Transkriptomsequenzierung identifizierte Hub pathogene Chemokine in atherosklerotischen Plaques

Zusammenfassung

Diese Studie zielt darauf ab, die zugrunde liegenden Mechanismen der entzündlichen Faktoren, die mit atherosklerotischen Plaques (AP) verbunden sind, mittels RNA-Sequenzierung zu analysieren. Die Ergebnisse identifizierten CCL3, CCL4 und CXCL1 als wichtige entzündliche Hub-Gene in AP. Diese Chemokine können die Atherosklerose antreiben, indem sie die Ansammlung von M0-Makrophagen fördern und gleichzeitig schützende Immunzellen unterdrücken und so potenzielle therapeutische Ziele offenbaren.

Zusammenfassung

Atherosklerotischer Plaque (AP) ist eine Art entzündliche, faserige Gewebeproliferationserkrankung nach der Schädigung von Endothelzellen und glatten Muskelzellen in der Arterienwand, was zu unterschiedlichen Graden von Herz-Kreislauf- und zerebrovaskulärer Blutverstopfung führen kann. Allerdings sind wirksame therapeutische Ansätze zur Bekämpfung von Entzündungen bisher weitgehend ausgefallen, was darauf hindeutet, dass weitere Erkenntnisse weiterhin benötigt werden. Diese Studie zielte darauf ab, entzündliche, faktorbezogene transkriptomische Veränderungen in AP mittels RNA-Sequenzierung (RNA-seq) zu analysieren. RNA-Seq wurde an Proben von AP-Patienten (n = 11) und Kontrollpersonen (n = 3) durchgeführt. Differentiell exprimierte Gene (DEGs) wurden mit Metascape identifiziert, gefolgt von der KEGG-Signalweganreicherungsanalyse mit dem clusterProfiler-Paket in R-Software, einer Immuninfiltrationsanalyse mit CIBERSORT und dem Protein-Protein-Interaktionsnetzwerk (PPI) mit der STRING-Datenbank. Hub-Gene im PPI-Netzwerk wurden mit dem CytoHubba-Plugin identifiziert. Insgesamt wurden 3713 DEGs in der AP-Gruppe identifiziert, darunter 2097 hochregulierte und 1616 herunterregulierte Gene. Die Ergebnisse zeigten, dass DEGs hauptsächlich durch immun- und entzündungsbezogene Signalwege angereichert sind. Drei entzündungsbezogene Faktoren – CCL3, CCL4 und CXCL1 – wurden als wichtige Hub-Gene im pathologischen Prozess der AP betrachtet. Die Immuninfiltrationsanalyse zeigte eine ausgeprägte Mikroumgebung in AP, gekennzeichnet durch einen signifikanten Anstieg der M0-Makrophagen sowie Reduktionen der CD8⁺-T-Zellen, aktivierter NK-Zellen und ruhender Mastzellen innerhalb der AP. Abschließend beschreiben diese prozeduralen Ergebnisse die unterschiedliche Expression von CCL3, CCL4 und CXCL1 sowie deren Zusammenhang mit einer veränderten Immunzellzusammensetzung in AP und heben die drei Chemokine als potenzielle Kandidaten für weitere mechanistische Untersuchungen hervor.

Einleitung

Herz-Kreislauf-Erkrankungen (CVD) stellen weltweit eine ernsthafte Bedrohung für die menschliche Gesundheit^{dar 1}. Da sich der weltweite Alterungstrend der Bevölkerung verschärft, steigt auch die Inzidenz von Herz-Kreislauf-Erkrankungen^an. Darunter ist die atherosklerotische Plaque (AP) eine der Hauptursachen für CVD³. AP ist eine chronisch entzündliche Erkrankung, die durch die allmähliche Ansammlung von Lipiden in der Intima der Arterien und die Bildung von Plaques^{gekennzeichnet} ist. AP ist die häufige Grundlage für kardiovaskuläre und zerebrovaskuläre Ereignisse und betrifft hauptsächlich große und mittelgroße Arterien, die zu Ischämie und Verletzungen führen, und ist ein Hauptfaktor für Herz-Kreislauf- und zerebrovaskuläre Erkrankungen sowie Todesfälle⁵. Aufgrund des Fehlens offensichtlicher Symptome in den frühen Stadien ist AP meist schon bei der Diagnose fortgeschritten, was zu einer hohen Sterblichkeitsrate^{von 6} führt. Die Behandlung von AP konzentriert sich auf ihre Risikofaktoren, darunter veränderbare Faktoren wie geringe körperliche Aktivität, sitzendes Verhalten, Rauchen, psychische Probleme⁷ sowie Fettleibigkeit und Typ-2-Diabetes aufgrund einer fettreichen Ernährung sowie nicht veränderbare Faktoren wie Gene, Alter und Geschlecht⁸. Neuere Studien haben gezeigt, dass metabolisches Syndrom, Homocysteinämie, Hyperurikämie und Pankreasresistenz wichtige Risikofaktoren für das Auftreten und die Entwicklung von Arteriosklerose^sind.

