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Bewertung der Wirkung von Thymoquinon auf die Keap-1/Nrf-2-Signalübertragung, oxidativen Stress und das Verhalten bei Ratten

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DOI:

10.3791/69924

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13. März 2026

 , 
1Faculty of Medicine, Department of Physiology, Kirsehir Ahi Evran University, 2Faculty of Medicine, Department of Histology and Embryology, Kirsehir Ahi Evran University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll zeigt, wie man die Auswirkungen von Thymoquinon auf den Keap-1/Nrf-2-Weg, die Biomarker des oxidativen Stresses und die Verhaltensergebnisse in einem Rattenmodell der subchronischen Deltamethrin-Exposition bewerten kann.

Zusammenfassung

Jüngste Entwicklungen in der Forschung zur Pestizidexposition haben das Interesse an antioxidantien basierten Schutzstrategien gesteigert. Thymoquinon (TQ), eine pflanzlich abgeleitete bioaktive Verbindung, wurde berichtet, dass es schützende Wirkungen gegen verschiedene toxische Stoffe ausübt. Diese Studie beschreibt ein Protokoll zur Bewertung der Auswirkungen von TQ auf oxidative Stressparameter, den Keap-1/Nrf-2-Signalweg und Verhaltensergebnisse bei Ratten, die niedrig dosiertem Deltamethrin (DTM) ausgesetzt waren. Hier wurden 24 adulte männliche Wistar-Albino-Ratten (250 ± 20 g) zufällig in vier Gruppen (n = 6/Gruppe) eingeteilt: Kontroll, TQ, DTM und DTM+TQ. DTM (1,28 mg/kg) und TQ (10 mg/kg) wurden 30 Tage lang intragastrisch verabreicht. Das Körpergewicht wurde während der gesamten Studie überwacht. Lokomotorische Aktivität und angstähnliches Verhalten wurden am 31. Tag mit dem Openfield-Test bewertet, und depressives Verhalten wurde am 32. Tag mit dem erzwungenen Schwimmtest bewertet. Am Ende der experimentellen Phase wurden Plasma und Hirngewebe für biochemische, histopathologische und molekulare Analysen gesammelt. Oxidative Stressmarker, darunter Malondialdehyd, Gesamtwerte an Stickstoffmonoxid, Glutathion und Sulfhydrylgruppen, wurden in Plasma- und Großhirnrindeproben gemessen. Kelch-ähnliche ECH-assoziierte Protein-1 (Keap-1) und nukleäre Faktor-2-bezogene Faktor-2-bezogene Expressionsniveaus wurden mittels Western-Blotting und Immunhistochemie analysiert. Dieses Protokoll bietet einen umfassenden und reproduzierbaren Ansatz zur Untersuchung von pestizidinduzierter Neurotoxizität und der modulatorischen Wirkung antioxidativer Verbindungen.

Einleitung

Insektizide werden in der Landwirtschaft und im häuslichen Umfeld weit verbreitet eingesetzt, um Schädlinge zu bekämpfen; Chronische Exposition gegenüber niedrigen Dosen kann jedoch zu Umweltkontaminationen und gesundheitlichen Auswirkungen sowohl bei Menschen als auch bei Tieren führen. Solche Expositionen, insbesondere durch kontaminierte Lebensmittel und Wasser, werden mit einem erhöhten Risiko für neurologische Erkrankungen und andere systemische Toxizitäten in Verbindung gebracht.

Pyrethroide haben Organophosphor-Insektizide weitgehend ersetzt, da strengere Vorschriften zu letzteren und ihre relativ geringere Säugetiertoxizität vergünstigt sind. DTM, ein Typ-II-Pyrethroid mit einer α-Cyano-Gruppe, gehört zu den weltweit am häufigsten verwendeten Insektiziden und gilt als äußerst wirksam gegen Insekten2. Trotzdem haben experimentelle Studien gezeigt, dass eine DTM-Exposition oxidativen Stress und Neurotoxizität in Tiermodellen 3,4 hervorruft.

