Automatisierte ultraverdünnte Messungen der Selbstassoziation zur Identifikation von Antikörpern mit günstigen Eigenschaften hochkonzentrierter Lösung

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir eine Hochdurchsatzanpassung eines Antikörper-Kolloidenstabilitätstests im großen Maßstab, um große Datensätze zu generieren und KI/ML-reife Entwicklungsvorhersagen zu unterstützen.

Zusammenfassung

Eine der größten Herausforderungen in der Antikörpertechnik ist die Entwicklung analytischer Screening-Methoden zur Bewertung der kolloidalen Stabilität, um sicherzustellen, dass Biologika für hochkonzentrierte Formulierung und Verabreichung geeignet sind. Die ladungsstabilisierte Selbstinteraktions-Nanopartikelspektroskopie (CS-SINS), eine modifizierte Version der konventionellen Affinitätsfang-Selbstinteraktions-Nanopartikelspektroskopie (AC-SINS), wurde als robuste kolloidale Stabilitätsbewertung zur Vorhersage hochkonzentrierter Lösungsverhalten adaptiert. Diese Methode ermöglicht wichtige Entwicklungsentscheidungen in der Frühphase, indem kolloidale Stabilitätsprobleme erkannt werden, bevor erhebliche Ressourcen investiert werden, wodurch die Abfallraten nachgelagert und die Auswahl der Kandidaten beschleunigt werden. Diese Studie zeigt, dass sich der Assay nahtlos in bestehende Entdeckungsabläufe integriert und parallel zu typischen Frühphasen-Tests durchgeführt werden kann, da der Probenbedarf minimal ist, wodurch wertvolle Daten zur Vorhersage hochkonzentrierter Verhaltensweisen geliefert werden, ohne andere Charakterisierungsmaßnahmen zu beeinträchtigen. Es wurde gezeigt, dass routinemäßige Messungen der dynamischen Lichtstreuung (DLS) zusätzlich zur Verschiebung der Wellenlänge der Plasmonresonanz die Zuverlässigkeit der hier beschriebenen HTP-Methode verbessern können. Insgesamt wird erwartet, dass die Kreuzvalidierung mit DLS-Messungen und automatisierten Analyseprogrammen die zuverlässige Auswahl von Kandidaten-Antikörpertherapien verschiedener Modalitäten erleichtern wird.

Einleitung

Bei der Entwicklung und Formulierung therapeutischer Antikörper sind Opaleszenz und Viskosität Schlüsselfaktoren bei der Entwicklung eines patientenzentrierten kommerziellen Produkts 1,2,3,4,5,6,7,8. Klassisch sind große Proteinmengen erforderlich, um diese Eigenschaften direkt in hoher Konzentration zu beobachten, was eine optimale Lead-Identifikation in den frühen Phasen der Antikörperentdeckung verhindert, in denen die Proteinverfügbarkeit begrenzt ist. Eine zuverlässige Identifikation dieser Phänomene ist entscheidend für Entwicklungsbeurteilungen, um schlechtes Verhalten bei hochkonzentrierten Lösungen nachfolgend ^zu mindern^. Daher besteht großes Interesse an Hochdurchsatz- und Niedrigkonzentrationsmethoden, die ein schlechtes Lösungsverhalten bei hoher Konzentration^vorhersagen. Eine solche Methode, kD-DLS, hat sich als zuverlässig zur Vorhersage hochkonzentrierter Eigenschaften erwiesen, erfüllt jedoch nicht die niedrigen Proteinaufnahmen und hohen Durchsatzanforderungen von frühen Workflows^12,13.

Kürzlich wurde gezeigt, dass ein ultra-niedriger Verbrauch auf Gold-Nanopartikel-Basis namens CS-SINS eine starke Korrelation mit den Ergebnissen der kD-DLS-Experimente aufweist und bei hoher Konzentration¹⁶ relativ effektiv schlechte Lösungseigenschaften vorhersagt. Diese Eigenschaften machen CS-SINS zu einem idealen Kandidaten für die Entwicklung als Hochdurchsatz-Screening-Tool. Der CS-SINS-Test verwendet einen Fangantikörper, der auf Goldnanopartikeloberflächen immobilisiert ist, um Kandidatenantikörper über deren Fc-Regionen zu verankern, wodurch die Fab-Arme für Lösungsinteraktionen zugänglich sind. Diese Konfiguration bedeutet, dass Fab-Fab-Interaktionen das gemessene Selbstassoziationssignal dominieren, was vorteilhaft ist, da Studien zeigen, dass Fab-Domänen überwiegend zu den Eigenschaften der mAb-Selbstassoziation beitragen, wahrscheinlich aufgrund der Eigenschaften der komplementaritätsbestimmenden Region (CDR) 17,18,19,20,21,22,23. Diese mechanistische Grundlage macht CS-SINS gut geeignet, um kolloidale Stabilitätsrisiken vorherzusagen, die für hochkonzentrierte Formulierungen relevant sind. Alternative HTP-Methoden, darunter die Stand-Up-Monolayer-Adsorptionschromatographie (SMAC), ein Größenausschlusschromatographie (SEC)-Säulen-basierter Ansatz, der die Selbstassoziation mit einer generischen stationären Phase nachahmt, sowie Kreuzwechselwirkungschromatographie (CIC), beinhalten die Säulenpräparation und große Probenanforderungen 17,24,25,26,27.

Die hier beschriebene Methode beschreibt eine plattenvalidierte Einrichtung des CS-SINS-Tests und ermöglicht HTP-Screening durch Laborautomatisierung und Analyse, wodurch die Vorteile bestehender Methoden kombiniert und gleichzeitig die Zuverlässigkeit der Ergebnisse verbessert wird. Diese Studie zeigt außerdem, wie verschiedene Probentypen aufgrund der Art der Anreicherung der Selbstinteraktion im Assay hochwertige Ergebnisse liefern und zeigt, dass die Methode unabhängig von Proteinquellen ist. Darüber hinaus betrachten wir, wie eine frühere Kommunikation der kolloidalen Eigenschaften an Projektteams das strategische multispezifische Antikörperdesign weiter unterstützen kann 28,29,30,31,32,33,34.

Die Untersuchung der Eigenschaften hochkonzentrierter Lösungen erfolgt typischerweise nachträglich in multispezifischen Kandidatenauswahlkampagnen, nach der Auswahl der Führungsstärke und Abschluss der Ingenieursarbeit (Abbildung 1A). Die frühe Vorhersage dieser Eigenschaften ist mit Methoden wie CS-SINS, die nur wenige Mikrogramm Probe benötigen, machbar geworden, wodurch kolloidale Stabilitätsrisiken mit ultraverdünnten Messungen^{vorhergesagt werden 16}. Die Einführung des frühen Entwicklungstests (Abbildung 1A), wenn der Kandidatenpool groß ist, sowie parallele Datengenerierungskampagnen für sowohl monospezifische als auch multispezifische Formate könnten den Wirkstoffforschungsprozess^{besser informieren 31,32}. HTP CS-SINS passt parallel zur Bindung und Funktionsbestimmung in das bestehende Molekül-Screening-Paradigma und ergänzt so das Informationspaket, ohne bestehende Arbeitsabläufe zu stören oder zu behindern. Die Auswahl der führenden Kandidaten mit Betonung günstiger kolloidaler Eigenschaften beeinflusst den Auswahlverlauf, wie in Abbildung 1B dargestellt.

