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Hepatitis-E-Virus-Fluoreszenzreduktions-Neutralisationstest zur Messung neutralisierender Antikörper-Titer

DOI:

10.3791/69892

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May 22nd, 2026

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1Virology Laboratory, Centre for Virus Research, Therapeutics and Vaccines, Translational Health Science and Technology Institute, 2Department of Gastroenterology, All India Institute of Medical Sciences, New Delhi

In This Article

Summary

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Es gibt keinen standardisierten Virusneutralisationstest für das Hepatitis-E-Virus (HEV), ein nicht-zytopathisches Positivsträng-RNA-Virus. Hier wird ein Fluoreszenzreduktionsneutralisationstest (FRNT) auf Basis der Quantifizierung des fluoreszierend markierten viralen Kapsidproteins beschrieben, um die Wirksamkeit von Anti-HEV-Antikörpern zu bewerten.

Abstract

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Der Virusneutralisationstest misst das Neutralisierungspotenzial eines Antikörpers oder einer Mischung von Antikörpern gegen das entsprechende Virus. Es ist eine wertvolle Technik, um die Wirksamkeit von Impfstoffkandidaten und neutralisierenden Antikörpern gegen das Virus zu bewerten. Der Plaque-Reduktionsneutralisationstest (PRNT) ist eine beliebte Methode zur Bewertung des Titers virusspezifischer neutralisierender Antikörper. PRNT ist jedoch bei nicht-zytopathischen Viren nicht praktikabel. Das Hepatitis-E-Virus (HEV) ist ein positives, einzelsträngiges RNA-Virus, das zur Familie Hepeviridae gehört. Sie ist weltweit eine Hauptursache für akute virale Hepatitis. Es zeigt keinen zytopathischen Effekt in der Zellkultur von Säugetieren. Ein Impfstoff gegen HEV ist in China erhältlich. Allerdings sind Impfstoffe oder therapeutische Antikörper gegen HEV in den meisten Teilen der Welt nicht verfügbar. Mehrere Labore arbeiten an Impfstoffkandidaten gegen den HEV. Ein Neutralisierungstest zur Messung der Wirksamkeit von HEV-Impfstoffen wird für Forscher ein sehr nützliches Werkzeug sein. Hier beschreiben wir einen Fluoreszenzreduktionsneutralisationstest (FRNT), um den 50%igen Neutralisationstiter (NT50) der Anti-HEV-Antikörper zu schätzen. Anti-HEV ORF2-neutralisiert oder kaninchen-IgG-neutralisiertes HEV wurde verwendet, um Huh7-Zellen zu infizieren, gefolgt von einer immunfluoreszenten Färbung des viralen ORF2-Proteins. Fluoreszierende positive Zellen wurden in der ImageJ-Anwendung quantifiziert, und NT50 wurde auf 2,1 x 103 geschätzt. Diese Methode kann angewandt werden, um das NT50 der Anti-HEV-Antikörper in geimpften Mäus-Sera, von HEV-geborgenen einzelnen Seras und im Labor hergestellten Anti-HEV-Antikörpern zu schätzen.

Introduction

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Das Hepatitis-E-Virus (HEV) ist ein positives, einzelsträngiges RNA-Virus, das zur Familie Hepeviridae 1,2 gehört. Sie verursacht meist selbstlimitierende akute Hepatitis, kann aber chronische Hepatitis bei immungeschwächten Personenverursachen 3,4. Schwangere Frauen haben ein hohes Risiko, eine fulminante Leberinsuffizienz zu entwickeln, wobei die Sterblichkeitsrate bis zu 30 % steigt. Die Weltgesundheitsorganisation (WHO) meldete im Jahr 2021 weltweit etwa 19,47 Millionen Fälle von ak....

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Protocol

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Die Genehmigung des institutionellen Ethikkomitees (IEC) wurde eingeholt, um eine Stuhlprobe von einem HEV-infizierten Patienten zu entnehmen, der in der Abteilung für Gastroenterologie des AIIMS in Neu-Delhi aufgenommen wurde. Die informierte Zustimmung wurde von den an der Studie teilnehmenden Patienten eingeholt. Die Details der Reagenzien und der verwendeten Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Virusisolierung und Quantifizierung

  1. Mit informierter Zustimmung entnehmen Sie die Stuhlprobe von einem HEV-infizierten Patienten zur Reinigung des Virus.....

