Method Article

Hepatitis-E-Virus-Fluoreszenzreduktions-Neutralisationstest zur Messung neutralisierender Antikörper-Titer

DOI:

10.3791/69892

⸱

May 22nd, 2026

 ,  ,  ,  , 
1Virology Laboratory, Centre for Virus Research, Therapeutics and Vaccines, Translational Health Science and Technology Institute, 2Department of Gastroenterology, All India Institute of Medical Sciences, New Delhi

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Es gibt keinen standardisierten Virusneutralisationstest für das Hepatitis-E-Virus (HEV), ein nicht-zytopathisches Positivsträng-RNA-Virus. Hier wird ein Fluoreszenzreduktionsneutralisationstest (FRNT) auf Basis der Quantifizierung des fluoreszierend markierten viralen Kapsidproteins beschrieben, um die Wirksamkeit von Anti-HEV-Antikörpern zu bewerten.

Abstract

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Der Virusneutralisationstest misst das Neutralisierungspotenzial eines Antikörpers oder einer Mischung von Antikörpern gegen das entsprechende Virus. Es ist eine wertvolle Technik, um die Wirksamkeit von Impfstoffkandidaten und neutralisierenden Antikörpern gegen das Virus zu bewerten. Der Plaque-Reduktionsneutralisationstest (PRNT) ist eine beliebte Methode zur Bewertung des Titers virusspezifischer neutralisierender Antikörper. PRNT ist jedoch bei nicht-zytopathischen Viren nicht praktikabel. Das Hepatitis-E-Virus (HEV) ist ein positives, einzelsträngiges RNA-Virus, das zur Familie Hepeviridae gehört. Sie ist weltweit eine Hauptursache für akute virale Hepatitis. Es zeigt keinen zytopathischen Effekt in der Zellkultur von Säugetieren. Ein Impfstoff gegen HEV ist in China erhältlich. Allerdings sind Impfstoffe oder therapeutische Antikörper gegen HEV in den meisten Teilen der Welt nicht verfügbar. Mehrere Labore arbeiten an Impfstoffkandidaten gegen den HEV. Ein Neutralisierungstest zur Messung der Wirksamkeit von HEV-Impfstoffen wird für Forscher ein sehr nützliches Werkzeug sein. Hier beschreiben wir einen Fluoreszenzreduktionsneutralisationstest (FRNT), um den 50%igen Neutralisationstiter (NT50) der Anti-HEV-Antikörper zu schätzen. Anti-HEV ORF2-neutralisiert oder kaninchen-IgG-neutralisiertes HEV wurde verwendet, um Huh7-Zellen zu infizieren, gefolgt von einer immunfluoreszenten Färbung des viralen ORF2-Proteins. Fluoreszierende positive Zellen wurden in der ImageJ-Anwendung quantifiziert, und NT50 wurde auf 2,1 x 103 geschätzt. Diese Methode kann angewandt werden, um das NT50 der Anti-HEV-Antikörper in geimpften Mäus-Sera, von HEV-geborgenen einzelnen Seras und im Labor hergestellten Anti-HEV-Antikörpern zu schätzen.

Introduction

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Das Hepatitis-E-Virus (HEV) ist ein positives, einzelsträngiges RNA-Virus, das zur Familie Hepeviridae 1,2 gehört. Sie verursacht meist selbstlimitierende akute Hepatitis, kann aber chronische Hepatitis bei immungeschwächten Personenverursachen 3,4. Schwangere Frauen haben ein hohes Risiko, eine fulminante Leberinsuffizienz zu entwickeln, wobei die Sterblichkeitsrate bis zu 30 % steigt. Die Weltgesundheitsorganisation (WHO) meldete im Jahr 2021 weltweit etwa 19,47 Millionen Fälle von akuter Hepatitis E (AHE) und 3450 Todesfälle durch HEV6. HEV wird in Entwicklungsländern hauptsächlich durch kontaminierte Lebensmittel und Wasser übertragen, bedingt durch schlechte sanitäre Hygiene, während sporadische berufliche Infektionen in Industrieländern mit dem Verzehr von rohem oder nicht durchgegartem Fleisch verbunden sind6. HEV wird in acht Genotypen eingeteilt. Genotyp (g) 1- und g2- HEV infizieren ausschließlich Menschen. g3- und g4-HEV haben eine große Bandbreite an Wirten wie Menschen, Kaninchen, Schweine, Wildschweine und Hirsche. g5- und g6-HEV infizieren Wildschweine, während g7- und g8-HEV Kamele befallen. Ein einzelner Fall der menschlichen Übertragung von G7-HEV wurde im Nahen Osten durch den Verzehr von Kamelfleisch und Milch gemeldet 7,8. Die HEV-Infektion ist hauptsächlich in Ländern mit niedrigem bis mittlerem Einkommen häufig. In endemischen Regionen Süd- und Südostasiens, Afrikas und Mexikos wurden mehrere wassergetragene Ausbrüche gemeldet, die hauptsächlich durch G1- und seltener durch eine G2-HEV-Infektion verursacht wurden. Berufsbedingte sporadische Infektionsfälle in entwickelten Ländern Europas und Ostasiens werden größtenteils durch das g3-HEV 6,7 verursacht.

