Methodenartikel

Multitierische Magnetresonanztomographie für Tumormessungen in Bauchspeicheldrüsenkrebs-Mausmodellen

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DOI:

10.3791/69927

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3. Februar 2026

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1Precision Health Program, Michigan State University, 2Department of Radiology, College of Human Medicine, Michigan State University, 3Veterinary Diagnostic Laboratory, College of Veterinary Medicine, Michigan State University, 4Institute for Quantitative Health Science and Engineering, Biomedical Imaging, Advanced Molecular Imaging Facility, Michigan State University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll verwendet ein Mehrkammerbett für die parallele Magnetresonanztomographie (MRT) von bis zu vier Tieren, um Pankreasadenokarzinom-Tumore in gentechnisch veränderten Mausmodellen nachzuweisen. Dieses multianimalische MRT-Protokoll ist schnell und kosteneffizient zur Erkennung und Messung von Tumoren, erleichtert die Tierselektion für präklinische Studien und die longitudinale Überwachung des Tumorwachstums.

Zusammenfassung

Fortschrittliche bildgebende Verfahren in vivo, wie die Magnetresonanztomographie (MRT), sind wesentliche Forschungsinstrumente, um Tumore in präklinischen Mausmodellen effektiv zu erkennen. Das MRT liefert detaillierte anatomische Informationen über Tumorstandort und -größe. Diese bildgebende Methode ist jedoch teuer und zeitaufwendig. Um diese Zugangsbarriere zu überwinden, ohne die Bildqualität zu beeinträchtigen, wurde ein Mehrtier-MRT-Protokoll implementiert. Dieses Protokoll verwendet einen Vierkammer-Betteinsatz, um hochauflösende multitierische anatomische MRT-Scans innerhalb einer einzigen Aufnahmesitzung zu erhalten. Das gleichzeitige Vorstellen mehrerer Mäuse reduziert Zeit und Kosten dieses Verfahrens. Dieses Protokoll beschreibt einen multitierischen MRT-Workflow, der darauf ausgelegt ist, die Effizienz der Tumorerkennung und der longitudinalen Tumorüberwachung in einem gentechnisch veränderten Kras-gesteuerten, p53-gelöschten (KPC) Mausmodell des pankreas-duktalen Adenokarzinoms zu erhöhen. Dieses gut etablierte, klinisch relevante KPC-Modell hat wertvolle Einblicke in die molekularen Mechanismen geliefert, die der Pankreaskarzinogenese zugrunde liegen, dem Tumorprogression und der Behandlungsresistenz. Als Proof-of-Concept wird dieses Protokoll angewandt, um den therapeutischen Nutzen des Standard-Chemotherapeutikums Gemcitabin im KPC-Modell zu validieren. Zukünftige Anwendungen dieses MRT-gesteuerten präklinischen Studiendesigns werden kurz diskutiert, um die therapeutische Wirksamkeit von Kombinationstherapien zu bewerten.

Einleitung

Das pankreatales Adenokarzinom (PDAC) bleibt eine der tödlichsten Malignitäten. Trotz moderater Verbesserungen im Überleben in den letzten Jahren liegt die 5-Jahres-Überlebensrate immer noch bei nur 13 %. In den meisten Fällen wird PDAC in einem fortgeschrittenen Stadium festgestellt, oft mit lokaler Invasion oder entfernten Metastasen, was die Behandlung erschwert. Die Krankheit ist biologisch vielfältig und gekennzeichnet durch hochinvasive Tumorzellen, ein dichtes desmoplastisches Stroma und eine schlechte Gefäßbildung 2,3,4. Diese komplexe Tumor-Mikroumgebung behindert weiterhin Bemühungen, die zellulären und nicht-zellulären Komponenten, die den Krankheitsverlauf beeinflussen, vollständig zu charakterisieren. Um dem entgegenzuwirken, werden effektive präklinische Modelle benötigt, die den menschlichen Krankheitsverlauf und die Desmoplasie eng nachahmen.

Eine Vielzahl von Mausmodellen kann verwendet werden, um die Biologie des Krebsverlaufs zu untersuchen und die Wirksamkeit neuartiger Therapeutikazu bewerten 5,6. Das KRas-gesteuerte genetisch veränderte Mausmodell (GEMM) entwickelt spontan Pankreastumore, die viele pathophysiologische und molekulare Merkmale des menschlichen PDAC 3,7,8,9,10,11 repapitulieren. Insbesondere das Kras-gesteuerte, p53-entfernte KPC-Modell (LSL-KrasG12D; p53lox/+; Pdx1-Cre) ist ein gut charakterisierter PDAC GEMM 7,8,9. Die Tumorbildgebung ist ein wichtiger Bestandteil präklinischer Studien. Die Tumorerkennung und Messung der Tumorgröße ermöglichen die Auswahl von Tieren für präklinische Studien, die longitudinale Überwachung des Tumorwachstums und Krankheitsverlaufs sowie die Bewertung der Behandlungsreaktion.