Im vorgeschlagenen Early Developability Screening-Workflow berücksichtigt die Lead-Identifikation das Gesamtbild günstiger Arzneimitteleigenschaften, einschließlich Herstellung und Patientenzugang, und vereinfacht so die nachgelagerte Entwicklung³⁴. Die hochkonzentrierten Eigenschaften von Biologika bestimmen ihren Verabreichungsweg: intravenöse Injektionen, die Krankenhausbesuche erfordern, oder subkutane Injektionen, die vom Patienten zu Hause verabreicht werden können, aber oft ein hochkonzentriertes Produkt^35,36 erfordern. Entwicklungsfähige MAbs mit geringer Selbstassoziation werden oft mit >100 mg/mL ^5,35 formuliert. Die Formulierungsoptimierung mit Hilfsstoffen, wie viskositätsreduzierenden Mitteln, kann kolloidale Stabilitätsrisiken für wünschenswerte Kandidaten mit schlechten Lösungseigenschaften in den CMC-Entwicklungsstadien^34,35 überwinden. Dies bringt jedoch nachgelagerte Herausforderungen in der biopharmazeutischen Herstellung mit sich und verlängert die Zeitpläne für erfolgreiche Arzneimittelzulassungen³⁶. Hilfsstoffe, die die Viskosität senken (wie Salze und Aminosäuren), können ebenfalls die Proteinstabilität beeinflussen, wodurch die zuvor charakterisierten Entwicklungsprofile verändert und der Prozess weiter erschwert^{werden 36,37}. Darüber hinaus können übermäßige Hilfsstoffe die Patientenpopulation aufgrund von Immunogenitätsaspekten, verschiedenen Sicherheitsbedenken einschränken oder die Therapietreue beeinträchtigen und neue Herausforderungen im Produktionsbereich^{mit sich bringen.} Starr et al. veröffentlichten erstmals die CS-SINS-Methode, beschrieben den optimalen Massenanteil von PLL und IgG mit 0,03 und bestätigten die Nanopartikelstabilisierung durch Zeta-Potentialmessungen für die mAb-Selbstassoziation in Histidinformulierungen¹⁶. Bemerkenswert ist, dass zu viel PLL zu einer Überstabilisierung im Assay führt und die Beobachtung der mAb-Selbstinteraktion verhindert (die Verbesserung der Goldnanopartikelstabilität durch PLL ist in ergänzender Abbildung 1 dargestellt). Die Verwendung von Hitidin-Formulierungen ohne Salz minimiert das elektrostatische Screening (erhöht die Debye-Länge), wodurch der Bereich der intermolekularen Wechselwirkungen erweitert wird, wodurch schwache Selbstassoziationssignale verstärkt und hochkonzentriertes Verhalten bei nahen Antikörpern nachahmt. Im Allgemeinen werden Formulierungen mit niedriger Ionenfestigkeit für hochkonzentrierte Formulierungen bevorzugt, bei denen keine Selbstassoziation beobachtet wird.

Große PLL-Polymere verhindern die Besetzung weiterer Capture mAbs an den Goldnanopartikeloberflächen, was das plasmonische Verschiebungsfenster verengt und ein ausgefeilteres Kurvenanpassungsprogramm und eine Analyse für die spätere Datenanalyse erfordert. Diese Studie nutzte ein Webportal-Tool, das mit internen Datenbanken synchronisiert wird. Der Hauptvorteil dieser Anfangskosten ist das Datenaufbaupotenzial aus einem großen Sequenzpool, um die Vielfalt der Kandidaten nachgelagert zu maximieren und Engpässe in den teureren Entwicklungsphasen^{zu mindern.} Der hier beschriebene CS-SINS-Test sticht als HTP-kompatible Methode hervor, die nachweislich gut mit späten kolloidalen Stabilitätstests¹⁶ korreliert. KI-unterstütztes Profiling ist im Gange, um die durchdachte Gestaltung von Multispezifischen für zukünftige Programme zu gestalten und die individuellen Beiträge jeder Domäne in komplexen Formaten zu verstehen 41,42,43,44. Diese Bemühungen werden gemeinsam Metaanalysen und eine detailliertere Bestimmung der kolloidalen Stabilitätseigenschaften für Antikörpertherapien beeinflussen und somit letztlich Zeit in den frühen F&E-Phasen sparen.

Protokoll

Abbildung 2 zeigt die Vorbereitung der Nanopartikelkonjugation, Abbildung 3 zeigt den gesamten Workflow, Abbildung 4 zeigt den Laborautomatisierungsprozess und Abbildung 5 enthält ein Diagramm der Datenanalysepipeline. Die Reagenzien und die verwendeten Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Vorbereitung von Puffern

HINWEIS: Woche 1 (Beispielvorbereitung)

1. Histidin (10 mM), pH 6,0 (Probe- und Testpuffer) bereiten.
   HINWEIS: Diese Schritte werden am ersten Tag durchgeführt.
   1. Lösen Sie 5 mM L-Hisidinmonohydrochlorid-Monohydrat und 5 mM L-Hisidin in ultrareinem Wasser. Salzsäure tropfweise beim Rühren hinzufügen, bis der pH-Wert 6,0 erreicht, gemessen mit einem kalibrierten pH-Messgerät.
   2. Filtern Sie die Lösung unter Vakuum durch einen 0,22 μm porengroßen Filter und sammeln Sie das Filtrat in einer sterilen Flasche.
   3. Messen Sie die Leitfähigkeit zu Qualitätskontrollzwecken und stellen Sie eine Messung von etwa 500 μS/cm sicher.
2. Kaliumacetat (20 mM), pH 4,3 (Capture mAb Konjugationspuffer) werden vorbereitet.
   1. Lösen Sie Kaliumacetat in ultrareinem Wasser auf und stellen Sie den pH-Wert mit Gletscheressigsäure auf 4,3 ein.
   2. Sterilisieren Sie die Lösung durch Vakuumfiltration durch einen 0,22 μm Porenfilter wie in Schritt 1.1.2 beschrieben.
3. Bereite Poly-L-Lysin vor.
   1. Bereiten Sie eine 5 mg/mL Brühlösung in ultrareinem Wasser vor und lagern Sie sie bis zur Anwendung bei −20 °C.

2. Dialyse aller Proben (Kandidaten-mAbs)

HINWEIS: Führen Sie diese Schritte an den Tagen 2–5 aus.

1. Vorabweichen Sie 100 μL oder 300 μL Dialysatoren in 10 mM Histidin, pH 6,0, für 5 Minuten.
2. Übertragen Sie alle Proben (50–100 μL) auf Dialysekassetten. Tauchen Sie die Kassetten in einen 10 mM Histidinpuffer mit pH 6,0 (700 mL pro Box), fügen Sie Rührstäbe in die Reservoirs ein, legen Sie die Reservoirs auf magnetische Rührplatten und inkubieren Sie bei 4 °C für 2 Stunden 15 Minuten.
3. Führen Sie sieben Pufferaustausche mit 10 mM Histidin, pH 6,0 alle 2 Stunden und 15 Minuten durch, oder führen Sie vier nächtliche Pufferaustausche durch, um eine gründliche Salzentfernung aus den Proben sicherzustellen.
4. Entnehmen Sie die Proben, geben Sie sie in saubere Matrixfläschchen und lagern Sie sie bei 4 °C, bis der CS-SINS-Test durchgeführt wird.
5. Messen Sie die Probenkonzentrationen und notieren Sie die Polydispersitätsinformationen nach der Dialyse. Berechnen Sie die korrigierten Konzentrationen, indem Sie die Rohabsorptionswerte bei 280 nm durch die Absorptionswerte bei 280 nm für eine 1 mg/mL Lösung teilen.
6. Bereiten Sie die Flüssigkeitshandler-Eingabedatei mit den Bohrlochadressen und -konzentrationen (μg/mL) einschließlich der Steuerungen vor.

3. Pufferaustausch von Capture mAb (Abbildung 2, Schritt 1)

HINWEIS: Führen Sie diese Schritte am ersten Tag der zweiten Woche (Assay) durch.

