Vergleichende RNA-Strukturanalyse von entjungen und reifen Transkripten in Saccharomyces cerevisiae

Summary

Die RNA-Sekundärstruktur wurde hauptsächlich in reifer RNA mit Struktursondierungsmethoden beobachtet. Die Co-transkriptionelle Struktur-Tracking-Sequenzierung (CoSTseq) vereint den nuklearen Run-on, der zur Untersuchung der Polymeraseposition auf entstehender RNA verwendet wurde, mit Strukturprobing. CoSTseq ermöglicht dadurch die Beobachtung der RNA-Sekundärstruktur in RNA unter aktiver Transkription.

Abstract

Während der Transkription beginnt die naszente RNA mit der Basenpaarung, sobald sie RNA-Polymerasen (Pols) verlässt. Diese Basenpaarung ermöglicht die Bildung von RNA-Strukturen, die die Genexpression auf der Ebene der RNA-Verarbeitung, Translation und Stabilität maßgeblich beeinflussen. Etablierte Methoden zur Untersuchung der RNA-Sekundärstruktur sind auf reife Transkripte beschränkt, während über Faltungszustände wenig bekannt ist. Darüber hinaus erschweren die relativ geringere Häufigkeit (< 1 %) und die vorübergehende Natur der entstehenden RNA deren Isolierung und Charakterisierung. Ko-transkriptionelle Strukturverfolgung (CoSTseq) nutzt transkriptionelle Run-On mit Biotin-NTP- und Dimethylsulfat-(DMS)-Sonden, um gleichzeitig Pol-Position und Basenpaarungsstatus entstehender Transkripte zu ermitteln. Bei Saccharomyces cerevisiae liefert CoSTseq die Sequenz- und Strukturinformationen nahe dem 3'-Ende entstehender RNAs, die von einem der drei RNA-Pols transkribiert werden. Während des transkriptionellen Durchlaufs blockiert das Biotin-NTP, das an der aktiven Stelle eingebaut wird, effektiv Pols. Anschließend die Behandlung mit DMS-Methylaten, ungepaarten A-, C- und U-Nukleotiden. Die anschließende Biotinanreicherung und cDNA-Synthese mit einer Template-Switching-Reverse-Transkriptase ermöglichen die paarweise Endsequenzierung und die Berechnung der DMS-Reaktivitäten als Funktion der Pol-Position. CoSTseq kann problemlos parallel zu DMS-Sondierung (DMS-MaPseq) durchgeführt werden, was auch die Erfassung des gefalteten reifen Transkripts ermöglicht. Hier wird ein detailliertes Protokoll für parallele CoSTseq und DMS-MaPseq präsentiert, einschließlich transkriptioneller Run-on, Bibliotheksvorbereitung und Datenanalyse.

Introduction

RNA kann aufgrund der Basenpaarung innerhalb von RNA-Molekülen in sekundäre und tertiäre Strukturen folden, und diese Strukturen können weiter von Proteinen beeinflusst werden, die als Chaperone fungieren, um RNA-Faltung¹ zu steuern. Die RNA-Struktur kann hochdynamisch sein, wobei zelluläre RNAs sich einer Reihe von Strukturen anpassen können, die durch die thermodynamische Landschaft definiert sind, um Ensembles möglicher RNA-Konformationen^{zu erzeugen 2}. Dynamische Konformationsänderungen haben das Potenzial, die Genregulation und -expression^zu beeinflussen ^3,4. Umgekehrt kann RNA auch sehr bevorzugte Strukturen annehmen, die eng mit ihrer Funktion verbunden sind, wie tRNAs, kleine Kern-RNAs und rRNA. Während diese Beispiele reife RNAs mit starken regulatorischen Rollen hervorheben, treten eukaryotische RNA-Verarbeitungsschritte häufig gleichzeitig mit der Transkription auf, einschließlich Pre-mRNA-Spleißen, 3'-End-Spaltung und RNA-Modifikation. Ebenso kann RNA-Faltung vor der Reifung des Transkripts stattfinden, wie an anderer Stelle diskutiert⁵.

Während die RNA-Sequenz die sekundäre Struktur kodieren kann, erfordert eine genaue Bestimmung oft eine experimentelle Validierung in vitro oder in vivo. Das Aufkommen strukturspezifischer chemischer Modifikationstechniken wie DMS-MaPseq (Dimethylsulfat-Mutationsprofilierung mit Sequenzierung) hat den Weg für die Bestimmung der zellulären RNA-Sekundärstruktur aus lebenden Zellen⁶ geebnet. DMS wird in Zellen eingeführt und methyliert gezielt die Watson-Crick-Basenpaarungsflächen von Adenosin, Cytosin und in geringerem Maße Uridin, die nur ungepaart zugänglich sind. Nach der Modifikation durch DMS kann eine hochpräzise und hochprozessive Reverse Transcriptase, wie die Thermostable Group II Intron Reverse Transcriptase (TGIRT)⁷, verwendet werden, um modifizierte Basen als Mutationen in der endgültig vorbereiteten cDNA-Bibliothek neu zu kodieren. Diese Mutationen können dann genutzt werden, um die Zugänglichkeit von RNA auf Nukleotidebene zu bestimmen. Obwohl es eine leistungsstarke Technik ist, wurden DMS-MaPseq und verwandte Methoden hauptsächlich zur Untersuchung reifer RNA eingesetzt, die bereits vollständig^{gefaltet 6} ist.

