Werkzeugen hat sich die aktuelle Forschung zur APAP-Hepatotoxizität auf diagnostische, prognostische und mechanistische Biomarkerausgeweitet 14,15,16. Allerdings bleibtes schwierig, ausreichende Serum- oder Plasmaproben von APAP-Überdosispatienten, insbesondere von Nicht-Überlebenden, zu erhalten. Daher besteht ein dringender Bedarf, neue diagnostische, prognostische und mechanistische Biomarker mit neuartigen Ansätzen zu erforschen, um APAP-induzierte Hepatotoxizität besser zu untersuchen.

Netzwerktoxikologie ist ein aufkommendes Fachgebiet, das Netzwerkmodelle entwickelt, um toxikologische Daten aus Verbindungsdatenbanken zu analysieren18,19. Es hilft, Substanztoxizität zu charakterisieren, Mechanismen aufzudecken und zentrale Zielevorherzusagen 20,21. Derzeit wird die Netzwerktoxikologie weithin als wertvolles Werkzeug in der wissenschaftlichen Forschung anerkannt. So integrierten Tengjiao Qu et al. Netzwerktoxikologie mit Transkriptomik, um neue neurotoxische Mechanismen von 2,2',4,4'-Tetrabromodiphenyläther (ein häufiger Flammhemder) und dessen potenziellen Biomarkern22 zu identifizieren. Neuere Studien heben auch die Bedeutung dieses Ansatzes bei der Bewertung der Toxizität von Naturproduktenhervor 23. Dieses innovative Forschungsparadigma wurde jedoch noch nicht angewandt, um die potenziellen Mechanismen der durch APAP induzierten Lepatotoxizität zu erforschen und neue Biomarker zu identifizieren, die mit ihrer Toxizität verbunden sind.

IntelliGenes wurde als maschinelle Lernpipeline für die Entdeckung multigenomischer Biomarkerentwickelt 24. Es integriert statistische Methoden mit fortschrittlichem ML, um I-Gen-Scores zu berechnen und individuelle Biomarkerprofile zu erstellen. Die Ergebnisse zeigen eine verbesserte Genauigkeit bei der Vorhersage komplexer Merkmale und ermöglichen personalisierte Krankheitseinblicke. Einschränkungen sind unter anderem die Abhängigkeit von der Datenqualität, begrenzte Validierung über verschiedene Bevölkerungsgruppen hinweg und der Bedarf an umfassenderen klinischen Tests.

Das Highlight ist, dass die aktuellen Biomarker des pankreatalen ductalen Adenokarzinoms (PDAC) unzureichend sind und Patienten-abgeleitete Organoide (PDOs) als funktionelle Plattformen für die Entwicklung von Biomarkernvorgeschlagen werden 25. Es bewertet PDO-basierte Arzneimittelphänotypisierung, Chemoresistenzmodellierung, Kokultursysteme und proteomisch-/metabolomisches Profiling. Die Ergebnisse zeigen, dass PDOs therapierelevante Biologie besser erfassen, aber Einschränkungen umfassen technische Variabilität, begrenzte Mikroumgebungsreplikation, lange Kulturzeiten und Herausforderungen bei der routinemäßigen klinischen Integration26,27.

Ziel der Studie war es, analytische proteomische Methoden und die Funktion der Bioinformatik bei der Identifikation von Biomarkern zu bewerten28. Es wurde untersucht, wie rechnerische Werkzeuge die Dateninterpretation unterstützten, und untersuchte MS-basierte Proteinanalysetechniken. Die Ergebnisse zeigten eine verbesserte Biomarkerentdeckung und neue Behandlungsziele, machten aber auch deutlich, dass die Identifizierung von sehr niedrigen Proteinen weiterhin schwierig ist und dadurch die Empfindlichkeit bestehender proteomischer Techniken verringert. Obwohl mehrere diagnostische, mechanistische und prognostische Biomarker für APAP-induzierte Lebertoxizität gut etabliert sind, spiegeln diese Marker in erster Linie eine hepatozelluläre Schädigung oder mitochondriale Dysfunktion nach Eintritt der Toxizitätwider. Im Gegensatz dazu zielte die vorliegende Studie darauf ab, transkriptomische Regulatoren zu identifizieren, die die Anfälligkeit oder die Wirtsreaktion auf APAP-Exposition modulieren könnten. ESR1 und PNP wurden daher als explorative regulatorische Marker und nicht als klassische diagnostische Biomarker untersucht.