1. Entfernen Sie den Speicherpuffer aus 2-mL-Entsalzungssäulen durch Zentrifugation für 2 Minuten bei 1.000 × g bei Raumtemperatur. Bereiten Sie zwei Entsalzungssäulen für jeweils 700 μL benötigte Abfang-mAb vor. Verwerfen Sie den Durchfluss nach jedem Zentrifugationsschritt.
2. Waschen Sie die Säulen dreimal mit 1 ml 20 mM Kaliumacetatpuffer, pH 4,3. Zentrifugieren Sie die Säulen während jeder Wasche für 2 Minuten bei 1.000 × g .
3. Fügen Sie jeder Säule 700 μL Capture mAb (ziegen-antihumaner Fcγ-spezifischer Antikörper) hinzu und elutieren Sie in ein frisches 15-mL-Rohr durch Zentrifugation für 2 Minuten bei 1.000 × g.
4. Sammeln Sie das entsalzte Eluat, geben Sie es auf eine zweite ausgeglichene Entsalzsäule und zentrifugieren Sie weitere 2 Minuten bei 1.000 × g.
5. Kombinieren Sie alle elutierten Proben.
6. Missen Sie die Konzentration der Fang-mAb-Lösung nach dem Entsalzen, wie in den Tagen 2–5, Schritt 2.5 beschrieben.
7. Verdünnen Sie die Auffang-mAb-Lagerlösung auf 0,8 mg/mL mit 20 mM Kaliumacetatpuffer, pH 4,3, und stellen Sie sie bis zur Anwendung beiseite.

4. Herstellung eines Arbeitsmaterials aus Poly-L-lysin

1. Verdünnen Sie einen kleinen Aliquot der Poly-L-Lysin-Lösung mit ultrareinem Wasser auf 2,66 mg/mL.

5. Konzentration von Goldnanopartikeln (Abbildung 2, Schritt 2)

1. Bereite 1,2 mL Aliquot der Standardaufhängung in 1-mL Röhren oder 4,8 mL Aliquot in 5 mL Röhren mit Polypropylen-Mikrozentrifugenröhren mit 20 nm Goldnanopartikeln vor. Zentrifugiere bei 21.130 × g für 6 Minuten.
2. Entfernen Sie die Supernatanten (~1,1–1,15 mL) ohne die Pellets zu stören und übertragen sie in ein separates konisches Rohr.
3. Kombinieren Sie die konzentrierten Pellets und Restvolumina in einem sauberen Mikrozentrifugenrohr. Bestimmen Sie das Nanopartikelvolumen durch Pipettieren und passen Sie das Volumen mit dem reservierten Supernatant auf (Anzahl der 1-ml-Röhren × 50 μL) oder auf (Anzahl der 5-ml-Röhren × 200 μL) an. Zum Beispiel wird nach der Zentrifugierung von 10 Aliquoten à 1,2 mL in 1-mL-Röhren das Endvolumen der konzentrierten Nanopartikel auf 500 μL angepasst.

6. Nanopartikel-Assemblierung

1. Sorgfältig 1,5 μL der Poly-L-Lysin-Arbeitslösung mit 48,5 μL des pufferausgetauschten Capture-mAb mischen (Abbildung 2, Schritt 3).
2. Bereiten Sie eine 1:1-Mischung aus der konzentrierten Nanopartikellösung aus Schritt 5 und der Poly-L-Lysin/Capture mAb-Lösung aus Schritt 6.1 (Abbildung 2, Schritt 4) vor.
3. Inkubieren Sie die Mischung über Nacht bei Raumtemperatur (23 °C) (Abbildung 2, Schritt 5).

7. Aufbau der Flüssigkeitsbehandler-Prüfplatte

HINWEIS: Führen Sie diese Schritte am zweiten Tag aus.

1. Stellen Sie die für den Test benötigten Materialien zusammen, darunter dialysierte Antikörper, die Flüssigkeitshandler-Eingabedatei mit Postdialysekonzentrationen, konjugierten Goldnanopartikeln, robotischen Handhabungstipps, Platten und Reservoirs (Abbildung 3, Laborautomatisierung, Schritt 1). Laden Sie die Spitzen, Proben, Platten und Reservoirs gemäß dem in Abbildung 3 gezeigten Layout (Laborautomatisierung, Schritt 1) auf das Deck vor.
2. Fügen Sie die Kontrollen den Bohrungen A12–D12 der Probeplatte hinzu (zwei positive und zwei negative Kontrollen). Lassen Sie das Bohrloch H12 für die vom Flüssigkeitsbehandler vorbereitete Pufferprobe leer.
3. Öffnen Sie die Liquid-Handler-Methode CS-SINS und starten Sie das Programm (Abbildung 3, Laborautomatisierung, Schritte 2–3). Laden Sie die Flüssigkeitshandler-Eingabedatei bei Aufforderung und geben Sie die Anzahl der Proben ein (Abbildung 4A). Überprüfen Sie die beiden folgenden Berechnungsprüffenster (Abbildung 4B, C), bestätigen Sie die Werte und fahren Sie mit dem Durchlauf fort.
4. Normalisieren Sie die Proben, einschließlich der Kontrollen, auf 55,5 μg/mL in einem 10 mM Histidinpuffer, pH 6,0, indem Sie sie von den Matrixprobenröhrchen auf die Polymerase-Kettenreaktionsplatte in einem Endvolumen von 100 μL übertragen (Abbildung 4D, Schritt 1). Überwachen Sie den Fortschritt und beachten Sie, dass abgeschlossene Plattenbereiche grau erscheinen und aktive Schritte grün markiert sind (Abbildung 4E).
5. Bereiten Sie eine größere Verdünnung jeder Probe bei 11,1 μg/mL in einem 10 mM Histidinpuffer mit pH 6,0 vor, indem das Material von der Polymerase-Kettenreaktionsplatte auf einen Tiefbrunnenblock mit einem Endvolumen von 200 μL transferiert wird (Abbildung 4D, Schritt 2).
6. Lass das System nach Schritt 2 pausieren. Auf Aufforderung mischen Sie die konzentrierten Goldnanopartikel, die in Schritt 6.3 hergestellt wurden, indem Sie das Rohr invertieren und etwa 10 Mal auf und ab pipetteren.
   1. Verteilt werden die Nanopartikel gleichmäßig auf zwei Polypropylen-Mikrozentrifugenröhren und platziert die Röhren mit offenen Kappen an der vorgesehenen Röhrenrackstelle auf dem Deck (Abbildung 4D, hervorgehoben "AuNP"). Setzen Sie den Lauf fort und lassen Sie den Flüssigkeitsbehandler 20 μL Nanopartikel in jede Bohrung des zweiten Tiefbrunnenblocks dosieren, jeweils zwei Bohrlöcher (Abbildung 4D, Schritt 3).
7. Lassen Sie den Flüssigkeitsbehandler 192 μL Probe aus dem Tiefbrunnenblock mit den 11,1 μg/mL Proben (Abbildung 4D, Schritt 2) in den zweiten Tiefbrunnenblock übertragen und vermischen Sie gründlich. Erzeugen Sie für jede Probe einen 4× CS-SINS-Mastermix, der nach der Zugabe von 48 μL Goldnanopartikeln zu einem Endvolumen von 240 μL zu einer Endkonzentration von 10 μg/mL führt (Abbildung 4D, Schritt 3). Starte jetzt den 4-Stunden-Inkubationstimer.
8. Lassen Sie den Flüssigkeitsbehandler 30 μL in den Quellbrunnen dosieren und anschließend 60 μL in drei der vier Brunnen in jedem Quadranten einer 384-Well-Platte, um technische Triplikate für jede Probe zu erzeugen (Abbildung 4D, Schritt 4). Geben Sie die verbleibenden 30 μL an die Quellplatte zurück.
9. Überwachen Sie das Layout des Liquid-Handler-Decks, während der Lauf voranschreitet. Beobachten Sie, wie die verwendeten Spitzen und gefüllten Probebohrungen in Echtzeit von hell zu dunkelgrau wechseln, während aktive Bewegungen grün markiert sind (Abbildung 4E).
10. Entfernen Sie die Platte nach Abschluss des Durchlaufs. Versiegeln Sie die Platte mit einer minimalklebenden, transparenten Plattendichtung und inkubieren Sie sie bei Raumtemperatur für insgesamt 4 Stunden. Am 3,5-Stunden-Zeitpunkt starten Sie das dynamische Lichtstreuungsprogramm, um die Kammer auf 20 °C auszugleichen, indem Sie die in ergänzender Abbildung 2 gezeigten Einstellungen verwenden.
11. Messen Sie das Absorptionsspektrum jedes Bohrlochs von 510 bis 570 nm in 1-nm-Schritten (30 nm auf jeder Seite des Peaks) am 4-Stunden-Zeitpunkt.
12. Messen Sie die Platte sofort mit dem dynamischen Lichtstreuplattenleser zum Zeitpunkt von 4,5 Stunden mit den in ergänzender Abbildung 2 gezeigten Einstellungen.
    HINWEIS: Verwenden Sie für spektrale Messungen einen leistungsstarken Plattenleser aufgrund des begrenzten Dynamikumfangs. Verwenden Sie nicht die Schnelllesefunktion.