DTM ist eine hochgradig lipophile Verbindung, die die Blut-Hirn-Schranke leicht durchdringt und die neuronale Funktion stört, indem sie die Öffnung spannungsgesteuerter Natriumkanäle verlängert. Dieser Effekt führt zu wiederholtem neuronalem Feuer, erhöhtem intrazellulärem Natriumzufluss und verstärkter Bildung reaktiver Sauerstoffspezies, was letztlich zu oxidativen Schäden, Entzündungen und Verhaltensänderungen führt, insbesondere in gefährdeten Hirnregionen wie Hippocampus und Großhirnrinde1. Angesichts der wachsenden Besorgnis über durch Pestizide induzierte Neurotoxizität richtet sich zunehmend die Aufmerksamkeit auf antioxidantienbasierte Schutzstrategien, die aus natürlichen Quellen abgeleitet sind. TQ, ein wichtiger bioaktiver Bestandteil des ätherischen Öls Nigella sativa, wurde als wirksam antioxidativ, entzündungshemmend und neuroprotektiv berichtet5. Mehrere Studien haben ihre positiven Wirkungen gegen chemisch induzierten oxidativen Stress und neurodegenerative Prozesse nachgewiesen 5,6,7,8,9.

Einer der Hauptmechanismen hinter den schützenden Effekten von TQ ist die Modulation des Keap-1/Nrf-2-Signalwegs. Dieser Weg spielt eine zentrale Rolle bei der Aufrechterhaltung der zellulären Redoxhomöostase, indem er die Expression von Antioxidantien und entgiftenden Enzymen reguliert. Unter oxidativen Stressbedingungen wird die durch Keap-1 vermittelte Repression von Nrf-2 gelindert, sodass Nrf-2 in den Kern translokieren und die von den Antioxidantien-Element-Elementen abhängige Genexpression9 aktiviert werden kann.

Da die DTM-Exposition Veränderungen auf molekularer, biochemischer, histologischer und verhaltensbezogener Ebene induziert, reicht ein einziger analytischer Ansatz nicht aus, um das volle Ausmaß ihrer neurotoxischen Effekte zu erfassen. Daher integriert dieses Protokoll Verhaltensbewertungen, Biomarker-Analysen von oxidativem Stress, histopathologische Bewertung und molekulare Untersuchung des Keap-1/Nrf-2-Weges, um einen umfassenden und reproduzierbaren Rahmen für die Untersuchung von pestizidinduzierten Neurotoxizität und den modulatorischen Effekten antioxidativer Verbindungen wie TQ zu schaffen.

Zusammenfassend unterstreicht die oben zusammengefasste Evidenz die Notwendigkeit eines integrierten experimentellen Ansatzes, um die Mechanismen der DTM-induzierten Neurotoxizität zu klären und potenzielle protektive Interventionen zu bewerten. Durch die Kombination von Verhaltensanalysen mit biochemischen, histopathologischen und molekularen Analysen des Keap-1/Nrf-2-Weges ermöglicht das vorliegende Protokoll eine multidimensionale Bewertung von oxidativ-stressbedingten neuronalen Schäden. Die Interpretation der experimentellen Ergebnisse innerhalb dieses mechanistischen Rahmens betont, wie TQ die Redox-Signalübertragung moduliert, Gewebeschäden abschwächt und die Verhaltensergebnisse im Kontext subchronischer DTM-Exposition verbessert.

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Protokoll

Das lokale Ethikkomitee für Institutionelle Tierversuche genehmigte das experimentelle Protokoll unter der Registrierungsnummer 68429034/35. Die Gesamtdauer der Studie betrug 32 Tage. Vor den Experimenten wurden die Tiere an die üblichen Laborbedingungen gewöhnt. Alle experimentellen Verfahren wurden in strikter Übereinstimmung mit institutionellen und internationalen Tierethikrichtlinien durchgeführt. Die in diesem Protokoll verwendeten experimentellen Materialien sind in der Materialtabelle aufgeführt.

HINWEIS: Chemische und biologische Abfälle wurden gemäß den Richtlinien für Laborsicherheit und Abfallmanagement der Institution entsorgt. Säuren, Basen und organische Lösungsmittel wurden in separaten, beschrifteten Behältern gesammelt und an die institutionelle Abteilung für gefährliche Abfälle geliefert. Biologische Materialien und kontaminierte Verbrauchsmaterialien wurden in Biogefährdungsbehältern gesammelt, sterilisiert und zur endgültigen Entsorgung in die zuständige Einrichtung gebracht.