Um die Einschränkungen der aktuellen Methoden zu adressieren – insbesondere die Kulturvariabilität von PDOs und die Sensitivitätsfragen der Proteomik – verwendet diese Studie ein integriertes rechnergestütztes Rahmenwerk, das Netzwerktoxikologie, Transkriptomik, maschinelles Lernen und molekulares Andocken umfasst. Diese mehrstufige Strategie umgeht den Bedarf an großen Kohorten oder komplexen experimentellen Systemen, indem sie rechnergestützte Vorhersagen und Multi-Omic-Kreuzvalidierung nutzt. Die Begründung für diesen kombinatorischen Ansatz ist, dass jede Technik die anderen verstärkt, um Fehlalarme zu minimieren: Die Netzwerktoxikologie liefert zunächst eine systemweite Vorhersage von APAP-bezogenen Zielen und toxischen Signalwegen; Die transkriptomische Analyse bestätigt anschließend, welche dieser vorhergesagten Gene während der Hepatotoxizität tatsächlich dysreguliert sind; Maschinelle Lernalgorithmen priorisieren dann die informativsten Kandidatenbiomarker aus diesem Hochvertrauenspool; und schließlich bietet das molekulare Andocken mechanistische Unterstützung, indem es die Machbarkeit direkter Wechselwirkungen zwischen APAP und den identifizierten Proteinzielen bestätigt.

Zusammen schaffen diese Schritte eine kohärente, evidenzbasierte Pipeline zur Biomarker-Vorhersage. Diese Kombination dieser vier Strategien minimiert falsch-positive Vorhersagen und erhöht das Vertrauen darin, ESR1 und PNP als starke Ziele bei APAP-induzierter Hepatotoxizität zu finden. In dieser Forschung wäre es notwendig, GSE74000 Genexpressionsdatensätze mit guter statistischer Stärke zu besitzen, mindestens drei biologische Replikationen einer beliebigen Erkrankung mit vollständigen Metadaten. Die Rohexpressionsdateien müssten auf eine standardisierte Weise verarbeitet werden, die aus Hintergrundkorrektur, Normalisierung (Quantilnormalisierung usw.) und dem Ausfiltern niedrig exprimierter Gene besteht. R wurde verwendet, um alle Analysen mit Paketen wie Limma und externen Tools wie GeneCards und Cytoscape durchzuführen, die den Aufbau eines Netzwerks ermöglichen. Obwohl die Pipeline die Priorisierung von Biomarkern auf Basis systematischer Analyse erleichtert, sind die Ergebnisse durch die Qualität des Datensatzes, Batch-Effekte und das Fehlen experimenteller und in vivo Validierung begrenzt, was die Generalisierbarkeit beeinträchtigen könnte.

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Protokoll

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Dieses Protokoll beschreibt eine computergestützte Methode zur Definition der möglichen Biomarker für durch Paracetamol verursachte Leberschädigung, die Netzwerktoxikologie, Transkriptomik, maschinelles Lernen und molekulares Andocken nutzt (Abbildung 1). Das Protokoll richtet sich an Forscher, die Zugang zu Bioinformatik-Tools, transkriptomischen Datensätzen und Molekulardocking-Software haben.

Vorgehen

Schritt 1: Identifizierung von Paracetamol-Zielen
Holen Sie die SMILS-Darstellung von Paracetamol (APAP) von PubChem ab. Nutzen Sie Online-Plattformen (ChEMBL, SwissTargetPrediction, STITCH, SEA), um potenzielle molekulare Ziele von APAP vorherzusagen. Integrieren und deduplizieren Sie die vorhergesagten Ziele, um eine Liste von 140 APAP-Zielen mit hoher Zuverlässigkeit zu erstellen.

Schritt 2: Identifikation von Hepatotoxizitätszielen
Hepatotoxizitätsbezogene Gene aus der GeneCards-Datenbank abrufen. Kompilieren und deduplizieren Sie die Liste, um einen nicht-redundanten Satz von 657 hepatotoxizitätsbezogenen Genen zu erzeugen. Identifizieren Sie überlappende Gene zwischen APAP-Zielen und hepatotoxizitätsbezogenen Genen mithilfe eines Venn-Diagramms.