Mehrere Methoden wurden zur Untersuchung der Regulierung und Verarbeitung von jungem RNA entwickelt. Global Run-on Sequencing (GROseq) wurde entwickelt, um die Einschränkungen von RNA-seq zu überwinden, das eine stationäre Messung der RNA-Niveaus in Zellen ermöglicht und somit Informationen liefert, die über Transkription, RNA-Verarbeitung und Abbauprozesse hinweg gemittelt werden, die RNA-Niveaus beeinflussen. GROseq verwendete Bromoutin für nukleare Run-on, wobei eine RNA-Polymerase (Pol) Nukleotide zu entstehender RNA bei der Auflösung von Dutzend Basen⁸ hinzufügen konnte. Auf dieser Methodik basierte die präzise Run-on-Sequenzierung (PROseq), um RNA-Pols auf entstehender RNA mit Basenpaar-Auflösung unter Verwendung von Biotin-NTPs zu kartieren. Hier wird ein biotinyliertes NTP hinzugefügt, wo Pol zuletzt am 3'-Ende der neu synthetisierten RNA⁹ nachgewiesen wurde.

Kürzlich haben Schärfen et al. Co-transkriptionelle Strukturverfolgung (CoSTseq) entwickelt und genutzt, die Biotin-Run-on und DMS-Sondierung nutzen und anpassen, um die RNA-Strukturbestimmung entstehender Transkripte in S. cerevisiae¹⁰ zu ermöglichen. CoSTseq ermöglicht die Bestimmung der RNA-Sekundärstruktur während aktiver Transkription; dieses Protokoll beschreibt, wie nuklearer Run-on während CoSTseq-Experimenten mit DMS-Sonden kombiniert wird. Da CoSTseq bei der Probenvorbereitung eine sorgfältige Handhabung sowie eine genaue Aufmerksamkeit der Datenqualität bei der CoSTseq-Analyse erfordert, beschreibt dieses Protokoll Best Practices zur Generierung geeigneter Bibliotheken für die Paired-End-Sequenzierung auf der Illumina-Plattform. Das CoSTseq-Protokoll liefert gleichzeitig junge und reife RNA, von denen letztere als DMS-MaPseq-Datensatz analysiert werden können, um einen rigorosen Vergleich zwischen junger und reifer RNA zu ermöglichen (Abbildung 1). Experimentell ist der Zugang zu Reagenzien erforderlich, die zur Aufrechterhaltung von Hefekulturen sowie zur Durchführung von nukleären Run-on- und DMS-Sonden benötigt werden, wie im untenstehenden Protokoll beschrieben. Der entstehende RNA-Ertrag ist entscheidend für den Erfolg der CoSTseq-Bibliotheksvorbereitung und Datenanalyse; Daher sind die von geeigneten Inkubatoren und Wachstumsmedien geschaffenen Wachstumsbedingungen entscheidend, um ausreichend Ausgangsmaterial zu sichern. Schließlich ist der Zugang zu einem High-Performance Computing (HPC)-Cluster ideal, um eine computergestützte Analyse der CoSTseq-Daten durchzuführen.

Abbildung 1: Überblick über die kombinierte CoSTseq- und DMS-MaPseq-Bibliotheksvorbereitung aus derselben biologischen Probe. (A) Die Permeabilisierung der Hefezellwand und der Kernmembran mit Sarkosyl ermöglicht die Einbindung von Biotin-NTP am 3'-Ende der entstehenden RNA während einer nuklearen Run-on-Reaktion. (B) DMS-Methylaten, ungepaarte A- und C-Reste (manchmal U) auf entstehender und reifer RNA in der permeabilisierten Zelle, und die gesamte RNA wird durch Phenol/Chloroform-Extraktion gewonnen. Naszente RNA wird dann durch streptavidinkonjugierte magnetische Perlen aus der gesamten RNA gereinigt; Die TRIzol-Extraktion setzt die entstehende RNA aus den Perlen frei. Parallel dazu kann der Perlensupernatant mit polyadenylierten mRNAs mit EtOH ausgefällt werden; aus diesem Material kann mRNA durch Oligo(dT)-Perlenpulldown isoliert werden. Poly-A+-mRNAs werden vor der Bibliotheksvorbereitung fragmentiert. (C) Eine template-switching-Reverse-Transkriptase wird verwendet, um cDNA separat aus junger oder reifer RNA zu erzeugen, gefolgt von der Ligation von 5'- und 3'-Adaptern zur Einführung eines_N7-UMI und Barcodes (siehe Abbildung 2 für Details zu CoSTseq). Beachten Sie, dass die Reverse-Transkriptionsschritte von DMS-MaPseq und CoSTseq unterschiedliche Heteroduplex-Adapter mit Überhängen verwenden, die komplementär zu Biotin-NTP im CoSTseq verwendet werden, und N-Überhängen, die in DMS-MaPseq verwendet werden. Minimale PCR-Zyklen werden zur Verstärkung verwendet, um den Bias in der Bibliothek zu begrenzen, und die Größenauswahl wird angewandt, um Adapterdimere zu entfernen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Protocol

HINWEIS: Stellen Sie vor Beginn sicher, dass alle in Tabelle 1 aufgeführten Puffer vorbereitet sind. Alle Reagenzien sollten in nukleasefreiem Wasser vorbereitet werden. Die Filtersterilisation von Puffern wird empfohlen, wenn nicht-molekularbiologische Chemikalien/Reagenzien zur Puffervorbereitung verwendet werden. Für die Abschnitte 1 bis 4 bereiten Sie Folgendes im Voraus vor:

