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Methodenartikel

Isolierung und Kultur primärer Randzellen der Stria vascularis aus neonatalen Mäusen

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DOI:

10.3791/69916

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20. März 2026

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1Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, Renmin Hospital of Wuhan University, 2Research Institute of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, Renmin Hospital of Wuhan University, 3The First Clinical School of Wuhan University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Isolierung, Reinigung und Kultur primärer marginaler Zellen aus der Maus-Stria vascularis sowie zur Etablierung von in-vitro-Modellen von oxidativem Stress und zellulärer Seneszenz zur Untersuchung von cochlearen lateralen Wandstörungen.

Zusammenfassung

Die Stria vascularis ist eine Schlüsselstruktur im Innenohr, die für die Erzeugung und Aufrechterhaltung des endokochulären Potentials (EP) verantwortlich ist, und ihre Funktionsstörung ist eng mit verschiedenen Formen des Hörverlusts verbunden. Die Stria vascularis besteht aus Randzellen, Zwischenzellen und Basalzellen, wobei Randzellen eine zentrale Rolle bei der Entstehung und Erhaltung der EP spielen. Daher ist die Einrichtung eines in-vitro-Primärkulturmodells von marginalen Zellen unerlässlich, um die biologischen Eigenschaften der Stria vascularis und ihre Beteiligung an hörverlustbedingten Erkrankungen zu untersuchen.

In dieser Studie haben wir erfolgreich primäre marginale Zellen aus der Stria vascularis von neonatalen Mäusen isoliert und kultiviert. Stämmische Gewebe wurden durch Mikrodissektion gewonnen, mit Typ-II-Kollagenase verdaut und durch Differentialbeschichtung gereinigt, um die meisten Fibroblasten zu entfernen, wobei kultivierte Zellen bis Tag 7 über 80 % Konfluenz erreichten. Die Immunfluoreszenzfärbung zeigte eine stabile Expression von Cytokeratin 18 (CK18) und der kalium-spannungsgesteuerten Kanal-Unterfamilie Q Member 1 (KCNQ1), was eine erfolgreiche Isolierung, hohe Reinheit und erhaltene physiologische Funktion marginaler Zellen bestätigte.

Basierend auf diesem Modell wurden in vitro Modelle für oxidativen Stress und zelluläre Seneszenzmodelle mit Wasserstoffperoxid (H2O2) bzw. D-Galactose etabliert. Die behandelten Zellen zeigten signifikant erhöhte intrazelluläre reaktive Sauerstoffspezies (ROS)-Spiegel und eine seneszenzassoziierte β-Galactosidase (SA-β-gal) Positivität, was auf eine hohe Sensitivität primärer marginaler Zellen gegenüber oxidativem Stress und seneszenzinduzierenden Reizen hinweist. Zusammenfassend etabliert diese Studie ein stabiles und reproduzierbares System für die Kultur und Modellierung primärer marginaler Mauszellen und bietet eine zuverlässige In-vitro-Plattform zur Untersuchung von Stria vascularis-Dysfunktion und verwandten Mechanismen.

Einleitung

Im auditiven System arbeiten verschiedene Gewebe innerhalb der Cochlea zusammen, um komplexe Schallwellen inelektrische Signale umzuwandeln. Die Stria vascularis reguliert die ionische Zusammensetzung der Endolymphe und erzeugt das endocochleare Potential (EP), wodurch die cochleare Homöostase erhalten bleibt und die normale Funktion der inneren und äußeren Haarzellen gewährleistet wird. Sie besteht aus drei unterschiedlichen Zelltypen: Randzellen, Intermediärzellen und Basalzellen. Marginale Zellen bilden eine polarisierte epitheliale Monoschicht, die direkt zur Endolymphe zeigt und durch enge Verbindungen versiegelt wird. Die basolaterale Membran der Randzellen ist mit zwei wichtigen Kaliumtransportern, Na⁺/K⁺-ATPase und NKCC1, angereichert, die an der Regulierung des Natrium- und Kaliumionentransports im stria vascularis beteiligt sind. Die Funktion von Na⁺/K⁺-ATPase ist nachweislich direkt mit dem EP 2,3 verbunden. Die KCNQ1/KCNE1 K⁺-Kanäle befinden sich an der apikalen Membran der Randzellen und erzeugen ein zusätzliches K⁺-Diffusionspotenzial, das zur Bildung des EP4 beiträgt. Randzellen sind mit mehreren kaliumbezogenen Proteinen angereichert und dienen als Kernzelleinheit, die das Kaliumrecycling in der cochlearen Endolymphe vorantreibt. Daher sind Randzellen die Schlüsselzellen, die für die Erzeugung und Aufrechterhaltung des EP verantwortlich sind.