Schritt 3: Transkriptomische Datenvorverarbeitung
Laden Sie den GSE74000-Datensatz von GEO herunter. Rohexpressionsdaten mit DESeq2 vorverarbeiten: Gene mit niedriger Expression entfernen, Größenfaktoren normalisieren und Varianz-stabilisierende Transformation (VST) anwenden. Führen Sie eine differentielle Expressionsanalyse mit Limma und DESeq2 durch, mit Schwellen des angepassten p-Werts < 0,05 und |log2FC| > 1.

Schritt 4: Funktionale Anreicherungsanalyse
Laden Sie überlappende Gene in STRING hoch, um Genontologie (GO), KEGG-Signalweg, Gewebeexpression und Krankheitskorrelationsanalysen zu untersuchen. Visualisieren Sie die Ergebnisse der funktionalen Anreicherung mithilfe von Blasendiagrammen und Heatmaps.

Schritt 5: Maschinelles Lernen zur Auswahl von Merkmalegenen
Wenden Sie einen Random Forest-Klassifikator (n_estimators=500, max_depth=10) an, um Merkmalsgene aus den sich überlappenden APAP- und Hepatotoxizitätsgenen zu priorisieren. Bewerten Sie die Modellleistung anhand von Out-of-Bag (OOB)-Fehler- und Feature-Importance Scores. Wählen Sie die Top 20 Merkmalsgene für eine weitere Analyse aus.

Schritt 6: Molekulare Andockung
APAP-Struktur (CID 1983) aus PubChem und Proteinrezeptoren (ESR1: PDB ID 1SJ0, PNP: PDB ID 1V2H) aus PDB abgerufen. Liganden- und Rezeptordateien vorbereiten: in PDB-Format konvertieren, polare Wasserstoffe hinzufügen, Ladungen zuweisen und als PDBQT-Dateien speichern. Definieren Sie das Andockgitter in AutoDock Tools, das die aktive Stelle des Proteins abdeckt. Führe molekulare Andockung mit AutoDock Vina durch, wobei die Erschöpfung auf 8 gesetzt ist, und analysiere Bindungsaffinitäten und Wechselwirkungen. Visualisieren Sie Andockergebnisse mit PyMOL, um Bindungskonformationen und Schlüsselinteraktionen zu analysieren.

Schritt 7: Statistische Analyse
Bestimmen Sie die statistische Signifikans mittels t-Tests und passen p-Werte für Mehrfachvergleiche mit der Benjamini-Hochberg-Methode31 an. Visualisieren Sie statistisch signifikante Assoziationen mithilfe von Heatmaps und Streudiagrammen.

Materialien und Methoden

Identifikation von Paracetamol-Zielen
Um potenzielle molekulare Ziele von APAP zu identifizieren, haben wir zunächst die SMILS-Darstellung aus der PubChem-Datenbank abgerufen. Anschließend nutzten wir mehrere Online-Plattformen, darunter das Chemical European Molecular Biology Laboratory (ChemBL)32, Swiss Target Prediction33, Search Tool for the Interaction of Chemicals and Targets (STITCH)34 und Similarity Ensemble Approach (SEA)35, um mögliche Ziele vorherzusagen. Nach der Integration der Ergebnisse dieser Tools haben wir eine Reihe von High-Confidence-Zielen für APAP ausgewählt. Tabelle 1 definiert die wichtigsten Genkategorien, die in dieser Studie verwendet werden, und erläutert ihre Rolle in der Datenanalyse und biologischen Interpretation. Die konsequente Verwendung dieser Begriffe gewährleistet eine klare Kommunikation unserer Ergebnisse.

Identifikation von Hepatotoxizitätszielen
Potenzielle hepatotoxizitätsassoziierte Gene wurden aus der GeneCards-Datenbank abgerufen. Alle identifizierten Gene wurden zusammengestellt, Duplikate entfernt und eine nicht-redundante Liste für nachgelagerte Analysen erstellt. Der GSE74000-Datensatz wurde am 15. März 2024 aus dem GEO-Repository heruntergeladen. Rohexpressionsdaten wurden mit dem Limma-Paket (Quantilnormalisierung) verarbeitet und normalisiert. Die differentielle Ausdrucksanalyse wurde mit linearer Modellierung mit empirischer Bayes-Schrumpfung durchgeführt. Gene, die den bereinigten p-Wert < 0,05 (Benjamini-Hochberg FDR) und |log₂FC| > 1 galten als signifikant. Die Visualisierung der DEGs erfolgte mithilfe von Vulkandiagrammen und Heatmaps, die mit ggplot2 generiert wurden.