1. Herstellung von Materialien und Reagenzien

1. Bereiten Sie mindestens einen Tag im Voraus eine 10%ige Sarkosyllösung (v/v) vor, um genügend Zeit für die vollständige Auflösung zu haben. Filtersterilisieren Sie die homogene Lösung mit einem 0,22 μm-Filter. Am Tag des Experiments verwenden Sie das 10%ige Sarkosyl, um eine 0,5%ige Sarkosyllösung herzustellen, und lassen Sie sie bis zur Anwendung auf Eis.
2. Ultrazentrifugen auf 4 °C vorkühlen. Im Dampfhaube stellen Sie den Thermomixer auf 30 °C ein und erwärmen Sie einen Aliquot mit 2,5x Structure Probing Buffer vor. Dieser Thermomixer wird später für die DMS-Behandlung verwendet.
3. Im Abzugshaube stellen Sie einen Heizblock auf 65 °C ein und erwärmen Sie 650 μL Säurephenol: Chloroform pro Reaktion zur RNA-Extraktion.
4. Mischen Sie DTT mit einem 2,5-fachen Transkriptionspuffer auf eine Endkonzentration von 2 mM. Frisch bereiten und kühlen Sie die Abschreck- und Waschlösungen für die sofortige Verwendung nach der DMS-Behandlung vor (siehe Tabelle 1).
5. Aliquot 40 μL mit 20 % SDS in die Röhrchen zur Hefelyse vor der RNA-Extraktion. Bereiten Sie vor der Verwendung eine 100 mM Zinkchlorid (ZnCl2)-Lösung vor und sterilisieren Sie sie mit Filtern.
6. Generieren Sie Deletion-, Depletion- oder Knock-in-Hefestämme, die erforderlich sein könnten, um spezifische Forschungsfragen zur entstehenden RNA-Basenpaarung im Vergleich zum Wildtyp-Stamm der Knospungshefe zu beantworten. Immer frisch die Stämme wiederbeleben, indem man auf einer geeigneten Hefe-Agarplatte (YPD, Dropout oder Antibiotikaplatten) streift. Starten Sie am Tag vor Beginn des Experiments eine Flüssigkeitskultur aus einer einzelnen Kolonie. Weitere Anleitungen zum Wachstum und zur Manipulation von Hefestämmen finden Sie bei Schärfen et al., 2025.

2. Herstellung von Hefezellen für CoSTseq

1. Aufbau einer Vorkultur: Ziehen Sie den S. cerevisiae-Stamm BY4741 in 50 mL YPAD-Medien, bis die Zellen die mittlere Logitam-Phase erreichen (Optische Dichte (OD) bei 600 nm = 0,6) bei 30 °C mit Schütteln bei 200 U/min. Falls nötig, verdünnen Sie die Kultur auf 0,2–0,3 OD und lassen Sie die Hefe 0,6 OD erreichen.
2. Hefegewinnung: Hefe sammeln und 1,8 OD (~3 ml) Hefekultur bei 2.500 x g für 3 Minuten in einer vorgekühlten Zentrifuge (4 °C) abdrehen. Entsorgen Sie das Supernatant in einem Abfallbehälter. Waschen Sie das Pellet, indem Sie 10 ml kaltes phosphatgepuffertes Kochsalzlösungsmittel (PBS) neu suspendieren. Noch einmal bei 2.500 x g für 3 Minuten bei 4 °C drehen. Entsorgen Sie das Oberrohr und legen Sie das Hefepellet auf Eis.
3. Permeabilisierung der Hefezellen: Das Hefepellet wird vorsichtig in 10 mL kaltem 0,5 % Sarkosyl wieder suspendiert. Verwenden Sie einen P1000-Pipettor zum Resuspendieren der Zellen und vermeiden Sie das Erzeugen von Blasen. Inkubiere 20 Minuten auf Eis, um die Permeabilisierung zu fördern. Pelletiere die permeabilisierten Hefezellen bei 400 x g für 5 Minuten bei 4 °C. Die permeabilisierten Hefezellen werden in 100 μL nukleasefreiem Wasser wieder suspendiert.

HINWEIS: Obwohl die DMS-Markierung keine Zellwandpermeabilisierung erfordert, erfordert die nukleare Run-on-Reaktion eine Permeabilisierung, damit biotinylierte Nukleotide den Transkriptionsort erreichen. Dies wird durch eine Sarkosylbehandlung erreicht, die sowohl die Hefezellwand als auch ihre Kernmembran permeabilisiert. Darüber hinaus erleichtert die Sarkosylbehandlung den Run-on-Assay, indem sie neue Transkriptionsinitiierungsereignisse verhindert und negative Elongationsfaktoren von Pol II und Chromatin ^11,12 entfernt. Behandle die Proben vorsichtig und halte eine niedrige Zentrifugalgeschwindigkeit (400 x g) aufrecht, um Zellriss zu verhindern und eine erfolgreiche Biotin-Einbindung in verlängernde entstehende Transkripte^{zu fördern 13}.

3. Nuklear-Run-On und DMS-Sonde

HINWEIS: Der nukleare Lauf mit Biotin-NTP führt zu sterischer Behinderung, die RNA-Pols an ihrem aktiven Standort stoppt und einen Biotingriff für die selektive Anreicherung junger RNA bereitstellt. Je nach gewünschter Auflösung kann ein nuklearer Run-on mit einem, zwei oder allen vier biotinylierten Ribonukleotide⁹ durchgeführt werden. Aus Kostengründen verwendet der hier beschriebene Workflow nur ein biotinyliertes Nukleotid (d. h. Biotin-CTP).