Das HEV-Genom ist eine 7,2 kb große Plus-Strang-RNA, die am 5′-Ende eine 7-Methylguanin-Kappe sowie drei offene Leserahmen (ORFs) und ein polyadenyliertes 3'-Ende enthält. ORF1 codiert das nicht-strukturelle Polyprotein, das aus sieben verschiedenen Domänen besteht: Methyltransferase (Met), Y-Domäne, Papain-ähnliche Cysteinprotease (PCP), V-Domäne, Makrodomäne (X-Domäne), Helikase (Hel) und RNA-abhängige RNA-Polymerase (RdRp). ORF2 codiert das Kapsidprotein, das für die Assemblierung viraler Kapsiden verantwortlich ist. ORF3 codiert ein Phosphoprotein, das als Viroporin wirkt und beim viralen Austritt9 hilft. Ein zusätzlicher offener Leserahmen, ORF4, ist im g1-HEV vorhanden, der über einen cap-unabhängigen Mechanismus übersetzt wird, wobei ein internes, ribosomenähnliches Element im ORF1 verwendet wird. Die Expression von ORF4 wird durch endoplasmatische Retikulum-Stress-induzierende Verbindungen verstärkt. ORF4 wurde vorgeschlagen, um die G1-HEV-Replikationskomplex-Montage10 zu fördern.

Obwohl HEV sich in vitro nicht effizient repliziert, wurden einige Stämme des Virus, die aus Hepatitis-E-Patienten isoliert wurden, erfolgreich in Hepatozyten, Lungenzelllinien und Colon-Epithelzelllinie11 vermehrt. Es ist jedoch schwierig, das Virus robust in den kultivierten Zellen zu vermehren. Der infektiöse cDNA-Klon von g1-HEV (Sar55-Stamm) wurde für In-vitro-Studien verwendet, aber eine effiziente Produktion und Vermehrung von G1-HEV-Stämmen in kultivierten Zellen wurde bisher nicht erreicht. Einige G3- und G4-HEV-Stämme wachsen besser in kultivierten Zellen12. Dennoch reicht das gereinigte Virus, das aus Zellen erzeugt wird, die mit der in vitro transkribierten und gekappten p6-HEV-Genom-RNA transfiziert wurden, für mehrere Tests nicht aus. Darüber hinaus sind alle durch Zellkulturen erzeugten HEV-Partikel quasi-umhüllt, was ihre Infektivität beeinflusst. Im Gegensatz dazu ist HEV, das in kontaminierten Lebensmitteln und Wasser gefunden wird, nicht umhüllend und hoch ansteckend. HEV, das im Patientenkot vorhanden ist, ist nicht umhüllt und ist die häufigste Quelle natürlicher Infektionen. Daher gewährleistet der Einsatz von HEV, das aus dem Stuhl der Patienten gereinigt wird, eine effiziente Infektion im Zellkultursystem der Säugetiere. Unsere früheren Studien haben die Zuverlässigkeit des vom Kot gereinigten G1-HEV von Patienten bei der Quantifizierung der viralen Replikation in menschlichen Hepatomzellen gezeigt (Huh7). Gereinigtes Virus, das bei -80 °C gelagert wird, behält über mehrere Jahre die Infektivität und wurde in mehreren unabhängigen Studien verwendet, um die virale Replikation 10,13,14,15 zu schätzen. Diese Studie entwarf einen HEV-Neutralisationstest mit gereinigtem G1-HEV, der von einem Patienten gewonnen wurde. Das Virus wurde gereinigt, titeriert, charakterisiert und in Aliquots bei -80 °C gespeichert, um später in Neutralisierungstests verwendet zu werden. Da HEV nicht zytopathisch ist, ist die traditionelle PRNT-Methode nicht nützlich, um das Virusneutralisierungspotenzial von Anti-HEV-Antikörpern abzuschätzen. Es gab mehrere Versuche, Neutralisierungstests für HEV zu entwickeln, darunter ein auf Flusszytometrie basierender Neutralisationstest, ein antigenbasierter ELISA-Kit-basierter Neutralisationsassay zur Erkennung von pORF2, das in Zellsupernatanten sekretiert wird, einen in vitro basierenden ELISA-basierten Bindungsassay, einen RT-PCR-basierten Test und einen fluoreszenzbasierten Neutralisationsassay 16,17,18,19,20. Ein ELISA-basierter Test erkennt indirekt Antikörperbindungen, um die funktionelle Neutralisierung des Virus zu bewerten, kann jedoch die tatsächliche Infektion nicht messen. Die auf Flow Cytometrie basierende Methode misst üblicherweise den Prozentsatz infizierter Zellen, die ein Pseudovirus verwenden. Die RT-PCR-basierte Neutralisierungsmethode ist komplizierter als FRNT; daher sind die Wahrscheinlichkeiten eines Handhabungsfehlers höher. Andererseits ist die hier beschriebene FRNT-Methode durch die Verfügbarkeit von High-Titer-Infektionsviren und Bildgebungsmöglichkeiten begrenzt. Dennoch ist es eine effiziente Methode, NT50 der Anti-HEV-Antikörper zu messen.