Die Stria vascularis (SV) spielt nachweislich eine entscheidende Rolle bei der Entstehung mehrerer Erkrankungen, die mit sensorineuralem Hörverlust (SNHL) assoziiert sind, darunter altersbedingten Hörverlust (ARHL), lärmbedingten Hörverlust (NIHL), erblichen Hörverlust (HHL) und drogeninduzierter Hörverlust (DIHL). Darüber hinaus haben mehrere andere Hörstörungen, wie Autoimmunerkrankungen im Innenohr (AIED), autoinflammatorische Innenohrerkrankung (AID) und Ménière-Krankheit (MD), obwohl sie sich verschieden, durch aktuelle Studien gezeigt, dass sie die SV in ihren zugrundeliegenden pathogenen Mechanismenbetreffen 5,6. Daher ist es unerlässlich, zuverlässige zelluläre Modelle zur Untersuchung der Pathogenese des Hörverlusts zu etablieren. Studien haben gezeigt, dass eine verringerte marginale Zelldichte als starker Prädiktor für die EP während der gesamten Mauslebensspanne dient, während die Atrophie der stria vascularis eine frühe charakteristische Läsion in ARHL 7,8 darstellt. In-vitro-Kultur von Randzellen kann ein zuverlässiges Modell zur Untersuchung der Pathogenese von ARHL und zur Untersuchung potenzieller therapeutischer Ziele liefern. Über ARHL hinaus haben neuere Studien eine hohe Korrelation und eine mögliche zugrundeliegende Beziehung zwischen der Stria vascularis und anderen auditiven Störungen gezeigt, was darauf hindeutet, dass in vitro marginale Zellmodelle breitere Anwendungen habenkönnten 5,9,10.

Diese Studie beschreibt ein Protokoll zur Dissektion und Kultivierung der Stria vascularis aus neonatalen Mauscochleae, gefolgt von der Reinigung marginaler Zellen mittels differenzialer Beschichtung, wodurch ein zuverlässiges zelluläres Modell für die Forschung an stria-vascularis-bezogenen Pathologien bereitgestellt wird.

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Protokoll

Die neonatalen Mauswelpen (P0-3) wurden von Biont bereitgestellt. Alle experimentellen Verfahren entsprachen den Richtlinien für die Pflege und Nutzung von Labortieren, die von den United States National Institutes of Health (NIH-Veröffentlichung, überarbeitet 2011) veröffentlicht und vom Tierethikkomitee des Renmin-Krankenhauses der Universität Wuhan (WDRM202400019) genehmigt wurden.

1. Sterilisation und Materialvorbereitung

  1. Bereiten Sie die Dissektionswerkzeuge vor, darunter zwei Paar Mikro-Dissektions-Zangen, ein Paar Standard-Pinzette, eine chirurgische Schere und ein Paar Mikro-Dissektionsschere. Sterilisiere alle Werkzeuge mit einem Autoklaven und trockne sie 4 Stunden lang in einem 60 °C Ofen.
  2. Bereiten Sie gemäß den Anweisungen des Herstellers 100 ml Epithelzellmedium-Tier (EpiCM-a) vor. Fügen Sie fetales Rinderserum (FBS), Epithelzellwachstumserum (EpiCGS-a) und Penicillin/Streptomycin-Lösung in das Basalmedium hinzu, um die Endkonzentrationen von 2 % FBS, 1 % EpiCGS-a und 1 % Penicillin/Streptomycin zu erreichen.
  3. Desinfizieren Sie die Stereomikroskop-Bühne und das Gehäuse mit 75 % Ethanol. Dann werden die autoklavierten Sektionswerkzeuge und das desinfizierte Mikroskop in einen biologischen Sicherheitsschrank gelegt. Setzen Sie alle Gegenstände 30 Minuten lang UV-Licht aus, um eine vollständige Sterilität zu gewährleisten, bevor Sie mit dem Dissektionsverfahren beginnen.