1. Aufbau der nuklearen Run-on-Reaktion
   1. Bereiten Sie eine 2,5-fache Transkriptionspuffer-Arbeitslösung mit frisch hinzugefügtem 5 mM DTT vor und vorwärmen Sie den 2,5-fachen Struktur-Probing-Puffer auf 30 °C (siehe Tabelle 1).
   2. In einem sauberen 2-mL-Röhrchen fügen Sie 120 μL 2,5-fachen Transkriptionspuffer, 3,75 μL 10 mM ATP, 3,75 μL 10 mM GTP, 3,75 μL 10 mM UTP, 7,5 μL 1 mM Bio-CTP, 15 μL 10 % Sarkosyl zusammen und erhöhen Sie das Volumen auf 200 μL mit 46,25 μL nukleasefreiem Wasser.
   3. Gib 100 μL Zellen in das Rohr und inkubiere in einem auf 30 °C eingestellten Thermomixer für 2 Minuten mit 500 U/min.
      HINWEIS: Dieser Schritt ist sehr zeitkritisch. Versuche, die Anzahl der Stichproben zu begrenzen, um zuverlässige Daten zu erzeugen. Es ist beste Praxis, das Timing zwischen den Proben für Konsistenz zu staffeln.
2. DMS-Behandlung: Nach Abschluss der Inkubation werden schnell 200 μL vorgewärmten 2,5-fachen Strukturpuffer und 25 μL DMS-Reagenz gleichzeitig in das Rohr gegeben. Vortex sanft in zwei Pulsen und weiter 4 Minuten lang auf dem Thermomixer bei 30 °C inkubieren, während es bei 500 U/min geschüttelt wird. Räumen Sie 30 Sekunden zwischen den Samples ein, um konsistent zu sein.
   HINWEIS: DMS-Sonde ist eine sofortige Reaktion, die eine hohe zeitliche^{Auflösung 14} des RNA-Basenpaarungsstatus ermöglicht. Um eine kontinuierliche DMS-Modifikation zu verhindern, ist es entscheidend, die DMS-Kennzeichnung umgehend mit dem starken Reduktionsmittel β Mercaptoethanol abzuschrecken. Außerdem behindert das verbleibende DMS die RNA-Rückgewinnung bei der Extraktion. Die Zugabe von wassergesättigtem Isoamylalkohol vor der Zentrifugation kann das unlösliche DMS im Zellpellet¹⁵ entfernen. Dieser Schritt ist sehr zeitkritisch. Es ist unerlässlich, mit einer begrenzten Anzahl von Stichproben zu arbeiten, um verlässliche Daten zu erzeugen.
   VORSICHT: DMS ist eine hochgiftige, farblose Flüssigkeit mit einem leicht zwiebelartigen Geruch. Bei der Arbeit mit DMS sind extreme Vorsichtsmaßnahmen erforderlich. Direkter Kontakt und/oder das Einatmen von Dämpfen kann eine Nekrose von Augen, Mund und Atemwegen verursachen, einschließlich schwerer Schäden an Organen. Tragen Sie Schutzbrillen, einen Laborkittel und richtige Handschuhe. Wenn möglich, doppelten Handschuh verwenden und die Handschuhe sofort nach der Belichtung oder nach DMS-Benutzung wechseln. Führen Sie Schritte mit DMS unter einer Abzugshaube aus. Verwenden Sie spezielle Abfallbehälter für die DMS-Entsorgung.
3. Abschrecken und Waschen
   1. Bereiten Sie Puffer vor, wie in Tabelle 1 erwähnt, im Voraus und legen Sie sie auf Eis, bis Sie sie verwenden. Stoppe die DMS-Methylierung, indem du 1 ml Stop-Puffer hinzufügst.
   2. Drehen Sie die DMS-gekennzeichneten Proben für 5 Minuten bei 3.500 x g in einer vorgekühlten Zentrifuge ab. Entsorgen Sie den Abfall in einen geeigneten Abfallbehälter.
   3. Gib 1 ml Waschpuffer zum Pellet und suspendiere es erneut. Wiederhole Schritt 3.3.2. Geht sofort mit der RNA-Extraktion über. Frieren Sie das Hefepellet nicht ein.
4. Phenolchloroform-Extraktion
   1. Die DMS-markierte Hefe wird in 600 μL RNA-Lysepuffer neu suspendiert und anschließend in Röhren mit 40 μL 20 % SDS übertragen. Inkubiere bei 65 °C 30 Sekunden lang mit Schütteln bei 950 U/min.
   2. Fügen Sie dem Hefelysat 650 μL vorgewärmtes Säure-Phenol:Chloroform hinzu und erhitzen Sie es weiter auf dem Thermomixer für 2 Minuten bei 65 °C, wobei Sie bei 950 U/min schütteln. Lass die Proben 5 Minuten auf dem Eis liegen.
      HINWEIS: Wechsel in der Zwischenzeit den Wärmeblock oder Thermomixer auf Raumtemperatur (RT).
   3. Zentrifugiere bei 20.000 x g für 3 Minuten bei RT.
   4. Die oberste Schicht in ein neues Rohr verlegen und 650 μL Chloroform hinzufügen. Vortex kurzzeitig. Zentrifugieren Sie erneut und sammeln Sie die oberste Schicht in einem neuen Röhrchen mit 700 μL Isopropanol.
   5. Invertieren, um zu mischen und 30 Minuten im -20 °C Gefrierschrank auszubrüten, sodass die RNA ausfällen kann. Zentrifugiere mit 20.000 x g für 45 Minuten bei 4 °C. Entsorge das Supernatant. Waschen Sie das Pellet mit 750 μL 75% Ethanol (EtOH).
      HINWEIS: Dies ist ein Stopp-/Pause-Punkt im Protokoll. Die Proben können über Nacht bei -80 °C in 75 % EtOH gelassen werden.
   6. Dreimal 3 Minuten bei 20.000 x g drehen und das Supernatant entsorgen. Trocknen Sie das RNA-Pellet an der Luft und lösen Sie es in 81 μL nukleasefreiem Wasser. Quantifizieren Sie die RNA-Ausbeute mit einem Spektrophotometer auf eine Wellenlänge von 260 nm. Wenden Sie 1 μL der oben genannten Aufhängung zum Messen an. Verdünnen Sie die RNA-Probe bei Bedarf. Mindestens 80 μg Gesamt-RNA sollten vorhanden sein, um zum nächsten Schritt überzugehen.
      HINWEIS: Falls nötig, kann DMS-markierte RNA bei -80 °C bis zu 2 Wochen gelagert werden.