8. Datenanalyse (Abbildung 5, Datenverarbeitungsschema)

1. Exportiere die RAW-Dateien von der Spektrophotometer-Plattform und speichere sie in einem zugänglichen Laufwerksordner.
2. Greifen Sie auf das Scripting-Webportal zu, das mit dem internen Server verbunden ist. Geben Sie die erforderlichen CS-SINS-Eingangsparameter ein, darunter: (1) Anfangswellenlänge; (2) Verzeichnisstandort der Rohergebnisdatei; (3) Kennzeichensätze und Kandidatenkennzeichen; (4) Positiv- und Negativkontrollbrunnen adressieren für die Normalisierung; (5) Bezeichnung der Methodeneinrichtung ("Manual" oder "Liquid Handler"); (6) Instrumente für spektrale Scanning und dynamische Lichtstreumessungen; (7) Kennung des elektronischen Labornotizbuchs (ELN); (8) Erwerbsdatum.
3. Reichen Sie die Parameter in das Webportal ein und überprüfen Sie, dass drei Excel-Dateien in einem Unterordner des Raw-Results-Verzeichnisses generiert werden.
4. Berechnen Sie die λmax-Werte mit dem Curve-Fitting-Skript, das vom Webportal ausgeführt wird.
5. Überprüfen Sie die beiden Ausgabedateien mit Replikationswerten, normalisierten Ergebnissen und repräsentativen Graphen für die spektralen Scan- und dynamischen Lichtstreumessungen.
6. Verwenden Sie die dritte Ausgabedatei, die Assay-Metadaten und normalisierte Ergebnisse enthält, um Massenlaborergebnisse in der Benutzeroberfläche der Datenbank zu erstellen. Definieren Sie Berichtsattribute entsprechend gruppenspezifischen Anforderungen und laden Sie die Ergebnisse in die Datenbank hoch, um unternehmensweiten Zugriff zu ermöglichen.

Ergebnisse

Abbildung 6 zeigt die Ergebnisse, ergänzende Abbildung 3A zeigt ein Beispiel des CS-SINS-Scores aus einer repräsentativen Rohöl- und gereinigten Probe, ergänzende Abbildung 3B zeigt die Variabilität des Signals von Bohrloch zu Bohrloch über verschiedene Tage hinweg, ergänzende Abbildung 4 enthält die Ergebnisse des Plattenvalidierungsprozesses und ergänzende Abbildung 5 beschreibt die Normalisierungsberechnung für beide CS-SINS-Anzeigen.

Wichtig ist, dass Proben mit berichteten Konzentrationen von mindestens 55 μg/mL nach der Dialyse in 10 mM Histidin, pH 6,0, zur Prüfbarkeit entnommen wurden, da dies die Mindestbestandskonzentration (mindestens 6 μg pro Probe) darstellt, und neue Kinderidentifikatoren erstellt wurden. Insgesamt gab es 70 gereinigte Proben und 20 Rohexprimationsproben, die jeweils Probentypen an unterschiedlichen Entwicklungskontrollpunkten repräsentierten (gereinigt in der Bleioptimierungsphase und 1- oder 2-stufiges gereinigtes Rohölmaterial aus der Bleiidentifikationsphase, wie in Abbildung 1A hervorgehoben). Das Rohmaterial wurde aus einem vollständig automatisierten Säugetierexpressionssystem, der Protein Expression and Purification Platform (PEPP; GNF, San Diego, CA, USA). Die Kontrollen wurden aus kommerziellem Material abgeleitet und zuvor mit maximalen oder minimalen Viskositäts-, kD-DLS- und CS-SINS-Werten validiert. Frische Aliquots werden bei -80°C gelagert, und für jeden Assay wird ein neuer Aliquot verwendet.

Abbildung 6A,B zeigen die durchschnittlichen spektralen und DLS-Werte, die nach Stichprobentyp dargestellt werden, und die Balkendiagramme zeigen Fehlerbalken (Standardabweichung) mit passenden Farbcodes. Die Normalisierung wird durch das Skript berechnet, indem die Differenz zwischen der Stichprobe und den negativen Kontrollwerten (berechnet Lambda Max durch Spektralverschiebung oder Z-Durchschnitt, hydrodynamischer Durchmesser in nm) durch die Differenz zwischen den Kontrollen geteilt wird (ergänzende Abbildung 5). Abbildung 6C zeigt die spektralen Werte mit den DLS-Werten und zeigt eine klare Korrelation zwischen den analytischen Ansätzen. Tabelle 1 listet die Identifikatoren, Bohrlochadressen, Stichprobentyp, Spektralwerte und DLS-Werte zusammen mit ihren Standardabweichungen als Referenz auf. Die Grenze für das kolloidale Stabilitätsrisiko (unabhängig von spektraler oder DLS-Messung) für ein monospezifisches IgG liegt bei einem normalisierten Wert von 0,35 (angezeigt durch eine grüne gestrichelte Linie in Abbildung 6A,B, 6/70 (ohne Replikationskontrollen)) gereinigte Proben erzielten ein hohes Risiko, während 64/70 für das gereinigte Material niedrig bewertet wurden. Wichtig ist, dass wir erwarten, dass die Grenze für multispezifische Formate weiter steigt. Bei den rohen Expressionsproben erzielten 2 von 20 Proben hohe Werte, während 18 von 20 niedrig bewerteten. Von den hier getesteten gereinigten Materialien wurde auch die grobe Expression der elterlichen Chargen einer Teilmenge untersucht, die ähnliche Ergebnisse ergab (dargestellt in ergänzender Abbildung 3A), was auf die repräsentative Natur des Tests bei der Skalierung (Reinigung) von Kandidatenproteinen aus unabhängigen Chargen hinweist. Trotz der Begrenzung der Probengrößen wird festgestellt, dass der Standardfehler bei den rohem PEPP-Proben höher ausfallen kann als bei den gereinigten Proben. Der Vorteil der Durchführung von CS-SINS in späteren Phasen stellt sicher, dass orthogonale Bewertungen mit Assays durchgeführt werden können, die mehr Protein für die Analyse benötigen, wie Viskositäts- und kD-DLS-Messungen, während der Vorteil der Durchführung von CS-SINS in frühen Entwicklungsscreens kolloidale Stabilitätsrisiken präventiv berücksichtigt und potenziell den endgültigen Lead-Kandidatenpool beeinflusst (Abbildung 1B). Grenzwertige Kandidaten mit hohem Fehler können mit Tests stromabwärts als hoch- oder geringes Risiko bestätigt werden.

Aufgrund der geringen Erkenntnis der plasmonischen Verschiebungen wurde eine alternative Anzeige beschrieben, um Vertrauen in den Test zu schaffen, was den Dynamikumfang erweitert, was besonders nützlich sein könnte, wenn kein hochwertiger Plattenleser zur Erkennung winziger Veränderungen vorhanden ist. Die DLS-Anzeige unterscheidet zwischen Nanopartikelclustering und der Abhängigkeit von den spektralen Eigenschaften der Nanopartikel; beide Deskriptoren haben jedoch ähnliche Standardfehlerbereiche und sind im Verhältnis zu ihren Messungen klein. Es scheint, dass Proben, die anfälliger für Ausreißerwerte sind, einen höheren Fehler aufweisen (oder "multimodal" sind und kein DLS-Ergebnis melden), aber CS-SINS-Werte innerhalb des Arbeitsbereichs des Tests weisen niedrige Fehlerverteilungen auf. Beim Vergleich von DLS-Werten mit spektralen Werten ist die Fehlerverteilung für die DLS-Ergebnisse aus groben Stichproben enger als für die spektralen Werte; dies machte jedoch nur einen Unterschied für einen Kandidaten, der unter der DLS-Grenze lag, aber nicht als spektraler Wert. Das könnte nützlich sein, wenn Labore unterschiedliche Instrumente zur Verfügung haben.

