Forschungsartikel

Next-Generation-Sequencing-Klonality-Assays: Klinische Validierung für das Monitoring der minimalen Restsarkonomie beim Multiplen Myelom

DOI:

10.3791/69890

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21. August 2026

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1The First Affiliated Hospital of Gannan Medical University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Diese Studie evaluierte einen neuartigen, auf NGS basierenden BCR/TCR-Klonalitäts-Test (OriMIRACLE LTM) zur MRD-Detektion bei lymphatischen Malignitäten, einschließlich multiplem Myelom (MM). Unter Verwendung von Zelllinien und klinischen Abstrichen zeigte er eine Nachweisrate von >90 % und eine Übereinstimmung mit der Durchflusszytometrie von 81,36 %. Der Test bietet eine hohe Empfindlichkeit, ermöglicht die Vorhersage eines Rezidivs und unterstützt therapeutische Entscheidungen.

Zusammenfassung

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Der Nachweis von minimaler Resterkrankung (MRD) ist entscheidend für das Management lymphoider Malignome. Diese Studie stellt OriMIRACLE LTM vor, einen neuartigen, auf Next-Generation-Sequencing (NGS) basierenden Assay zur Bestimmung der Klonalität von B-Zell-Rezeptoren (BCR) und T-Zell-Rezeptoren (TCR) zum Nachweis von MRD. Wir validierten den Assay unter Verwendung von Zelllinien und klinischen Proben, einschließlich Restpräparaten, von Patienten mit Multiplem Myelom (MM). Der BCR/TCR-Klonalitätsassay zeigte eine positive Nachweisrate von über 90 % bei lymphoiden Malignomen. Validierungsstudien bei MM-Patienten ergaben eine Übereinstimmungsrate von 81,36 % (48/59) zwischen multicolor-Flusszytometrie (MFC) und klinischer Beurteilung des Tumorzellnachweises. Bemerkenswerterweise erlitten 61,11 % (11/18) der MM-Patienten, bei denen MRD sowohl durch NGS als auch durch MFC nachgewiesen wurde, eine Krankheitsprogression oder ein Rezidiv. Patienten, bei denen MRD ausschließlich durch NGS detektiert wurde, wiesen niedrigere Raten einer klinischen kompletten Remission auf, und einige anfänglich ansprechende MM-Patienten erlitten nach Beendigung der Therapie ein Rezidiv. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass dieser auf NGS basierende Assay einen hochsensitiven und spezifischen Nachweis von MRD bei lymphoiden Malignomen ermöglicht, selbst in aus Restpräparaten von MM-Patienten gewonnenen Proben. Er zeigt Vorteile gegenüber der MFC und erweist sich als wertvoll für das MRD-Monitoring. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die derzeitigen Daten NGS als ergänzendes Werkzeug zur MFC unterstützen, insbesondere bei MFC⁻/NGS⁺-Patienten, da NGS eine tiefere Risikostratifizierung ermöglicht. Der optimale Interventions-Schwellenwert muss jedoch noch in prospektiven Studien bestimmt werden.

Einleitung

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Multiples Myelom (MM) ist eine hämatologische maligne Erkrankung, die durch die Proliferation aberranter, klonaler Plasmazellen im Knochenmark gekennzeichnet ist1. In China wurden im Jahr 2022 etwa 22.450 neue MM-Fälle diagnostiziert und 17.360 damit verbundene Todesfälle verzeichnet2. Trotz erheblicher Fortschritte in der Behandlung des MM in den letzten zehn Jahren, die die mittlere Überlebensdauer der Patienten deutlich verlängert haben, erleidet die Mehrheit der Patienten letztendlich einen Rückfall3,4. Dieser starke Anstieg unterstreicht die entscheidende Notwendigkeit einer präzisen Überwachung der Remission, einer frühen Vorhersage von Rückfällen und rechtzeitiger therapeutischer Maßnahmen.

Klinische Belege haben die prognostische Bedeutung des minimalen Resterkrankungszustands (MRD) bei hämatologischen Malignitäten fest etabliert5,6,7. Angesichts ihrer Bedeutung hat die Internationale Myelom-Arbeitsgruppe (IMWG) die MRD-Bestimmung 2016 in ihre Kriterien zur Beurteilung des Ansprechens aufgenommen8. Zu den derzeitigen Methoden zur MRD-Bestimmung im Knochenmark gehören die allelspezifische Oligonukleotid-Polymerase-Kettenreaktion (ASO-PCR), die digitale PCR (dPCR), die multiparametrische Durchflusszytometrie (MFC) und Next-Generation-Sequencing-(NGS-)Assays8. Obwohl die ASO-PCR eine empfindliche Detektion ermöglicht, ist sie zeitaufwändig und schwierig zu standardisieren, da patientenspezifische Primer erforderlich sind9,10. Ebenso ist die dPCR durch ihr allelspezifisches Design eingeschränkt10,11. Die MFC hat eine wichtige Rolle bei der MRD-Detektion gespielt12 und liefert schnelle zelluläre Informationen, steht jedoch vor Herausforderungen hinsichtlich Standardisierung und Reproduzierbarkeit.

NGS stellt einen reproduzierbaren, hochsensitiven Ansatz dar, der die Verwendung patientenspezifischer Primer überflüssig macht. Er ermöglicht die zuverlässige Identifizierung und Quantifizierung einzigartiger Immunglobulin-Umlagerungen bei hämatologischen Malignitäten13. Die Food and Drug Administration (FDA) hat ClonoSEQ von Adaptive Biotechnologies für die MRD-Testung bei Patienten mit akuter lymphatischer Leukämie (ALL), MM und chronischer lymphatischer Leukämie (CLL) zugelassen14,15,16. Zahlreiche internationale klinische Leitlinien enthalten mittlerweile NGS als empfohlene Methode zur MRD-Überwachung. Auch die Chinesischen Leitlinien zur Diagnose und Behandlung von MM (überarbeitet 2020) befürworten die MRD-Bewertung bei MM-Patienten mithilfe von Methoden wie der Next-Generation-Durchflusszytometrie (NGF) und NGS17.