4. Naszente RNA (CoSTseq)

HINWEIS: Die gesamte RNA, die aus dem Phenol gewonnen wird: Chloroform-Extraktion enthält DMS-markierte reife RNAs sowie DMS-markierte biotinylierte naszente RNAs aus allen drei Polymerasen. Um die entstehenden RNAs von der Gesamt-RNA zu reinigen, werden in den folgenden Schritten Streptavidinperlen verwendet, um biotinylierte naszente RNA zu bereichern. Aufgrund der starken Affinität des Biotins für Streptavidin (K_d = ^10-14 - ^10-15 M) werden zwei aufeinanderfolgende RNA-Reagenzextraktionen (siehe Materialtabelle) durchgeführt, um die RNA von den Streptavidinperlen zu elutieren. Beachten Sie, dass weniger als 1 % der Hefe-RNA junge RNA sind, abhängig von der Wachstumsbedingung¹⁶.

1. Biotin-Pulldown
   1. Herstellung von Streptavidin-Magnetperlen
      1. Bereiten Sie den Vorwaschpuffer A und den Vorwaschpuffer B wie in Tabelle 1 für die Zusammensetzung vor. Streptavidin-Magnetperlen durch Vortexen homogenisieren. Erhalten Sie 44 μL homogenisierte magnetische Perlen pro Probe von 80 μg Gesamt-RNA.
         HINWEIS: Skalieren Sie durch Multiplikation des Volumens mit der Anzahl der Samples.
      2. Legen Sie die magnetischen Perlen auf das magnetische Regal und entfernen Sie die Aufbewahrungslösung. Suspendieren Sie die magnetischen Perlen in 1 ml Vorwaschpuffer A.
      3. Inkubiere 2 Minuten bei Zimmertemperatur. Magnetisieren und das Supernatant entfernen. Wiederhole den Ablauf. Wasche 1x mit 1 ml Vorwäschepuffer B. Magnetisiere und entferne das Supernatant, und gehe schnell mit dem Binden und Waschen über.
   2. Einbinden und Waschen
      1. Bereiten Sie die 2x Bindungspuffer, 1x Bindungspuffer, Salzgehalts- und Salzarme Waschpuffer wie in Tabelle 1 dargestellt vor.
      2. Hängen Sie die vorgewaschenen Perlen wieder auf, indem Sie das doppelte ursprüngliche Volumen (88 μL) des 2x-Bindungspuffers hinzufügen. Übertragen Sie 80 μL Perlen in ein steriles 1,5-ml-Rohr, das 80 μL der biotinylierten RNA-Probe enthält.
      3. Drehen Sie das Perlen-Probe-Gemisch auf einem Rotator 20 Minuten bei Zimmertemperatur. Sammeln Sie den Durchfluss mit reifer RNA in der magnetischen Phase auf (zum Ausfällungsschritt).
      4. Spülen Sie den perlennaszenten RNA-Komplex zweimal mit 500 μL Hochsalzpuffer. Führen Sie eine Spülung mit 500 μL 1x Bindung durch, gefolgt von einer Spülung mit 500 μL Salzarm-Puffer.
2. Elution durch RNA-Reagenzienextraktion
   1. Heizen Sie einen Thermomixer auf 60 °C vor. Kühlen Sie eine Zentrifuge, die eine Geschwindigkeit von 20.000 x g bis 4 °C erreichen kann.
   2. Fügen Sie 300 μL RNA-Reagenz (siehe Materialtabelle) dem perlennaszenten RNA-Komplex hinzu und suspendieren Sie erneut. Inkubieren Sie 5 Minuten auf einem Thermomixer auf 60 °C.
   3. Fügen Sie 60 μL Chloroform, Vortex hinzu, und inkubieren Sie 3 Minuten bei RT. Schleudern Sie bei 14.000 x g für 5 Minuten in einer vorgekühlten Zentrifuge.
   4. Verschieben Sie die obere wässrige Phase in ein neues Sammelrohr (~180 μL). Verwerfen Sie die organische Phase und lassen die Perlen und die verbleibende wässrige Phase zurück.
   5. Wiederholen Sie die Extraktion, um ein endgültiges Volumen von 360 μL wässriger Phase im Sammelrohr zu erreichen.
   6. Fügen Sie 360 μL Chloroform in das Sammelrohr und wirbeln kurz vor. Drehen Sie bei 14.000 x g für 5 Minuten in einer vorgekühlten Zentrifuge.
   7. Übertragen (etwa 350 μL) der obersten Schicht in ein frisches Rohr. Präzipitieren Sie die RNA, indem Sie 900 μL absolutes EtOH und 1 μL Kopräzipitant hinzufügen.
   8. Vortex kurzzeitig und erlauben dem Niederschlag bei -20 °C für 20 Minuten oder -80 °C über Nacht.
   9. In der vorgekühlten Zentrifuge zentrifugieren Sie bei 20.000 x g für 20 Minuten. Entsorge das Supernatant vorsichtig.
   10. Waschen Sie das Pellet mit 750 μL 75 % EtOH, gefolgt von einer weiteren kalten Zentrifugation mit 20.000 x g für 5 Minuten.
   11. Trockne das Pellet 10 Minuten lang, um Reste von EtOH zu entfernen. Lösen Sie das RNA-Pellet in 3,75 μL H₂O.
       HINWEIS: Das Dot-Blotting der eluierten RNA gefolgt von Sonden mit Streptavidin-HRP-Konjugat ist die effektivste Methode zur Bewertung des Biotin-Pulldowns. Dieser Ansatz verbraucht jedoch einen erheblichen Teil des Mustermaterials, sodass nicht genügend Material für die Bibliotheksvorbereitung übrig bleibt.
3. Niederschlag des Supernatanten
   1. Fällen Sie das Supernatant mit reifen RNAs aus, indem Sie 2,5–3 Bände EtOH hinzufügen. Lassen Sie den Niederschlag bei -20 °C für 1 Stunde zu.
   2. In einer vorgekühlten Zentrifuge drehen Sie 45 Minuten bei 20.000 x g. Atmen Sie vorsichtig das Überwassermittel ab.
   3. Waschen Sie das RNA-Pellet mit 0,5 ml 75 % EtOH. Trocknen und lösen Sie das Pellet in 50 μL nukleasefreiem Wasser. Stellen Sie das Rohr auf einen Heizblock bei 65 °C, um die Auflösung des RNA-Pellets zu verbessern.
   4. Messen Sie die RNA-Konzentration mit einem Spektrophotometer für die folgenden Schritte.