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Protocol

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Die Genehmigung des institutionellen Ethikkomitees (IEC) wurde eingeholt, um eine Stuhlprobe von einem HEV-infizierten Patienten zu entnehmen, der in der Abteilung für Gastroenterologie des AIIMS in Neu-Delhi aufgenommen wurde. Die informierte Zustimmung wurde von den an der Studie teilnehmenden Patienten eingeholt. Die Details der Reagenzien und der verwendeten Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Virusisolierung und Quantifizierung

  1. Mit informierter Zustimmung entnehmen Sie die Stuhlprobe von einem HEV-infizierten Patienten zur Reinigung des Virus.
  2. Die Fäkalprobe in Dulbeccos Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS) bei 10 % Endkonzentration (w/v) resuspendieren und bei 7800 x g für 1 Stunde bei 4 °C zentrifugieren.
    HINWEIS: Verwenden Sie Handschuhe beim Umgang mit der HEV-Kotprobe und reinigen Sie den Arbeitsbereich nach der Arbeit mit 70 % Ethanol (führen Sie alle Schritte in einem Biosicherheitsschrank durch).
  3. Sammeln Sie das Supernatant auf und leiten Sie es durch einen 0,45-μm-Filter.
  4. Fügen Sie 8 % PEG6000 in 0,4 M NaCl zum Virusüberstand hinzu und inkubieren Sie 16 Stunden bei 0 °C.
  5. Zentrifugieren Sie die Probe bei 18.000 x g für 30 Minuten bei 4 °C.
  6. Entfernen Sie das Supernatant und suspendieren Sie das Pellet in 40 mL Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM).
  7. Konzentrieren Sie die Federung auf ein Volumen von 5 mL mittels Tangentialströmungsfiltration (TFF) mit einer 30-kDa-Membranpatrone. Filtern Sie es durch einen 0,2 μm-Filter im Biosicherheitsschrank, stellen Sie Aliquots her und lagern Sie es bei -80 °C. Verwenden Sie einen Aliquot, um die gesamte RNA zu isolieren und RT-qPCR durchzuführen.
  8. Verwenden Sie mehrere Verdünnungen des pSK-HEV2-Plasmids [pBluscript-Vektor mit cDNA eines infektiösen Klons von g1-HEV (Genbank-ID: AF444002.1)] (1 ng bis 0,000001 ng DNA/Reaktion bei 10-facher serieller Verdünnung), um einen Standard zur Quantifizierung viraler RNA zu zeichnen.
  9. Zeichnen Sie das Diagramm mit der Menge an pSK-HEV2-DNA auf der X-Achse und den entsprechenden Ct-Werten auf der Y-Achse dar. Extrapolieren Sie die Konzentration der viralen RNA aus dem Standardplot.
  10. Quantifizieren Sie das HEV-Genom-RNA-Level aus dem Standardplot und berechnen Sie die Genomkopienzahl des Virus mit folgender Formel: Anzahl der Kopien = ng*(Anzahl/Mol) / Basen *(ng/g)*(g/Mol der Basen).