Theorien zur Pathogenese von AP umfassen hauptsächlich Theorien zur Lipidinfiltration, Entzündung, oxidativer Stressreaktion, Infektion und der Wechselwirkung zwischen genetischen und Umweltfaktoren^11,12. Darunter werden Entzündungen und oxidativer Stress als die Kernpathogenese von AP anerkannt und sind an allen Prozessen vom Auftreten über die Entwicklung und Verschlechterung von AP¹³ beteiligt. Plötzliche Schäden an AP, instabiler Plaque, Thrombozytenaktivierung und Thrombose sind eine wichtige Pathogenese für Myokardinfarkt und hämorrhagischen Schlaganfall¹⁴. Durch kontinuierliche Forschung wurde festgestellt, dass AP nicht nur Lipide, sondern auch viele entzündliche Zellen^enthält. Rauchen, Bluthochdruck, Lipidstörungen, Hyperinsulinämie, Hyperglykämie, hoher Harnsäurespiegel und andere schädliche Reize veranlassen weiße Blutkörperchen und Endothelzellen, dass lösliche Adhäsionsmoleküle und verschiedene Zytokine kontinuierlich freigesetzt werden und die Monozyten an vaskuläre Endothelzellen anbringen. Die angesammelten Chemokine führen weiter zur Migration der Monozyten in den subendothelialen Raum und deren Differenzierung zu Makrophagen, die dann das cholesterinreiche, oxidierte Lipoprotein mit niedriger Dichte (LDL) im Gewebe phagozytisieren, wodurch sie sich in Schaumzellen umwandeln und die Bildung von Lipidstreifen¹⁶ einleiten. Die frühe pathologische Schädigung von AS, nämlich Lipidstreifen, besteht hauptsächlich aus Makrophagen und T-Lymphozyten, was eine typische entzündliche^{Läsion 17} ist. Daher sind verschiedene entzündliche Zellen und ihre Produkte an der Entstehung und dem Fortschreiten von AP¹⁸ beteiligt. Die entzündliche Landschaft der AP ist jedoch komplex und umfasst mehrere bekannte und potenziell unbekannte Faktoren. Traditionelle Kandidatengen-Ansätze könnten dieses gesamte Spektrum an entzündlichen Treibern nicht erfassen.

Um diese Einschränkung zu beheben, verwendeten wir RNA-Sequenzierung (RNA-seq), eine unvoreingenommene Hochdurchsatz-Transkriptommethode. Dieser Ansatz ist besonders geeignet für hypothesenbildende Studien, bei denen die wichtigsten molekularen Treiber nicht vordefiniert sind. Im Gegensatz zu Kandidatengen- oder mikroarraybasierten Methoden bietet RNA-Seq einen größeren Dynamikbereich, eine höhere Sensitivität und die Möglichkeit, neuartige Transkripte ohne vorheriges Probedesign^{zu erkennen.} Diese Merkmale machen es besonders geeignet zur Entdeckung entzündungsbezogener Signaturen in AP, wo die molekulare Basis noch unvollständig charakterisiert ist.

In dieser Studie wurde RNA-seq durchgeführt, um die zugrunde liegenden Mechanismen der mit AP assoziierten Entzündungsfaktoren zu analysieren. Bioinformatische Werkzeuge mit verschiedenen Algorithmen wurden verwendet, um auf eine Reihe von DEGs zu screenen. Anschließend wurden Anreicherungsanalysen (WGCNA, KEGG-Signalweg, mcode, GSEA, Hub-Gen-Analyse) und Protein-Protein-Interaktions-(PPI)-Netzwerkanalyse durchgeführt. Die Ergebnisse dieser Studie tragen zu einem besseren Verständnis des molekularen pathologischen Mechanismus bei, der der entzündungsbedingten AP zugrunde liegt, und spielen eine wichtige Rolle bei der Suche nach neuartigen Biomarkern.

Protokoll

Diese Studie wurde vom Ethikausschuss des Volkskrankenhauses Liaocheng genehmigt (Genehmigungsnummer: 2023014) und hielt sich an die Grundsätze der Helsinkier Erklärung. Von allen Teilnehmern wurde eine informierte Zustimmung eingeholt. Formulare zur informierten Einwilligung wurden von allen Patienten oder deren Familien unterschrieben.