Nach unserem Wissen ist die NGS-Technologie aufgrund von Kosten- und Zeitbeschränkungen in der klinischen Praxis nicht die bevorzugte Methode zur MRD-Detektion bei lymphatischen Malignitäten. Wenn die MFC-Ergebnisse negativ sind, ist häufig eine zusätzliche Knochenmarkaspiration erforderlich, um eine MRD nachzuweisen. Dieses zusätzliche Verfahren kann erhebliche körperliche und psychische Belastungen für die Patienten mit sich bringen und dadurch eine breite klinische Anwendung möglicherweise einschränken.

In dieser Studie haben wir die Entwicklung, Charakterisierung und Validierung der Leistung eines NGS-basierten B- oder T-Zell-Rezeptor-(BCR/TCR)-Klonalitätsassays (OriMIRACLE LTM) durchgeführt. Die primären Zielsetzungen dieser Studie bestanden darin, die Sensitivität und Spezifität dieses Assays zur Verfolgung der minimalen Resterkrankung (MRD) bei lymphatischen Malignitäten zu validieren, auch bei Verwendung von Restpräparaten. Diese Methode kann direkt verbliebene Knochenmarkausstriche nutzen, die von der routinemäßigen Diagnostik übrig geblieben sind, und überwindet damit die inhärenten Einschränkungen von Ausstrichproben. Selbst wenn die DNA in den Ausstrichen aufgrund von Fixierung, Färbung und Langzeitlagerung fragmentiert, in äußerst geringen Mengen vorhanden oder teilweise degradiert ist, können durch optimierte Nukleinsäure-Extraktion und multiplex PCR-Amplifikation zuverlässige Immunrepetoirprofile gewonnen werden. Die Methode ermöglicht eine hochsensitive klonale Verfolgung mit einer Sensitivität von 10⁻5 bis 10⁻6, wodurch die untere Nachweisgrenze der konventionellen, auf Durchflusszytometrie basierenden MRD-Analyse übertroffen wird. Diese Arbeit unterstreicht das Potenzial der NGS-basierten BCR/TCR-Klonalitätsbestimmung, die MRD-Überwachung zu verbessern und die Therapieentscheidungen für Patienten mit multiplem Myelom (MM) zu unterstützen, und könnte damit aktuelle Limitationen in der klinischen Praxis adressieren.

Protokoll

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Die Studie wurde in Übereinstimmung mit den Grundsätzen der Deklaration von Helsinki durchgeführt und von dem Ethikkomitee des Ersten Angegliederten Krankenhauses der Gannan Medizinischen Universität genehmigt (Ethik-Zulassungsnummer: 22SC-2023011201). Von allen Teilnehmern wurde vor ihrer Aufnahme in die Studie eine schriftliche, informierte Einwilligung eingeholt.

Probenauswahl
Klinische Proben wurden von 40 Patienten mit verschiedenen hämatologischen Malignitäten, einschließlich ALL, MM, CLL und Lymphom, gewonnen. Zusätzlich wurden gepaarte Proben aus der chronischen Phase und Blastenkrise von Patienten mit chronischer myeloischer Leukämie gesammelt. Die Proben wurden zwischen Dezember 2016 und August 2022 vom Ersten Angegliederten Krankenhaus der Gannan Medical University in Jiangxi, China, erhalten. Diese Proben stammten aus Knochenmarkaspiraten (BMA) oder peripherem Blut. Vier Zelllinien von lymphatischen Malignitäten wurden ebenfalls verwendet: die B-ALL-Linien REH und NALM6, die T-ALL-Linie Jurkat und die Lymphomlinie H9, alle bezogen aus der American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA).

Für die analytische Validierungsstudie wurde eine Teilmengen gepaarter klinischer Restmaterial-Präparate des Knochenmarks vor und nach der Behandlung von 30 neu diagnostizierten oder rezidivierten MM-Patienten einbezogen. MFC-Analysen wurden an BMA-Proben zu den entsprechenden Zeitpunkten mittels 4-Farben-Durchflusszytometrie durchgeführt.

Die Proben wurden mit sechs verschiedenen 4-Farben-Antikörperkombinationen (Verdünnungen gemäß Herstellerangaben) gefärbt: CD38/CD56/CD45/CD19, CD38/CD138/CD45/CD34, CD38/CD117/CD45/CD33, CD38/CD22/CD45/CD20, CD38/CD9/CD45/HLA-DR sowie K/L/CD45/CD38. Die Färbung erfolgte 30 min bei 4 °C im Dunkeln, gefolgt von zwei Waschschritten mit PBS (Zentrifugation bei 500 × g für 5 min bei 4 °C). In immunhämatologischen Laboren wird die MFC-MRD-Positivität im Knochenmark derzeit anhand einer Schwelle von 10-4 (1 Zelle in 10.000) definiert. Die Qualität der Durchflusszytometrie-Datenaufnahme wurde überprüft, indem Streuung in Vorwärts- und Seitwärtsrichtung visuell kontrolliert und sichergestellt wurde, dass pro Probe mindestens 10.000 CD45+-Ereignisse erfasst wurden.