Datenvorverarbeitung
Rohzähldaten wurden mit DESeq2 vorverarbeitet. Gene mit niedriger Expression wurden mit einem Nachweisschwellenwert von CPM >1 in mindestens 70 % der Proben entfernt. Die Bibliotheksgrößennormalisierung wurde unter Verwendung der DESeq2-Größenfaktoren durchgeführt, wie in Gleichung (1) definiert:

Gleichung 1(1)

Wobei der mediane Größenfaktor mit sj bezeichnet wird. Zur Stabilisierung von Mittelwert-Varianz-Beziehungen wurde in Gleichung (2) eine varianzstabilisierende Transformation (VST) verwendet:

Gleichung 2(2)

DEGs wurden mittels des Wald-Tests mit Benjamini-Hochberg-Korrektur identifiziert, wobei Gene als signifikant betrachtet wurden, wenn sie in Gleichung (3) verwendet werden:

Gleichung 3(3)

Die von DESeq2 abgeleitete DEG-Menge wurde als Gleichung (4) definiert:

Gleichung 4(4)

Diese Menge (X) wurde in der Konsensstrategie zusammen mit Limma Trend (Y) und Limma Voom (Z) verwendet.

Aufbau von PPI-Netzwerken
Venn-Diagramme wurden verwendet, um gemeinsame Gene zwischen APAP- und Hepatotoxizitätszielen zu identifizieren. Die sich überlappenden Gene wurden dann in die Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins (STRING)-Datenbank hochgeladen, um PPI-Netzwerke zu konstruieren.

Multidimensionale funktionale Anreicherungsanalyse
Zunächst führten wir Gene Ontology (GO), Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG), Gewebeexpression und krankheitsbezogene funktionelle Analysen der überlappenden Gene für APAP und Hepatotoxizität über die STRING-Website durch. Anschließend führten wir GO-, KEGG- und Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) (REACTOME) Anreicherungsanalysen der Differentialgene auf Hepatotoxizität mit Sendo Academic Tools durch.

Zufallswaldanalyse
Wir haben maschinelles Lernen angewendet, um die Top 20 Feature-Gene aus den sich überlappenden APAP- und Hepatotoxizitätsgenen in den APAP-induzierten Hepatotoxizitätstranskriptomdaten zu identifizieren. Ein Random Forest-Klassifikator wurde implementiert, mit 500 Bäumen (n_estimators=500), maximaler Baumtiefe von 10 (max_depth=10), mindestens 2 Stichproben erforderlich, um einen Knoten zu spalten (min_samples_split=2), und dem Gini-Verunreinigungskriterium (Kriterium='Gini')36. Die Leistung des Modells wurde anhand des Out-of-Bag-(OOB)-Fehlers bewertet, wobei ein Wert nahe 0 eine höhere prädiktive Genauigkeit anzeigt. Feature-Importance Scores wurden berechnet und auf Basis der Random Forest-Analyse visualisiert, um den Beitrag jedes Gens zu bewerten, wie in Gleichung (5).

Gleichung 5(5)

N war die Gesamtzahl der Stichproben, yi war die 1(·) war eine Indikatorfunktion, 1, wenn die Bedingung stimmte, und sonst 0; Gleichung 6 war das vorhergesagte Label von Probe III, das nur Bäume verwendete, bei denen III nicht im Training enthalten war.

Differenzielle Expression charakterisierter Gene
Die Expressionsunterschiede von Merkmalsgenen in den transkriptomischen Daten wurden mithilfe von Geigendiagrammen visualisiert. Biomarker mit statistisch signifikanten Unterschieden wurden als potenzielle neuartige Biomarker für APAP-induzierte Hepatotoxizität für weitere Untersuchungen identifiziert.

Molekulare Andockung
Kleine Molekülverbindungen (CID 1983) wurden aus der PubChem-Datenbank abgerufen, und die Proteinrezeptoren ESR1 und PNP (PDB-IDs 1SJ0 und 1V2H) wurden aus der Protein Data Bank heruntergeladen. Ligandenstrukturen wurden mit OpenBabel in das PDB-Format umgewandelt und in AutoDock Tools vorverarbeitet, indem polare Wasserstoffe hinzugefügt, Gasteiger-Ladungen zugewiesen, rotierbare Bindungen definiert und im PDBQT-Format gespeichert wurden. Proteinrezeptoren wurden mit PyMOL hergestellt, indem Wassermoleküle und kokristallisierte Liganden entfernt wurden, gefolgt von der Zugabe polarer Wasserstoffe und der Zuweisung von Kollman-Ladungen mit AutoDock Tools und als PDBQT-Dateien gespeichert wurden.