2. Infektion der Huh7-Zellen mit g1-HEV

  1. Nimm eine T75-Flasche mit Huh7-Zellen. Schau unter dem Mikroskop, ob die Zellen zusammenfließen und gesund sind.
  2. Entfernen Sie das Medium mit dem Aspirator (führen Sie alle Schritte im Biosicherheitsschrank durch). Fügen Sie 10 ml DPBS hinzu, wirbeln und entfernen.
  3. Fügen Sie 1 ml 0,05%ige Trypsinlösung hinzu, um sicherzustellen, dass die Oberfläche gleichmäßig verteilt wird.
  4. Inkubieren Sie 30–60 Sekunden in einem CO-2-Inkubator, bis die Zellen zu 90 % abgetrennt sind.
  5. Fügen Sie 5 ml vollständiges Medium hinzu, verteilen Sie es gleichmäßig über die gesamte Oberfläche des T75 und pipettieren Sie mehrmals, um eine gleichmäßige Einzelzellpopulation ohne Zuschlagstoffe zu bilden.
  6. Die Zellsuspension wird in ein 50-mL konisches Rohr übertragen und bei Raumtemperatur 5 Minuten bei 200 x g zentrifugiert.
  7. Aspirieren Sie das Kulturmedium aus dem konischen Rohr im Biosicherheitsschrank.
  8. Fügen Sie dem Rohr 5 ml vollständiges Medium hinzu und suspendieren Sie die Zellen durch sanftes Pipettern zu einer gleichmäßigen Suspension.
  9. Nehmen Sie 10 μL Zellsuspension und legen Sie sie auf einen Zellzähler-Objektträger. Zähle die Zellen in 4 Quadranten, berechne den Durchschnitt/mL.
  10. Saat 0,5 x 106 Zellen /Brunnen einer 6-Well-Platte in 2 mL DMEM (ergänzt mit 10 % FBS).
  11. Am nächsten Tag wird das Medium entfernt, 1 ml DPBS eingewaschen und 50 μL g1-HEV-Virus (entsprechend 4,5 × 104 Genomkopiendes gereinigten g1-HEV) in 1 mL serumfreiem Medium (SFM) hinzugefügt.
  12. Inkubieren Sie die Zellen in einem 5%igen CO2-Inkubator bei 37 °C für 1 Stunde.
  13. Waschen Sie die Zellen mit 500 μL DPBS und fügen Sie dann 2 ml Komplettmedium hinzu (DMEM ergänzt mit 2 % FBS).
  14. Inkubieren Sie die Zellen 72 Stunden lang in einem 5%igen CO2-Inkubator bei 37 °C.
  15. Fahren Sie flussabwärts zu Assays fort.