Um speziell die Zuverlässigkeit der Datenverarbeitung und der Methode selbst zu gewährleisten, wurden die Scanzeiten von Anfang bis Ende sowohl für die Auslesungen der positiven als auch für negative Kontrollen im obigen Datensatz angepasst, zusätzlich zu mehreren mittleren und niedrigen Kontrollen, die als Zwischenreferenzpunkte am Anfang und Ende einer 384-Well-Platte dienen. Ergänzende Abbildung 4 zeigt die Ergebnisse der finalisierten Plattenvalidierung und zeigt größtenteils unsignifikant unterschiedliche Werte von den Proben am Anfang im Vergleich zum Ende der Platte (ergänzende Abbildung 4A,B) sowie eine hohe Korrelation zwischen beiden Auslesewerten (ergänzende Abbildung 4C). Schließlich wurden der Z-Faktor und %CV für die Kontrollen aus dem spektralen Scan und dem DLS-Datensatz in Abbildung 6 berechnet. Aus den hier für die Kontrollen generierten und präsentierten Daten wurde festgestellt, dass die spektrale Scan-Anzeige einen Z-Faktor von 0,648 hatte, mit 0,019 % CV für die positive Kontrolle und 0,012 % für die negative Kontrolle. Für die DLS-Anzeige wurde ein Z-Faktor von 0,998 berechnet, mit 0,025 % CV für die positive Kontrolle und 0,021 % für die negative Kontrolle. Insgesamt wurde der Spearman-Korrelationskoeffizient zwischen den Probenwerten in diesem Test (Abbildung 6C) als stark positiv mit 0,829 berechnet. Diese Werte repräsentieren eine solide Präzision und Reproduzierbarkeit für beide Messtypen, und wenig überraschend optimiert die neue, vorteilhafte DLS-Detektionsstrategie den Z-Faktor, aber der spektrale Scan bietet ein ausreichendes Trennband für zuverlässige Ergebnisse (Z > 0,5). Es ist wichtig zu beachten, dass der DLS-Score eine orthogonale Anzeige ist, die gleichzeitig im CS-SINS-Workflow erfasst wird und keine zusätzliche Probenvorbereitung erfordert. Der größere Unterschied in den Werten für rohe DLS-Werte erklärt einen verbesserten Z-Faktor, aber die "Werte" werden gleich interpretiert, da sie aus Rohwerten normalisiert sind. Darüber hinaus erfassen DLS-Messungen dreidimensionale Größen von Nanopartikelclustern gegenüber indirekten Hinweisen auf Nähe durch plasmonische Verschiebung und spektrale Informationen, was unser Verständnis der CS-SINS-Analysedynamik stärken kann. Angesichts der plattenbasierten und zeitkritischen Natur eines HTP-Tests wollten wir mit diesen Methoden die Zuverlässigkeit des Tests erhöhen.