5. Reife RNA (DMS-MaPseq)

1. Poly-A-Auswahl
   HINWEIS: Die polyadenylierten reifen RNAs werden mittels oligo(dT) perlenbasierter Affinitätsaufnahme gereinigt. Dieses Protokoll ist optimiert, um das Dynabeads mRNA DIRECT Purification Kit zu verwenden (siehe Materialtabelle). Als Erstvorbereitung wird 1 ml nukleasefreies Wasser auf 80 °C für die Elution vorgeheizt und ein Wärmeblock auf 70 °C eingestellt.
   1. Vorbereitung von RNA für Poly-A-Pulldown: Übertragen Sie 50 μg ausgefällter RNA und bringen Sie sie mit nukleasefreiem Wasser auf ein Endvolumen von 300 μL. Erhitze die RNA bei 70 °C für 2 Minuten, um Sekundärstrukturen zu stören, und lege sie sofort auf Eis. Die RNA mit 300 μL Lyse-/Bindungspuffer mischen und kurz vortexen.
   2. Herstellung magnetischer Perlen: Bringen Sie die magnetischen Perlen mindestens 30 Sekunden lang in Schwebe. Übertragen Sie 100 μL suspendierte Perlen pro Probe in ein steriles 1,5-mL-Rohr. Magnetisieren, um den Speicherpuffer zu entsorgen. Spülen Sie die magnetischen Perlen in einem gleichen Volumen Lysis-/Bindungspuffer aus, magnetisieren Sie und entsorgen Sie das Supernatant.
   3. Einbinden und Waschen
      1. Fügen Sie die 100 μL vorgewaschenen Perlen zu den 600 μL der präparierten Proben-RNA hinzu. Rotieren Sie kontinuierlich auf einem Rotator für 5 Minuten bei Raumtemperatur.
      2. Sammle die Perlen, indem du sie auf ein magnetisches Gestell legst, und entsorge den Durchfluss. Wasche die Perlen mit 600 μL Waschpuffer A. Pipette zum Mischen.
      3. Sammle die Perlen erneut ein, um die Wäsche wegzuwerfen. Waschen Sie die Perlen mit 300 μL Waschpuffer B. Rühren Sie die Pipette an.
      4. Sammle die Perlen erneut ein, um die Wäsche wegzuwerfen. Mische die Perlen mit 90 μL warmem (80 °C) Wasser und lasse die Bindung durch Zugabe von 90 μL Lyse-/Bindungspuffer zu. Wiederholen Sie Schritt 5.1.3.1-5.1.3.3.
   4. Elution: Die Perlen in 30 μL warmem (80 °C) nukleasefreiem Wasser wieder suspendieren. Inkubieren Sie bei 75 °C bis 80 °C für 2 Minuten. Setzen Sie die Perlen schnell einem Magnetfeld aus und sammeln Sie das Eluat in ein RNase-freies Rohr. Wiederhole die Elution und sammle die eluierte RNA.
2. Fragmentierung
   HINWEIS: Die Fragmentierung von mRNAs kann entweder enzymatisch oder chemisch erfolgen. Hier werden Zinkchlorid und Wärme zur Fragmentierung verwendet. Im Gegensatz zu Enzymen, die eine bestimmte Sequenz oder Strukturelemente benötigen, wirken Zinkionen als Lewis-Säure, um den 2'-Sauerstoff (ein Nukleophil) zu aktivieren und das Phosphodiester-Rückgrat zu spalten. Dies führt zur Bildung von 5' OH und 2',3' zyklischem Phosphatester auf den Produkt-RNA-Strängen¹⁷.
   1. Vorheizen Sie den Thermocycler, wobei die Blocktemperatur auf 94 °C und die Deckeltemperatur auf 105 °C eingestellt wird. Legen Sie 54 μL eluierte mRNA in ein PCR-Röhrchen.
   2. Fügen Sie 6 μL 100 mM Zinkchloridlösung hinzu (Endkonzentration von 10 mM), Wirbel für 2 Sekunden und inkubieren Sie sofort bei 94 °C für 55 Sekunden auf dem vorgeheizten Thermocycler.
   3. Am Ende der Inkubation wird die Fragmentierungsreaktion mit 6,6 μL 0,5 M EDTA (Endkonzentration von 50 mM) abgeschreckt, hoch und runter gerührt, und die Röhren schnell auf Eis gelegt. Übertragen Sie den Inhalt in sterile 1,5-ml-Röhren.
   4. Erlauben Sie die Ausfällung der fragmentierten mRNAs mit der Zugabe von 150 μL Isopropanol, 15 μL 3 M Natriumacetat, pH 5,2 und 1 μL Kopräzipitant.
   5. Stellen Sie es 30 Minuten bei -20 °C ein. Drehen Sie bei 20.000 x g für 45 Minuten in einer vorgekühlten Zentrifuge. Waschen Sie das Pellet mit 75 % EtOH und lösen Sie es in 15 μL nukleasefreiem Wasser.
3. PNK-Behandlung
   HINWEIS: Chemische Fragmentierung mit ZnCl₂ erzeugt 5'- und 3'-Enden, die für die^{Ligation 17} ungeeignet sind. Nach der chemischen Fragmentierung werden die RNAs einer Polynukleotid-Kinase-(PNK)-Behandlung unterzogen, die das 5'-OH phosphoryliert und die 3'-Phosphatenden dephosphoryliert, die dann an die Adaptoren¹⁸ ligiert werden können.
   1. Fügen Sie 1 μL Ribonukleaseinhibitor, 2 μL 10x PNK Buffer und 2 μL T4 PNK hinzu. Inkubieren Sie 60 Minuten bei 37 °C. Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie 30 μL nukleasefreies Wasser, 50 μL RNA-Bindungspuffer und 50 μL EtOH hinzufügen.
   2. Verwenden Sie eine spinsäulenbasierte RNA-Reinigungsmethode, um Schadstoffe zu entfernen und die RNA zu konzentrieren. Dies kann mit einem kommerziell erhältlichen Kit (RNA Clean and Concentrator Kit, siehe Materialtabelle) erreicht werden. Kurz gesagt: Mischen Sie zwei Bände RNA-Bindungspuffer mit 1 Volumen Probe, mischen Sie ein gleiches Volumen dieser Mischung mit 100 % EtOH und laden Sie mit einem frischen Sammelröhrchen auf die Spin-Säule. Drehen Sie diese Probe und verwerfen Sie den Durchfluss. Waschen Sie die Spin-Säule mit 700 μL RNA-Wash-Puffer und einmal mit 400 μL RNA-Wash-Puffer. Verwerfen Sie den Durchfluss. Drehen Sie die leere Säule 1 Minute, um den Waschpuffer vollständig zu entfernen.
   3. Elutieren Sie die RNA in 10 μL warmes, nukleasefreies Wasser.
      HINWEIS: Führen Sie alle Zentrifugationsschritte bei 10.000 - 16.000 x g bei RT für 30 Sekunden durch.