2. Dissektion und Isolierung des temporalen Knochens zur Sammlung von auditivem Epithel

  1. Euthanasie neonatale Mauswelpen (P0-3) nach 4 % Isofluran-Anästhesie, desinfizieren Sie mit 75 % Ethanol und führen Sie die Enthauptung auf Eis durch. Verwenden Sie bei Bedarf andere ethisch anerkannte Methoden.
  2. Kopf immobilisieren, die Kopfhaut entlang der sagittalen Naht mit einer Mikrodissektionsschere öffnen, die Kopfhaut beidseitig trennen und entfernen.
  3. Schneiden Sie den Kopf der neonatalen Maus entlang der Mittellinie mit einer Mikrodissektionsschere durch. Entfernen Sie das Gehirngewebe mit einer Pinzette, um die Schläfenknochen freizulegen (Abbildung 1A).
  4. Beobachten Sie beidseitige Schläfenknochen an der Schädelbasis, entfernen Sie andere unnötige Knochen und behalten Sie das Schläfenbeingewebe, das die Cochlea enthält (Abbildung 1B).
  5. Übertragen Sie ein Schläfenknochen in eine 35 mm dicke sterile Schale mit frischer Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) auf Eis.
  6. Übertragen Sie das andere Schläfenbein unter das Mikroskop, sichern Sie das Schläfenbeingewebe mit einer Zange und verwenden Sie ein weiteres Paar, um das Oberflächenmuskelgewebe stumpf zu dissektionieren, bis der weiße halbkreisförmige Hörknochenring sichtbar ist (Abbildung 1C). Nach Bestätigung der Cochlea-Position wird die stumpfe Sektion nach unten fortgesetzt, bis durchscheinendes Cochlea-Gewebe beobachtet wird (Abbildung 1D).
    HINWEIS: Die Schritte 2.6-2.7 sollten auf Eis ausgeführt werden.
  7. Mit einer Mikrodissektionszange wird vorsichtig ein kleines Stück der Knochenwand an der apikalen Kurve der Cochlea entfernt, eine Seite der Pinzette vorsichtig in die Cochlea eingeführt und die Knochenwand vom membranösen Labyrinth getrennt. Entfernen Sie die Knochenwand und verlängern Sie das membranöse Labyrinthgewebe in frischer Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) (Abbildung 1E).
  8. Sichern Sie die Basilarmembran mit einer Zange und trennen Sie vorsichtig die Stria vascularis mit einer weiteren Pinzette. Übertragen Sie es in ein 1,5 mL Mikrozentrifugenrohr mit 1 ml 1 mg/mL Kollagenase-Typ-II-Lösung auf Eis (Abbildung 1F).
  9. Wiederholen Sie die obigen Schritte, um die Stria vascularis von der anderen Seite zu entnehmen.

3. Enzymatische Disaggregation zur Gewinnung von marginalen Zellen der stria vascularis

  1. Inkubieren Sie das Mikrozentrifugenröhrchen mit dem entnommenen Gewebe in einer 1 mg/mL Kollagenase-Typ-II-Lösung bei 37 °C für 30 Minuten.
    HINWEIS: Die Kollagenase-Typ-II-Lösung wurde durch Verdünnung von Kollagen Typ II in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS; 2,7 mM KCl, 2,0 mM KH₂PO₄, 137 mM NaCl, 10 mM Na2HPO4) hergestellt.
  2. Zentrifugiere das Rohr bei 300 × g für 8 Minuten.
  3. Entfernen Sie vorsichtig das Überwasser. Fügen Sie 1 ml Kulturmedium hinzu, um die Verdauung zu beenden, triturieren Sie sanft, um die Zellen wieder zu suspendieren, und zentrifugieren Sie erneut bei 300 × g für 8 Minuten.
  4. Aspiriere das Supernatant und gib 1 ml frisches Kulturmedium dazu. Triturieren, um eine Einzelzellenaufhängung zu erhalten, die Federung auf ein 15-ml-konisches Rohr übertragen und zusätzliches Medium hinzufügen, um das Gesamtvolumen auf 10 ml anzupassen.
  5. Die Zellsuspension wird gründlich durch wiederholtes Pipettern gemischt und dann 1 ml der Suspension in jede Mulde einer 6-Well-Platte übertragen. Kultivieren Sie die Zellen in 2 ml DMEM, ergänzt mit 2 % FBS, 1 % EpiCGS-a und 1 % Penicillin/Streptomycin-Lösung bei 37 °C in einem 5 % CO2-Inkubator.
  6. Ersetze das Medium täglich und überwache den Zellstatus. Ein gruppiertes Wachstum von Randzellen kann typischerweise zwei Tage nach der Panzerung beobachtet werden.