Abbildung 1: Entwicklungs-Paradigma und CS-SINS-Datenerhebung. (A) Der typische Arbeitsablauf von einer Entdeckungskampagne bis zur Kandidatenauswahl ist in diesem Diagramm für multispezifische Antikörper dargestellt. Der Entdeckungsprozess führt dazu, dass monospezifische Kandidaten gescreent werden, gefolgt von einer Auswahl verschiedener Datenpakete, um die Monospezifischen von Interesse einzugrenzen, bevor sie zu multispezifischen Formaten kombiniert werden. Datenpakete werden wiederholt oder erweitert, um die führenden Kandidaten einzugrenzen, bis der beste Kandidat für die Entwicklung ausgewählt ist. Im aktuellen Arbeitsstrom werden niedrigere Durchsatz-Assays durchgeführt, wenn ein kleines Molekülpanel ausgewählt wird (violette Boxen). HTP CS-SINS können in jeder Phase des Weges durchgeführt werden, wodurch wertvolle Daten hinzugefügt und der Auswahlprozess verbessert wird. (B) Das hypothetische Ergebnis der kolloidalen Eigenschaften der besten 6 Kandidaten wird für zwei mögliche Wege gezeigt: die Auswahl des führenden Kandidaten mit niedrigdurchsatzfähigen Assays und die Auswahl des führenden Kandidaten mit HTP CS-SINS. Kandidaten mit ungünstigem Lösungsverhalten werden mit einem Glanz dargestellt. Im ersten Szenario zeigt die Hälfte der führenden Kandidaten, basierend auf optimalen Bindungseigenschaften aus Entdeckungsbildschirmen, ein schlechtes Verhalten bei hoher Konzentration. Im zweiten Szenario wird nur ein Kandidat mit mäßig schlechter kolloidaler Stabilität einbezogen, da CS-SINS-Daten parallel zu den Bindungsdaten in frühen Entdeckungsscreens betrachtet wurden. Im zweiten Szenario ist die Vielfalt potenziell geeigneter Kandidaten höher als im ersten Szenario. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 2: SINS-Assay-Workflow. Herstellung und Konjugation von Goldnanopartikeln: (1) Das Capture mAb wird pufferausgetauscht in 20 mM Kaliumacetat, pH 4,3, und auf 0,8 mg/ml verdünnt. (2) Goldnanopartikel werden aus dem Bestand konzentriert. (3) Poly-l-lysin wird mit dem pufferausgetauschten Capture-mAb gemischt. (4) Goldnanopartikel werden mit Poly-l-lysin inkubiert und mAb gefangen und gründlich vermischt. (5) Inkubation des CS-SINS-Komplexes über Nacht bei Raumtemperatur. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 3: Workflow der Laborautomatisierung. Workflow zur Laborautomatisierung: (1) Materialien und Proben werden für die Flüssigkeitsbehandlungsmethode zusammengestellt. Dialysierte Proben in 10 mM Histidin, pH 6, werden in Matrizenröhren oder 96-Well-Platten entnommen. Die Probenkonzentrationen werden in eine Flüssigkeitshandler-Eingabedatei formatiert. CS-SINS-Komplex-Goldnanopartikel, die zur Erfassung von MAb konjugiert werden, robotische Flüssigkeitshandhabungstipps und Kunststoffwaren werden zur Vorbereitung des Flüssigkeitsbehandlungs-Assay-Setups gesammelt. (2) Die Prüfplatte wird auf dem Flüssigkeitsbehandler vorbereitet und 4 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. 3) Bei der 4-Stunden-Marke werden Spektralscans (Anzeige 1) aus Probenbohrungen mit einer Dauer von 25 Minuten gesammelt; Nach der 4,5-Stunden-Marke sammelt die dynamische Lichtstreuung (Auslesung 2) Größeninformationen für jede gleichmäßigere Bohrlochpopulation. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 4: Flüssigkeitsbehandlungsprogramm und Plattenaufbau. (A) Beim Programmstart und nachdem das System initialisiert ist, öffnet sich ein separates Fenster/Prompt, um die Eingabedatei mit den zugewiesenen Brunnenadressen und Probenkonzentrationen auszuwählen. Die Anzahl der Proben muss jedes Mal angegeben werden, aber das 200-μL-Volumen (das letzte Volumen der gemischten Reagenzien vor der 384-Well-Plattenprägung) bleibt gleich. (B) Nachdem man im vorherigen Fenster in (A) auf Fortsetzen klickt, erscheint dieses zweite Fenster, um die Interpretationen aus der Eingabedatei links und den Werten rechts zu bestätigen. (C) Nach Bestätigung der Interpretationen aus (B) erscheint dieses dritte Fenster mit einem Dialogfeld, das die Mathematik für die Probenkonzentration zur Normierung (das 100 μL Volumen) zur finalen tiefen Bohrlochplatte (das 200 μL Volumen) überprüft. (D) Dieses Layout stammt aus der Methode Editor-Ansicht des Flüssigkeitshandler-Softwaremoduls. Links sind 300 μL Standardspitzen geladen, und in der Bühnenmitte befinden sich 1 Box mit 50 μL und 3 Boxen mit 300 μL schlanken Spitzen, die mit Flüssigkeitshandhabungsrobotik kompatibel sind. An der Front wird ein Puffertrog mit 10 mM Histidin, pH 6 (dem Puffer, in den die Proben dialysiert wurden) geladen. Die Goldnanopartikel werden gleichmäßig in zwei Mikrozentrifugenröhren aufgeteilt und unbedeckt im hinteren Röhrengestell rechts geladen. Die Matrizenplatte mit Probenröhrchen wird im hinteren Teil des Trägers in Spalte 10 geladen. Nach den Proben sind die Normalisierungsplatte (1), die Tiefbrunnenplatte mit 11,1 μg/mL Probe (2), die 200 μL tiefe Bohrlochplatte der kombinierten Probe und Nanopartikel (3) sowie die 384-Bohrloch-formatierte Platte (4) angezeigt. (E) Das Layout des Decks des Flüssigkeitshandlers zeigt die Entnahme der Spitzen und die Probenabgabe in Echtzeit und markiert die Bohrungen im Verlauf jedes Schrittes. Hier sind alle Proben (96-Well-Bild am hinteren Rand des Trägers in der 3^{. Spalte}) ebenso ausgegraut wie die anschließende Normalisierungsplatte, die darauf hinweist, dass Proben von den Quellmatrixplatten zur Normalisierungsplatte hinzugefügt wurden. In Grün zeigen wir den 8-Kanal-Kopf, nachdem der Puffer aus dem Trog abgesaugt und in die erste Spalte der Normalisierungsplatte beim Mischen eingegeben wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 5: Datenverarbeitungsschema. Das Datenverarbeitungsschema: (1) Die Rohdatendateien werden an einen internen Server übermittelt. (2) Die Datendateien werden von einem Skript gelesen und verarbeitet, das zur Feinjustierung der Kurvenanpassung von Spektralscans angepasst wurde, die Berechnung des Lambda-Max für CS-SINS-Replikate und die Überprüfung multimodaler Populationen mittels DLS. (3) Die Daten werden nach Replikaten gruppiert, anschließend auf bestimmte Kontrollen gemittelt und normalisiert; Passende Plattenkarten im Datenbankportal werden verwendet, um die Ergebnisse zu verknüpfen. (4) Alle Daten werden in einer Vorlage organisiert, die in die Datenbank hochgeladen werden kann, und Diagramme werden automatisch für die ELN-Berichterstattung erstellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 6: Repräsentative Daten aus Auslesung 1 und Auslesung 2. (A) Die normalisierten spektralen Verschiebungswerte wurden mit PPB-ID für gereinigte, grobe Expressionsproben und Kontrollproben, wo angezeigt und durch eine vertikale gestrichelte Linie getrennt, in einem Balkendiagramm dargestellt, um die Fehlerbalkenverteilung zwischen den Stichprobentypen zu bestimmen. Die durchgezogene rote Linie zeigt die obere Grenze des Tests an, was der positiven Kontrolle entspricht, während die grüne gestrichelte Linie den Grenzwert für ein risikoarmes Molekülprofil für CS-SINS markiert. (B) Die normalisierten DLS-Werte wurden mit PPB-ID für gereinigte, grobe Expressionsproben und Kontrollproben, wo angezeigt und durch eine gestrichelte Linie getrennt, in einem Balkendiagramm dargestellt, um die Fehlerbalkenverteilung zwischen den Stichprobentypen zu bestimmen. Einige Werte fehlen (wie zum Beispiel der^{zweite Wert in} Hellblau mit einem überdurchschnittlichen Wert in (A) aufgrund multimodaler Scans aus der DLS-Ausgabe, die vom Webportal der Skriptsoftware als ungültig eingestuft wurden. Die durchgezogene rote Linie zeigt die obere Grenze des Tests an, was der positiven Kontrolle entspricht, während die grüne gestrichelte Linie den Grenzwert für ein risikoarmes Molekülprofil für CS-SINS markiert. (C) Die gemittelten, normalisierten Werte für Spektralverschiebungs- und DLS-Werte wurden durch ein Korrelationsdiagramm verglichen, wie gezeigt (Spektralverschiebungswerte entsprechen der Y-Achse und DLS-Werten der X-Achse). Der Farbcode ist ausschließlich mit DLS-Werten abgestimmt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Tabelle 1. Kolloidale Stabilitätswerte von Antikörperproben, bestimmt durch CS-SINS. Die Tabelle fasst Stichprobenkennzeichen, Bohrlochadressen, Stichprobenklassifikationen, normalisierte spektrale Werte und dynamische Lichtstreuungswerte (DLS) zusammen, die aus dem CS-SINS-Test gewonnen wurden. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 1: PLL verbesserte die Stabilität von AuNP in 10 mM Sein Puffer, pH 6, für CS-SINS. Diese Abbildung zeigt die enge Überlagerung des negativen Kontroll-mAb, das an den PLL-beschichteten CS-SINS-Komplex gebunden ist, und die nur puffergebundene Kontrolle im Gegensatz zu unbeschichteten Goldnanopartikeln mit dem Negativkontroll-mAb oder Puffer allein, die Spitzen in völlig unterschiedlichen Bereichen aufweisen. In Blau sind die inkrementellen spektralen Scans (in 1-nm-Schritten zum 4-Stunden-Zeitpunkt durchgeführt) für konjugierten AuNP mit 10 mM inkubiert. Sein Puffer wurde mit konjugierten Perlen überlagert, die mit der negativen Kontrolle (PPB-117487) inkubiert wurden, ohne eine Vorinkubation von Poly-l-Lysin. In Rot sind die inkrementellen spektralen Scans (in 1-nm-Schritten am 4-Stunden-Zeitpunkt durchgeführt) für konjugierten AuNP mit 10 mM inkubiert. Dessen Puffer mit konjugierten Perlen überlagert wurde, die mit der negativen Kontrolle (PPB-117487) nach der Vorinkubation von Poly-l-Lysin inkubiert wurden. Die berechneten Lambda-Maxima für beide negativen Kontrollen in Anwesenheit von PLL sind nahe beieinander. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 2: Einstellungen für DLS und Bohrloch-Plattenauswahl für den DLS-Kennzeichenleser. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 3: CS-SINS-Werte aus Abs ausgedrückt in PEPP vs. Purified downstream. (A) Die normalisierten spektralen Verschiebungswerte wurden anhand von Bohrloch- und Platten-ID für PEPP-Proben (z. B. A1PL1 = Brunnen A1 von Platte 1) dargestellt, die Ab64 ausdrücken, und durch eine vertikale gestrichelte Linie von den normalisierten Spektralverschiebungen oder DLS-Werten aus gereinigtem Ab64 nachgeschaltet in einem Balkendiagrammdiagramm getrennt, um die Fehlerbalkenverteilung (Standardabweichung) zwischen den Stichprobentypen zu bestimmen. Die grüne gestrichelte Linie markiert den Cutoff-Wert für ein risikoarmes Molekülprofil für CS-SINS. (B) Der gesamte AUC und die Verteilung über die Platte für alle Proben in den in (A) durchgeführten Experimenten werden hier dargestellt (farbcodiert für entsprechende Experimente). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 4: End-to-End-384-Well-Plattenvalidierung von Kontrollen. (A) Die gemittelten, normalisierten Spektralwerte für Proben in den Anfangsspalten der 384-Well-Platte werden rot dargestellt, während doppelte Werte am Ende der 384-Well-Platte in Limettengrün dargestellt werden. Replikationswerte sind nebeneinander verlaufen und reichen von der positiven Kontrolle (markiert mit einem Pluszeichen neben der PPB-ID) bis zur negativen Kontrolle (markiert mit einem Minuszeichen neben der PPB-ID). Der Wert für die vom Flüssigkeitsbehandler erstellte Puffersteuerung (unabhängig von der Probeneingabe-Eingabeaufforderung) wird in einem schachbrettigen Muster dargestellt. (B) Die gemittelten, normalisierten DLS-Werte für Proben in den Anfangsspalten der 384-Well-Platte werden in Rot dargestellt, während doppelte Werte am Ende der 384-Well-Platte in Limettengrün dargestellt werden. Replikationswerte sind nebeneinander verlaufen und reichen von der positiven Kontrolle (markiert mit einem Pluszeichen neben der PPB-ID) bis zur negativen Kontrolle (markiert mit einem Minuszeichen neben der PPB-ID). Es gibt keinen Pufferkontrollwert für die DLS-Auslesung (aufgrund multimodaler Messwerte). (C) Die gemittelten, normalisierten spektralen Werte werden im Vergleich zu DLS-Werten in einem Korrelationspunktdiagramm für Stichproben von Messungen in den Anfangsspalten der 384-Well-Platte bis zum Ende der 384-Well-Platte dargestellt. Die Farbcodierung der Datenpunkte entspricht direkt den durchschnittlichen, normalisierten spektralen Scanwerten. Da es keinen Pufferkontrollwert für die DLS-Auslesung gibt (aufgrund multimodaler Messwerte), werden nur die 6 doppelten Steuerelemente aus beiden Auslesungen in diesem Diagramm verglichen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 5: Die Berechnungen zur Normalisierung spektraler Scores oder DLS-Scores, um universelle Berichterstattung und Referenzierung zwischen Nutzern und Tagen zu ermöglichen. Positive Kontrollwerte werden auf 1 gesetzt, negative Kontrollen auf 0, und hohe Werte sind mit schlechtem kolloidalem Verhalten verbunden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Dieses Protokoll stellt mehrere wesentliche Änderungen gegenüber der ursprünglichen CS-SINS-Methode¹⁶ dar. Wichtig ist, dass das optimierte PLL:IgG-Verhältnis und der Hitidinpuffer aus der ursprünglichen Studie¹⁶ beibehalten wurden. Am auffälligsten wurde der Test für die robotische Flüssigkeitsbehandlungsplattform angepasst, um die HTP-Verarbeitung (bis zu 352 Proben an einem Tag statt ~20) zu ermöglichen, wodurch die Hand-on-Zeit reduziert und die Reproduzierbarkeit durch automatisierte Flüssigkeitsbehandlung verbessert wird. Das Robotiksystem ist kompatibel mit plattenbasierten Formaten, einschließlich des Stanzens in neue Formate wie die 384-Well-Platte und verschiedene Laborgerätetypen. Die Programme können unabhängig voneinander ausgeführt werden, und der End-to-End-Workflow bietet eine hochvolumige Auslesung mit verbesserter Reproduzierbarkeit in einer sample-limitierenden Umgebung. DLS-Messungen wurden auch als orthogonale Anzeige zur Spektralverschiebung mit einem optimaleren Z-Faktor als Spektralverschiebungsinterpretationen (0,998 gegenüber 0,648) integriert, was besonders wertvoll für Proben mit grenzwertigen spektralen Werten oder hohen Standardabweichungen ist und die Interpretation der Plasmonverschiebung beschreibt, um den Dynamikumfang allein aus der Ausgabe des Plattenlesers zu verbessern. Es wird vorgeschlagen, dass Labore ohne High-End-Multimode-Plattenleser DLS nutzen könnten, um CS-SINS zuverlässig durchzuführen. Um potenzielle zeitabhängige Variabilität über eine 384-Well-Platte zu adressieren, wurde eine umfangreiche Plattenvalidierung durchgeführt (ergänzende Abbildung 4), indem Kontrollen sowohl am Anfang als auch am Ende der Platte platziert wurden, um die Effekte der minimalen Scanzeit zu bestätigen. Außerdem wurde gezeigt, dass rohe PEPP-Proben vergleichbare Ergebnisse mit gereinigtem Material liefern (Abbildung 6, ergänzende Abbildung 3A), wodurch die Anwendbarkeit der Methode auf frühere Entdeckungsstadien erweitert wird, in denen gereinigtes Protein nicht verfügbar ist, was zuvor nicht berichtet wurde. Die Daten in ergänzender Abbildung 3 deuten auf die Stichprobenzuverlässigkeit zwischen Quellen hin, zeigen aber auch eine minimale Variabilität der Assay von Tag zu Tag, da die Daten aus verschiedenen Datensätzen erhoben und normalisiert wurden. Genauer gesagt zeigt die ergänzende Abbildung 3B die Gesamtfläche unter der Kurve für alle Bohrlöcher aus den jeweiligen Experimentplatten (farblich codiert, um die Platte desselben Experiments in ergänzender Abbildung 3A zu übereinstimmen), um die erwartete, aber minimale Variabilität innerhalb desselben Experiments und an verschiedenen Tagen mit unterschiedlichen Perlenpräparaturen zu demonstrieren. In der frühen Entdeckungsphase sind Methoden wie kD-DLS und säulenbasierte Ansätze (SMAC, CIC) aufgrund höherer Probenverbrauchsanforderungen und der Unfähigkeit, Rohmaterial 12,13,24,25,26,27 zu verarbeiten, nicht praktikabel; CS-SINS ermöglicht in diesem Stadium einzigartig das kolloidale Stabilitätsscreening mit nur 6 μg pro Probe, die in einem Schritt gereinigt werden kann. Schließlich wurde das Kurvenanpassungsskript aktualisiert, um die Feinabstimmung kleiner Lambda-Max-Verschiebungen zu ermöglichen und eine verbesserte Dateiverarbeitung sowie automatisierte Datenberichterstattung an interne Datenbanken zu ermöglichen.