1. Versuchsdesign

  1. Beziehen Sie 24 erwachsene männliche Wistar-Albino-Ratten mit einem Gewicht von 250 ± 20 g aus dem Tierversuchslabor. Jede Ratte einzeln in Käfigen bei 24 ± 2 °C in einem 12-Stunden-Hell/Dunkel-Zyklus unterzubringen, mit ad libitum Zugang zu Standardrattenfutter und Leitungswasser.
  2. Die Tiere werden zufällig in vier Gruppen eingeteilt (n = 6 pro Gruppe): Gruppe 1: Kontrolle (C), Gruppe 2: TQ, Gruppe 3: DTM, Gruppe 4: DTM + TQ.
  3. Lösen Sie DTM (98 % Reinheit) in Maisöl auf und geben Sie 30 Tage lang mit einer Dosis von 1,28 mg/kg über intragastrisches Gavage.
  4. Lösen Sie TQ in einer Dosis von 10 mg/kg in Maisöl auf und geben Sie es 30 Tage lang über intragastrisches Gavage. Bereiten Sie alle Medikamente täglich frisch vor und geben Sie sie mit einem Gesamtvolumen von 1 ml/kg.
  5. In der kombinierten Behandlungsgruppe wird TQ unmittelbar nach der DTM verabreicht. Geben Sie der Kontrollgruppe nur Maisöl, um Gavage-bedingten Stress zu berücksichtigen.
    HINWEIS: Die DTM-Dosis wurde auf Basis früherer Literatur ausgewählt, um oxidativen Stress auszulösen, ohne Morbidität zu verursachen, und entspricht etwa 1/100 des LD501.

2. Messung des Körpergewichts

  1. Messen Sie das Körpergewicht an den Tagen 1, 10, 20 und 30 der Studie (Abbildung 1).

3. Verhaltensparameter

  1. Führen Sie alle Verhaltenstests unter standardisierten Bedingungen durch, um Konsistenz sicherzustellen. Sowohl den Forced Swim Test (FST) als auch den Open-Field-Test (OFT) mit einer Überwachungskamera aufnehmen, die eine vollständige Sicht auf das Testgerät bietet. Halten Sie die Beleuchtung bei etwa 100–150 Lux. Definieren Sie Unbeweglichkeit als das Fehlen aktiver Bewegung, außer bei minimalen Bewegungen, die zur Aufrechterhaltung und Atmung erforderlich sind. Reinigen Sie alle Testbereiche zwischen Tieren mit 70 % Ethanol, um Riecheinflüsse zu vermeiden.
  2. FST
    1. Führe FST am 32. Tag durch, um depressives Verhalten zu beurteilen. Führen Sie 24 Stunden vor der 5-minütigen Testsitzung eine 15-minütige Vor-Testsitzung durch, um die Tiere an die Wasserumgebung zu gewöhnen und Neuheitsstress zu minimieren. Führen Sie während der Vor-Testsitzung keine Verhaltensbewertung durch.
    2. Geben Sie die Ratten einzeln in zylindrische Behälter (Durchmesser: 35 cm, Höhe: 50 cm) mit 30 cm Wasser, die bei 25 ± 1 °C für 5 Minuten gehalten werden.
    3. Zeichnen Sie Schwimmen, Klettern und Unbeweglichkeit mit einer Videokamera auf. Quantifizieren Sie Verhaltensparameter in Sekunden aus Videoaufnahmen10.
    4. Verhaltensweisen werden wie folgt definiert:
      Unbeweglichkeit: Betrachten Sie das Tier als unbeweglich, wenn es ohne aktive Bewegungen schwimmt, sodass nur minimale Bewegungen nötig sind, um seinen Kopf über Wasser zu halten.
      Schwimmen: Definieren Sie Schwimmen als aktive horizontale Bewegung durch den Zylinder mit koordinierten Bewegungen aller vier Pfoten.
      Klettern: Definieren Sie Klettern als kräftige, nach oben gerichtete Bewegungen der Vorderpfoten an der Zylinderwand, während das Tier in vertikaler Position bleibt.
    5. Wenn das Tier völlig regungslos bleibt, wird das Verhalten gemäß den vordefinierten Kriterien als Unbeweglichkeit bewertet.
    6. Wenden Sie während der Testsitzung keine äußere Stimulation oder Kurskorrektur an. Lassen Sie das Tier während des gesamten 5-Minuten-Zeitraums frei handeln, es sei denn, aus Sicherheitsgründen (z. B. Ertrinkungsgefahr) ist ein Eingreifen erforderlich.
  3. OFT
    1. Führen Sie am Tag 31 OFT durch, um die Bewegungsaktivität und angstähnliches Verhalten zu beurteilen11. Nehmen Sie einzelne Bewegungen für 5 Minuten in einer Arena von 90 x 35 cm auf, die durch schwarze Linien in 24 gleiche Einheiten unterteilt ist.
    2. Quantifizieren Sie die folgenden Verhaltensparameter anhand von Videoaufnahmen eines Forschers, der für die Gruppenzuweisung blind ist:
      Die Anzahl der Überquerungen mit allen vier Pfoten (Lokomotorik)
      Zeit, die man in den mittleren und peripheren Bereichen verbringt (angstähnliches Verhalten)
    3. Wenn ein Tier völlig regungslos bleibt, wird das Verhalten als Unbeweglichkeit notiert und für diesen Zeitraum null Kreuzungen zugewiesen.
    4. Wenden Sie während der Testsitzung keine äußere Stimulation, Umpositionierung oder Kurskorrektur an.
    5. Lassen Sie das Tier während der gesamten 5-minütigen Zeit frei handeln, es sei denn, aus Sicherheitsgründen ist ein Eingreifen erforderlich.
    6. Reinigen Sie die Arena mit 70 % Ethanol zwischen den Tieren, um Riechspuren zu vermeiden.