4. Reinigung von Randzellen

  1. Am dritten Kulturtag beobachten Sie das Auftreten zahlreicher spindelförmiger Fibroblasten, die die kopfsteinartigen Randzellcluster umgeben (Abbildung 2B).
  2. Indem Unterschiede in den Adhäsionsraten genutzt werden, pipettieren Sie vorsichtig, um die spindelförmigen Fibroblasten teilweise zu entfernen. Mit einer 1-mL-Pipette spülen Sie die ausgewogene Salzlösung der D-Hanks vorsichtig über große Flächen in jedem der vier Quadranten. Überwachen Sie die Zellreinigung unter dem Mikroskop und passen Sie die Kraft und Richtung des Pipettierens entsprechend an. In der Regel wird das Flushing mit großen Flächen zweimal durchgeführt. Nach jeder Runde wird die Dichte der Fibroblasten mikroskopisch untersucht; Basierend auf diesen Beobachtungen wenden Sie lokales, sanftes Pipetieren auf dicht besiedelte Fibroblastenbereiche an, um eine spärliche und gleichmäßige Verteilung über die Kulturschale zu erreichen.
    HINWEIS: Eine angemessene Dichte an Fibroblasten wurde beibehalten, da vollständige Entfernung oder übermäßige Reinigung das Wachstum der Primärzellen einschränken kann. Wir empfehlen, ein ungefähres Verhältnis von 2:1 zwischen marginalen Zellen und Fibroblasten aufrechtzuerhalten.
  3. Die Reinigung wird eingestellt, wenn Fibroblasten unter mikroskopischer Untersuchung spärlich auf marginale Zellcluster verteilt erscheinen. Entfernen Sie das Supernatant und fügen Sie 2 ml frisches Kulturmedium hinzu, um die Kultivierung fortzusetzen.

5. Immunfluoreszenzfärbung

  1. Am zweiten Tag nach der Reinigung untersuchen Sie die Zellmorphologie unter dem Mikroskop. Bei Beobachtung einer ausreichenden Cellclusterbildung und angemessener Dichte aspirieren Sie Kulturmedium und waschen Sie die Zellen dreimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4).
  2. Stellen Sie Zellen mit 4 % Paraformaldehyd für 15 Minuten bei Raumtemperatur fest. Nach dem Entfernen der fixierenden Lösung die Zellen dreimal mit PBS waschen (5 Minuten pro Waschen).
  3. Permeabilizierte Zellen mit 0,5 % Triton X-100 für 15 Minuten. Entferne die Lösung und wasche die Zellen dreimal mit PBS (5 Minuten pro Waschen).
  4. Blockieren Sie Zellen mit PBS, das 10% Ziegenserum enthält, für 30 Minuten bei Zimmertemperatur.
  5. Inkubieren Sie Zellen über Nacht bei 4 °C mit einem Kaninchen-Antimaus-Anti-Maus-Antikörper CK18 (verdünnt 1:300 in PBS mit 3 % Ziegenserum) oder KCNQ1-Antikörper (G-8 verdünnt 1:100 in PBS mit 3 % Ziegenserum).
  6. Wasche die Zellen dreimal mit PBS (10 Minuten pro Waschen). Inkubieren Sie mit dem entsprechenden sekundären Antikörper (verdünnt 1:300 in PBS mit 3 % Ziegenserum) für 1 Stunde bei Zimmertemperatur.
  7. Sekundäre Antikörper entfernen und die Zellen dreimal mit PBS waschen (10 Minuten pro Wasch).
  8. Tragen Sie 1–2 Tropfen Antifade-Montagemedium mit DAPI auf Objektträger auf, montieren Sie Deckfolien und untersuchen Sie Proben mit einem konfokalen Laserscansystem.
    HINWEIS: Mit Ausnahme der Waschschritte wurden alle Inkubationslösungen, einschließlich Antikörper, in ausreichenden Mengen zugesetzt, um die Zellen vollständig zu bedecken.