Patienten und Proben

Diese Studie analysierte retrospektiv 11 Patienten mit schwerer Karotisarterienstenose, die sich von Januar 2023 bis Dezember 2023 einer Karotisendarteriektomie in der Abteilung für Gefäßneurochirurgie des Liaocheng Volkskrankenhauses, Provinz Shandong, China, unterzogen hatten. Diese Patienten wurden als AP-Gruppe aufgenommen. Die Diagnose der Halsschlagaderstenose basierte auf bildgebenden Daten wie CTA oder zerebraler Angiographie. Die Einschlusskriterien für die AP-Gruppe waren: (1) Alter zwischen 50 und 80 Jahren; (2) Computertomographie, Angiographie/digitale Subtraktionsangiographie, bestätigte intrakranielle interne Karotisarteriestenose ≥70 %; (3) vor Beginn modifizierter Rankin-Skala-Wert ≤ 1; (4) informierte Einwilligung vom Patienten oder dessen Rechtsvertreter. Die Ausschlusskriterien waren: (1) entzündliche oder Immunerkrankungen; (2) Vorliegen psychiatrischer Störungen; (3) das Vorhandensein bösartiger Tumore; (4) Schwangerschaft, Stillzeit oder Gebärpotenzial. Altersübereinstimmung Patienten mit schwerer traumatischer Hirnverletzung, die im selben Zeitraum im selben Krankenhaus eine Organspende unterzogen hatten, wurden als Kontrollgruppe ausgewählt (NA; Normale Kontrolle, n = 3). Die Probanden in beiden Gruppen wurden hinsichtlich Alter, Geschlecht und Body-Mass-Index abgeglichen, um Störfaktoren auszuschließen. Die Einschlusskriterien für die Kontrollgruppe waren: (1) Alter zwischen 50 und 80 Jahren; (2) keine Vorgeschichte von koronarer Herzkrankheit, Halsschlagaderstenose oder anderen systemischen Gefäßerkrankungen; (3) eine informierte Einwilligung vom Rechtsvertreter des Patienten. Proben der Carotisarterie intima und Plaque wurden während der Karotisendarteriektomie aus der AP-Gruppe entnommen, während Aorten-Intima-Proben aus der Kontrollgruppe nach der Organspende entnommen wurden. Das Gefäß- und Plaquegewebe wurden für spätere Tests in flüssigen Stickstofftanks aufbewahrt. Die Ausgangsmerkmale von AP-Patienten sind in Tabelle 1 dargestellt.

Probenvorbereitung

Die vollständige RNA-Extraktion wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers mit TRIzol-Reagenz extrahiert. RNA-Konzentration und -Reinheit wurden mit einem Nanodrop-ND-2000-Spektrophotometer bei 260 nm und 280 nm (A260/A280-Verhältnis zwischen 1,8 und 2,0) bewertet. Die RNA-Integrität wurde mit 2 % Agarosegel-Elektrophorese bei 100 V für 30 Minuten bewertet. RNA-Integritätswerte (RINs) wurden mit dem Agilent 2100-Bioanalysator ermittelt (Proben mit RIN ≥ 7,0 wurden für die Downstream-Analyse verwendet). Alle Probenhandhabung und RNA-Extraktionsverfahren wurden bei Raumtemperatur durchgeführt, sofern nicht anders angegeben. Das Abfall-TRIzol-Reagenz wurde gemäß den institutionellen Richtlinien für gefährliche chemische Abfälle entsorgt.

RNA-Sequenzierung

Nach der Behandlung der Gesamt-RNA wurde mit DNase-I mRNA mittels Oligo D(T)-Magnetperlen angereichert und anschließend für 5 Minuten in kurze Stücke bei 94 °C fragmentiert. Die resultierenden mRNA-Fragmente dienten als Vorlage, mit zufälligem Oligonukleotid als Primer. Erststrang-cDNA wurde über das M-MuLV-Reverse-Transkriptasesystem bei 42 °C für 50 Minuten synthetisiert, gefolgt von RNase-H-vermittelter Abbau von RNA-Strängen. Die Synthese des zweiten Strangs erfolgte unter Verwendung von dNTPs im DNA-Polymerase-I-System. Die doppelsträngige cDNA wurde gereinigt, die Enden repariert und mit einem "A"-Überhang versehen, um die Adapterligatur zu erleichtern. AMPure XP-Perlen wurden verwendet, um cDNA-Fragmente von 250–300 bp auszuwählen, die anschließend mittels PCR amplifiziert wurden. Danach wurden die verstärkten Produkte gereinigt, um die endgültige Bibliothek zu erzeugen. Die Bibliothekssequenzierung erfolgte auf der Illumina HiSeq-Plattform mit einer gepaarten Leselänge von 150 bp. Für die Datenqualitätskontrolle (QC) wurden Rohdaten mit Adaptorsequenzen oder minderwertigen Basen mittels interner Skripte herausgefiltert. Aufgrund von Sequenzierungsfehlern, die durch das Instrument auftreten können, wurde die Datenqualität durch Analyse der Verteilung der Sequenzierungsfehlerraten bewertet (Fehlerquote < 1 % wurde als akzeptabel angesehen). Zusätzlich wurde die Verteilung der GC-Inhalte festgelegt. Alle Sequenzierungsverfahren wurden bei Umgebungstemperatur durchgeführt, sofern nicht anders angegeben. Reagenzien, die gefährliche Chemikalien enthalten (z. B. DNase-I-Puffer), wurden gemäß institutionellen Biosicherheitsrichtlinien entsorgt.