Fortschrittliche in vivo bildgebende Verfahren wie Ultraschallbildgebung (US), Biolumineszenz (BLI), Computertomographie (CT), Fluoreszenztomographie (FLI), Positronenemissionstomographie (PET) und Magnetresonanztomographie (MRT) können für die Tumorbildgebung im KPC-Modell und ähnlichen PDAC-Modellen 12,13,14,15,16 verwendet werden. Dennoch kann die Tumorbildgebung im KPC-Modell herausfordernd sein, und jede dieser Bildgebenden Modalitäten bietet einzigartige Stärken und Einschränkungen. Optische Bildgebende Technologien wie Biolumineszenz (BLI) und Ultraschallbildgebung (US) sind nicht-invasiv und kosteneffizient. Ihre begrenzte räumliche Auflösung, insbesondere bei inneren Organen, kann jedoch zu einer schlechten Korrelation mit Tumorvolumen 12,15,17,18 führen. Biolumineszenz erfordert genetisch veränderte Zellen, die das Luciferasesignal ausdrücken, was ebenfalls von der Substratabgabe, dem Blutfluss und der Sauerstoffversorgung des Gewebes abhängt. Ein Computertomograph liefert schnelle Bildgebung mit minimalen Bewegungsartefakten, aber schlechten Weichteilkontrast ohne Kontrastmittel. Jodiertes Kontrastmittel kann bei Mäusen zu Toxizität führen. Fluoreszenzbildgebung erfordert Kontrastmittel/fluoreszierende Sonden, und Autofluoreszenz von Bauchorganen verringert die Empfindlichkeit.

Aufgrund der Einschränkungen anderer bildgebender Verfahren gilt die Magnetresonanztomographie (MRT) allgemein als die zuverlässigste Methode zur Beurteilung tief sitzender Tumore und bietet einen überlegenen Weichteilkontrast und eine molekulare Sensitivität für innere anatomische Strukturen 13,14,15,19. Standard-präklinische MRT-Protokolle verursachen jedoch hohe Betriebskosten und lange Aufnahmezeiten und können für viele Forschungslabore ein Hindernis darstellen. Ein MRT mit mehreren Tieren kann diese Zugangsbarriere überwinden, indem die Vorbereitungszeit vor dem Scan (Anästhesie), die Scanzeit und die Genesung des Tieres nach dem Scan reduziert werden. Dieses Protokoll zeigt die technische Machbarkeit der PDAC-Tumorbildgebung (Abbildung 1, Abbildung 2, Abbildung 3 und Abbildung 4) sowie die Verwendung von Bildergebnissen zur Rekrutierung von Tieren für eine Chemotherapie mit Gemcitabin (Abbildung 5). PDAC-Tumore weisen mehrere inhärente Mechanismen auf, die zur Resistenz gegen Standardbehandlungs-(SOC)-Chemotherapien beitragen. wie zum Beispiel Gemcitabin, Gemcitabin/NAB-Paclitaxel oder FOLFIRINOX 2,3,4. Dieses Protokoll bietet eine geeignete und robuste Plattform, um neue therapeutische Wirkstoffe und SOC-Chemotherapie zu bewerten, um vielversprechende Kombinationen zu finden, die die Behandlungsansprache bei Patienten verbessern könnten.

Protokoll

Alle beschriebenen Experimente wurden gemäß Protokollen durchgeführt, die vom Institutional Animal Care and Use Committee der Michigan State University genehmigt wurden. Alle Verfahren mit lebenden Tieren entsprechen festgelegten Richtlinien zur Sicherstellung des Wohlergehens und der humanen Behandlung der Tiere. Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung und Behandlung des KPC-Mausmodells von PDAC: LSL-K-Ras G12D (Krastm4Tyj); p53lox/lox (Trp53tm1Brn); Pdx1-Cre (Pdx1-cre6Tuv)9.

1. Vorabbildung von Tieren

  1. Stellen Sie vor der Verwendung eine ordnungsgemäße Genotypisierungsverifikation der KPC-Mäuse sicher. Transportieren Sie Versuchsmäuse von der Tieranlage zur Bildgebungsanlage.
  2. Betäuben Sie bis zu vier Mäuse in einer vorgewärmten, versiegelten Induktionskammer mit 1,5–2 % Isofluran und 0,8–2 L/min Sauerstoff. Bestätigen Sie die Anästhesie durch Anwendung eines schädlichen Reizes (Zehenkneifen).
  3. Tragen Sie auf beide Augen jeder Maus ein Augenmittel auf, um eine Hornhauuttrocknung zu verhindern.