Beim molekularen Andocken wurde die AutoDock-Software verwendet, um das Andockgitter zu definieren, das die aktive Stelle von Protein37 abdeckt. Das Gitterfeld war an den Koordinaten zentriert (x = XX·XX, y = YY· YY,z = ZZ· ZZ) mit Abmessungen von 40 × 40 × 40 Å und einem Gitterabstand von 0,375 Å, was eine vollständige Abdeckung der Bindungstasche gewährleistet. AutoDock Vina wurde eingesetzt, um Liganden-Protein-Bindungsmodi und Bindungsaffinitäten zu berechnen, wobei der Exhaustivitätsparameter auf 8 gesetzt wurde und die obersten neun Bindungsposen für jeden Liganden generiert wurden.

Die Validierung des Andockprotokolls erfolgte durch erneutes Andocken des kokristallisierten Liganden in die aktive Stelle, was einen RMSD-Wert von < 2,0 Å ergab und die Zuverlässigkeit des Andockverfahrens bestätigte. Die Andockergebnisse wurden mit PyMOL visualisiert, um Bindungskonformationen und Schlüsselwechselwirkungen, einschließlich Wasserstoffbrückenbindungen, zu analysieren.

Andocksimulationen sagten voraus, dass Verbindung X in die Bindungsstelle von Protein Y passt und potenzielle Wasserstoffbrücken und hydrophobe Kontakte bildet, mit einer prognostizierten Bindungsenergie von -8,5 kcal/mol.

Fehlerbehebung und mögliche Modifikationen
Um die Robustheit und Reproduzierbarkeit des vorgeschlagenen Arbeitsablaufs zu verbessern, sollten mehrere Fehlerbehebungsüberlegungen und mögliche Änderungen berücksichtigt werden. Wenn eine unerwartet geringe Anzahl differenziell exprimierter Gene (DEGs) identifiziert wird, wird den Nutzern geraten, das Normalisierungsverfahren zu überprüfen, eine genaue Gruppenkennzeichnung zu überprüfen und die |log2-fache Änderung anzupassen| Schwellenwert, während eine angemessene Fehlentdeckungsrate (FDR) Kontrolle aufrechterhalten wird. Umgekehrt kann bei einer übermäßigen Anzahl von DEGs strengere FDR-Cutoffs oder das Filtern von Low-Varianz-Genen vor der differentiellen Expressionsanalyse die Spezifität verbessern.

Batch-Effekte können Clusteringmuster in explorativen Analysen wie der Hauptkomponentenanalyse (PCA) beeinflussen. Wenn die Proben überwiegend nach Batch und nicht nach biologischen Bedingungen clustern, sollten Batch-Korrekturmethoden (z. B. empirische Bayes-Ansätze wie ComBat) angewendet und die Metadaten der Proben sorgfältig auf Konsistenz überprüft werden.

Bei der Random Forest-basierten Merkmalsauswahl können hohe Out-of-Bag (OOB)-Fehlerraten oder instabile Merkmalsrankings auf eine suboptimale Modellkonfiguration hinweisen. In solchen Fällen kann eine Erhöhung der Anzahl der Bäume, das Abstimmen des MTRY-Parameters oder die Durchführung wiederholter Modellläufe mit Konsens-Merkmalsauswahl die Modellstabilität und die prädiktive Zuverlässigkeit verbessern. Zusätzlich können Kreuzvalidierungsstrategien eingesetzt werden, um die Modellrobustheit weiter zu bewerten.

Um die Zuverlässigkeit zu erhöhen, können Nutzer die Analyse optional mit alternativen DEG-Schwellenwerten oder Parametereinstellungen für maschinelles Lernen wiederholen und die Konsistenz identifizierter Merkmalsgene vergleichen. Solche Sensitivitätsanalysen helfen sicherzustellen, dass die wichtigsten Erkenntnisse nicht durch spezifische Parameterwahl bestimmt werden, und unterstützen die Reproduzierbarkeit des Workflows über ähnliche transkriptomische Datensätze hinweg.