QC-Schwellenwerte und Fehlerbehebung

Es wurden nur Samples mit RIN ≥ 7.0 und Bibliotheken mit einer Fragmentgröße von 250–300 bp verwendet. Mindestens 14 Millionen Rohlesungen pro Probe mit Q30 ≥ 98 % waren erforderlich. Die niedrige Bibliotheksrendite wurde durch die Erhöhung der PCR-Zyklen auf 18 behoben, aber 15 Zyklen wurden bevorzugt, um die Duplikaterraten unter 15 % zu halten.

Screening von DEGs

Wir bewerteten die Verteilung der Genexpressionsniveaus über verschiedene Proben. Die interprobenbedingte Korrelation der Genexpressionsniveaus wurde verwendet, um die experimentelle Zuverlässigkeit und die Angemessenheit der Probenauswahl zu überprüfen. Die Hauptkomponentenanalyse (PCA) wurde angewandt, um Unterschiede zwischen den Gruppen und die intra-gruppenmäßige Reproduzierbarkeit zu bewerten. DEGs wurden mithilfe der Metascape-Online-Datenbank (http://metascape.org/gp/index.html#/main/step1) identifiziert. DEGs wurden definiert als solche mit |log₂(fold change) | > 1 und ein p.-Wert < 0,05, die als statistisch signifikant angesehen wurden. Alle bioinformatischen Analysen wurden mit Standardparametern durchgeführt, sofern nicht anders angegeben. Als Zwischenkontrollpunkt für die Reproduzierbarkeit wurden PCA-Diagramme erstellt, um zu bestätigen, dass sich die Proben nach Gruppen und nicht nach Chargen gruppierten.

Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) Anreicherungsanalyse

Die KEGG-(http://www.genome.jp/)-Analyse ist ein systematischer Ansatz zur Bewertung der Genfunktion zur Entdeckung biologischer regulatorischer Wege. Dieses Paper erhielt erstmals die offizielle Symbolkonvertierungsgen-ID des Differentialgens aus org.Hs.eg (Version 3.12.0). Die KEGG-Pfadanalyse wurde mit dem clusterProfiler-Paket in der R-Software (Version 4.2.0) durchgeführt. Ein p. < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen. Ein Zwischenergebnis war die Erstellung einer gerankten Liste bereicherter Signalwege mit entsprechenden Genzählungen und angepassten p-Werten.

PPI-Netzwerkanalyse

Um das PPI-Netzwerk und das Screen-Key-Gen zu konstruieren, wurde die STRING-Datenbank (Version 11.0, https://string-db.org/) verwendet. Nur Interaktionen mit einem zusammengesetzten Wert von über 0,9 wurden als statistisch signifikant beibehalten. Das Netzwerk wurde mit Cytoscape (Version 3.10.1), einem Open-Source-Bioinformatik-Tool, visualisiert und analysiert, das zur Erforschung molekularer Interaktionsnetzwerke entwickelt wurde. Hub-Gene im PPI-Netzwerk wurden mit dem CytoHubba-Plugin (Version 0.1) identifiziert.

Hub-Gen

Die Top 20 Schlüsselgene wurden von CytoHubba Plugin ausgewählt. Rot zeigt hohe Genwerte an. Die bioinformatische Analyse der Hub-Gene durch die Metascape Online-Datenbank (Version 3.5, http://metascape.org/gp/index) zur Analyse von 20 Hub-Genen vorher. Genanreicherung wurde in folgenden Ontologieklassen identifiziert: WGCNA, PCA, mcode, GSEA. Alle Gene im Genom dienen als Anreicherungshintergrund. Objekte mit p. < 0,05, Mindestanzahl 3 und Anreicherungsfaktor > 1,5 wurden gescreent.

Statistische Analysemethode

Die Statistiksoftware SPSS 25.0 wurde zur Analyse der Daten verwendet. Die Zähldaten wurden als Häufigkeit oder Prozentsatz angegeben, und der Vergleich zwischen den Gruppen wurde mit dem Chi-Quadrat-Test getestet. Die Messdaten stimmten mit dem Mittelwert ± Standardabweichung der Normalverteilung überein, und der T-Test wurde zum Vergleich zwischen den Gruppen verwendet. S. < 0,05 wurde als bedeutender Unterschied angesehen.

Ergebnisse

RNA-seq-Datenanalyse von Differentialgenen in atherosklerotischen Plaques

Für die Bibliotheksvorbereitung wurden nur Proben mit RIN ≥ 7.0 verwendet. Alle 14 Proben (11 AP, 3 Kontroll) überschritten diesen Schwellenwert. Alle Proben wurden in einer einzigen Charge sequenziert; daher war keine Anpassung des Batch-Effekts notwendig. Im Durchschnitt wurden 16,8 Millionen Rohlesungen pro Probe erzeugt; Nach Qualitätsfilterung wurden 16,5 Millionen saubere Reads (98 %) gespeichert, wobei 91 % eindeutig auf das menschliche Referenzgenom (HG38) abgebildet waren. Die Analyse von DEG zeigte, dass es bei Patienten mit Atherosklerose-Plaques im Vergleich zu gesunden Kontrollgruppen 2097 hochregulierte und 1616 herunterregulierte Gene (|log2FC| >1, P <0,05) gab (Abbildung 1A). Die Heatmap der 20 höchst hochregulierten und herunterregulierten differenziell exprimierten Gene wurde in Abbildung 1B dargestellt. Die Transkriptom-RNAseq-Sequenzierung zeigte Probenkorrelationen (Abbildung 1C). Die Korrelation zwischen koexprimierten Genmodulen und Phänotypen wurde von WGCNA analysiert (Abbildung 1D). Die PCA-Analyse zeigte, dass es einen signifikanten Unterschied zwischen der NA-Gruppe und der AP-Gruppe gab (P .< 0,05) (Abbildung 1E).