2. Mehrtier-MRT-Bett-Aufbau

  1. Setzen Sie zwei betäubte Mäuse in eine ventrale Position auf den unteren Teil (links und rechts) des 3D-gedruckten Betteinsatz, der am vom Hersteller bereitgestellten Standard-Einzelratte-PET/MRI-Scannerhalter befestigt ist. Stellen Sie sicher, dass die Tiere mit geraden Stacheln und Gliedmaßen positioniert sind.
    HINWEIS: Ein 3D-Drucker wurde verwendet, um die Betteinsätze zu drucken (Supplemental File 1 und Supplemental File 2).
  2. Verbinden Sie den Lufteingang im Herstellerbett mit den Nasenkegeln über Schläuche (Innendurchmesser 1/16", Außendurchmesser 1/8") und Lockenanschlüsse (z. B. 7 x 1/16"-Stecker, 2 x 1/16" Weibchen, 2 Stecker-Stecker, 2 T-Steckdosen-Stecker).
  3. Sichern Sie den Mauskopf in einem Nasenkegel, um die Anästhesie aufrechtzuerhalten (1,5–2 % Isofluran, 0,8–2 L/min Sauerstoff). Bedecken Sie den unteren Teil mit der Oberseite der 3D-gedruckten Betteinsätze (Abbildung 2B).
  4. Legen Sie die anderen beiden betäubten Mäuse in eine ventrale Position oben (links und rechts) des 3D-gedruckten Betteinsatzes.
  5. Sichern Sie den Mauskopf in einem Nasenkegel, um die Anästhesie aufrechtzuerhalten (1,5–2 % Isofluran, 0,8–2 L/min Sauerstoff).
  6. Kleben Sie das Atemüberwachungspad an die Maus oben links. Stellen Sie sicher, dass das Überwachungspad auf Bauchhöhe und nicht auf Brusthöhe liegt, um die Atmung ohne Signal des Herzschlags zu messen.
  7. Stellen Sie den Isofluranspiegel so ein, dass während des gesamten Scans eine Atemfrequenz von 30–40 bpm gehalten wird, typischerweise 1,5–2 %. Wenn die Atemspur nicht sichtbar ist oder die Amplitude zu gering ist, achte darauf, dass das Pad durch das Klebeband sicher fixiert ist und alle Verbindungen im Schlauch fest sitzen.
  8. Decken Sie das Bett ab, um die Mehrtier-MRT-Kammer abzuschließen (Abbildung 2B).
    HINWEIS: Das vom Hersteller bereitgestellte Einzelratte PET/MRI-Bett ist mit zirkulierender warmer Luft ausgestattet, um die Körpertemperatur der Tiere (~35-37 °C) zu halten. Bis zu vier Mäuse können gleichzeitig mit 3D-gedruckten Einsätzen gescannt werden. Die genauen Einstellungen der Warmwassertemperatur sowie der Luftein- und Luftablassraten hängen von der jeweiligen Einrichtung ab, einschließlich des Abstands vom Leitraum zum MRT. Diese können an jedem Standort mittels einer Reihe von Pilotscans eingerichtet werden, bei denen die Temperatur während der gesamten Messung überwacht und dann für jede Studie standardisiert wird.

3. Presscan-Aufbau und Bildgebungskalibrierung

  1. Stellen Sie sicher, dass die Mäuse längs in der Mitte der MRT-Spule liegen, indem Sie den roten Laser mit der Mitte des Mehrkammerbetts ausrichten, bevor Sie den Betthalter in die Bohrung schicken.
  2. Weisen Sie dem Scan ein Etikett mit der Maus-ID und dem Scan-Datum im folgenden Format zu: Strain, Maus-ID, Scan-Datum.
  3. Richten Sie einen T1-gewichteten FLASH-Scan mit einem axialen Schnitt, zwei koronalen Schnitten und zwei sagittalen Schnitten ein, um die Mäuse im Vierkammerbett zu visualisieren und den Bildgebungsbereich mit folgenden Einstellungen zu definieren: TR/TE 50/2,4 ms, 2 Durchschnitte, Drehwinkel 20°, Auflösung 0,313 mm, 1 mm Schnittdicke, Scanzeit 13 s.
  4. Überprüfen Sie, dass der gesamte Mauskörper im Sichtfeld ist und die Mäuse gerade stehen. Falls nicht, wiederhole die Schritte zur Mauspositionierung und/oder bewege das Mausbett in oder aus dem Lauf.
    HINWEIS: Diese Parameter basierten auf den Spezifikationen des verwendeten MRT-Systems. Diese Parameter können bei Bedarf angepasst werden, um die Bildaufnahme entsprechend den experimentellen Anforderungen und/oder den Fähigkeiten des MRT-Systems zu optimieren.