Statistische Analysen
Die statistische Signifikanz wurde mittels eines t-Tests bestimmt, wobei p-Werte zum Vergleich angegeben wurden. Statistische Korrelationen zwischen Genexpressionsniveaus und hepatotoxizitätsbezogenen Phänotypen wurden mit Pearson- und Spearman-Korrelationskoeffizienten bewertet, abhängig von der Datennormalität. P-Werte wurden für Mehrfachvergleiche mit der Benjamini-Hochberg-Methode angepasst. Signifikante Assoziationen wurden mit Heatmaps und Streudiagrammen visualisiert, was eine robuste Bewertung der transkriptomischen Beziehungen ermöglichte.

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Ergebnisse

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Identifikation überlappender Gene für APAP und Hepatotoxizität sowie deren funktionelle Analyse
Um potenzielle molekulare Ziele von APAP zu bestimmen und deren biologische Rolle zu untersuchen, wurden Vorhersagen mit vier Rechenwerkzeugen erstellt: ChEMBL, SwissTargetPrediction, STITCH und SEA. Nach der Entfernung der doppelten Einträge und der Integration überlappender Ergebnisse wurde eine nicht-redundante Liste von 140 Kandidatenzielen erstellt. Zusätzlich wurden 657 hepatotoxizitätsbezogene Gene a...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

APAP ist ein häufig verschriebenes Analgetikum und Fiebersenker; Übermäßige Aufnahme kann jedoch zu erheblicher Hepatotoxizität führen, die manchmal in akutem Leberversagen38 gipfelt. Trotz Fortschritte bei der Aufklärung der pathophysiologischen Mechanismen von APAP-induzierten Leberschäden bleibt ein Mangel an zuverlässigen Biomarkern für eine genaue Diagnose, Prognose und mechanistische Untersuchung. Daher besteht ein dringender Bedarf, potenzielle neuartige Bi...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren danken der Tianjin University of Traditional Chinese Medicine für die institutionelle Unterstützung. Wir danken den Entwicklern öffentlicher Datenbanken (GeneCards, PubChem, STRING) und Open-Source-Tools, die diese Forschung ermöglicht haben. Ein besonderer Dank gilt den Kolleginnen und Kollegen der School of Chinese Materia Medica und dem College of Integrative Chinese and Western Medicine für ihre wertvollen Diskussionen und technische Unterstützung. Wir würdigen auch die Beitragenden des GSE74000-Datensatzes dafür, dass sie ihre Daten öffentlich zugänglich gemacht haben.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Datenbanken & Webserver
STRINGhttps://cn.string-db.org/PPI-Netzwerkaufbau; Funktionale Anreicherung
Sendo Akademische Werkzeugehttps://www.xiantaozi.com/GO-, KEGG- und GSEA-Anreicherungsanalyse
PubChemhttps://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/Rückgewinnung chemischer Strukturen (APAP)
GeneCardshttps://www.genecards.org/Abruf von hepatotoxizitätsbezogenen Genen
GEO-Datenbankhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/Abruf des transkriptomischen Datensatzes (GSE74000)
ChEMBLhttps://www.ebi.ac.uk/chembl/Zielvorhersage
SwissTargetPredictionhttp://www.swisstargetprediction.ch/Zielvorhersage
STICHhttp://stitch.embl.de/Interaktionsvorhersage
SEAhttp://sea.bkslab.org/Ähnlichkeitsensemble-Ansatz zur Zielvorhersage
Proteindatenbank (PDB)https://www.rcsb.org/Proteinstrukturrückgewinnung (ESR1, PNP)
Software
R (Version 4.x.x)https://www.r-project.org/Statistische Analyse und Datenverarbeitung
AutoDock Tools / Vinahttp://autodock.scripps.edu/Vorbereitung und Simulation des molekularen Andockens
PyMOLhttps://pymol.org/Visualisierung molekularer Strukturen
Zytoscapehttps://cytoscape.org/Netzwerkvisualisierung