Klonalitätsnachweis und MRD-Überwachung mittels NGS-basiertem Klonalitätstest
gDNA wurde aus 200 µL Knochenmarkaspirat, peripherem Blut oder gesamtem restlichen Ausstrich (in 200 µL PBS resuspendiert) unter Verwendung des entsprechenden Kits gemäß Herstelleranweisungen extrahiert. Es wurde eine minimale gDNA-Konzentration von 20 ng/µL und eine Gesamtausbeute von ≥ 1 µg gefordert. Ein A260/A280-Verhältnis von 1,8–2,0 wurde überprüft. Dieser Test amplifiziert gDNA mittels locus-spezifischer Multiplex-PCR mit Primern, gefolgt von der Hinzufügung eines reaktionsspezifischen Index-Barcodes zur amplifizierten Rezeptorsequenz zur Probenidentifizierung. Die barcodierten, amplifizierten DNA-Proben werden anschließend gepoolt, um Sequenzierbibliotheken herzustellen, die mittels NGS auf der Illumina-Plattform analysiert werden. Die endgültige Bibliotheksgröße von 350–450 bp und eine Konzentration von ≥ 5 nM wurden am Bioanalyzer überprüft. Die Sequenzierdaten werden mithilfe maßgeschneiderter Bioinformatik-Pipelines und strenger Qualitätskontrollmaßnahmen verarbeitet. Die Reads werden jeweils den umgeordneten BCRs oder TCRs jeder Probe zugeordnet und zu klonalen Rezeptorsequenzen zusammengefasst. Diese Sequenzen werden anschließend hinsichtlich ihres krankheitsbezogenen Potenzials und ihrer Eignung für die nachfolgende Verfolgung bewertet. Um als geeignet zu gelten, muss eine Sequenz mindestens 10 % aller BCR-Sequenzen an dem betreffenden Locus ausmachen und ausreichend eindeutig sein. Bei der Bewertung einer Sequenz für die MRD-Verfolgung wird ihre Eindeutigkeit durch Vergleich mit einer umfassenden B- oder T-Zell-Reperoirdatenbank, wie beispielsweise der ImMunoGeneTics (IMGT)-Datenbank (http://www.imgt.org), bestimmt. Die Häufigkeit der Sequenz in dieser Datenbank wird zur Beurteilung ihrer Unterscheidbarkeit herangezogen. Sobald geeignete krankheitsbezogene Sequenzen identifiziert sind, werden sie mit nachfolgenden Proben verglichen, um die MRD zu überwachen. Proben werden als MRD-positiv (+) klassifiziert, wenn Übereinstimmungen gefunden werden, oder als MRD-negativ (-), wenn keine Übereinstimmungen nachgewiesen werden. Die Konzentration jeder überwachten Sequenz wird quantifiziert, wodurch die Berechnung konsensbasierter maligner Zellen und der Gesamtanzahl kernhaltiger Zellen auf Proben-Ebene ermöglicht wird. Das Verhältnis dieser Werte liefert eine Schätzung der Tumorzellfrequenz innerhalb einer Probe und bietet wertvolle Einblicke in den Krankheitsverlauf oder die Remission. Eine klonale Sequenz galt als valide für die Verfolgung, wenn mindestens 50 unterstützende Reads nachgewiesen wurden und die Sequenz ≥10 % des gesamten BCR/TCR-Reperoires bei der Diagnose ausmachte.

Alle aus Menschen stammenden Proben wurden unter Biohazard-Bedingungen in einem Biosicherheitswerkbank der Klasse II (BSC) unter Verwendung persönlicher Schutzausrüstung (PPE) behandelt. Kontaminierte Verbrauchsmaterialien wurden vor der Entsorgung im Autoklaven (121 °C, 20 min) sterilisiert; flüssige Abfälle wurden mit 10 % Bleichmittel behandelt.

Studien zur Präzision und Empfindlichkeit
Die Nachweisgrenze (LOD) wurde mithilfe von klinischen Proben und Zelllinien gegenüber einem Hintergrund von peripherem gDNA von gesunden Spendern bestimmt. Um die Linearität der Detektion zu ermitteln, wurde gDNA aus Zelllinien in normales gDNA eingearbeitet, um eine Bandbreite an klonalen Frequenzen über mehrere Größenordnungen hinweg zu erzeugen. Konkret wurden maligne Zellen beginnend mit 10 Zellen sowie anschließenden 10-fachen seriellen Verdünnungen eingearbeitet: 10, 100, 1.000 und 10.000 Zellen. Die LOD wurde als die erwartete Anzahl maligner Eingabezellen berechnet, bei der die angepasste Probit-Kurve eine Nachweiswahrscheinlichkeit von 95 % erreichte. Die Übereinstimmung zwischen beobachteten und erwarteten Frequenzen wurde mittels linearer Regression analysiert. Diese Parameter bilden eine solide Grundlage für die abschätzbare MRD-Quantifizierung auf Proben-Ebene in nachfolgenden Evaluationsstudien. Diese überarbeitete Version bewahrt den wissenschaftlichen Ton, verbessert gleichzeitig Klarheit und Prägnanz und stellt zudem die korrekte Verwendung wissenschaftlicher Fachbegriffe sicher, wobei die Konventionen des wissenschaftlichen Schreibens im Bereich der Lebenswissenschaften und Medizin eingehalten werden.

Statistische Analyse
Ein zweiseitiger p < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen. Die Linearität wurde mithilfe des Korrelationskoeffizienten nach Pearson (r) in GraphPad Prism bewertet und berechnet. Die statistische Analyse wurde mit der Programmiersprache R (Version 3.6.1) durchgeführt. Die Berechnung des progressionsfreien Überlebens (PFS) beginnt zu dem Zeitpunkt, zu dem der Patient eine komplette Remission (CR), eine partielle Remission (PR) oder eine sehr gute partielle Remission (VGPR) erreicht, und erstreckt sich bis zum Eintritt einer progredienten Erkrankung (PD) oder dem Tod aus beliebiger Ursache. Zur Analyse des Überlebens wurde die Kaplan-Meier-Kurve verwendet, und der Log-Rank-Test diente zum Vergleich der Überlebensunterschiede zwischen Subgruppen. Die Cox-Analyse wurde sowohl als univariate als auch als multivariate Analyse durchgeführt.

Ergebnisse

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Verarbeitung, Linearität und Präzision der Klonalitätsdetektion
Die BCR/TCR-Klonalitätsanalysen basierten auf zwei Runden einer Multiplex-PCR, gefolgt von einer NGS-Analyse (Abbildung 1). Die BCR-Klonalitätsanalysen konnten Umlagerungen von IGH (VH-DH-JH oder DH-JH), IGK (Vκ-Jκ, Vκ-Kde und IntronRSS-Kde) sowie IGL (Vλ-Jλ) identifizieren und zudem Translokationen BCL1-IGH und BCL2-IGH mittels separater Reaktionen oder einer einzigen angepassten Mischreaktion nachweisen. Die TCR-Klonalitätsanalysen konnten Umlagerungen von TCRB (Vβ-Dβ-Jβ) und TCRG (Vγ–Jγ) detektieren. Die BCR-Klonalität bei malignen B-Zell-Lymphoiderkrankungen zeigte eine Nachweisrate von 93,94 %, und die TCR-Klonalität bei malignen T-Zell-Lymphoiderkrankungen zeigte eine Nachweisrate von 90,91 % (Tabelle 1).