3. RT-qPCR-Test

  1. Entferne das Wachstumsmedium von der 6-Well-Platte (ab Schritt 2.15) und wasche die Zellen mit 1 mL DPBS.
  2. Geben Sie 1 ml TRI-Reagenz direkt auf die 6-Well-Platte, um die Zellen zu lysieren. Pipettieren Sie das Lysat mehrmals auf und ab und übertragen Sie es dann in ein 1,5-mL-Mikrozentrifugenrohr.
    HINWEIS: TRI-Reagenz ist giftig, wenn es eingeatmet, geschluckt oder mit der Haut in Kontakt kommt. Verwenden Sie Schutzhandschuhe während der Anwendung des Reagens und vermeiden Sie das Einatmen von Dämpfen. Am besten verwenden Sie sie in der chemischen Haube. Alle Kunststoffwaren sollten RNAse-frei sein.
  3. Die Proben 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. 0,2 ml Chloroform hinzufügen, das Rohr sicher abschließen und dann 10–15 Sekunden vortoben (Chloroform ist gefährlich und giftig; mit geeigneter PSA gehandhabt). 2–3 Minuten inkubieren.
  4. Zentrifugieren Sie die Proben für 15 Minuten bei 12.000 × g bei 4 °C. Übertragen Sie die wässrige Phase auf ein neues 1,5-ml-Mikrozentrifugenrohr. Gib 0,5 ml Isopropanol zur wässrigen Phase und mische das Rohr ein paar Mal gut um.
  5. Inkubiere 10 Minuten bei Zimmertemperatur.
  6. Zentrifugiere 10 Minuten bei 12.000 × g bei 4 °C. Entsorge das Supernatant.
  7. Setzen Sie das Pellet in 1 mL 75% Ethanol wieder auf. Zentrifugiere für 5 Minuten bei 7500 × g bei 4 °C. Entsorge das Supernatant.
  8. Das RNA-Pellet 5–10 Minuten an der Luft trocknen.
  9. Das Pellet wird in 50 μL nukleasefreiem Wasser (NFW) wieder suspendiert, bei 55 °C 10 Minuten inkubiert, durch Handklopfen gemischt und die RNA-Konzentration mittels Spektrophotometrie gemessen.
  10. Führen Sie TaqMan-Sonden-basierte einstufige RT-qPCR mit den folgenden Primern durch:
    g1-HEV FP: 5′TATACTCGAGGGTGCCGATCGGTCCC3′;
    g1-HEV RP: 5′TATACCATGGCATCTGGCAGCAAGCTCAG3′;
    g1-HEV-Sonde: 5′[FAM] TTGACGCCTGGGAGCGGAATCACC [BHQ1]3′; Ribonuklease P (RP) FP: 5′AGATTTGGACCTGCGAGCG3′;
    RP RP: 5′GAGCGGCTGTCTCCACAAGT3′;
    RP-Sonde: 5′[FAM]TTCTGACCTGAAGGCTGCGCG[BHQ1]3′.
  11. Berechnen Sie die relative Quantifizierung von g1-HEV-RNA mit der 2−ΔΔCT-Methode .

4. Immunfluoreszenz-Assay (IFA)

  1. Teile die Huh7-Zellen wie in früheren Schritten beschrieben.
  2. Setze den mikroskopischen Glasdeckzettel in eine 12-Well-Platte und säe 0,2 × 106 Zellen pro Bohrloch in 1 mL Komplettmedium (DMEM ergänzt mit 10 % FBS).
  3. Infizieren Sie die Zellen mit 1,8 × 104 Genomkopien des gereinigten G1-HEV in 500 μL SFM. Inkubieren Sie die Zellen in einem 5%igen CO2-Inkubator bei 37 °C für 1 Stunde.
  4. Waschen Sie die Zellen dreimal mit 500 μL DPBS.
  5. Füge 2 ml komplettes Medium hinzu (DMEM ergänzt mit 2 % FBS).
  6. Inkubieren Sie die Zellen 72 Stunden lang in einem 5%igen CO2-Inkubator, 37 °C.
  7. Waschen Sie die Zellen dreimal mit 500 μL DPBS und inkubieren Sie zwischen jedem Waschen 5 Minuten bei Raumtemperatur.
  8. Fügen Sie 500 μL 4 % PFA (Paraformaldehyd) zu den Zellen hinzu und inkubieren Sie 20 Minuten bei Raumtemperatur.
    HINWEIS: 4 % PFA sind schädlich beim Einatmen, verursachen Haut- und Augenreizungen und können eine allergische Hautreaktion auslösen. Zur Sicherheit tragen Sie Schutzhandschuhe und Augenschutz bei der Verwendung des Reagenz, um Dämpfe einzuatmen.
  9. Wasche die Zellen mit 500 μL DPBS, jeweils dreimal für 5 Minuten, und inkubiere sie 30 Minuten in DPBS.
  10. Gib 250 μL Blocklösung (5 % normales Ziegenserum, 0,5 % BSA, 0,3 % Triton X-100 in DPBS) zu den Zellen und inkubiere 1 Stunde bei Raumtemperatur (RT).
  11. Blockierungslösung entfernen, einmal mit 500 μL DPBS waschen und die Zellen mit 250 μL Primärantikörper (DPBS, 0,3 % Triton X-100, 5 % BSA, 0,5 % normales Ziegenserum, 1,500 % Verdünnung des Anti-ORF2-Antikörpers oder Kaninchen-IgG) über Nacht bei 4 °C inkubieren.
  12. Wasche die Zellen dreimal mit 500 μL DPBS für jeweils 5 Minuten.
  13. Inkubieren Sie die Zellen mit einem sekundären Antikörper (DPBS, 0,3 % Triton X-100, 5 % BSA, 0,5 % normales Ziegenserum, 1:1000 Verdünnung des Ziegen-Antikaninchen-Antikörpers Alexa fluor 594) für 1 Stunde bei RT.
  14. Wasche die Zellen dreimal mit DPBS für jeweils 5 Minuten. Fügen Sie 10 μL Prolong-Gold-Antifade-Reagenz mit DAPI (4′,6-Diamidino-2-Phenylindol) Lösung zum Glasträger hinzu. Montieren Sie die Zellen mit Deckschichten, wobei die Zellen auf Glasscheiben zur DAPI-Lösung zeigen, um Luftblasen zu vermeiden.
  15. Versiegeln Sie den Deckzettel mit Nagellack.
  16. Nehmen Sie fluoreszierende Bilder in einem konfokalen Mikroskop mit 60x-Objektiv auf.
  17. Stellen Sie das Mikroskop für die Visualisierung und Erfassung von fluoreszierenden Signalen ein.
  18. Zuerst fokussieren Sie die Kerne im Objektträger, die den Mock-Zellen (nicht infiziert) entsprechen, mit 60-facher Vergrößerung. Stellen Sie die Schwellenspannung und den Laser so an, dass kein Hintergrund-Fluoreszenzsignal sichtbar ist. Überprüfen Sie das mit Kontrollantikörper (Kaninchen-IgG) gefärbte Objektträger und stellen Sie sicher, dass kein Hintergrundfluoreszenzsignal sichtbar ist.
  19. Visualisieren Sie Folien von HEV-infizierten Zellen, ohne die oben genannten Parameter zu verändern. Nehmen Sie Bilder in 1028 x 1028 Pixeln auf.