6. Template-Switching Reverse-Transkriptionsreaktion

HINWEIS: Die entstehenden RNAs aus dem Biotin-Pulldown (Schritt 4.2) und fragmentierte mRNA nach der PNK-Behandlung (Schritt 5.3) werden den folgenden Schritten zur Bibliotheksvorbereitung unterzogen (siehe Abbildung 1 und Abbildung 2). Kurz gesagt, ein synthetischer RNA-Template/DNA-Primer-Starter-Duplex (R2 RNA/DNA-Heteroduplex-Adapter), auf dem ein Template-Switching erfolgen kann, wird vorbereitet. Dieses Heteroduplex liefert eine kurze komplementäre Sequenz, die das Template-Switching durch die Reverse Transcriptase (RT) ermöglicht, um die Stränge zu wechseln, wobei der RT die Stränge von der RNA zum DNA-Primer wechselt und so eine nahtlose cDNA-Synthese von der RNA in die Adaptersequenz ermöglicht. Hier wird die Induro-Reverse-Transkriptase verwendet, die für dieses Protokoll getestet und optimiert wurde. Andere Template-Switching-Reverse-Transkriptasen können bei Bedarf zur Erstellung von CoSTseq-Bibliotheken verwendet werden, erfordern jedoch eine Optimierung durch den Benutzer.

1. DNA/RNA-Heteroduplex-Adaptersequenzen
   HINWEIS: Die DNA/RNA-Heteroduplex-Adapter, die für die Reverse-Transkription der DMS-MaPseq-Probe verwendet werden, sind dieselben wie in Xu et ^al.7 aufgeführt und von Schärfen et ^al.10 referenziert.
   1. Für den DNA/RNA-Heteroduplex-Adapter, der für die Reverse-Transkription der CoSTseq-Probe verwendet wird, verwenden Sie einen Adapter mit einem 'G' im Überhangbereich. Dadurch kann G das Biotin-C am 3'-Ende der RNA einfangen. Wenn ein anderes biotinyliertes NTP verwendet wird, wird der Heteroduplex-DNA-Primer so bearbeitet, dass das passende Paarungsnukleotid als Überhang dient (siehe Tabelle 2).
   2. Für den DMS-MaPseq-Adapter sollte sichergestellt werden, dass ein einzelner N-Überhang vorhanden ist, da das 3'-Ende nach der Fragmentierung zufällig ist. Für einen Überblick über die folgenden Vorbereitungsschritte der Bibliothek siehe Abbildung 2.
2. Herstellung eines DNA/RNA-Hybrids für das Template-Switching: 1 μM R2- und R2R-DNA-Primer in einem Puffer aus 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 und 1 mM EDTA vorbereiten. Inkubieren Sie die Grundierungmischung bei 82 °C für 2 Minuten und lassen Sie sie dann auf 25 °C mit einer Geschwindigkeit von 0,1 °C abkühlen. Aliquot die Mischung und einfrieren für spätere Gebrauch.
3. Template-Switching-Reverse-Transkription
   1. Fügen Sie folgende Reagenzien hinzu und inkubieren Sie 30 Minuten bei Raumtemperatur: 2 μL 5x Reaktionspuffer, 1 μL 1 μM DNA/RNA-Heteroduplex (verwenden Sie Heteroduplex mit einem einzelnen G-Überhang für die CoSTseq-Probe; verwenden Sie Heteroduplex mit zufälligem N-Überhang für die DMS-MaPseq-Probe), 0,5 μL Enzym, 0,5 μL RNase-Inhibitor, 3,75 μL RNA-Probe (oder Wasser hinzufügen, um ein Gesamtvolumen von 7,75 μL zu erreichen).
   2. Inkubiere diese Mischung (ohne dNTPs) 30 Minuten bei RT. Dann fügen Sie 1,25 μL 10 mM dNTPs zur Reaktion hinzu und wenden folgende Zyklusbedingungen in einem Thermocycler an: 25 °C für 10 Minuten, 42 °C für 10 Minuten, 50 °C für 10 Minuten, 55 °C für 10 Minuten, 60 °C für 30 Minuten, 65 °C für 20 Minuten, 75 °C für 15 Minuten.
   3. Gib 1 μL RNase-H hinzu und inkubiere bei 37 °C für 20 Minuten. Reinigen Sie die PCR-Reaktion mit einer säulenbasierten DNA-Reinigungsmethode, um verbleibende Primer, Nukleotide und Enzyme zu entfernen. Elut in einem Endvolumen von 20 μL.