KEGG-Anreicherungsanalyse von Differentialgenen

Die KEGG-Signalweganreicherungsanalyse mit dem clusterProfiler-Paket in R-Software (Version 4.2.0) wurde separat an den hochregulierten und herunterregulierten differenziell exprimierten Genen der Krankheitsgruppe durchgeführt (Abbildung 2A,B). Die Ergebnisse zeigten, dass diese Gene signifikant in mit Immunität und Entzündung verbundenen Signalwegen wie hämatopoetischer Zelllinie, rheumatoider Arthritis, fokaler Adhäsion, Integrin-Signalübertragung und Chemokin-Signalweg angereichert waren.

GSEA-Analyse

Die GSEA-Analyse zeigte, dass die Kerngene in der experimentellen Gruppe hauptsächlich an der Spitze angereichert waren, was einen Aufwärtsregulierungstrend zeigt (Abbildung 3A). Die Kerngene der Kontrollgruppe waren hauptsächlich am unteren Ende angereichert, was einen Abwärtstrend zeigt (Abbildung 3B). Zusammenfassend wurden entzündliche Gene in der experimentellen Gruppe (ASA) hochreguliert und in der Kontrollgruppe (NA) herunterreguliert.

Analyse von PPI-Netzwerken

Im mit der STRING-Datenbank analysierten PPI-Netzwerk (Version 11.0) befinden sich Knoten mit derselben Cluster-ID meist nahe beieinander. Wie in Abbildung 4A gezeigt, zeigte diese Clusterung, dass die entsprechenden Gene hauptsächlich an der Regulation der Zellaktivierung, der Entzündungsreaktion und der Zellaktivierung beteiligt sind. Abbildung 4B zeigte dasselbe Netzwerk, das durch p-Werte gefärbt ist, wobei Cluster mit mehr Genen signifikantere p-Werte aufweisen.

Identifikation von Hub-Genen und Analyse der Immunzellinfiltration

DEGs wurden für die mcode-Analyse ausgewählt und die Analyseergebnisse wurden hauptsächlich mit Acetylcholinrezeptoren in Zusammenhang gebracht (Abbildung 5 und Tabelle 2). Die Hub-Genanalyse mit dem CytoHubba-Plugin in Cytoscape identifizierte die 20 wichtigsten Hub-Gene, von denen die meisten mit Immunität und Entzündung assoziiert waren (Abbildung 6A, linkes Panel). Die Top 10 Hub-Gene bestanden aus CXCR4, CCL4, CCL3, CCL20, CXCL1, CCL5, CXCL8, CD4, CCR2 und CCR5 (Abbildung 6A, rechtes Panel). Die Schnittstelle der Hub-Gene mit dem Olink-Inflammatoirpanel 92-Gene zeigte 5 gemeinsame Gene, darunter CXCL1, CCL20, TNF, CCL3 und CCL4 (Abbildung 6B). Die CIBERSORT-Analyse zeigte signifikante Unterschiede in der Infiltration von Immunzellen zwischen der Krankheitsgruppe und gesunden Kontrollpersonen. Im Vergleich zur Kontrollgruppe zeigte die Krankheitsgruppe einen signifikant höheren Anteil an M0-Makrophagen (p < 0,05) (Abbildung 6C). Umgekehrt waren die Anteile der CD8-T-Zellen, aktivierten NK-Zellen und der meisten Ruhezellen in der Krankheitsgruppe signifikant niedriger (S. < 0,05 für alle) (Abbildung 6C).

Funktionalanalyse von Hub-Genen

Wir haben die biologische Funktion des Hub-Gens mit einer Metascape-Datenbank weiter analysiert und gezeigt, dass diese Gene hauptsächlich mit zytokinvermittelten Signalwegen und calciumvermittelten Signalwegen assoziiert sind (Abbildung 7A und Tabelle 3). Zelltyp-Signaturen wurden anschließend verwendet, um die transkriptionellen regulatorischen Faktoren des Hub-Gens zu bereichern, was zeigte, dass Hub-Gene hauptsächlich mit der gao-Dickdarm-24W C11-Panath-ähnlichen Zelle, der sich entwickelnden C8-Makrophagen im Herzen und den Manno-Mittelhirn-Neurotypen HMGL verwandt sind (Abbildung 7B). Die Analyse der DisGeNET-Datenbank zur Krankheitsanreicherung zeigte, dass die Hub-Gene mit Hautläsionen, Epstein-Barr-Virusinfektionen und Zeckenbome-Enzephalitis assoziiert sind (Abbildung 7C). Die Analyse der PaGenBase-Datenbank zur Gewebeanreicherung zeigte, dass Hub-Gene hauptsächlich in der Milz, im Blut und in der Lunge angereichert waren (Abbildung 7D). Darüber hinaus ergab die Analyse der TRRUST-Datenbank, dass RELA und NFKB1 die Haupttranskriptionsfaktoren sind, die die Hub-Gene regulieren (Abbildung 7E).