Referenzen

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  1. Aminoshariae, A., Khan, A. Acetaminophen: old drug, new issues. J Endod. 41 (5), 588-593 (2015).
  2. Bertolini, A., et al. Paracetamol: new vistas of an old drug. CNS Drug Rev. 12 (3-4), 250-275 (2006).
  3. Hayward, K. L., Powell, E. E., Irvine, K. M., Martin, J. H. Can paracetamol (acetaminophen) be administered to patients with liver impairment. Br J Clin Pharmacol. 81 (2), 210-222 (2016).
  4. Lee, W. M. Acetaminophen (APAP) hepatotoxicity: isn't it time for APAP to go away. J Hepatol. 67 (6), 1324-1331 (2017).
  5. Li, X., Ni, J., Chen, L. Advances in the study of acetaminophen-induced liver injury. Front Pharmacol. 14, 1239395(2023).
  6. Li, R., et al. Underlying mechanisms and treatment of acetaminopheninduced liver injury (review). Mol Med Rep. 31 (4), 106(2025).
  7. Black, M. Acetaminophen hepatotoxicity. Annu Rev Med. 35, 577-593 (1984).
  8. Lai, Y., Zhong, X. B. Special section on mechanisms of drug metabolism in acetaminophen-induced hepatotoxicity: editorial. Drug Metab Dispos. 52 (8), 704-706 (2024).
  9. Jaeschke, H., et al. Recommendations for the use of the acetaminophen hepatotoxicity model for mechanistic studies and how to avoid common pitfalls. Acta Pharm Sin B. 11 (12), 3740-3755 (2021).
  10. Ameer, B., Greenblatt, D. J. Acetaminophen. Ann Intern Med. 87 (2), 202-209 (1977).
  11. Blieden, M., Paramore, L. C., Shah, D., Ben-Joseph, R. A perspective on the epidemiology of acetaminophen exposure and toxicity in the United States. Expert Rev Clin Pharmacol. 7 (3), 341-348 (2014).
  12. Vitols, S. Paracetamol hepatotoxicity at therapeutic doses. J Intern Med. 253 (2), 95-98 (2003).
  13. Hinson, J. A., Pohl, L. R., Monks, T. J., Gillette, J. R. Acetaminophen-induced hepatotoxicity. Life Sci. 29 (2), 107-116 (1981).
  14. Monte, A. A., et al. Genetic variants associated with ALT elevation from therapeutic acetaminophen. Clin Toxicol (Phila). 60 (11), 1198-1204 (2022).
  15. Zhang, C. J., et al. A human liver organoid screening platform for DILI risk prediction. J Hepatol. 78 (5), 998-1006 (2023).
  16. McGill, M. R., Jaeschke, H. Mechanistic biomarkers in acetaminophen-induced hepatotoxicity and acute liver failure: from preclinical models to patients. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 10 (7), 1005-1017 (2014).
  17. Zhou, Y., et al. Rapid and non-invasive analysis of paracetamol overdose using paper arrow-mass spectrometry: a prospective observational study. BMC Med. 22 (1), 553(2024).
  18. Panagiotou, G., Taboureau, O. The impact of network biology in pharmacology and toxicology. SAR QSAR Environ Res. 23 (3-4), 221-235 (2012).
  19. Lan, Y., Peng, Q., Fu, B., Liu, H. Effective analysis of thyroid toxicity and mechanisms of acetyltributyl citrate using network toxicology, molecular docking, and machine learning strategies. Toxicology. 511, 154029(2025).
  20. Guan, T., et al. Probing the potential mechanism of permethrin exposure on Alzheimer's disease through enantiomer-specific network toxicology, multi-spectroscopic, and docking approaches. Chemosphere. 369, 143786(2024).
  21. Zheng, Q., Peng, Q., Shen, J., Liu, H. Efficient analysis of toxicity and mechanisms of acetyl tributyl citrate on aging with network toxicology and molecular docking strategy. Toxicology. 510, 154009(2025).
  22. Qu, T., et al. Integration of network toxicology and transcriptomics reveals the novel neurotoxic mechanisms of 2,2',4,4'-tetrabromodiphenyl ether. J Hazard Mater. 486, 136999(2025).
  23. Ran, Q., et al. Integrated bioinformatics and multi-omics to investigate the mechanism of Rhododendron molle Flos-induced hepatotoxicity. J Ethnopharmacol. 341, 119308(2025).
  24. DeGroat, W., et al. Intelligenes: a novel machine learning pipeline for biomarker discovery and predictive analysis using multi-genomic profiles. Bioinformatics. 39 (12), btad755(2023).
  25. Chew, C. A., et al. Functional precision in pancreatic cancer: redefining biomarkers with patient-derived organoids. Int J Mol Sci. 26 (18), 9083(2025).