4. Multianimalische Magnetresonanztomographie

  1. Richte die T2-gewichtete schnelle Spin-Echosequenz mit folgenden Parametern ein: Wiederholungszeit (TR): 3.200 ms, Echo-Zeit: 46 ms, Anzahl der Durchschnitte: 10, In-Plane-Auflösung: 300 x 300 μm, Anzahl der koronalen Schnitte: 14, Intraslice-Lücke: 0,3 - 0,7 mm, Fettunterdrückung: aktiviert, Seltener Faktor: 8, Schnittpakete: 2, Gesamtaufnahmezeit: 14 Min.
  2. Klicken Sie auf die Mitte (Translation) und die Kante (Rotation) der gelben und grünen Boxen auf dem Localizer-Bild, um die Positionierung des Schnittpakets nach Bedarf anzupassen und so die Abdeckung der Bauchspeicheldrüsenregion und anderer Bauchorgane für die obere und untere Tiergruppe zu optimieren.
  3. Bestätigen Sie, dass alle vier Mäuse im Multi-Tier-Bett korrekt ausgerichtet sind, bevor Sie mit dem Scannen beginnen.
  4. Überwachen Sie die Atmung während der Bildaufnahmen und passen Sie bei Bedarf den Isofluranspiegel an.
  5. Nach Abschluss des MRTs prüfen Sie, ob die Bildqualität ausreichend ist. Achten Sie auf ein Bewegungsartefakt, das als Unschärfe angezeigt wird, wenn sich eine Maus während des Scans bewegt hat. Überprüfen Sie die vollständige Abdeckung des Bauches. Wenn nötig, positioniere die Mäuse neu und mache den Scan erneut.

5. Maus-Wiederherstellung

  1. Wenn der Scan abgeschlossen und überprüft ist, entferne das Bett aus dem MRT-System.
  2. Öffne die Oberseite des Mehrkammerbetts. Entferne den Atemmonitor von der linken Maus oben und übertrage die Tiere von oben und unten der 3D-gedruckten Einsätze in den Erholungs-Käfig.
  3. Setze die Tiere in einen Erholungskäfig über ein 37 °C Heizkissen zur Nachanästhesie-Erholung.
  4. Überwachen Sie die Atemfrequenz und -bewegung, um eine vollständige Erholung von der Anästhesie sicherzustellen, bevor Sie Mäuse wieder in Heimkäfige zurückbringen. Anzeichen der Genesung sind normale Atmung und Bewegung (Gehen).

6. Magnetresonanzbild-Dateiverarbeitung und -analyse

  1. Exportiere die DICOM-Bilder aus der MRT-Software in ein Bildanalyseprogramm, um die Bilder von einem Bild mit vier Mäusen auf ein Bild für jede einzelne Maus zuzuschneiden.
  2. Öffne in der Software das Bild der obersten Tiergruppe im View-Modul . Die automatischen Fenster-/Pegeleinstellungen sind ausreichend, passen aber bei Bedarf im allgemeinen Bilddisplay-Kontrolltab an, sodass die Mäuse sichtbar sind. Im VOI-Tab zeichnen Sie manuell ein großzügiges Feld um die rechte Maus oben mit einem Würfel-Analyseobjekt; schneide dann das Bild um dieses Feld aus dem Tab Masking and Contouring Operations . Beim Speichern der neuen Datei werden die DICOM-Metadaten und der Dateiname auf die korrekte Maus-ID bearbeitet; Dann wiederhole ich das für die linke Maus oben mit demselben Bild, öffne das Bild für die unterste Mäusegruppe und wiederhole das ROI-Zuschneiden und Speichern.
    HINWEIS: Das VOI muss nicht präzise sein.
  3. Verwenden Sie MRI-Viewer-Software, um Bilder zu analysieren, die in DICOM-Dateien gespeichert sind.
  4. Analysieren Sie bildgebende Schnitte von dorsal nach ventral oder ventral nach dorsal. Lokalisieren Sie Milz und Magen, um einen geeigneten Kontext für die Identifizierung von Bauchspeicheldrüsen- und/oder Bauchspeicheldrüsentumoren zu schaffen.
  5. Definieren Sie "Region of Interest" (ROI), indem Sie eine Linie an der Tumorgrenze ziehen und eine halbautomatisierte Segmentierung zur Berechnung des Tumorvolumens durchführen. Beachten Sie Flüssigkeitszysten und andere hyperchromatische Befunde (Abbildung 3 und Abbildung 4).
    HINWEIS: Ein MRT-Viewer sollte verwendet werden, um DICOM-Dateien zu analysieren.