DATENVERFÜGBARKEIT:

Die verarbeitete Zählmatrix wird als ergänzende Dateien bereitgestellt (Supplementary File 1 und Supplementary File 2). Alle weiteren Daten werden im Artikel vollständig dargestellt. Rohsequenzierungsdaten sind auf angemessene Anfrage vom korrespondierenden Autor verfügbar.

Abbildung 1: Analyse der DEGs. (A) Gesunde Plaques und atherosklerotische Plaques, Vulkankarte des Differentialgegens, hochreguliert 2097, herunterreguliert 1616 (|log2FC| > 1, P .< 0,05). (B) Heatmap der 20 wichtigsten differenziell exprimierten und hochregulierten Gene. (C) Stichprobenkorrelationsanalyse. (D)Die Korrelation zwischen koexprimierten Genmodulen und Phänotypen wurde von WGCNA analysiert. (E) PCA-Analyse (NA-Gruppe unterschied sich signifikant von der AP-Gruppe). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 2: KEGG-Analyse. Die KEGG-Anreicherungsanalyse des Signalwegs wurde separat an den hochregulierten (A) und herunterregulierten (B) differentiell exprimierten Genen der Krankheitsgruppe durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 3: GSEA-Analyse. (A) Die GSEA-Analyse zeigte, dass die Kerngene in der experimentellen Gruppe hauptsächlich an der Spitze angereichert waren, was einen Aufwärtsregulierungstrend zeigt. (B) In der Kontrollgruppe waren die Kerngene hauptsächlich am unteren Ende angereichert und zeigten einen Abwärtstrend. Zusammenfassend wurden entzündliche Gene in der experimentellen Gruppe (AP) hochreguliert und in der Kontrollgruppe (NA) herunterreguliert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 4: PPI-Netzwerkdiagramm. (A) Koloriert nach Cluster-ID, wobei Knoten, die dieselbe Cluster-ID teilen, in der Regel nahe beieinander liegen. (B) Färbung mit P-Werten, wobei Objekte mit mehr Genen signifikantere P-Werte haben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 5: mcode-Analyse von DEGs. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 6: Nabengen-Analyse. (A) Top 20 Hub-Gene (linkes Panel) und Top 10 Hub-Gen (rechtes Panel), die durch die Gradberechnungsmethode über das CytoHubba-Plugin in Cytoscape erhalten werden und hauptsächlich mit Immunität und Entzündung assoziiert sind. (B) Intersektion von Hub-Genen und Olink-Entzündungspanel: 92 Gene identifizierten 5 Schnitt-Gene. (C) Der CIBERSORT-Algorithmus wurde verwendet, um die Infiltrationshäufigkeit von 22 Immunzell-Subsets zwischen AP- und NA-Gruppen zu vergleichen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 7: Bioinformatische Analyse von Hub-Genen. (A) Funktionale Annotation von Hub-Genen unter Verwendung der Metascape-Datenbank. (B) Anreicherungsanalyse von transkriptionellen Regulatoren, die mit Hub-Genen assoziiert sind, basierend auf Zelltypsignaturen. (C) Krankheitsanreicherungsanalyse von Hub-Genen, durchgeführt mit der DisGeNET-Datenbank. (D) Gewebespezifische Expressionsmuster von Hub-Genen, identifiziert über die PaGenBase-Datenbank. (E) Transkriptionsregulatorisches Netzwerk von Hub-Genen, analysiert mit der TRRUST-Datenbank. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

MCODE	LOS	Beschreibung	Logbuch10(P)
MCODE_1	R-HSA-629597	Hochdurchlässige, calciumdurchlässige, nikotinische Acetylcholinrezeptoren	-10.7
MCODE_1	R-HSA-622323	Präsynaptische nikotinische Acetylcholinrezeptoren	-10.3
MCODE_1	R-HSA-629594	Hochdurchlässige postsynaptische nikotinische Acetylcholinrezeptoren	-10.3
MCODE_2	R-HSA-1296346	Tandem-Porendomänen-Kaliumkanäle	-10.3
MCODE_2	LOS: 0030322	Stabilisierung des Membranpotenzials	-9.8
MCODE_2	R-HSA-5576886	Phase 4 – Ruhemembranpotenzial	-9.7

Tabelle 1: Die Ausgangsmerkmale von AP-Patienten

MCODE	LOS	Beschreibung	Logbuch10(P)
MCODE_1	LOS: 0030322	Hochdurchlässige, calciumdurchlässige, nikotinische Acetylcholinrezeptoren	-19.9
MCODE_1	R-HSA-5576886	Präsynaptische nikotinische Acetylcholinrezeptoren	-19.6
MCODE_1	R-HSA-1296346	Hochdurchlässige postsynaptische nikotinische Acetylcholinrezeptoren	-16.7

Tabelle 2: Die MCODE-Anreicherungsanalyse von DEGs.