6. H2O2 Behandlung und ROS-Färbung

  1. Nach 7 Tagen Kultur, wenn marginale Zellen eine konfluente Monoschicht gebildet haben, induzieren sie oxidativen Stress durch Behandlung mit 1 mM H2O2. Bereiten Sie die 1 mM Arbeitslösung vor, indem Sie die 30%ige H2O2-Lagerlösung 1:10000 in einem epithelellen Medium verdünnen. Inkubieren Sie die experimentellen Gruppen mit dieser Arbeitslösung, während die Kontrollgruppen ausschließlich mit Epithelzellen behandelt werden.
  2. Nach 16 Stunden Behandlung entfernen Sie das Medium vorsichtig und waschen Sie die Zellen mit PBS. Bewerten Sie die intrazellulären ROS-Werte in marginalen Zellen mit einem Reaktiv-Sauerstoff-Spezies-Assay-Kit gemäß dem Protokoll des Herstellers.
  3. Entfernen Sie das Kulturmedium, geben Sie dann verdünnten MitoTracker Red CMXRos (ein mitochondrienselektiver Farbstoff) und DCFH-DA zu den Zellen und inkubieren Sie bei 37 °C in einem Zellkulturinkubator für 30 Minuten.
  4. Waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS (jeweils 5 Minuten), montieren Sie die Deckblätter und beobachten Sie die Proben mit einem konfokalen Laserscanningmikroskop.

7. D-galaktose-Behandlung und SA-β-gal-Färbung

  1. Nach 7 Tagen Kultur, wenn marginale Zellen eine konfluente Monoschicht bilden, wurde D-galactose-Pulver in EpiCM – einem Medium – gelöst, um eine 40 mg/mL D-gal Arbeitslösung herzustellen. Inkubieren Sie experimentelle Gruppen mit dieser Lösung (2 ml pro Brunnen einer 6-Well-Platte, 48 H, bei 37 °C), um die zelluläre Seneszenz zu induzieren, während Kontrollgruppen nur mit demselben Volumen an Epi-Medium behandelt werden.
  2. Nach 48 Stunden Behandlung entfernen Sie das Medium vorsichtig und waschen Sie die Zellen mit PBS. Untersuchen Sie die zelluläre Alterung in Randzellen mit dem SA-β-gal Färbungsset gemäß den Anweisungen des Herstellers.
  3. Zellen mit fixierender Lösung für 15 Minuten bei Raumtemperatur fixieren. Nach dem Entfernen des Fixativs wasche die Zellen dreimal mit PBS (5 Minuten pro Waschen).
  4. Inkubieren Sie Zellen mit SA-β-gal Färbungsarbeitslösung, die 5 % X-Gal (1 ml pro Brunnen einer 6-Bohrloch-Platte) enthält, über Nacht bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator ohneCO2.
  5. Aufnahmen von SA-β-gal Färbung unter Hellfeldbeleuchtung mit einem Mikroskop.

8. Statistische Analyse

  1. Für Vergleiche zwischen H₂O₂-behandelten und Kontrollgruppen hinsichtlich der mittleren Immunfluoreszenzintensität der ROS-Färbung sowie zwischen D-Galactose-behandelten und Kontrollgruppen hinsichtlich des Anteils der SA-β-gal-positiven Zellen werden T-Tests nach Bewertungen von Normalität und log-Normalität durchgeführt.