7. Gemcitabin-Behandlung

  1. Führen Sie wöchentlich MRT-Scans von KPC-Tieren durch, bis sich der Tumor bildet und nachweisbar ist (Volumen ≥20 mm3). Vor dem Scannen sollten Sie sicherstellen, dass Mäuse gesund sind (kein übermäßiger Gewichtsverlust oder Anzeichen von Stress, Atembeschwerden und/oder Keuchen).
  2. Richten Sie ein Behandlungsprogramm ein, sobald die Tumorkriterien erfüllt sind.
    HINWEIS: Für die behandelte Gruppe wurde Gemcitabin intraperitoneal (i.p.) in einer Dosis von 100 mg/kg zweimal pro Woche injiziert.
    VORSICHT: Gemcitabin ist ein zytotoxisches chemotherapeutisches Wirkstoff. Behandeln Sie sie mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (PSA), einschließlich Handschuhen und einem Laborkittel. Entsorge kontaminierte Spritzen und Materialien gemäß institutionellen Protokollen für gefährliche Abfälle.
  3. Führe einmal pro Woche MRT-Scans (nach Abschnitten 1-6) durch, um die Tumorreaktion auf Gemcitabin zu überwachen.
  4. Opfern Sie Tiere, wenn der Tumor die Euthanasiekriterien erfüllt, basierend auf Volumenmessungen aus MRT-Analyse (Abschnitt 6) und/oder anderen Symptomen.
  5. Bei MRT-Untersuchungen behandelter Mäuse wird eine Schutzbarriere aufgesetzt, um die mögliche Übertragung des chemotherapeutischen Mittels durch Ausscheidungen zu verhindern. Während und nach der Arbeit mit Gemcitabin sollten Sie gute persönliche Hygiene einhalten. Entsorgen Sie benutzte leere Spritzen in einem Chemotherapie-Scharfbehälter.
  6. Nach Abschluss der Arbeiten sprühen Sie alle Anästhesiegeräte, MRT-Betten und alle Arbeitsflächen mit 70 % Ethanol. Lege chemisch kontaminierte Schutzbarrieren und Handschuhe, die während der Bildnahme verwendet werden, in eine Plastiktüte, binde die Tüte ab und lege sie in ein Faserfass zur Verbrennung.
  7. Planen Sie vor der nächsten Behandlungsrunde bildgebende Sitzungen, um die Exposition gegenüber dem Chemotherapeutum zu minimieren.
    HINWEIS: Eine Häufigkeit von MRT-Scans alle zwei Wochen kann je nach Wachstumsrate des Tumors und Behandlungsplan in Betracht gezogen werden. Reaktionen auf die Behandlung durch Tumorkinetik können mittels längsschnittiger Bildgebung bewertet werden (Abbildung 5).

Ergebnisse

KPC-Tiere entwickeln Bauchspeicheldrüsentumoren nach der 12. Woche imAlter von 9 Jahren. Mit einem Mehrkammer-MRT-Bett wurde das Tumorscreening bei KPC-Mäusen im Alter von 10 Wochen eingeleitet. Dies ermöglichte die Rekrutierung von Tieren mit Tumoren von etwa 200 mm3 für die präklinische Studie mit der Gemcitabin-Behandlung. Unterschiede in der Tumorkinetik und Variationen in der Tumorpräsentation wurden beobachtet. Die meisten KPC-Tumore zeigten ein solides Wachstumsmuster mit einem einzigen oder überwiegenden Fokus (Abbildung 4A), was die Tierrekrutierung für Behandlungen und die Bewertung des Tumorvolumens erleichterte. Allerdings wurden auch Tiere mit mehreren kleinen, soliden Tumoren beobachtet, die sich über die gesamte Bauchspeicheldrüse ausgebreitet hatten (Abbildung 4A). Einige PDAC-Fälle können auch intratumorale, flüssigkeitsgefüllte zystische Läsionen aufweisen, begleitet von peritumoralen, nicht-neoplastischen zystischen Läsionen und Flüssigkeitseinlagerungen, die durch eine Ductalblockade der Gallenblase und/oder der Bauchspeicheldrüse entstehen. (Abbildung 4A).

Nach der Rekrutierung wurden die Tiere zufällig zwei Versuchsgruppen zugeteilt: einer Kontrollgruppe, die keine Behandlung erhielt, und einer behandelten Gruppe, die zweimal wöchentlich intraperitoneales (i.p.) Gemcitabin in einer Dosis von 100 mg/kg erhielt. Von insgesamt 23 geeigneten Tieren wurden 4 Weibchen und 7 Männchen der Kontrollgruppe zugeteilt, 6 Weibchen und 6 Männchen der behandelten Gruppe. Wöchentliche MRT-Scans wurden mit dem Multianimal-Bettsystem durchgeführt (Abbildung 5A), das es uns ermöglichte, die Veränderungen der Tumorwachstumskinetik sowohl in der Kontroll- als auch in der behandelten Gruppe kontinuierlich zu überwachen (Abbildung 5B).

Die verarbeiteten Bildgebungsdaten zeigen, dass Tumore im mit Gemcitabin behandelten KPC-Modell ein langsameres Wachstumsmuster aufwiesen als die unbehandelte Kontrollgruppe (Abbildung 5C), die mit einer statistisch signifikanten (Log-Rank-Test, p = 0,04) Erhöhung des Gesamtüberlebens der behandelten Kohorte assoziiert war (Abbildung 5D). Das mediane Überleben für unbehandelte KPC betrug 20 Wochen, während die behandelte Gruppe eine Verlängerung des medianen Überlebens von über 23 Wochen zeigte (Abbildung 5D).