MCODE	LOS	Beschreibung	Logbuch10(P)
MCODE_1	R-HSA-629597	Hochdurchlässige, calciumdurchlässige, nikotinische Acetylcholinrezeptoren	-10.7
MCODE_1	R-HSA-622323	Präsynaptische nikotinische Acetylcholinrezeptoren	-10.3
MCODE_1	R-HSA-629594	Hochdurchlässige postsynaptische nikotinische Acetylcholinrezeptoren	-10.3
MCODE_2	R-HSA-1296346	Tandem-Porendomänen-Kaliumkanäle	-10.3
MCODE_2	LOS: 0030322	Stabilisierung des Membranpotenzials	-9.8
MCODE_2	R-HSA-5576886	Phase 4 – Ruhemembranpotenzial	-9.7

Tabelle 3: Die MCODE-Anreicherungsanalyse des Hub-Gens.

Ergänzende Datei 1: Kontroll-(n=3) Genexpression.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Akte 2: Patienten (n=10) Kern-Tabellengen.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Mit der kontinuierlichen Vertiefung der Forschung zu AP werden ständig neue Zytokine in AP nachgewiesen, und Entzündungen sind zu einem wichtigen Faktor bei der Entstehung und Entwicklung von AS^21,22 geworden. Die Aktivierung von Albumin kann die Verbindung zwischen Endothelzellen und der vaskulären intimalen Matrix kappen und die Endothelzellen dazu bringen, sich von den vaskulären intima zu lösen. Induzierte vaskuläre Intimitätsverletzung^23,24. Die Entzündung induziert eine oxidative Modifikation von LDL-C, und das modifizierte LDL-C führt wiederum zu einem Entzündungsprozess in der Intima der Arterie, wodurch die Bildung von AP²⁵ beschleunigt wird. Instabile Plaques können unter inneren und äußeren Ursachen schließlich platzen und ACS verursachen²⁶. Während des Plaque-Platzes sekretieren Makrophagen, gefäßglatte Muskelzellen (VSMC) und Lymphozyten entzündliche Faktoren wie Leukozyteninterleukin-1 (IL-1), IL-6, intervaskuläre Adhäsionsfaktor-1 und interzelluläre Adhäsionsfaktor-1. Gleichzeitig ist die Expression von Leukozytenintegrin (CD11b/CD18), einem Rezeptor auf Monozyten und Granulozyten,^{um 27,28} erhöht. Der molekulare Mechanismus der Entzündung, der zur Bildung von AP führt, bleibt jedoch noch zu erforschen.

Das Auftreten und die Entwicklung von AP, verursacht durch Entzündungen, ist ein komplexer Verlauf von Multi-Faktor-Wirkung, Multi-Gen-Veränderung und mehrstufiger Erkrankung, insbesondere eng verbunden mit der abnormen Expression vieler Gene. In dieser Studie zeigten RNA-Seq- und bioinformatische Analysen, dass zwischen gesunden Kontrollgeweben und AP das Vulkanplot der DEGs 2097 hochregulierte und 1616 herunterregulierte Gene zeigte. Weitere KEGG-Anreicherungsanalysen von DEGs zeigten, dass die DEGs hauptsächlich in immun- und entzündungsbezogenen Wegen angereichert waren. Die Hub-Genanalyse identifizierte die Top 10 Hub-Gene, bestehend aus CXCR4, CCL4, CCL3, CCL20, CXCL1, CCL5, CXCL8, CD4, CCR2 und CCR5. Die Schnittstelle von Hub-Genen mit dem Olink-Inflammatorpanel 92-Genen offenbarte fünf gemeinsame Gene, darunter CXCL1, CCL20, TNF, CCL3 und CCL4. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die entzündungsbedingten Faktoren CCL3, CCL4 und CXCL1 eine entscheidende Rolle im pathologischen Prozess der AP spielen könnten. Die Immuninfiltrationsanalyse zeigte eine ausgeprägte Mikroumgebung, die durch einen signifikanten Anstieg der M0-Makrophagen sowie Reduktionen der CD8⁺-T-Zellen, aktivierter NK-Zellen und ruhenden Mastzellen in Plaques gekennzeichnet ist.