5. Fluoreszenzreduktionsneutralisationstest (FRNT)

  1. Virusneutralisierung und Infektion von Huh7-Zellen
    1. Teile die Huh7-Zellen wie in früheren Schritten beschrieben. Setzen Sie den Deckmantel in eine 12-Well-Platte und säen Sie 0,2 × 106 Zellen pro Brunnen in 1 mL Complete Media (DMEM + 10 % FBS).
    2. Am nächsten Tag bereiten Sie eine 10-fache serielle Verdünnung der Antikörper (Anti-ORF2 und Kaninchen-IgG) in SFM mit einer Anfangskonzentration von 25 μg/mL in 1:10 Schritten bis 1:10 5 Verdünnung vor. Das Endvolumen der Verdünnung sollte 100 μL betragen.
    3. Fügen Sie zu jeder Antikörperverdünnung 1,8 x 10 4 genomische Kopien des gereinigten G1-HEV hinzu.
    4. Inkubieren Sie die Antikörper- und Virusmischung mit 5 % CO2-Inkubator, 37 °C für 1 Stunde.
    5. Entfernen Sie die 12-Well-Platte mit Huh7-Zellen (am Vortag ausgesät) und waschen Sie die Zellen mit 500 μL DPBS.
    6. Gib die Antikörper-Virus-Mischung zu den Zellen und lege die Platte für 1 Stunde in einen 5%igen CO2-Inkubator bei 37 °C.
    7. Waschen Sie die Zellen mit 500 μL DPBS.
    8. Fügen Sie DMEM + 2 % FBS-Medium zu den Zellen hinzu und inkubieren Sie die Platte in einem 5 % CO2-Inkubator bei 37 °C für 72 Stunden.
    9. Führen Sie die IFA gemäß Abschnitt 4 (ab Schritt 4.7) durch.
    10. Nehmen Sie fluoreszierende Bilder von 5 Zufallsfeldern mit einem 10-fachen Objektiv in 1028 x 1028 Pixeln auf.
    11. Speichere die Bilder im JPEG/TIFF-Format. Quantifizieren Sie die fluoreszierenden Flecken mit der ImageJ-Analyse wie unten beschrieben.
    12. Um das Bild in ImageJ zu analysieren, konvertiere das RGB-Bild in ein 8-Bit-Bild. Klicken Sie auf das Bild > tippen Sie > 8-Bit.
    13. Passen Sie die Schwelle des Bildes an. Klicken Sie auf das Bild > > Schwellenwert anpassen. Wählen Sie das untere Schwellenwertniveau auf 40 und das obere Schwellenwert auf 255.
    14. Zum Zählen wählen Sie Analysieren> Analysieren von Partikeln. Anzeigeergebnisse auswählen, Ergebnisse löschen, zusammenfassen, Kanten ausschließen und ROIs zusammenfassen. Deaktiviere Hinzufügen zum Manager, Füge Löcher hinzu und überlagere. Drückt man OK, erscheint die Zahl der fluoreszierenden Flecken.
  2. Schätzung von NT50
    1. Berechnen Sie die prozentuale Neutralisierung jeder Verdünnung mit folgender Formel:
      % Neutralisation= 100-[(((ORF2-positive Zellen in Verdünnung)⁄(ORF2-positive Zellen in Viruskontrolle)) X 100]
    2. Berechnen Sie NT50 mit folgender Formel:
      log10(NT50) = log10D1+(50-N1 ⁄ N2-N1) X (log10D2-log10D1)
      Dabei gilt D1 = Verdünnung, bei der die prozentuale Neutralisierung unter 50 liegt
      D2 = Verdünnung, bei der die prozentuale Neutralisierung über 50 liegt
      N1= % Neutralisierung unter 50
      N2= % Neutralisation über 50
    3. Berechnen Sie den Antilog von Log10 NT50 mit der Formel:
      NT50= 10log10(NT50)
    4. Plotte den Graphen von (Mittel±SD) aller Körper.