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Results

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Infektion von Huh7-Zellen mit g1-HEV und Viruscharakterisierung

Der g1-HEV wurde aus einer Fäkalprobe mit einer Reihe von Schritten isoliert, wie dargestellt (Abbildung 1A). Die Genomkopiezahl des gereinigten g1-HEV wurde durch RT-qPCR geschätzt, gefolgt von einer Speicherung bei -80 °C. Zur Bestätigung der Virusinfektion und Replikation wurden Huh7-Zellen 72 Stunden lang mit 1,8 × 104 Genomkopie-Äquiv.......

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Discussion

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FRNT ist eine immunfärbungsbasierte Methode zur Abschätzung des neutralisierenden Potenzials von Antikörpern. Es wurde verwendet, umNT-50-Werte für Antikörper gegen mehrere Viren zu schätzen, darunter das Dengue-Virus (DENV), das Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus-2 (SARS-CoV-2) und das Japanische Enzephalitis-Virus (JEV)23,24,25. Bei dieser Methode wird das Virus mit einem.......

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Disclosures

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Die Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Acknowledgements

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Diese Forschung wurde teilweise durch einen Zuschuss des Biotechnology Industry Research Assistance Council, Department of Biotechnology, Regierung von Indien finanziert, der an MS, S und BN vergeben wird. Die Forschung im MS-Labor wird durch einen Kernzuschuss des Translational Health Science and Technology Institute unterstützt. SA wird durch eine Stelle als Projektforschungswissenschaftler unterstützt, die vom Indian Council of Medical Research der indischen Regierung finanziert wird. Die UB wird durch ein Senior Research Fellowship des Department of Biotechnology der indischen Regierung unterstützt.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1,5-mL-MikrofugeröhrenAxygenMCT-150-C
12-Well-Zellkultur-SchüsselCorning3512
37-Grad-Inkubator-SchüttlerThermowissenschaftlich50163013
4′,6-diamidino-2-phenylindolAbcamAB104139DAPI
50-mL ZentrifugenrohrFalcon352070
6-Well-Zellkultur-SchüsselCorning 3516
Alexa-Mehl 594 sekundärer IgG-AntikörperThermowissenschaftlichA-11012
Anti-ORF2-AntikörperGenskriptNAIndividuell von Genscript synthetisiert und in unserem Labor14
Anti-Kaninchen-IgG-AntikörperGenskriptNA
Rinderserum-AlbuminHIMEDIAMB083BSA
KonfokalmikroskopOlympusFV3000
DMEM, hoher BlutzuckerHIMEDIAAL007A
Fetales RinderserumGIBCO16000-044FBS
ImageJ 1,54gImageJ.org (Wayne Rasband und Mitwirkende, NIH, USA)
Normales ZiegenserumHIMEDIARM-10701
ParaformaldehydHIMEDIAGRN3660PFA
Phosphatpuffer-Kochsalzlösung pH 7,4HIMEDIATL1006PBS
Polyethylenglykol 6000SIGMA81255PEG6000
SOLIScript 1-Schritt-Sonden-KitSOLIS BIODYNE08-57-00250
TRI-ReagenzMolekulares ForschungszentrumTR118
Triton X100SIGMAX100
Trypsin-EDTAGIBCO25300-54

References

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  1. Smith, D. B., et al. International Committee on Taxonomy of Viruses Hepeviridae Study Group. Consensus proposals for classification of the family Hepeviridae. J Gen Virol. 95 (Pt 10), 2223-2232 (2014).
  2. Nan, Y., Zhang, Y. J. Molecular biology and infection of hepatitis E virus. Fron....

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Hepatitis E VirusNeutralization AssayFluorescence ReductionNeutralizing Antibody TitersVirus NeutralizationAntibody EfficacyVaccine EvaluationImmunofluorescent StainingORF2 ProteinHuh7 Cells
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