Die Linearität wurde über einen weiten Bereich an Probeneingaben (0,2 µg, 2 µg und 20 µg) hinweg anhand der Ergebnisse von Zelllinientests nachgewiesen, die mehrere Größenordnungen umfassen. Zur Etablierung der Linearität wurden maligne Zellen mittels 10-facher serieller Verdünnungen (10, 100, 1.000 und 10.000 Zellen) in normale gDNA eingestellt. Die Linearität zeigte sich mit geschätzten Steigungen von 0,93–1,06 über klonale Frequenzen von 1 bis 10-6 (Abbildung 2A). Die Nachweisgrenze (LOD) wurde für beide BCR- und TCR-Klonalitätsassays auf zwischen 1 und 2 malignen Zellen geschätzt (Abbildung 2B). Darüber hinaus konnten die BCR/TCR-Klonalitätsassays Klonalität bei Lymphomen sowohl in Gewebeproben (BMA) als auch im zugehörigen peripheren Blut nachweisen (Ergänzende Tabelle 1).

Patienten und Proben zur Validierung des MRD-Nachweises
Zur Validierung des MRD-Nachweises wurden insgesamt 29 Patienten mit multiplem Myelom untersucht, wobei ein Patient aufgrund von Probenbeschädigung ausgeschlossen wurde. Die Studienpopulation bestand aus 65,52 % (19/29) Männern und 34,48 % (10/29) Frauen, das mediane Alter betrug 65 Jahre (Spanne 33–82) (Tabelle 2). Gemäß den Kriterien der IMWG wurden 31,03 % (9/29) der Patienten als Hochrisiko, 24,14 % (7/29) als Standardrisiko und 37,93 % (11/29) als Niedrigrisiko eingestuft18. Die Stadien I, II und III des überarbeiteten internationalen Stadiensystems für multiples Myelom (R-ISS) entfielen jeweils auf 10,34 % (3/29), 48,28 % (14/29) und 20,69 % (6/29) der Patienten19.

Vergleich der NGS- und MFC-Assays
Ein direkter paarweiser Vergleich wurde durchgeführt, um die quantitative Genauigkeit der OriMIRACLE LTM- und MFC-Assays zu bewerten. Die Ergebnisse zeigten eine ähnliche quantitative Genauigkeit über den getesteten Bereich hinweg, insbesondere bei MRD-Frequenzen oberhalb von 10−4, mit einem Pearson-R-Wert von 0,73 (Abbildung 3). Tumorzellen wurden in 59 Proben von 29 MM-Patienten sowohl durch MFC- als auch durch NGS-Assays nachgewiesen, wobei die Übereinstimmung 81,36 % (48/59) betrug. Diese Übereinstimmung spiegelt das Vorhandensein nachweisbarer Tumorzellen zu verschiedenen Zeitpunkten wider, nicht jedoch eine echte Übereinstimmung zwischen den Methoden. Unter den Proben waren 62,07 % (18/29) mittels beider Assays (NGS und MFC) als MRD+ klassifiziert, ein Patient wurde mit beiden Methoden als MRD− eingestuft, und bei 11 Patienten wurde MRD mittels NGS positiv, jedoch mittels MFC negativ getestet. Unter den Patienten mit inkonsistenten Nachweisergebnissen lagen drei unterhalb einer Nachweisfrequenz von 10-4, während acht eine Nachweisfrequenz im Bereich von 10-2–10-4 aufwiesen (Abbildung 3). Die DNA-Extraktion erfolgt aus verbliebenen Knochenmarkausstrichproben, um möglichst viel DNA zu gewinnen. Für die Klonalitätsbestimmung vor der Behandlung wurde eine durchschnittliche DNA-Menge von 91,95 ng (bis zu 100,0 ng) eingesetzt. Für die anschließende MRD-Testung wurde durchschnittlich 1623,39 ng DNA (Bereich: 50,1–17400,0 ng) extrahiert (ergänzende Tabelle 2). Es zeigte sich, dass NGS in der Lage ist, MRD auch bei unzureichender Restprobe nachzuweisen, während MFC in einigen Fällen keinen MRD-Nachweis erbringen konnte.

Klinische Validität der MRD-Detektion mittels NGS-Assay für das Lead-Intervall
Klonale Sequenzen wurden bei allen MM-Patienten im Basisstatus nachgewiesen, gefolgt von der Beurteilung der MRD (Abbildung 4). Bei 18 Patienten wurde mittels NGS und MFC eine MRD-Positivität bestätigt. Unter den Patienten mit MRD-Positivität sowohl durch MFC als auch durch NGS erlitten 61,11 % (11/18) anschließend ein Progress oder einen Rezidiv. 38,89 % (7/18) der Patienten erreichten im Verlauf der Studie eine stabile Erkrankung (SD) oder eine partielle Remission (PR). Unter den Patienten, bei denen MRD mittels NGS als positiv, jedoch mittels MFC als negativ bestätigt wurde, konnten 36,36 % (4/11) bei der letzten klinischen Beurteilung keine klinische komplette Remission (CR) erreichen (Ergänzende Tabelle 2). Zudem erlitten unter allen Patienten, deren klinische Remission als CR eingestuft wurde, 37,50 % (3/8) nach Beendigung der Therapie ein Rezidiv. Wir untersuchten außerdem primäre klinische Merkmale und MFC-Ergebnisse in Bezug auf das Ergebnis des progressionsfreien Überlebens (PFS) (Ergänzende Abbildung 1). Univariate und multivariate Analysen des PFS zeigten, dass diese Faktoren nicht signifikant miteinander verbunden waren. In dieser Studie wurde kein signifikanter Unterschied im PFS beobachtet, wenn ausschließlich die aus MFC gewonnenen MRD-Ergebnisse analysiert wurden.

VERFÜGBARKEIT VON DATEN
Aufgrund von Beschränkungen zum Schutz der Privatsphäre der Patienten und institutionellen Richtlinien sind die Rohdaten nicht öffentlich zugänglich. Eine Zusammenfassung der erhobenen Daten ist in Supplementary File 1 enthalten.