4. Bewertung von oxidativen Stressmarkern

  1. Führen Sie alle Eingriffe am 32. Tag durch. Ratten tief mit intramuskulärem Xylazin (5 mg/kg) und Ketamin (45 mg/kg) betäuben. Bestätigen Sie die tiefe Anästhesie durch das Fehlen des Pedalrückzugsreflexes. Nehmen Sie etwa 3–5 ml Blut durch Herzpunktion in EDTA-beschichtete Röhren ab.
  2. Vollständige Euthanasie durch Exblunation unter Tiefennarkose und Bestätigung des Todes vor Gewebeentnahme. Zentrifugieren Sie Blutproben bei 3.000 x g für 10–15 Minuten bei 4 °C. Sammeln Sie vorsichtig Plasma, ohne den Buffy-Mantel zu stören, und lagern Sie Aliquots bei −80 °C. Seziere das Gehirn schnell auf Eis. Trennen Sie die linke Gehirnhälfte und den Hippocampus für biochemische Analysen und frieren Sie in flüssigem Stickstoff (−80 °C Speicherung). Fixieren Sie die rechte Gehirnhälfte in 10 % neutralem gepuffertem Formalin zur histologischen Begutachtung.
  3. Plasma-oxidative Stressanalysen
    1. Plasma-Lipidperoxidation (TBARS-Assay)
      1. Zentrifugiere Plasmaproben (3.000 x g, 10 min, 4 °C). Mischen Sie 0,5 ml Plasma mit 1 ml TCA–TBA–HCl-Reagenz (15 % Trichloressigsäure (TCA), 0,375 % Thiobarbitursäure (TBA), 0,25 N Salzsäure (HCl)). Zentrifugieren Sie mit 1.000 x g für 10 Minuten und übertragen Sie das Überstandsmittel auf Glasröhren. Fügen Sie 50 μL 0,02 % butyliertes Hydroxytoluol (BHT) hinzu, um künstliche Oxidation zu verhindern.
      2. Erhitze bei 100 °C für 15 Minuten, kühle auf Zimmertemperatur ab, zentrifugiere bei 1.000 x g für 10 Minuten und messe die Absorption des Überstands bei 532 nm10. Berechnung der MDA-Konzentration mit dem Beer–Lambert-Gesetz
        ε = 1,56 × 105 M⁻1 cm⁻1, l = 1 cm und wird als nmol/mL Plasma ausgedrückt.
    2. Plasma-Thiol (RSH)-Spiegel
      1. Mischen Sie 0,5 ml Plasma mit einem Tris-HCl-Puffer (100 mM, pH 8,2), der 1 % Natriumdodecylsulfat (SDS) und 2 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) enthält. Inkubieren Sie 5 Minuten bei 25 °C und zentrifugieren (3.000 x g, 10 min, 4 °C). Verwenden Sie das Supernatant für die Analyse.
      2. Fügen Sie 0,3 mM 5,5′-Dithiaobis-(2-Nitrobenzoesäure) (DTNB) hinzu und inkubieren Sie bei 37 °C für 15 Minuten. Misse die Absorption bei 412 nm10. Berechnen Sie RSH-Konzentrationen mit ε = 13.600 M⁻1 cm⁻1 und drücken Sie sie als μmol/L-Plasma aus.
    3. Plasma-NOx-Spiegel (Griess-Reaktion)
      1. Deproteinisiere Plasma mit 0,3 m Natriumhydroxid (NaOH) und 5 % Zinksulfat (ZnSO₄). Zentrifugiere mit 20.000 x g für 5 Minuten und sammle das Supernatant.