Typische Fehlersuchszenarien sind: (1) hohe Standardabweichungen bei spektralen oder DLS-Werten, die oft auf eine unvollständige Mischung von Nanopartikeln (Schritt 7.6) oder Probenaggregation hinweisen – in solchen Fällen wird empfohlen, eine QC-Prüfung mit den dialysierten Proben durch DLS durchzuführen, um die Integrität nach der Dialyse sicherzustellen und die Einstellung zu spektralen Werten als Standardergebnis zu gewährleisten; (2) multimodale DLS-Verteilungen oder fehlgeschlagene DLS-Messungen, typischerweise verursacht durch bereits vorhandene Probenaggregation oder Staubkontamination – die Filtration durch 0,22-μm-Filter vor der Dialyse kann dies abmildern; (3) Diskrepanzen zwischen spektralen und DLS-Werten, die typischerweise auf verzerrte DLS-Messungen zurückzuführen sind (wahrscheinlich aufgrund hoher Polydispersität, die im normal-hohen Bereich des spektralen Scores liegt); (4) inkonsistente positive Kontrollwerte, meist verursacht durch unsachgemäße Nanopartikelspeicherung oder degradierte Capture mAb; Frische Aliquots, die bei -80 °C gelagert werden, sollten für jeden Assay verwendet werden (nicht länger als einige Tage bei 4 °C gelagert).

Einige Einschränkungen des Tests sind unter anderem die Zeit, um die Proben gründlich zu dialysieren und konjugierte Nanopartikel halbmanuell am Tag vor dem Test vorzubereiten; Dialysezeit ist jedoch unabhängig von der Größe des Stichprobensatzes äquivalent. Bezüglich des Risikos von Verstopfungen der Spitze überwachen die Flüssigkeitshandhabungstipps Druckänderungen während der Aspiration, und relevante Fehler treten während des Betriebs auf. Während der Methodenentwicklungsphase überprüften wir Logdateien (und machen das auch nach dem Service), um sicherzustellen, dass die erwarteten Volumes vom Skript berechnet werden. Die Aliquotierungsfunktionen wurden auf die konzentrierten Perlenpräparaten getestet und erwarten keine Probleme. Wir erkennen die zeitkritische Natur des Assays an, die von Fab dominierte Bewertung und seine Rolle als Ersatzassay, ohne direkt kolloidale Verhaltensweisen wie Viskosität und Opaleszenz zu messen. Diese Anpassung ermöglicht jedoch eine effiziente Charakterisierung größerer Datensätze früher im Wirkstoffforschungsprozess und dient als leistungsstarkes Screening-Tool, wo zuvor keine vorhanden war.