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Abbildung 1: Der BCR/TCR-Klonalitätsassay umfasste eine Multiplex-PCR, gefolgt von NGS. In der ersten PCR-Runde wurde der CDR3-Bereich umgelagerter Immunrezeptorgene unter Verwendung locus-spezifischer Primer und probespezifischer Indizes amplifiziert, und NGS-Adapter wurden während der zweiten PCR-Runde hinzugefügt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 2: Die Linearität der Klonalitätsdetektion wurde durch Zugabe von Zelllinien-gDNA zu normaler gDNA über einen Bereich klonaler Frequenzen hinweg bewertet. (A) Linearität der BCR- und TCR-Klonalitätsassays. (B) Bestimmung der Nachweisgrenze (LOD) unter Verwendung von klinischen Proben und Zelllinien, die in gDNA aus peripherem Blut gesunder Spender eingemischt wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 3: Paarweiser Vergleich der MRD-Häufigkeitsmessungen zwischen MFC und dem NGS-MRD-Assay. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 4: Die MRD-Dynamik von MM-Patienten und die unterschiedlichen klinischen Zustände der Patienten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

ProbentypenNr.ErkrankungstypDominanter Klontyp
ZelllinienREH1B-ALLIGH, IGK
NALM62B-ALLIGH, IGK
Jurkat3T-ALLTCRB, TCRG
H94LymphomTCRB, TCRG
Klinische B-Zell-Lymphom-Erkrankungen5B-ALLIGH
6B-ALLIGL
7B-ALLIGH
8B-ALLNicht nachgewiesen
9CLLIGH, IGK
10CLLIGH, IGK
11CP-CMLIGH
12BP-CMLIGH
13MMIGK
14MMIGH, IGK
15MMIGK
16MMIGH
17MMIGH
18MMIGK
19MMIGH
20MMIGH, IGK
21MMIGH, IGK
22MMIGH
23LymphomIGH, IGK
24LymphomIGH, IGK, IGL
25LymphomIGH, IGK, IGL
26LymphomIGH, IGK, IGL
27LymphomIGH
28LymphomIGH
29LymphomIGH, IGK, IGL
30LymphomIGH, IGK 
31LymphomIGH, IGK 
32LymphomIGH, IGK, IGL
33LymphomIGK
34LymphomIGH
35LymphomNicht nachgewiesen
Klinische T-Zell-Lymphom-Erkrankungen36LymphomTCGR
37LymphomTCRB, TCRG
38LymphomTCRB, TCRG
39LymphomTCRB, TCRG
40LymphomTCRB, TCRG
41LymphomTCRB, TCRG
42LymphomTCRB, TCRG
43LymphomTCRB, TCRG
44LymphomNicht nachgewiesen

Tabelle 1: Nachweis der Klonalität mittels BCR/TCR-Klonalitätsassays in 4 Zelllinien und 40 klinischen Proben. B-ALL: B-zelluläre akute lymphoblastische Leukämie; T-ALL: T-zelluläre akute lymphoblastische Leukämie; CP-CML: Chronische Phase der chronischen myeloischen Leukämie; BP-CML: Blastenphase der chronischen myeloischen Leukämie; CLL: Chronische lymphatische Leukämie; MM: Multiples Myelom.

MerkmaleGesamt (N = 29)
Medianalter, Jahre (Spanne)65 (33–82)
Geschlecht, n (%)
Männlich19 (65,52)
Weiblich10 (34,48)
Typ der schweren Kette, n (%)
IgG14 (48,28)
IgA7 (24,14)
IgE1 (3,45)
Typ der leichten Kette, n (%)
k19 (65,52)
λ8 (27,59)
zytogenetische Abnormalität, n (%)
del17p2 (6,90)
del13q149 (31,03)
1q21 Gewinn/Verstärkung12 (41,38)
t (4;14)2 (6,90)
Keine Abnormalitäten9 (31,03)
ISS-Stadium, n (%)
I4 (13,79)
II13 (44,83)
III12 (41,38)
R-ISS-Stadium, n (%)
I3 (10,34)
II14 (48,28)
III6 (20,69)
Fehlend6 (20,69)
IMWG, n (%)
Hohes Risiko9 (31,03)
Standardrisiko7 (24,14)
Niedriges Risiko11 (37,93)
Fehlend2 (6,90)

Tabelle 2: Basischarakteristika der 29 MM-Patienten, die in diese Studie eingeschlossen wurden. k: Kappa; λ: Lambda; DS: Durie-Salmon; ISS: Internationales Stadiensystem; R-ISS: überarbeitetes Internationales Stadiensystem; IMWG: Internationale Myelom-Arbeitsgruppe

Abbildung 1, Zusatzmaterial: Überlebensanalyse basierend auf klinischen Merkmalen und MFC-Ergebnissen. (A) Univariate und multivariate Analysen der progressionsfreien Überlebenszeit (PFS). (B) Kaplan-Meier-Kurve mit MFC-Ergebnis. (C) Kaplan-Meier-Kurve mit NGS-Ergebnis. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Zusatz-Tabelle 1: Nachweis der Klonalität von Lymphomen mittels BCR/TCR-Klonalitätsanalysen in Gewebeproben und passendem peripherem Blut. NHL: Non-Hodgkin-Lymphom; HGBL: hochgradiges B-Zell-Lymphom; FL: follikuläres Lymphom; DLBCL: diffuses großes B-Zell-Lymphom; ITLPD-GI: indolente T-lymphoproliferative Erkrankungen des Gastrointestinaltrakts. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Zusatz-Tabelle 2: Ergebnisse der MRD-Detektion basierend auf MFC- und NGS-Assays. ND: nicht nachgewiesen; Teilremission: PR; Vollständige Remission: CR; Stabile Erkrankung: SD; Sehr gute Teilremission: VGPR. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Zusatzdatei 1: Zusammenfassung der in dieser Studie erhobenen Rohdaten. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

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In den letzten Jahren haben sich die klinischen Ergebnisse bei lymphatischen Erkrankungen erheblich verbessert, was die Suche nach alternativen Markern befeuert hat, die Überlebensendpunkte früher vorhersagen und die Bewertung neuer Therapien beschleunigen können20. Eine umfassende Metaanalyse mit 8.098 Patienten hat den starken prognostischen Wert der MRD-Negativität für ein verbessertes Langzeitüberleben bei MM-Patienten erneut bestätigt21. Darüber hinaus haben BCR- und TCR-Klonale-Umlagerungen als entscheidende diagnostische Marker und zur Verfolgung der MRD-Belastung an Bedeutung gewonnen und leiten therapeutische Entscheidungen bei malignen Erkrankungen des Lymphsystems22.