      2. Stellen Sie Nitratbestandlösungen (100, 10 und 1 mmol/L) vor und erzeugen Sie eine Standardkurve (1–100 μmol/L). Laden Sie 100 μL Supernatant (doppelte Bohrungen) in eine Mikroplatte ein.
      3. Fügen Sie 100 μL Vanadium(III)-Chlorid (VCl₃) hinzu, gefolgt von 50 μL Sulfanilamid und 50 μL N-(1-Naphthyl)-Ethylendiamin. Inkubieren Sie 30–45 Minuten bei Raumtemperatur und messen Sie die Absorption bei 540 nm10. Bestimmen Sie die NOx-Konzentrationen aus der Standardkurve und drücken Sie sie als μmol/L-Plasma aus.
  4. Gewebe-oxidative-Stress-Analysen
    1. Verwenden Sie für alle biochemischen Analysen etwa 100 mg Gewebe der linken Gehirnhemisphäre.
    2. Gewebelipidperoxidation (TBARS-Assay)
      1. Homogenisiere das Gewebe (1:10 W/V) bei eiskalten 10% TCA. Fügen Sie ein gleiches Volumen von 0,67 % TBA hinzu und erhitzen Sie 15 Minuten bei 100 °C. Kühlen und zentrifugieren (3.000 x g, 10 min, 4 °C). Misse die Überschussabsorption bei 535 nm. Berechnen Sie MDA mit ε = 1,56 × 105 M⁻1 cm⁻1 und drücken Sie es als nmol/g Nassgewebe aus.
    3. Gewebeglutathion (GSH)-Spiegel
      1. Homogenisiere Gewebe mit 10 % TCA (1:10 w/v) und Zentrifuge (3.000 x g, 10 min, 4 °C). Mischen Sie 0,5 ml Supernatant mit 2 ml DTNB-Lösung (0,4 mg/mL in 1% Natriumcitrat)10. Misse sofort die Absorption bei 412 nm. Berechnen Sie GSH mit ε = 13.600 M⁻1 cm⁻1 und drücken Sie es als μmol/g Nassgewebe aus.
    4. Gewebe-NOx-Spiegel (Griess-Reaktion)
      1. Homogenisiere das Gewebe in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) (1:5 w/v) und Zentrifuge (2.000 x g, 5 min). Supernatant deproteinisieren mit 0,3 m NaOH und 5 % ZnSO₄. Zentrifugiere (3.000 x g, 20 min) und sammle das klare Supernatant.
      2. Stellen Sie Nitratstandards (1–100 μmol/L) vor. Lade 100 μL Supernatant in doppelte Bohrlöcher auf. Fügen Sie VCl₃ und Griess-Reagenzien wie oben beschrieben hinzu. Inkubieren Sie 45 Minuten bei 37 °C und messen Sie die Absorption bei 540 nm10. Bestimmen Sie die Konzentrationen aus der Standardkurve und drücken Sie sie als μmol/g Gewebe aus.
        VORSICHT: Verfahren mit gefährlichen Chemikalien, einschließlich TCA, HCl, NaOH und organischen Lösungsmitteln, wurden in einem zertifizierten chemischen Abzugshaube durchgeführt. Geeignete persönliche Schutzausrüstung (PSA) wie Laborkittel, chemikalienresistente Handschuhe, Schutzbrillen und, wenn nötig, Gesichtsschutzschilde, wurden in allen Experimenten verwendet. Alle Chemikalien wurden gemäß institutionellen Sicherheitsrichtlinien und relevanten Materialsicherheitsdatenblättern (MSDS) behandelt.