  26. Hu, J. W., Pan, Y. Z., Zhang, X. X., Li, J. T., Jin, Y. Applications and challenges of patient-derived organoids in hepatobiliary and pancreatic cancers. World J Gastroenterol. 31 (20), 106747(2025).
  27. Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
  28. Diouf, O., Soumboundou, M., Sall, C. Proteomics analysis techniques and bioinformatics approaches for biomarkers discovery. Int J Biol Chem Sci. 17 (7), 2943-2957 (2024).
  29. McGill, M. R., Jaeschke, H. Metabolism and disposition of acetaminophen: recent advances in relation to hepatotoxicity and diagnosis. Pharm Res. 30 (9), 2174-2187 (2013).
  30. Jaeschke, H., Ramachandran, A. Acetaminophen hepatotoxicity: paradigm for understanding mechanisms of drug-induced liver injury. Annu Rev Pathol. 19, 453-478 (2024).
  31. Pang, Z., et al. MetaboAnalyst 5.0: narrowing the gap between raw spectra and functional insights. Nucleic Acids Res. 49 (W1), W388-W396 (2021).
  32. Zdrazil, B., et al. The ChEMBL database in 2023: a drug discovery platform spanning multiple bioactivity data types and time periods. Nucleic Acids Res. 52 (D1), D1180-D1192 (2024).
  33. Daina, A., Michielin, O., Zoete, V. SwissTargetPrediction: updated data and new features for efficient prediction of protein targets of small molecules. Nucleic Acids Res. 47 (W1), W357-W364 (2019).
  34. Szklarczyk, D., et al. STITCH 5: augmenting protein-chemical interaction networks with tissue and affinity data. Nucleic Acids Res. 44 (D1), D380-D384 (2016).
  35. Keiser, M. J., et al. Relating protein pharmacology by ligand chemistry. Nat Biotechnol. 25 (2), 197-206 (2007).
  36. Nematzadeh, S., Kiani, F., Torkamanian-Afshar, M., Aydin, N. Tuning hyperparameters of machine learning algorithms and deep neural networks using metaheuristics: a bioinformatics study on biomedical and biological cases. Comput Biol Chem. 97, 107619(2022).
  37. Li, S., et al. Immunomodulatory peptides from sturgeon cartilage: isolation, identification, molecular docking and effects on RAW264.7 cells. Food Chem X. 24, 101863(2024).
  38. Chidiac, A. S., Buckley, N. A., Noghrehchi, F., Cairns, R. Paracetamol (acetaminophen) overdose and hepatotoxicity: mechanism, treatment, prevention measures, and estimates of burden of disease. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 19 (5), 297-317 (2023).
  39. Nowotka, M. M., et al. Using ChEMBL web services for building applications and data processing workflows relevant to drug discovery. Expert Opin Drug Discov. 12 (8), 757-767 (2017).
  40. Daina, A., Michielin, O., Zoete, V. SwissTargetPrediction: updated data and new features for efficient prediction of protein targets of small molecules. Nucleic Acids Res. 47 (W1), 357-364 (2019).
  41. Kuhn, M., et al. STITCH 2: an interaction network database for small molecules and proteins. Nucleic Acids Res. 38 (Database issue), D552-D556 (2010).
  42. Josephy, D. P. The molecular toxicology of acetaminophen. Drug Metab Rev. 37 (4), 581-594 (2005).
  43. Pogosian, L. G., Nersesova, L. S., Gazariants, M. G., Mkrtchian, Z. S., Akopian, Z. I. Some inhibitors of purine nucleoside phosphorylase. Biomed Khim. 57 (5), 526-534 (2011).
  44. Walker, P. L., et al. Purine nucleoside phosphorylase deficiency: a mutation update. Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. 30 (12), 1243-1247 (2011).
  45. Skácel, J., et al. synthesis, biological evaluation, and crystallographic study of novel purine nucleoside phosphorylase inhibitors. J Med Chem. 66 (10), 6652-6681 (2023).
  46. Zhao, X., et al. a natural steroid saponin, shows remarkable protective effect against acetaminophen-induced liver damage in vitro and in vivo. Toxicol Lett. 214 (1), 69-80 (2012).
  47. Arao, Y., Korach, K. S. The physiological role of estrogen receptor functional domains. Essays Biochem. 65 (6), 867-875 (2021).
  48. Chen, P., Li, B., Ou-Yang, L. Role of estrogen receptors in health and disease. Front Endocrinol (Lausanne). 13, 839005(2022).
  49. Höllein, A., et al. The combination of WGS and RNA-seq is superior to conventional diagnostic tests in multiple myeloma: ready for prime time. Cancer Genet. 242, 15-24 (2020).

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