Vergleichende RNA-Strukturanalyse von entjungen und reifen Transkripten in Saccharomyces cerevisiae

Summary

Die RNA-Sekundärstruktur wurde hauptsächlich in reifer RNA mit Struktursondierungsmethoden beobachtet. Die Co-transkriptionelle Struktur-Tracking-Sequenzierung (CoSTseq) vereint den nuklearen Run-on, der zur Untersuchung der Polymeraseposition auf entstehender RNA verwendet wurde, mit Strukturprobing. CoSTseq ermöglicht dadurch die Beobachtung der RNA-Sekundärstruktur in RNA unter aktiver Transkription.

Abstract

Während der Transkription beginnt die naszente RNA mit der Basenpaarung, sobald sie RNA-Polymerasen (Pols) verlässt. Diese Basenpaarung ermöglicht die Bildung von RNA-Strukturen, die die Genexpression auf der Ebene der RNA-Verarbeitung, Translation und Stabilität maßgeblich beeinflussen. Etablierte Methoden zur Untersuchung der RNA-Sekundärstruktur sind auf reife Transkripte beschränkt, während über Faltungszustände wenig bekannt ist. Darüber hinaus erschweren die relativ geringere Häufigkeit (< 1 %) und die vorübergehende Natur der entstehenden RNA deren Isolierung und Charakterisierung. Ko-transkriptionelle Strukturverfolgung (CoSTseq) nutzt transkriptionelle Run-On mit Biotin-NTP- und Dimethylsulfat-(DMS)-Sonden, um gleichzeitig Pol-Position und Basenpaarungsstatus entstehender Transkripte zu ermitteln. Bei Saccharomyces cerevisiae liefert CoSTseq die Sequenz- und Strukturinformationen nahe dem 3'-Ende entstehender RNAs, die von einem der drei RNA-Pols transkribiert werden. Während des transkriptionellen Durchlaufs blockiert das Biotin-NTP, das an der aktiven Stelle eingebaut wird, effektiv Pols. Anschließend die Behandlung mit DMS-Methylaten, ungepaarten A-, C- und U-Nukleotiden. Die anschließende Biotinanreicherung und cDNA-Synthese mit einer Template-Switching-Reverse-Transkriptase ermöglichen die paarweise Endsequenzierung und die Berechnung der DMS-Reaktivitäten als Funktion der Pol-Position. CoSTseq kann problemlos parallel zu DMS-Sondierung (DMS-MaPseq) durchgeführt werden, was auch die Erfassung des gefalteten reifen Transkripts ermöglicht. Hier wird ein detailliertes Protokoll für parallele CoSTseq und DMS-MaPseq präsentiert, einschließlich transkriptioneller Run-on, Bibliotheksvorbereitung und Datenanalyse.

Introduction

RNA kann aufgrund der Basenpaarung innerhalb von RNA-Molekülen in sekundäre und tertiäre Strukturen folden, und diese Strukturen können weiter von Proteinen beeinflusst werden, die als Chaperone fungieren, um RNA-Faltung¹ zu steuern. Die RNA-Struktur kann hochdynamisch sein, wobei zelluläre RNAs sich einer Reihe von Strukturen anpassen können, die durch die thermodynamische Landschaft definiert sind, um Ensembles möglicher RNA-Konformationen^{zu erzeugen 2}. Dynamische Konformationsänderungen haben das Potenzial, die Genregulation und -expression^zu beeinflussen ^....

Protocol

HINWEIS: Stellen Sie vor Beginn sicher, dass alle in Tabelle 1 aufgeführten Puffer vorbereitet sind. Alle Reagenzien sollten in nukleasefreiem Wasser vorbereitet werden. Die Filtersterilisation von Puffern wird empfohlen, wenn nicht-molekularbiologische Chemikalien/Reagenzien zur Puffervorbereitung verwendet werden. Für die Abschnitte 1 bis 4 bereiten Sie Folgendes im Voraus vor:

1. Herstellung von Materialien und Reagenzien

1. Bereiten Sie mindestens einen Tag im Voraus eine 10%ige Sarkosyllösung (v/v) vor, um genügend Zeit für die vollständige Auflösung zu haben.....

Results

Dieser Abschnitt präsentiert die tatsächlichen Ergebnisse, die durch die Implementierung des CoSTseq-Workflows und der Analyse erzeugt werden, wie in diesem Protokoll beschrieben. Zunächst beschreibt dieser Abschnitt die erwarteten Ergebnisse nach der Qualitätsbewertung erfolgreicher Bibliotheksvorbereitungen vor und nach der Sequenzierung. Vor der Sequenzierung können Forscher eine Test-PCR- und TapeStation-Analyse verwenden, um das Vorhandensein von RNA nach der Biotinanreicherung zu b.......