5. Bestimmung der Keap-1- und Nrf-2-Werte durch Western-Blot-Analyse

  1. Schneiden Sie das Hippocampusgewebe in 50 mg Stücke und legen Sie es in Homogenisierungsröhrchen mit 500 μL RIPA-Puffer, ergänzt mit einem Proteaseinhibitor-Cocktail.
  2. Fügen Sie eine passende Menge magnetischer Perlen hinzu und homogenisieren Sie bei 1.000 x g für zwei Zyklen. Zentrifugiere bei 14.000 x g für 10 Minuten bei 4 °C.
  3. Übertrage den Überstandsstoff in reinigende Mikrozentrifugenröhren und zentrifugiere erneut unter denselben Bedingungen. Bewahren Sie Proben auf Eis und bestimmen Sie die Proteinkonzentrationen.
  4. Messen Sie die Proteinkonzentrationen mit einem Fluorometer und dem Protein BR Assay Kit und folgen Sie den Anweisungen des Herstellers.
  5. Bereiten Sie 10% SDS–PAGE-Gele für die Elektrophorese vor. Stellen Sie die Proteinkonzentration auf 30 μg/μL an.
  6. Fügen Sie 4x Laemmli-Puffer im Verhältnis 3:1 hinzu und ergänzen Sie 10 % β-Mercapptoethanol. Proben bei 95 °C 5 Minuten erhitzen, dann kurz zentrifugieren.
  7. Lade 5 μL Proteinmarker und 30 μg Protein pro Lane ein. Gels bei 110 V für 60–90 Minuten ausführen.
  8. PVDF-Membranen in 100 % Methanol für 3–5 Minuten aktivieren, dann in 1 × Transferpuffer bei Raumtemperatur 10 Minuten ausgleichen, bevor sie übertragen werden.
  9. Nassfilterpapier und Schwämme mit Transferpuffer und Zusammenbau des Transfersandwiches sorgfältig, um die vollständige Entfernung von Luftblasen sicherzustellen. Führen Sie einen Proteintransfer mit einem Nasstransfersystem bei 100 V für 90 Minuten bei 4 °C (konstante Spannung) durch.
  10. Blockieren Sie Membranen mit 3 % Rinderserumalbumin (BSA) für 1 Stunde bei Raumtemperatur auf einem Orbitalshaker. Membranen über Nacht bei 4 °C inkubieren, wobei primäre Antikörper in 3 % BSA verdünnt sind (Keap-1 und Nrf-2, 1:3.000; β-Aktin, 1:1.000).
  11. Wasche die Membranen 5x für 5 Minuten mit 1 × Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit 0,1 % Tween 20 Waschmittel (TBS-T). Inkubieren Sie mit einem sekundären Antikörper (1:15.000) für 1 Stunde bei Raumtemperatur im Dunkeln.
  12. Waschmembranen wie beschrieben und inkubieren Sie mit einem Enhanced Chemiluminescence (ECL)-Substrat (z. B. luminolbasiertem HRP-Substrat) gemäß den Anweisungen des Herstellers (gleichmäßige Mengen von Reagenz A und B unmittelbar vor der Verwendung mischen). Tragen Sie ausreichend Substrat auf, um die Membranoberfläche vollständig zu bedecken (ca. 1 ml pro Membran), und inkubieren Sie 1–2 Minuten bei Raumtemperatur.
  13. Detektieren Sie chemilumineszente Signale mit einem digitalen Bildgebungssystem, das zur chemilumineszenzen Detektion ausgerüstet ist (keine spezifische Anregungswellenlänge erforderlich, da Lichtemission aus der HRP-Luminol-Reaktion resultiert). Nehmen Sie Bilder mit automatischen Belichtungseinstellungen auf, wobei ungesättigte Bänder sichergestellt werden. Beibehalten Sie identische Belichtungsparameter für alle Proben innerhalb desselben Blecks.
  14. Führen Sie eine densitometrische Analyse mit Bildanalysesoftware unter identischer ROI-Auswahl, Hintergrundsubtraktion und Normalisierungsparameter durch. Normalisieren Sie die Bandintensitäten von Keap-1 und Nrf-2 auf das entsprechende Housekeeping-Protein β-Actin. Exportiere normalisierte Werte als .csv Dateien zur statistischen Analyse.