Zunehmende Evidenz untermauert die Überlegenheit der NGS-basierten BCR/TCR-Klonalitätsbestimmung gegenüber MFC- und PCR-basierten Assays, insbesondere wenn ausreichende DNA-Proben verfügbar sind. NGS bietet eine höhere Sensitivität und einfachere Standardisierung10,23,24,25,26 und wurde als starker prognostischer Faktor für das progressionsfreie Überleben (PFS) sowie das Gesamtüberleben zu Beginn einer Erhaltungstherapie identifiziert27.
In dieser Studie entwickelten wir ein NGS-basiertes Assay, das eine positive Detektionsrate von über 90 % sowohl für die BCR- als auch für die TCR-Klonalität bei lymphatischen Malignitäten aufweist. Die Nachweisgrenze (LOD) des Assays wird für beide BCR- und TCR-Klonalitätsassays auf zwischen 1 und 2 malignen Zellen geschätzt, vergleichbar mit der hohen Empfindlichkeit des clonoSEQ-Assays, dessen LOD bei 1,903 malignen Zellen liegt16. Wir beobachteten eine Linearität mit geschätzten Steigungen zwischen 0,93 und 1,06 über klonale Frequenzen von 1 bis 10-6, was auf eine starke Proportionalität zwischen beobachteten und erwarteten klonalen Frequenzen hinweist. Nach Etablierung standardisierter Nachweismethoden und Abschluss der laborinternen Validierung führten wir eine klinische Validierung durch, um die Eignung des Assays für das klinische MRD-Monitoring sicherzustellen.

Diese Studie zeigte eine Übereinstimmung von 81,36 % (48/59) zwischen dem NGS-basierten Assay und der MFC. Beide Methoden wiesen eine Sensitivität von 100 % bei der Identifizierung von Tumorzellen in neu diagnostizierten oder rezidivierten Fällen auf. Bei der Überwachung nach der Behandlung fanden wir keinen signifikanten Zusammenhang zwischen dem MRD-Status, bewertet mittels MFC, und dem PFS, wahrscheinlich aufgrund der begrenzten Stichprobengröße. Daher führten wir eine umfassende Analyse aller Fälle durch.

Unter den 18 Patienten, die von beiden Methoden als MRD-positiv identifiziert wurden, stimmten die MRD-Ergebnisse mit den klinischen Ansprechbewertungen überein. Neun dieser Patienten zeigten eine progrediente Erkrankung (PD) oder ein Rezidiv, vier erreichten eine stabile Erkrankung (SD), vier erreichten eine partielle Remission (PR) und einer verstarb. Dies legt nahe, dass bei Patienten, die von beiden Methoden als MRD-positiv getestet wurden, nahezu ausnahmslos eine progrediente Erkrankung oder ein Rezidiv beobachtet wird. Diese Daten deuten darauf hin, dass eine MRD-Positivität in beiden NGS- und MFC-Assays überwiegend einer begrenzten Wirksamkeit oder einer ungünstigen Prognose bei diesen Patienten entspricht. Von den 11 Patienten, die mittels NGS als MRD-positiv, jedoch mittels MFC als MRD-negativ getestet wurden, erreichten 36,36 % keine komplette Remission (CR). Diese Befunde unterstreichen die Fähigkeit der NGS, MRD in Frequenzen zwischen 10-2 und 10-6 auch bei begrenzten Restproben nachzuweisen, während die MFC in einigen Fällen versagte. Dies untermauert weiterhin die höhere Sensitivität und Spezifität der NGS im Vergleich zur MFC bei der MRD-Detektion.

Frühere Untersuchungen haben gezeigt, dass der MRD-Status, bewertet mittels MFC, ein starker Prädiktor für das progressionsfreie Überleben und das Gesamtüberleben bei MM-Patienten ist, was die Bedeutung der MRD-Überwachung bei der Steuerung therapeutischer Entscheidungen und der Prognosebeurteilung nach autologer Stammzelltransplantation unterstreicht28. Die hier vorgestellten Ergebnisse unterstreichen weiterhin die Bedeutung von NGS-Assays, wie anhand zweier Fälle (Patienten 11 und 14) veranschaulicht, bei denen die Patienten mittels MFC als MRD-negativ, jedoch mittels NGS als MRD-positiv getestet wurden. Es ist entscheidend zu beachten, dass das Absetzen der Therapie in solchen Fällen ein Rezidivrisiko mit sich bringen kann, was die Notwendigkeit einer sorgfältigen Beurteilung des Therapieansprechens bei diskordanten MRD-Ergebnissen verdeutlicht.

Diese Studie durchbricht die Abhängigkeit bestehender NGS- und MFC-Methoden von frischen Knochenmarkaspiraten oder gefrorenen Zellen und validiert erstmals systematisch, dass verbleibende, bereits gefärbte Knochenmarkausstriche, die nach der routinemäßigen Diagnose übrig sind, als zuverlässiges Ausgangsmaterial für die hochsensible Nachweisung von MRD dienen können. Dies behebt direkt die folgenden klinischen und methodischen Lücken: (1) Es entfällt die Notwendigkeit, große Volumina an Knochenmarkflüssigkeit zur MRD-Überwachung zu entnehmen, insbesondere bei älteren Patienten oder solchen mit erschwerter Probenentnahme; (2) Es ermöglicht die retrospektive Analyse archivierter Ausstriche und nutzt damit vorhandene pathologische Ressourcen, um MRD-basierte prognostische Evidenz in historischen Kohorten zu etablieren; und (3) Mit einer Nachweisempfindlichkeit von 10-5-10-6 ist die Methode der konventionellen MFC (typischerweise 10-4-10-5) deutlich überlegen und umgeht falsch-negative Ergebnisse, die durch Probenqualitätsprobleme bei der MFC verursacht werden, wodurch ein DNA-basiertes, nachvollziehbares MRD-Bewertungsinstrument für die klinische Praxis bereitgestellt wird.