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Ergebnisse

Wachstum und morphologische Eigenschaften kultivierter Zellen
Mit diesem Protokoll haben wir erfolgreich Primärkulturen von marginalen Zellen etabliert, die aus der Mauscochlea isoliert wurden. Am zweiten Tag der Kultur zeigte die Lichtmikroskopie, dass die Zellen am Substrat haftet hatten und begannen, Clusterkolonien zu bilden (Abbildung 2Aa). Am dritten Tag haben wir die Zellen gereinigt (Abbildung 2B). Na...

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Diskussion

Seit Jahrzehnten konzentriert sich die Forschung zum Hörverlust hauptsächlich auf die Rolle sensorischer Haarzellen und deren synaptische Verbindungen zu spiralförmigen Ganglienneuronen11. Zahlreiche veröffentlichte Studien widmen sich der Etablierung und Optimierung von In-vitro-Kulturmodellen von Haarzellen, die eine unverzichtbare Rolle bei der Untersuchung von Haarzellschäden, Regeneration und den Auswirkungen ototoxischerMedikamente...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass die Forschung keine kommerziellen oder finanziellen Interessenkonflikte aufweist.

Danksagungen

Wir danken der Abteilung für Hals-Nasen-Ohren-Ohren-Heilkunde des Renmin-Krankenhauses der Universität Wuhan (Wuhan, China) und dem Forschungsinstitut für Hals-Nasen-Ohren-Heilkunde des Renmin-Krankenhauses der Universität Wuhan (Wuhan, China) für ihre großzügige Unterstützung und Ermutigung. Diese Arbeit wurde von der National Health Service Center Construction and Incubation Foundation of China (ZX0000000037), der National Natural Science Foundation of China (81700916, 82301294), der Natural Science Foundation der Provinz Hubei (2017CFB242) und dem Scientific Research Project der Gesundheitskommission der Provinz Hubei (WJ2017Q005) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
15-mL ZentrifugenröhreServicebioEP-1501-JVerwendung für Kultur
35 mm ZellkulturschüsselNEST706001Verwendung für die Dissektion
4 % ParaformaldehydServicebioG1101Immunfluoreszierende Färbung
6-Well-PlatteServicebioCCP-6HVerwendung für Kultur
Alexa Fluor 488 – Konjugierter Ziegen-Anti-Kaninchen-AntikörperProteintechSA00013-2Immunfluoreszierende Färbung
Antifade-Montagemedium mit DAPIAbsinabs9235Immunfluoreszierende Färbung
Zellzähl-Kit-8BeyotimeC0037Verwendung für die Zellzählung
Kollagenase Typ IIBiosharpBS164Verwendung für Kultur
Konfokales Laser-ScansystemOlympus FV1200Immunfluoreszierende Färbung
DCFH-DAInvitrogenC2938ROS-Verfärbung
D-galSolarbioD8310Verwendung für die Zellmodellierung
EpiCM-a MediumSciencell4131Verwendung für Kultur
Feine PinzetteHeckantriebF11020-11Verwendung für die Dissektion
ZiegenserumBeyotimeC0265Immunfluoreszierende Färbung
H2O2MkbioMM0707Verwendung für die Zellmodellierung
Hanks ausgewogene Salzlösung (HBSS)BiosharpBL561AVerwendung für Kultur
IsofluraneHeckantriebR510-22-10Verwendung für die Dissektion
KCNQ1-Antikörper (G-8)Santa CruzSC-365186Immunfluoreszierende Färbung
MikroskopOlympus SZX7-1063Verwendung für die Dissektion
MikroskopOlympus IX71Verwendet zur Beobachtung der Ergebnisse der Immunfluoreszenzfärbung
MitoTracker Red CMXRosInvitrogenM7512ROS-Verfärbung
Neugeborene Mauswelpen (P0-P3)bereitgestellt von BIONT
PBSServicebioG4202Immunfluoreszierende Färbung
Rabbit Anti-Maus CK18 Monoklonaler AntikörperProteintech10830-1-APImmunfluoreszierende Färbung
Seneszenz β-Galactosidase-FärbekitBeyotimeC0602Alterungsfärbung
Triton X-100Sigma-AldrichX100Immunfluoreszierende Färbung

Referenzen

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