M0-Makrophagen stellen einen ungebundenen Pool dar, der oxidiertes LDL leicht internalisieren und sich in Schaumzellen differenzieren kann, ein Markenzeichen der frühen Atherogenese²⁹. Der erhöhte Anteil an M0-Makrophagen, der in der Krankheitsgruppe beobachtet wurde, deutet auf eine Ansammlung dieser Vorläuferzellen in der Plaque-Mikroumgebung hin. CCL4, das hauptsächlich von aktivierten Makrophagen und T-Zellen produziert wird, dient als persistentester Reiz, der die Makrophagenaktivierung über den NFκB-Signalweg aufrechterhält, die Expression von Adhäsionsmolekülen fördert und die Matrix-Metalloproteinase-2 und -9 induziert, wodurch der Übergang der M0-Makrophagen in einen pro-atherogenen Zustand ermöglicht und die Plaquestabilität direkt gefährdet^{wird 30}. Der reduzierte Anteil der CD8⁺-T-Zellen könnte auf die CCL3-vermittelte Unterdrückung atheroprotektiver T-Zell-Subsets zurückzuführen sein. Komissarov et al. zeigten, dass die Migration von T-Zellen in menschliche atherosklerotische Plaques überwiegend über die CCR5-CCL3-Achse³¹ erfolgt. Darüber hinaus entdeckten Döring et ^al.32 einen nicht-kanonischen Weg, bei dem CCL17 über CCR8 signalisiert, um die CCL3-Expression zu induzieren, was wiederum die regulatorische T-Zelldifferenzierung unterdrückt; die genetische Ablation von CCL3 in CD4⁺-T-Zellen erhöhte die FoxP3⁺-Treg-Zahl und begrenzte die Arteriosklerose, während die Verabreichung von CCL3 die Erkrankung verschlimmerte und die Treg-Differenzierung einschränkte. Diese Verschiebung verringert wahrscheinlich die atheroprotektiven CD8⁺-regulatorischen T-Zellen und fördert pathogene Effektor-T-Zellen, was zu der in unserer Analyse beobachteten Nettoverringerung des CD8⁺-T-Zellanteils führt. Die Reduktionen der aktivierten NK-Zellen und ruhenden Mastzellen spiegeln wahrscheinlich Veränderungen im Aktivierungsstatus wider und nicht auf einen absoluten Verlust dieser Populationen. Bonaccorsi et ^al.33 berichteten, dass symptomatische Karotisplaques eine erhöhte NK-Zellinfiltration und die Produktion von IFN-γ aufweisen, was die Aktivierung von NK-Zellen direkt mit klinischer Plaqueinstabilität verknüpft. Bei Mastzellen zeigten Wezel et ^al.34 , dass Chemokine, die aus aktivierten Mastzellen, insbesondere CXCL1, freigesetzt werden, Neutrophilenwerbung über die CXCL1/CXCR2-Achse induzieren, wodurch die laufende Entzündungsreaktion verschärft und die Plaqueprogression sowie -destabilisierung gefördert wird. Daher spiegelt der geringere Anteil aktivierter NK-Zellen und ruhender Mastzellen wahrscheinlich ihre Aktivierung, Degranulation oder Erschöpfung im entzündlichen Plaque-Milieu wider, und nicht auf eine tatsächliche numerische Erschöpfung.

Diese Studie hat mehrere Einschränkungen. Erstens basiert diese Studie ausschließlich auf der Transkriptomsequenzierung und ist durch die kleine Stichprobengröße begrenzt. Abgesehen von der begrenzten Stichprobengröße sollten mehrere technische Einschränkungen des RNA-seq-Protokolls beachtet werden. Bulk-RNA-seq maskiert zelluläre Heterogenität; Einzelzellansätze sind erforderlich, um zelltypspezifische Expression von CCL3, CCL4 und CXCL1 aufzulösen. Die computergestützte Immundekonvolution (CIBERSORT) liefert nur Schätzungen, keine direkten Messungen. Die RNA-Häufigkeit korreliert nicht immer mit dem Proteingehalt; Orthogonale Validierung ist erforderlich. Zukünftige Studien sollten diese Einschränkungen durch Einzelzell-Transkriptomik, größere und unabhängige Kohorten sowie orthogonale Proteinvalidierung adressieren.

Abschließend unterstrichen die vorliegenden Ergebnisse die wichtige Rolle entzündlicher Faktoren im pathophysiologischen Prozess von AP. Darüber hinaus identifizierten wir die Hub-Gene CCL3, CCL4 und CXCL1, die ein koordiniertes Chemokin-Netzwerk bilden könnten, das die Atherosklerose durch Förderung der M0-Makrophagenansammlung, die Unterdrückung schützender T-Zell-Subsets und die Veränderung der Aktivierungszustände von NK-Zellen und Mastzellen antreibt. Insgesamt heben diese Ergebnisse die drei Chemokine als entscheidende Regulatoren der Plaque-Immun-Mikroumgebung und potenzielle therapeutische Ziele hervor.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
TRIzol	Invitrogen	15596026CN	RNA-Extraktion
Nanodrop ND-2000 Spektrophotometer	Thermo Fisher Scientific	ND2000	RNA-Konzentrationsnachweis
Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent	G2939BA	Qualitätskontrolle der RNA
Illumina HiSeq TM 2000	Illumina	HiSeq 2000	Transkriptom-Sequenzierung
Oligo D (T) magnetische Perlen	New England Biolabs	S1550S	RNA-Anreicherung