Mehrere kritische Schritte wurden identifiziert, um den Erfolg und die Zuverlässigkeit des Assays sicherzustellen. Ein schonendes Abkratzen verbliebener Aufstriche, gefolgt von sofortiger Pufferanwendung, war entscheidend für eine ausreichende gDNA-Ausbeute. Eine präzise eingesetzte DNA-Menge (100 ng pro Reaktion, innerhalb von ±10 %) war erforderlich, um Allelverluste oder verzerrte Amplifikationen zu vermeiden. Die equimolare Poolung barcodierter Produkte (2 nM) trug zu einer gleichmäßigen Sequenziertiefe bei, und die konsequente Anwendung bioinformatischer Schwellwerte (≥10 % klonale Frequenz bei Diagnosestellung und ≤5 % Mismatches zur Verfolgung) half, falsch-positive MRD-Befunde zu verhindern. Zusätzlich wurden mehrere Modifikationen des Standardprotokolls eingeführt, um häufig auftretende experimentelle Probleme zu beheben. Wenn die endgültige Bibliothekskonzentration unter 5 nM fiel, wurde vorsichtig eine zweite PCR-Runde mit 2–4 zusätzlichen Zyklen hinzugefügt, um eine Überamplifikationsverzerrung zu vermeiden. Bei Proben, bei denen die Klonverfolgung aufgrund übermäßiger Mismatches (>5 %) fehlschlug, wurde die Referenzdatenbank IMGT aktualisiert und die Fehlertoleranz vorübergehend auf 8 % gelockert, um explorative Analysen durchzuführen, obwohl 5 % weiterhin der Standardwert für die klinische Berichterstattung blieb. Falls die Sequenziertiefe unter 50.000 Reads pro Probe sank, wurden erneute Poolung und erneutes Sequenzieren durchgeführt, ohne den PCR-Schritt zu wiederholen.

Insgesamt zeigt diese Validierung unter realen Bedingungen, dass verbliebene Knochenmarkausstrichproben in verschiedenen Behandlungssituationen konsistente und zuverlässige Testergebnisse liefern. In wirtschaftlich benachteiligten Regionen, in denen routinemäßig Knochenmarkbiopsie und MFC anstelle von NGS durchgeführt werden, legen die Ergebnisse nahe, dass NGS für eine weitergehende molekulare Beurteilung in Betracht gezogen werden kann, wenn die anfänglichen Ergebnisse negativ sind. Die Nutzung verbliebener Proben ist in solchen Fällen angemessen, da sie die Notwendigkeit wiederholter Knochenmarkpunktionen entfallen lässt und somit die Belastung für den Patienten verringert.

Während unsere laufende Studie unter Realbedingungen darauf abzielt, die Stichprobengröße für weitere Analysen zu vergrößern, erkennen wir mehrere Limitationen an. Falsch-negative Ergebnisse können insbesondere dann auftreten, wenn der extrahierte DNA-Gehalt unzureichend ist, wie beim zweiten MRD-Nachweis beim Patienten 10 beobachtet. Zudem wird der Anteil der durch NGS detektierten Klone durch die Zellquantifizierung beeinflusst, was zu einer Überschätzung der MRD-Zellanteile führen kann. Die Validierung konzentrierte sich primär auf Knochenmarkproben. Die langfristige Bedeutung von NGS-MRD liegt jedoch in mehrfachen Nachuntersuchungen nach der Behandlung, bei denen peripheres Blut möglicherweise besser geeignet ist. Eine Validierung von Proben aus peripherem Blut wurde bisher nicht durchgeführt. Aufgrund der begrenzten Anzahl klinischer Validierungsproben, der zufälligen Rekrutierung von Patienten und der unterschiedlichen Behandlungsansätze in dieser Realweltstudie erwies sich die Sammlung konsekutiver MRD-Proben als schwierig. Folglich konzentrierten wir uns darauf, die Bedeutung früher MRD-Antworten im Hinblick auf ein späteres Fortschreiten der Erkrankung zu bewerten, konnten jedoch den Einfluss eines persistierenden MRD-Status auf langfristige Outcome-Parameter nicht nachweisen. Außerdem wurde NGF nicht in die vergleichende Analyse einbezogen. Obwohl NGS und konventionelle MFC systematisch verglichen wurden, hätte NGF – als eine der beiden vom IMWG empfohlenen MRD-Methoden (die andere ist NGS) – zusätzliche Erkenntnisse zur Leistungsfähigkeit des Assays liefern können. Darüber hinaus ist die Stichprobengröße relativ klein (n = 40), und das Kollektiv ist heterogen und umfasst verschiedene hämatologische Malignitäten. Zukünftige multizentrische, groß angelegte Studien, die NGF einbeziehen und sich auf eine einzelne Malignität wie das multiple Myelom konzentrieren, sind erforderlich, um unsere Schlussfolgerungen zu bestätigen und zu erweitern.

Nachdem wir die Leistung des NGS-basierten BCR/TCR-Klonalitätsassays umfassend charakterisiert und validiert hatten, konnten wir zeigen, dass er ein vielversprechendes Verfahren zur hochsensitiven, genauen und praktischen Quantifizierung und Überwachung der MRD in verbliebenen Knochenmarkausstrichproben von MM-Patienten darstellt.

Offenlegungen

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Die Autoren erklären, dass sie keinem Interessenkonflikt unterliegen.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Forschung wurde durch eine Förderung der Natural Science Foundation des Wissenschafts- und Technologiedepartments der Provinz Jiangxi (Nr. 20232BAB206059), des Wissenschafts- und Technologieforschungsprojekts des Bildungsministeriums der Provinz Jiangxi (Nr. GJJ211518), des Wissenschafts- und Technologieplanprojekts der Gesundheitskommission der Provinz Jiangxi (Nr. 202310782) und des leitenden Wissenschafts- und Technologieplanprojekts des Amtes für Wissenschaft und Technologie von Ganzhou in der Provinz Jiangxi (Nr. GZ2020ZSF027) unterstützt. Wissenschafts- und Technologieplanprojekt der Verwaltung für Traditionelle Chinesische Medizin der Provinz Jiangxi (Nr. 2024B0710)