6. Histopathologische Analyse

  1. Fixiere die rechte Gehirnhälfte für 72 Stunden in 10 % neutralem Formalin. Dehydrieren Sie durch eine graduierte Ethanolserie (70 %–100 %), in Paraffin eingebettet und mit 5 μm Schnitt.
    Koronale Gehirnschnitte auf Niveau des hippocampusalen und entorhinalen Cortex gemäß den stereotaxischen Koordinaten definiert in Paxinos & Watson, The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates (Academic Press), erhalten. Verwenden Sie den interaktiven Ratten-Gehirn-Atlas-Viewer (https://labs.gaidi.ca/rat-brain-atlas, um die anatomische Lokalisierungzu überprüfen und zu verfeinern.
  2. Bereiten Sie vier aufeinanderfolgende koronale Schnitte (5 μm Dicke) aus paraffineingebettetem Hirngewebe mit Standard-histologischen Verfahren vor. Färben Sie die Schnitte mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) gemäß den konventionellen Protokollen12. Untersuchen Sie alle Objektträger unter einem Lichtmikroskop mit 200× Vergrößerung. Stellen Sie sicher, dass die histologische Untersuchung von einem verblindeten Prüfer durchgeführt wird, um den Beobachter-Biaszu minimieren.
    HINWEIS: Dieses Verfahren stellte einen einheitlichen anatomischen Vergleich zwischen den Gruppen sicher.
  3. Neuronalen Verlust, zelluläres Ödem, nukleare Pyknose, entzündliche Infiltration und Gefäßverstopfung in 10 zufälligen Feldern pro Abschnitt semiquantitativ beurteilen.
  4. Berechnen Sie die Durchschnittswerte für jeden Parameter pro Gruppe. Die Bewertungskriterien waren wie folgt: 0 (keine, <5 %), 1 (mild, <33 %), 2 (moderat, 33–66 %) und 3 (schwer, >66 %; Tabelle 1).

7. Immunhistochemische Analyse der Nrf-2- und Keap-1-Reaktivität im Hippocampus und Entorhinalkortex

  1. Bereiten Sie 5 μm dicke Abschnitte aus dem Hippocampus und dem entorhinalen Kortex vor und montieren Sie sie auf Glasobjektträgern.
  2. Deparaffinieren und rehydrieren Sie die Abschnitte, dann werden sie bei Raumtemperatur in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen.
  3. Inkubiere Abschnitte mit 3 % Wasserstoffperoxid für 5 Minuten, um die endogene Peroxidaseaktivität zu blockieren. Waschabschnitte mit PBS
  4. Führen Sie Antigenentnahme durch Erhitzen der Objektträger im Natriumcitratpuffer (pH 6,0) für 10–15 Minuten durch. Lass die Objektträger 30 Minuten abkühlen und wasche dann mit PBS.
  5. Inkubieren Sie erneut Abschnitte mit 3 % Wasserstoffperoxid für 15 Minuten, um eine vollständige Peroxidase-Hemmung sicherzustellen. Waschen Sie Abschnitte mit PBS.
  6. Trage eine Blocklösung für 10 Minuten auf, um das unspezifische Binden zu reduzieren. Inkubieren Sie die Abschnitte über Nacht bei 4 °C mit primären Antikörpern gegen Nrf-2 (1:100 Verdünnung) und Keap-1 (1:200 Verdünnung). Wasche die Abschnitte nach der Inkubation mit PBS.
  7. Inkubieren Sie Sektionen mit einem geeigneten sekundären Antikörper für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Waschen Sie Abschnitte mit PBS.
  8. Tragen Sie Streptavidin-Peroxidase auf die Abschnitte auf und inkubieren Sie 20 Minuten bei Raumtemperatur in einer befeuchteten Kammer (halten Sie eine relative Luftfeuchtigkeit von 95–100 % mit einer versiegelten Inkubationsbox mit feuchtem Filterpapier). Waschen Sie die Abschnitte nach der Inkubation mit PBS.
  9. Trage DAB-Chromogen auf und beobachte die Farbentwicklung unter einem Lichtmikroskop mit 100× Vergrößerung. Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie die Objektträger mit Leitungswasser abspülen.
  10. Gegenfärbe die Schnitte mit 1:9 verdünntem Hämatoxylin für 5 Minuten bei Zimmertemperatur. Gründlich mit PBS und destilliertem Wasser abspülen. Montiere die Abschnitte mit einem festen Montagemedium.
  11. Untersuchen Sie die gefärbten Schnitte unter einem Lichtmikroskop. Nehmen Sie Fotomikrographen mit ×400 Vergrößerung aus 16 repräsentativen Feldern pro Schnitt auf.
  12. Quantifizieren Sie die Immunreaktivität Nrf-2 und Keap-1 mit Bildanalysesoftware. Erfassen und analysieren Sie die quantifizierten Daten zur weiteren statistischen Bewertung.
  13. Für die immunhistochemische Analyse öffnen Sie die Bilder in ImageJ und kalibrieren Sie mit dem Set Scale-Werkzeug. Konvertiere alle Bilder in 8-Bit-Graustufen, um Intensitätsmessungen zu standardisieren. Definiere manuell Interessenbereiche (ROIs) für positiv gefärbte Bereiche und angrenzende Hintergrundbereiche und speichere sie im ROI-Manager.
  14. Quantifizieren Sie die Färbungsintensität mittels konsistenter H-DAB-Farbdekonklusion, gefolgt von identischen Schwellenwerten über alle Proben. Messen Sie den mittleren Grauwert, die optische Dichte und den Prozentsatz der positiven Fläche.
  15. Für zellbasierte Analysen segmentieren Sie die Schwellenwerte mit dem Watershed-Tool und quantifizieren positive Zellen mit Analyze Particles. Alle Daten wurden als .csv Dateien zur statistischen Analyse exportiert.