Abbildung 1
Abbildung 1: Arbeitsablauf der multianimalischen Magnetresonanztomographieverfahren, Bildverarbeitung und -analyse. Wichtige Schritte des Multitier-MRT-Protokolls werden hervorgehoben – von der Prescan-Vorbereitung bis hin zu bildgeleiteten präklinischen Studien. Bis zu 4 Tiere werden in einer Induktionskammer (Prescan-Präparation) betäubt und für die Einlagerung in ein Mehrtierbett (Multitier-MRT-Bett-Setup) vorbereitet. Ein Prescan-Bild der Tiere in einer 2x2-Konfiguration (2 im oberen Bereich, 2 im unteren Bereich), gefolgt von einem Magnetresonanzscan (MR-Bildgebung). Die Bilddaten jedes Tieres werden als einzelne Dateien gespeichert und unabhängig analysiert (Bildanalyse). Bildfindung und Tumorgröße werden verwendet, um Tiere für präklinische Studien auszuwählen und die Behandlungsreaktion zu überwachen (präklinische Studien). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 2
Abbildung 2: Wichtige Schritte für das Mehrtier-MRT vom Aufbau bis zum Scan. (A) Oberes Panel, Zusammenbau des maßgeschneiderten Mehrtier-MRT-Bettsystems. Individuell entwickelte 3D-gedruckte Betteinlagen mit integrierten Anästhesieanschlüssen passen in einen standardmäßigen PET/MRT-Betthalter mit einer einzelnen Ratte. Im unteren Panel teilen diese 3D-gedruckten Einsätze das Bett in zwei Kammern und ermöglichen so eine gleichzeitige Abbildung von bis zu vier Tieren: Tier 1 und 2 auf dem oberen Einsatz und Tiere 3 und 4 auf dem unteren Einsatz. Die transversale Ebene und die frontale modifizierte Ebene der 3D-Drucker-Einsätze aus dem STL-Viewer werden gezeigt. (B) Fortlaufende Platzierung von Mäusen in ein Mehrkammer-MRT-Bett (von oben nach unten). Oberes Bild: Zwei Tiere, die in ventraler Position auf dem unteren Teil (links und rechts) des 3D-gedruckten Einsatzes platziert werden, der sich im vom Hersteller bereitgestellten PET/MRT-Bett befindet. Im mittleren Bild sind die anderen beiden Mäuse in ventraler Position auf dem oberen Teil (links und rechts) des 3D-gedruckten Einsatzes platziert; Die Maus, die auf der linken Seite des oberen Einsatzes positioniert ist, hat einen Atemmonitor befestigt. Unteres Bild: abgeschlossene Montage von vier Tieren mit dem Deckel oben. Alle Tiere haben Köpfe, die in einem Nasenkegel befestigt sind, um die Anästhesie aufrechtzuerhalten (1,5–2 % Isofluran, 0,8–2 L/min Sauerstoff). Endgültige Anordnung aller vier Tiere im MRT-Betthalter mit Anästhesie, Warmwasserbereiter und Vitalzeichenüberwachungssystem, um eine MRT-Untersuchung und Datenerfassung aller Tiere in einer einzigen Sitzung zu ermöglichen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 3
Abbildung 3: Datenerhebung und -verarbeitung aus Multitier-MRT-Scans. (A) Repräsentative Ansicht (mediale Ebene) der ersten MRT-Untersuchung aller vier Tiere. (B) MRT-Scan (Dorsalebene) aller vier Mäuse in einem Mehrkammerbett: zwei Mäuse unten (3, 4) und zwei Mäuse oben (1, 2) der 3D-gedruckten Einsätze. (C) Letzte hochauflösende MRT-Datei jedes einzelnen Mausscans. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 4
Abbildung 4: Verschiedene Präsentationen von PDAC-Tumoren: eine integrierte MRT- und Histologieanalyse. (A) Repräsentatives MRT-Bild (Dorsalebene), das die anatomische Variabilität von PDAC-Tumoren (von links nach rechts) veranschaulicht: normale Bauchspeicheldrüse, multifokale Tumore mit flüssigkeitsgefüllten zystischen Läsionen und solide Tumormasse. Anatomische Organe sind wie folgt farblich gekennzeichnet: Magen (gelb), Milz (grün), Tumor (lila), Flüssigkeitsansammlung durch Kanalverschluss (blau). Weißer Streifen = 1 cm. (B) Histologische Schnitte von H&E-gefärbten Tumoren neben Zellklassen basierend auf computerunterstützten, trainierten Klassifikator-Überlagerungen, die die histopathologischen Merkmale der mit den MRT-Befunden übereinstimmenden Tumoren hervorheben. Tumor (T)-Bereich schwarz umrandet für alle Proben, in denen der Tumor vorhanden ist. Die Zellklassen sind in Farbe dargestellt: normales Bauchspeicheldrüsengewebe (grau), Tumor (rot) und Immunzellen (gelb). Schwarzstufenleiste = 0,5 cm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 5
Abbildung 5: MRT-Anwendung für mehrere Tiere zur Tierrekrutierung und zur Überwachung des Tumorwachstums während der Gemcitabin-Behandlung. (A) Zeitplan des experimentellen Designs: Tiere (14+ Wochen alt) wurden rekrutiert, nachdem ein MRT einen Tumor ≥ 200 mm3 festgestellt hatte. Mäuse aus der behandelten Gruppe erhielten Gemcitabin (100 mg/kg, i.p., b.i.w.), bis sie die Euthanasiekriterien erreichten. Während des gesamten Experiments wurden Mehrtier-MRT-Scans für alle Tiere durchgeführt, um die Tumorwachstumskinetik zu überwachen. (B) Repräsentative MRT-Bilder (Dorsalebene), die den Tumorfortschritt für ein Tier aus dem unbehandelten und ein Tier aus der behandelten Gruppe vom Tag 0 bis zum letzten Tag des Experiments (Überlebensendpunkt) zeigen. Weiße Skalenleiste = 1 cm. (C,D) Diagramme, die die Tumorwachstumskinetik (C, n = 4 [2 F, 2 M] vs. 4 [2 F, 2 M]) und das Gesamtüberleben (D, n = 11 [4 F, 7 M] vs. 12 [6 F, 6 M]) in der Kontrollgruppe unbehandelter und behandelter Gruppe zeigen. Die statistische Signifikanz für Kaplan-Meier-Überlebenskurven wurde durch den Log-Rang-Test (Mantel-Cox) bestimmt (* p < 0,05). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Ergänzungsakte 1: STL-Datei für den 3D-Druck des unteren Einsatzes mit integrierten Anästhesieanschlüssen, die in eine Standard-Einzelratte PET/MRI-Betthalter passt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzungsakte 2: STL-Datei für den 3D-Druck des oberen Einsatzes mit integrierten Anästhesieanschlüssen, die in einen Standard-Einzelratten-PET/MRI-Betthalter passt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Dieses Protokoll verwendet ein vom Hersteller bereitgestelltes Standard-Einzelratte-PET/MRT-Bett, das mit maßgefertigten 3D-gedruckten Einsätzen modifiziert wird und das gleichzeitige Scannen von bis zu vier Mäusen ermöglicht (Abbildung 1). Diese Mehrtier-Konfiguration reduziert nicht nur die teure MRT-Scan-Zeit, sondern auch die Gesamtdauer des Verfahrens erheblich. Es ermöglicht die parallele Vorbereitung (Anästhesie, Positionierung im Bett und Bettverlegen), Scannen und Bergung von vier Tieren in einer Sitzung, verglichen mit der zusätzlichen Zeit, die für die Vorbereitung, Untersuchung und Bergung jedes Tieres einzeln in vier separaten Sitzungen benötigt wird. Das Setup umfasst außerdem individuelle Nasenkegel für die kontrollierte Anästhesieverabreichung an jedes Tier, eine spezielle Überwachung der Vitalität für ein Tier sowie integrierte Heizfunktionen zur Aufrechterhaltung der Körpertemperatur aller gescannten Mäuse (Abbildung 2). Die 3D-gedruckten Einsätze sorgen für eine einheitliche Ausrichtung der Tiere und verbessern die Segmentierungskonsistenz. Die Echtzeit-Atemüberwachung ermöglicht eine kontinuierliche Beurteilung und Anpassung der Anästhesie während des Scans und minimiert so Bewegungsartefakte.