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Anti-CD56AbcamAB75813Verdünnung gemäß Herstelleranweisungen
Anti-CD9AbcamAB2215Verdünnung gemäß Herstelleranweisungen
Anti-HLA-DRAbcamAB20181Verdünnung gemäß Herstelleranweisungen
GraphPad PrismGraphPadhttps://www.graphpad.com/
Illumina NovaSeq 6000IlluminaNovaSeq 6000https://www.illumina.com/systems/sequencing-platforms/novaseq.html
ImMunoGeneTics (IMGT)-DatenbankImMunoGeneTics (IMGT)-Datenbankhttp://www.imgt.org/
Lymphoide MalignitätszelllinienATCChttps://www.atcc.org/B-ALL-Linien REH und NALM6, T-ALL-Linie Jurkat und Lymphomlinie H9 (DSMZ)
Multiparametrische DurchflusszytometrieBECKMAN COULTERCytoFLEX
OriMIRACLE LTM-Assay Origimed Co., Ltd., Shanghai, China
R-SpracheR Foundation for Statistical ComputingVersion 3.6.1

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. van de Donk N, Pawlyn C, Yong KL. Multiple myeloma. Lancet. 2021;397(10272):410-27.
  2. Xia C, et al. Cancer statistics in China and United States, 2022: Profiles, trends, and determinants. Chin Med J. 2022;135(5):584-90.
  3. Ricciuti G, Falcone A, Cascavilla N, Martinelli G, Cerchione C. Autologous stem cell transplantation in multiple myeloma. Panminerva Med. 2020;62(4):220-4.
  4. Feng D, Sun J. Overview of anti-BCMA CAR-T immunotherapy for multiple myeloma and relapsed/refractory multiple myeloma. Scand J Immunol. 2020;92(2):e12910.
  5. Ontario Health. Minimal residual disease evaluation in childhood acute lymphoblastic leukemia: A clinical evidence review. Ont Health Technol Assess Ser. 2016;16(7):1-52.
  6. Yanamandra U, Kumar SK. Minimal residual disease analysis in myeloma: When, why and where. Leuk Lymphoma. 2018;59(8):1772-84.
  7. Bassan R, Brüggemann M, Radcliffe HS, Hartfield E, Kreuzbauer G, et al. A systematic literature review and meta-analysis of minimal residual disease as a prognostic indicator in adult B-cell acute lymphoblastic leukemia. Haematologica. 2019;104(10):2028-39.
  8. Kumar S, et al. International Myeloma Working Group consensus criteria for response and minimal residual disease assessment in multiple myeloma. Lancet Oncol. 2016;17(8):e328-e346.
  9. Dogliotti I, Drandi D, Genuardi E, Ferrero S. New molecular technologies for minimal residual disease evaluation in B-cell lymphoid malignancies. J Clin Med. 2018;7(9).
  10. Drandi D, et al. Highly sensitive MYD88(L265P) mutation detection by droplet digital polymerase chain reaction in Waldenström macroglobulinemia. Haematologica. 2018;103(6):1029-37.
  11. Camus V, et al. Digital PCR for quantification of recurrent and potentially actionable somatic mutations in circulating free DNA from patients with diffuse large B-cell lymphoma. Leuk Lymphoma. 2016;57(9):2171-9.
  12. Riva G, et al. Multiparametric flow cytometry for MRD monitoring in hematologic malignancies: Clinical applications and new challenges. Cancers. 2021;13(18).
  13. Anderson KC, et al. Minimal residual disease in myeloma: Application for clinical care and new drug registration. Clin Cancer Res. 2021;27(19):5195-212.
  14. ClonoSEQ cleared for residual cancer testing. Cancer Discov. 2018;8(12):OF6.
  15. Walzer S, Krenberger S, Vollmer L, Hewitt T, Eckert B. A cost impact analysis of clonoSEQ® as a valid and CE-certified minimal residual disease (MRD) diagnostic compared to no MRD testing in multiple myeloma in Germany. Oncol Ther. 2021;9(2):607-19.
  16. Ching T, et al. Analytical evaluation of the clonoSEQ assay for establishing measurable (minimal) residual disease in acute lymphoblastic leukemia, chronic lymphocytic leukemia, and multiple myeloma. BMC Cancer. 2020;20(1):612.
  17. Chinese Society of Hematology. The guidelines for the diagnosis and management of multiple myeloma in China (2020 revision). Zhonghua Nei Ke Za Zhi. 2020;59(5):341-6.
  18. Chng WJ, et al. IMWG consensus on risk stratification in multiple myeloma. Leukemia. 2014;28(2):269-77.
  19. Hagen P, Zhang J, Barton K. High-risk disease in newly diagnosed multiple myeloma: Beyond the R-ISS and IMWG definitions. Blood Cancer J. 2022;12(5):83.
  20. Rawstron AC, et al. Minimal residual disease assessed by multiparameter flow cytometry in multiple myeloma: Impact on outcome in the Medical Research Council Myeloma IX Study. J Clin Oncol. 2013;31(20):2540-7.
  21. Munshi NC, et al. A large meta-analysis establishes the role of MRD negativity in long-term survival outcomes in patients with multiple myeloma. Blood Adv. 2020;4(23):5988-99.
  22. Brüggemann M, et al. Standardized next-generation sequencing of immunoglobulin and T-cell receptor gene recombinations for MRD marker identification in acute lymphoblastic leukaemia: A EuroClonality-NGS validation study. Leukemia. 2019;33(9):2241-53.
  23. Medina A, et al. Comparison of next-generation sequencing (NGS) and next-generation flow (NGF) for minimal residual disease (MRD) assessment in multiple myeloma. Blood Cancer J. 2020;10(10):108.
  24. Kruse A, Abdel-Azim N, Kim HN, Ruan Y, Phan V, et al. Minimal residual disease detection in acute lymphoblastic leukemia. Int J Mol Sci. 2020;21(3).
  25. Kriegsmann K, et al. Comparison of NGS and MFC methods: Key metrics in multiple myeloma MRD assessment. Cancers. 2020;12(8).
  26. Takamatsu H. Comparison of minimal residual disease detection by multiparameter flow cytometry, ASO-qPCR, droplet digital PCR, and deep sequencing in patients with multiple myeloma who underwent autologous stem cell transplantation. J Clin Med. 2017;6(10).
  27. Perrot A, et al. Minimal residual disease negativity using deep sequencing is a major prognostic factor in multiple myeloma. Blood. 2018;132(23):2456-64.
  28. de Tute RM, et al. Minimal residual disease after autologous stem-cell transplant for patients with myeloma: Prognostic significance and the impact of lenalidomide maintenance and molecular risk. J Clin Oncol. 2022;40(25):2889-900.

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