Mehrere kritische Schritte in diesem Protokoll erfordern sorgfältige Aufmerksamkeit, um reproduzierbare Ergebnisse sicherzustellen. Zunächst ist eine präzise pH-Anpassung während der Puffervorbereitung (Schritte 1.1.1 und 1.2.1) unerlässlich, da Abweichungen über ±0,1 pH-Einheiten hinaus die Stabilität der Nanopartikel und die Effizienz der Antikörperaufnahme beeinflussen können. Der niedrige pH-Puffer, der zur Herstellung von Fangantikörpern verwendet wird, gewährleistet eine optimale Konjugation, und die spezifizierten Pufferbedingungen wurden auf Ladungsstabilisierung und breite Antikörperkompatibilität optimiert (typischerweise im Formulierungskontext). Der 10-mM-Histidin-pH-6.0-Puffer sorgt für optimale elektrostatische Wechselwirkungen und erhält dabei die Proteinstabilität. Zweitens ist eine gründliche Dialyse mit vollständiger Salzentfernung (Schritt 2.3) entscheidend; Unvollständige Dialyse kann elektrostatische Wechselwirkungen während der Nanopartikelassemblage beeinträchtigen. Drittens muss der Schritt der Gold-Nanopartikelkonzentration (Protokollschritte 5.1–5.3) sorgfältig durchgeführt werden, um die Kugel nicht zu stören, da inkonsistente Nanopartikelkonzentrationen die Assay-Empfindlichkeit direkt beeinflussen. Viertens ist das PLL:capture-mAb-Verhältnis von 0,03 (Schritt 4.1) für maximale Oberflächenabdeckung optimiert, während ein ausreichendes plasmonisches Verschiebungsfenster beibehalten wird, wie bereits¹⁶ festgestellt. Im Hinblick auf die Flüssigkeitshandhabungsdynamik wurden Flüssigkeitssensorspitzen verwendet, um Normalisierungen durchzuführen und Plattenmischungen durchzuführen, bis Goldnanopartikel eingebracht wurden, die nicht zuverlässig in Lösung gemessen werden (und daher die Dosierungsvolumen auf Standardmengen setzen). Die Flüssigkeitsmessung stromaufwärts ermöglicht es, dass der Bediener Probleme mit Plattenfehlstellungen oder fehlenden Proben markiert, während der 384-Well-Stempelschritt Z-Ausrichtungsprobleme identifiziert. Schließlich ist die strikte Einhaltung des 4-Stunden-Inkubationszeitpunkts (Protokollschritte 7.10–7.12) und das konsequente Lesen der Platte von Anfang bis Ende (unabhängig von einer unvollständigen Platte) entscheidend, da die plasmonische Verschiebung und das Clustering von Nanopartikeln zeitabhängige Phänomene sind; Verzögerungen oder frühe Lesungen können zu ungenauen CS-SINS-Ergebnissen führen, während das vollständige Lesen der Punktzahl im HTP-Format eine einheitliche Punktzahl über Tage hinweg gewährleistet.

Da die kolloidale Stabilität multispezifischer Antikörper zunehmend untersucht wird, haben die umfangreichen Datensätze von HTP-biophysikalischen Assays wie CS-SINS das Potenzial, KI/ML-Modelle zu unterstützen, um kombinatorische Effekte auf Molekülstabilität besser zu verstehen. Studien haben gezeigt, dass mit zunehmender Sequenzdiversität der Bedarf an größeren Datensätzen steigt, um die Genauigkeit von KI/ML-Ergebnissen zu verbessern 41,42,43. Eigenschaften und molekulare Deskriptoren für Monospezifische können sich ändern, wenn sie in Bispezifische oder Trispezifische umformatiert werden, wobei die gesamte Molekülladungsverteilung und -balance berücksichtigt wird, im Gegensatz zu sequenz- oder motivspezifischen Überlegungen für Attribute wie chemische Abbauverbindlichkeiten 17,18,19,20,21,22 . Bemerkenswert ist, dass strukturelle Merkmale wie vorhergesagte elektrostatische Flecken, Hydrophobie und lösungsmittelzugängliche Oberfläche die Vorhersagen von Aggregation und Stabilität unabhängig von sequenzspezifischen Eigenschaften verbessern können, wodurch mehrere kleinere Datensätze mit der Vorhersagevorbereitung kompatibel sind 17,18,19,20,21,22. Die Einfachheit des CS-SINS-Scores als Bezug auf die repräsentative Kulmination des biophysikalischen Profils eines Moleküls macht den Assay geeignet für das Training von KI/ML-Modellen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
CLEARSEAL FILM 100PKCLEARSEAL	Fisher Scientific	500214
CO-RE II (50 μL Conductive Tips, 300 μL Conductive Tips, 300 µL Slim Conductive Tips)	Hamilton Company	235966, 235902, 235806
Eppendorf Tubes Snap Cap (5,0 mL, Microtube)	Eppendorf	30119401
Falcon Conical Centrifuge Tubes (15 mL)	Thermo Fisher Scientific	Falcon 352196
Goat antihuman Fcγ-specific antibody	Jackson ImmunoResearch Laboratories	109-005-008
Gold nanoparticles (20 nm)	Ted Pella Inc.	157051
Greiner Bio-One 384-well μClear Bottom Polystyrene Microplates – (SS & DLS assay plates)	Fisher Scientific	07-000-057
Greiner Bio-One MASTERBLOCK 96 Deep Well Conical Bottom 2 mL Storage Plate – (mastermix and reagent mixing plates)	Fisher Scientific	07-000-122
Hard-Shell PCR Plates normalization (96-Well, low profile, thin wall, skirted, white/clear HSP9601)	Bio-Rad	HSP9601	URL: https://www.bio-rad.com/en-us/sku/HSP9601-hard-shell-96-well-pcr-plates-low-profile-thin-wall-skirted-white-clear?ID=HSP9601
Histidine hydrochloride buffer sample (10 mM, pH = 6,0, sample and assay buffer)	Sigma	H8125; H6034	Prepare final concentration of 5 mM per reagent in ultra-pure water, adjust pH to 6,0, adjust final volume with ultra-pure water, and filter with 0,22 μm filter
Matrix ScrewTop Tubes sample (500 μL)	Thermo Fisher Scientific	3744
MD100 or MD300 Xpress Mini Dialyzer (Xpress Micro Dialyzer, Scienova, 6-8 kDa, 96 pcs. in deep well plate (12 cartridges), sealing sheet) and dialysis reservoir/box (low volume dialysis cassettes)	Vivaproducts, Inc.	40789, 40076
Microcentrifuge tubes pure polypropylene (1,5 mL)	USA Scientific	1615-5500
Nalgene Disposable Polypropylene Robotic Reservoirs – (buffer trough)	Thermo Fisher Scientific	1200-2300
Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with PES Membranes	Thermo Fisher Scientific	567-0020
Poly-L-lysine, >70.000 MW	MP Biomedicals	219454405	Prepare a 5 mg/mL stock solution in ultra-pure water
Positive and negative Controls (1 mg/mL dialyzed into 10 mM Histidine, pH 6)	Internally-produced commercial antibodies	N/A	~2 nm spectral shift and DLS size of 250-300 nm for positive control; negligible spectral shift and DLS size comparable to buffer only control
Potassium acetate buffer capture (20 mM, pH = 4,3, mAb conjugation buffer)	Fisher Scientific	P171-500	Prepare final concentration of 10 mM reagent in ultra-pure water, adjust pH to 4,3 with acetic acid, adjust final volume with ultra-pure water, and filter with 0,22 μm filter
Zeba desalting columns (2 mL, 5 mL, or 10 mL)	Thermo Fisher Scientific	PI-89889; 89891; 89893