Dieses Protokoll wurde verwendet, um den Fortschreiten von Pankreastumoren im KPC-Modell (Abbildung 5A-C), das mit dem Chemotherapeutum Gemcitabin behandelt wurde, zu erkennen und längszeitig zu überwachen, und diente als Proof-of-Concept-präklinische Studie. Gemcitabin ist allein oder in Kombination eine Erst- oder Zweitlinienbehandlung für Patienten mit lokalem oder metastasiertem Bauchspeicheldrüsenkrebs 28,29,30. Diese Ergebnisse bei mit Gemcitabin behandelten Tieren stimmen mit früheren Berichten überein, die ebenfalls einen Überlebensvorteil31 gezeigt haben. Wichtiger ist, dass dieses Protokoll eine geeignete und robuste Plattform bietet, um Kombinationstherapien neuer Therapeutika und SOC-Chemotherapie im KPC-Modell oder ähnlichen PDAC-Modellen zu untersuchen. Diese Kombinationstherapien können kleine Molekülinhibitoren, Immuntherapien, siRNAs, MikroRNA-Aktivitätsmodulatoren und andere therapeutische Oligonukleotide gegen wichtige molekulare Zieleumfassen 20,21,22,23,24,25,26,27 . Diese Kombinationstherapien können auch genetisch veränderte Ziele enthalten, um deren Interaktion mit SOC-Chemotherapie oder anderen Therapien in einem frühenEntwicklungsstadium zu verstehen. 9,20,32.