Discussion

RNA beginnt, sich ko-transkriptionell zu falten, da die Basenpaarung im Vergleich zur Synthesegeschwindigkeit 24,25,26,27 schneller ist. Unser aktuelles Wissen über die entstehende RNA-Faltung stammt aus Einzelmolekülstudien prokaryotischer RNAs, in-vitro-Sondierung oder in-silico-Ansätzen. In diesem Protokoll wird ein detaillierter Workflow v.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10mM ATP	Invitrogen	18330019
10mM Biotin-11-CTP	Jenaer Biowissenschaften	NU-831-BIOX
10mM GTP	Invitrogen	18332015
10mM UTP	Invitrogen	18333013
10X NEBuffer 1	New England Biolabs	B7001S	Verwendet in Schritt 7.2.1
10-fach phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)	Gibco	70011-044
20 % SDS	RPI	L23100-500
Saures Phenol: Chloroform	Ambion	AM9722
AMPure XP-Perlen zur Größenauswahl	Beckman Coulter	A63880	Verwendet für die Größenauswahl in Schritt 7.5.1
Bacto-Pepton	Gibco	211677
Bacto-Hefeextrakt	Gibco	212750
Bicine	Sigma Aldrich	B3876-100G
Chloroform	Sigma Aldrich	319988
D-(+)-GLUKOSE	Sigma Aldrich	G5767-500G
DIFCO AGAR	BD DIFCO	214010
Dimethylsulfat	Sigma Aldrich	D186309-5ML
Dynaperlen & Handel; MyOne Streptavidin C1 Perlen	Invitrogen	65001	Verwendet für Biotin-Pulldown in Abschnitt 4.1
Dynaperlen & Handel; mRNA DIRECT™ Reinigungskit	Invitrogen	61011	Verwendet für die Poly-A-Auswahl in Abschnitt 5.1
EDTA, pH 8, 0,5M	Sigma Aldrich	03690-100ML
Ethanol	Sigma Aldrich	E7023-500ML
GlycoBlue	Invitrogen	AM9516	Co-Präzipitant verwendet in Schritt 4.2.7 und 5.2.4
Induro®   Umgekehrte Transkriptase	New England Biolabs	M0681S	RT-Enzym verwendet in Schritt 6.3.1
Isoamylalkohol	Sigma Aldrich	W205710-1KG-K
Isopropanol	JT-BAKER	9084-05-01
KAPA HiFi HotStart PCR Kit	Roche	07958889001	Hochpräzises DNA-Pol, verwendet in 7.3.2 und 7.4.1 für PCR-Reaktionen
Magnesiumchlorid	Sigma Aldrich	SLCM2154
MinElute PCR-Reinigungskit	Qiagen	28004	Verwendet für die DNA-Bereinigung in Schritt 6.3.3 und 7.2.2
Mth RNA-Ligase	New England Biolabs	M2611A
Oligo Clean & Konzentrator	Zymo-Forschung	D4060	Vorgeschlagen für die DNA-Oligo-Reinigung in Schritt 7.1.2
Kaliumacetat	Sigma Aldrich	236497-500G
Kaliumchlorid	JT Baker	3040-01
Kaliumhydroxid	Avantor	6984-04-01
RNA Clean & Konzentrator-5	Zymo-Forschung	R1014	RNA-Reinigungskit, das in Schritt 5.3.2 nach der PNK-Behandlung verwendet wird
RNaseOUT™ Rekombinanter Ribonukleaseinhibitor	Thermo Fisher Scientific	10777019	RNase-Inhibitor verwendet in Schritt 5.3.1 während der PNK-Behandlung
Sarkosyl	IBI Scientific	IB07080
Natriumacetat	Qualitätsbiologisch	351-035-721
Natriumchlorid	Sigma Aldrich	S5150-1L
Natriumhydroxid	Macron	7708-10
SUPERase· In™ RNase-Inhibitor (20 U/μ L)	Thermo Fisher Scientific	AM2696	RNase-Inhibitor verwendet in Schritt 6.3.1
T4-Polynukleotid-Kinase	New England Biolabs	M0201S
Thermostabil 5' App-DNA/RNA-Ligase	New England Biolabs	M0319L
Tris-HCl, pH 7,4, 1M	Thermowissenschaftlich	J60202. K2
Triton X-100	TEKNOVA	T1105
TRIzol™ Reagenz	Invitrogen	15596-026	Für die entstehende RNA-Elution in Abschnitt 4.2; auch als "RNA-Reagenz" in Abschnitt 4 bezeichnet
β-Mercapptoethanol	Sigma Aldrich	M6250-1L