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Results

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Infektion von Huh7-Zellen mit g1-HEV und Viruscharakterisierung

Der g1-HEV wurde aus einer Fäkalprobe mit einer Reihe von Schritten isoliert, wie dargestellt (Abbildung 1A). Die Genomkopiezahl des gereinigten g1-HEV wurde durch RT-qPCR geschätzt, gefolgt von einer Speicherung bei -80 °C. Zur Bestätigung der Virusinfektion und Replikation wurden Huh7-Zellen 72 Stunden lang mit 1,8 × 104 Genomkopie-Äquiv...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

FRNT ist eine immunfärbungsbasierte Methode zur Abschätzung des neutralisierenden Potenzials von Antikörpern. Es wurde verwendet, umNT-50-Werte für Antikörper gegen mehrere Viren zu schätzen, darunter das Dengue-Virus (DENV), das Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus-2 (SARS-CoV-2) und das Japanische Enzephalitis-Virus (JEV)23,24,25. Bei dieser Methode wird das Virus mit einem...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Forschung wurde teilweise durch einen Zuschuss des Biotechnology Industry Research Assistance Council, Department of Biotechnology, Regierung von Indien finanziert, der an MS, S und BN vergeben wird. Die Forschung im MS-Labor wird durch einen Kernzuschuss des Translational Health Science and Technology Institute unterstützt. SA wird durch eine Stelle als Projektforschungswissenschaftler unterstützt, die vom Indian Council of Medical Research der indischen Regierung finanziert wird. Die UB wird durch ein Senior Research Fellowship des Department of Biotechnology der indischen Regierung unterstützt.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1,5 mL MikrozentrifugenröhrchenAxygenMCT-150-C
12-Well ZellkulturplatteCorning3512
37-Grad-Inkubator-SchüttlerThermo Scientific50163013
4',6-Diamidino-2-phenylindolAbcamAB104139DAPI
50-mL ZentrifugenrohrFalcon352070
6-Well ZellkulturplatteCorning3516
Alexa Fluor 594 sekundärer IgG-AntikörperThermo ScientificA-11012
Anti-ORF2-AntikörperGenscriptNAVon Genscript custom synthetisiert und in unserem Labor charakterisiert14
Anti-Kaninchen IgG-AntikörperGenscriptNA
Bovines SerumalbuminHIMEDIAMB083BSA
KonfokalmikroskopOlympusFV3000
DMEM, hoher GlukoseHIMEDIAAL007A
Fötale bovines SerumGIBCO16000-044FBS
ImageJ 1.54gImageJ.org (Wayne Rasband und Mitwirkende, NIH, USA)
Normales Ziegen-SerumHIMEDIARM-10701
ParaformaldehydHIMEDIAGRN3660PFA
Phosphat-Puffer-Salinlösung pH 7,4HIMEDIATL1006PBS
Polyethylenglykol 6000SIGMA81255PEG6000
SOLIScript 1-Step-Sonde-KitSOLIS BIODYNE08-57-00250
TRI-ReagenzMolecular Research CentreTR118
Triton X100SIGMAX100
Trypsin-EDTAGIBCO25300-54

References

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