Obwohl der Schwerpunkt dieses Protokolls auf der Bildgebung der Bauchspeicheldrüse und anderer Bauchhöhlenorgane liegt, können dieses Multi-Tier-Protokoll und beschriebene MRT-Sequenzen zur anatomischen Charakterisierung anderer Mausmodelle von Krebs wie Brustkrebs und Glioblastom oder anderen Niere- und/oderLebererkrankungen verwendet werden. Wir kennen andere Protokolle, die Multitier-MRT18,34 beschreiben. Zum Beispiel beschrieben Dazai et al. neuroanatomische MRT-Scans von bis zu siebenMäusen 18. Während dieses Setup eine Gehirnbildgebung von sieben Tieren ermöglicht, ermöglicht es keine individuelle Kontrolle über Anästhesie und Temperatur für jede Maus. Ihre Gehäusekammer ist für Mäuse mit einem Gewicht von weniger als etwa 32 g konzipiert; Im Gegensatz dazu unterstützt unser Mehrkammerbett eine größere Bandbreite an Mäusekörpergrößen. Je nach beabsichtigtem Organ, Scanzeit und Auflösung kann das Protokoll von Dazai et al. einige Vorteile gegenüber dem hier beschriebenen Protokoll bieten.

Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte, die offengelegt werden müssen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde unter anderem durch den R01 CA258314 des National Cancer Institute und den MSU Tetrad Initiative for Interdisciplinary Research Grant 2024 für LFS unterstützt. Wir sind dem MSU Precision Health Program Tissue Analysis Core, dem Institute for MSU Quantitative Health Science and Engineering/Precision Health Program Advanced Molecular Imaging Facility, MSU Campus Animal Resources, MSU Veterinary Diagnostic Laboratory und dem MSU Quantitative Bio Element Analysis and Mapping (QBEAM) Center für ihre technische Unterstützung dankbar.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
3D-Drucker StratasysJ750 Für Multi-Tier-MRT-Betteinsätze
Gemcitabin HClApexBioA1402-500Für IP-Injektionen 
HOROSHOROShttps://horosproject.org/Für MRT-Analysen
IsofluraneCovetrus11695067772Für die Mausanästhesie
Isofluran-VerdampferSOMNI WissenschaftlichVS6002Für die Mausanästhesie
Low-Dose U-100 InsulinspritzenBD14-826-79Für IP-Injektionen 
Luer-Lockrohrkupplungen, Nylon-Geradestopfen, mit Widerhaken für 1/16" Rohrdurchmesser x7McMaster51525K521Für den Mehrtier-MRT-Bettaufbau
Luer-Verriegelungsrohrkupplungen, Stecker, für 1/16" Bardbed-Rohr-ID x2McMaster7466N11Für den Mehrtier-MRT-Bettaufbau
Männlicher zu männlicher Luer-Stecker X2SAIMMLFür den Mehrtier-MRT-Bettaufbau
MR-kompatibles Überwachungs- und Sperrsystem für kleine TiereSAIIModell 1030Tiere während der MRT überwachen
MRT-BettadapterBrukerT150743vom Hersteller bereitgestellte MRT-Bettkomponenten
MRT-Spule, 72 mm InnendurchmesserBrukerT20209V3vom Hersteller bereitgestellte MRT-Spule
Multimodale Wiege-MittelratteBrukerT151629vom Anbieter bereitgestellte MRT-Bett
ophthalmisches Schmiermittel&NBSP;Covetrus75848Zur Anwendung während der Anästhesie
ParaVision 360 SoftwareBrukerhttps://www.bruker.com/en/products-and-solutions/preclinical-imaging/paravision-360.htmlFür MRT-Analysen
PMOD 4.2Brukerhttps://www.bruker.com/en/products-and-solutions/preclinical-imaging/pmod.htmlFür MRT-Analysen
präklinisches MRT-System BrukerBioSpec 70/30Für das MRT
Stratasys Vero Clear HarzStratasysRGD810Für die Herstellung von Betten mit mehreren Tieren
Tee-Stecknuss-zu-Sockel-Stecker, Luer-Lock-Rohr x2McMaster51525K443Für das MRT-Bett mit mehreren Tieren & NBSP;
Rohr (Innendurchmesser 1/16", Außendurchmesser 1/8")BrukerT12330Für den Mehrtier-MRT-Bettaufbau

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