8. Statistische Analyse

  1. Führen Sie statistische Analysen mit SPSS Version 29.0 durch. Geben Sie die Rohdaten im Tab Datenansicht ein, wobei jede Zeile ein einzelnes Tier und Variablen im Reiter Variable View definiert sind; die experimentelle Gruppe wurde als kategoriale Variable kodiert (Control, TQ, DTM und DTM+TQ).
  2. Bewerten Sie die Datennormalität mit dem Shapiro–Wilk-Test, indem Sie Analysieren > Deskriptive Statistiken > Explore, Ergebnisvariablen der Abhängigenliste und Gruppe der Faktorenliste zuweisen und Normalitätsdiagramme mit Tests aktivieren. Für normal verteilte Variablen führen Sie Gruppenvergleiche mittels Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) über Analyze > Compare Means > One-Way ANOVA durch, wobei deskriptive Statistiken und Levenes Test für Homogenität der Varianzen unter Options aktiviert sind.
  3. Wenn ein signifikanter Haupteffekt festgestellt wurde, wenden Sie Tukeys Post-hoc-Test im Post-Hoc-Menü an, um paarweise Gruppenunterschiede zu identifizieren. Verwenden Sie Levenes Testergebnisse, um die Varianzhomogenität zu bestätigen (S. > 0,05).
  4. Für histopathologische Bewertungsdaten, die parametrische Annahmen nicht erfüllten, führen Sie eine nichtparametrische Analyse mit dem Kruskal–Wallis-Test durch, indem Sie Analysieren > nichtparametrische Tests > Legacy Dialogs > K Independent Samples auswählen, gefolgt von Dunns Post-hoc-Test mit Bonferroni-Korrektur unter Verwendung des nichtparametrischen Testmoduls Independent Samples.
  5. Exportieren Sie statistische Ausgaben und Zusammenfassungstabellen als .xls- oder .csv-Dateien, die Ergebnisse wurden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) ausgedrückt, und ein p-Wert < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

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Ergebnisse

Körpergewichtsmaße
Das Körpergewicht wurde an den Tagen 1, 10, 20 und 30 gemessen. Ratten in den C- und TQ-Gruppen zeigten über den experimentellen Zeitraum einen progressiven Anstieg des Körpergewichts, ohne signifikante Unterschiede zwischen diesen Gruppen am 30. Tag. Im Gegensatz dazu zeigten Ratten, die DTM ausgesetzt waren, eine signifikante Verringerung ihres Körpergewichts im Vergleich zu Kontrollen. Die gemeinsame Verabreichung von TQ schwächte den DTM-assozii...

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Diskussion

Diese Studie zeigt, dass subchronische orale Exposition gegenüber DTM bei Ratten konstante Verhaltens-, biochemische, molekulare und histopathologische Veränderungen auslöst und dass TQ diese Effekte effektiv abmildert, wenn es gleichzeitig verabreicht wird. Durch die Integration standardisierter Verhaltenstests mit oxidativem Stressprofiling, Signalweganalyse der Keap-1/Nrf-2-Signalübertragung und histopathologischer Bewertung bietet das Protokoll einen robusten und reproduzierbaren Rah...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte oder konkurrierende finanzielle Interessen.

Danksagungen

Diese Forschung erhielt keine externe Finanzierung.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
5,5'-Dithiobis (2-Nitrobenzoesäure)Thermowissenschaftlich   69-78-3 
Werkbankzentrifuge NF048Nü Ve43560
Beta_Actin ThermoFisher Scientific, Vereinigte Staaten7D2C10
BSA-Lösung  Proteintech, Vereinigte Staaten)66201-1-Ig
Butyliertes HydroxytoluolSigma Aldrich128-37-0
Dijital Homojenizatö r Daihan Scientifichttps://www.artlaboratuv
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