Abbildung 2: Detaillierte schaltplanische Darstellung der CoSTseq-Bibliotheksvorbereitung. Beginnende RNA mit biotinyliertem 3'-Ende wird mit einem Template-Switching-Adapter inkubiert, der einen G-Überhang enthält, der komplementär zu Biotin-CTP ist. Für fragmentierte reife RNA (DMS-MaPseq) wird ein Adapter mit N-Überhang verwendet (siehe Abbildung 1). cDNA-Synthese erfolgt mit einer hochprozessiven Reverse-Transkriptase, wie der thermostabilen Gruppe-II-Intron-Reverse-Transkriptase (TGIRT), gefolgt von einer RNase-H-Behandlung, um den RNA-Strang abzubauen. Anschließend verbindet die 5'-App-DNA/RNA-Ligase das riboseadenylierte 5'-Ende (rA^pp) des N₇ UMI-Linkers mit dem 3'-OH der einsträngigen cDNA. Der N₇ UMI-Adapter verfügt über ein blockiertes 3′-Ende, was eine Selbstligation zwischen den Adaptern verhindert. Schließlich erfolgt die PCR-Verstärkung mit Primern, die überlappende Regionen und 5′-Überhänge mit einzigartigen Illumina i5- und i7-Barcodes enthalten, die jeder Probe zugewiesen sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

7. 5' Adapterligierung zur Vorbereitung der finalen cDNA-Bibliotheken für die Sequenzierung von gepaarten Endtagen

1. Vorbereitung des 5'-End-Adapters
   1. Adenylieren Sie den 5'-End-Adapter mittels einer RNA-Ligase-basierten Reaktion (z. B. Mth RNA-Ligase, aufgeführt in der Materialtabelle) mit folgenden Reaktionskomponenten: 8 μL 10x 5'-DNA-Adenylierungsreaktionspuffer, 8 μL 1 mM ATP, 100 μM R1R-DNA (dies ist der TruSeq-Primer mit einem eindeutigen molekularen Identifikator oder UMI), 8 μL Mth RNA-Ligase, 52 μL nukleasefreies Wasser.
      HINWEIS: Für Details zum Design des N₇ UMI-Adapters siehe Tabelle 2 und Abbildung 2.
   2. Inkubieren Sie diese Reaktion bei 65 °C für 1 Stunde und dann bei 85 °C für 5 Minuten. Fahren Sie mit der Reinigung des Produkts mit EtOH-Präzipitation oder einer auf Siliziumdioxid basierenden DNA-Reinigungsmethode aus Siliziummembran zur Isolierung von cDNA fort, entsprechend den Anweisungen des Herstellers.
   3. Für die EtOH-Präzipitation kann DNA bei -20 °C (mindestens 20 min) mit Natriumacetat (pH 5,2) bei einer Endkonzentration von 0,3 m und 2x-2,5x 95%-100% kaltem EtOH ausgefällt werden. Zentrifugieren Sie die mit EtOH ausgefällte Reaktion 15 Minuten lang bei maximaler Geschwindigkeit in einer vorgekühlten (4 °C) Zentrifuge, waschen Sie das Pellet mit 70 % EtOH, zentrifugieren Sie es erneut und trocknen Sie das Pellet an der Luft. Das Pellet in 40 μL nukleasefreiem Wasser wieder suspendieren (oder elutieren, wenn eine Spin-Säule verwendet wird). Lagern Sie es langfristig bei -20 °C.
2. 5' Adapterligation
   1. Für ein einzelnes Reaktionsvolumen von 20 μL fügen Sie folgende Komponenten zu 10 μL cDNA hinzu: 2 μL 10x NE Puffer 1, 2 μL 50 mM MnCl_2, 2 μL 5' AppDNA/RNA-Ligase, 4 μL 10 μM (100 ng/μL) des adenylierten Adapters aus Schritt 7.1.
   2. Inkubieren Sie diese Reaktion bei 65 °C für 1 Stunde, dann 3 Minuten bei 90 °C. Reinigen Sie die Reaktion mit dem MinElute-PCR-Reinigungskit und elutieren Sie in einem Endvolumen von 20 μL nukleasefreiem Wasser.
3. Minimale PCR-Amplifikation von cDNA-Bibliotheken mit Pilottest
   1. Bevor Sie fortfahren, bereiten Sie einen 10 μM großen Bestand an Indexprimern mit eindeutigen Barcodes vor. Jede eindeutige CoSTseq- oder DMS-MaPseq-Probe sollte einen eindeutigen Barcode für eine reibungslose nachgelagerte Analyse haben. Siehe Primer-Sequenzen in Tabelle 2. Die vorwärts- und rückwärts einzelnen, barcodehaltigen Primer können zu einer 1:1-Mischung kombiniert und als Barcoding-Premix gespeichert werden.
   2. Mit 2 μL des PCR-Produkts aus Schritt 7.2 fügen Sie 2,5 μL hochpräzisen PCR-Puffer (z. B. ein kommerzieller HiFi-Puffer), 0,375 μL dNTP (10 mM), 0,75 μL Barcoding-Premix (oder 0,375 μL einzelne i5- und i7-Unique-Barcoding-Primer), 0,25 μL hochpräzise Hot-Start-DNA-Polymerase (z. B. kommerzielles HiFi-Hot-Start-Enzym) hinzu, 6,625 μL nukleasefreies Wasser.
   3. Inkubieren Sie diese Reaktion bei 95 °C und wiederholen Sie dies [15 s 98 °C, 30 s 62 °C, 30 s 72 °C] für 23 Zyklen, beenden Sie die Inkubation mit 1 Minute bei 72 °C. Laufe mit einem 1%-Agarose-Gel, um die optimale Zykluszahl zu bestimmen.
      HINWEIS: Um niedrigere Zyklusbedingungen zu testen, kann eine Probe am Ende eines niedrigeren Zyklus (z. B. am Ende von 15 oder 16 Zyklen) vorbereitet und auf einem Agarosegel betrieben werden, um die Intensität des cDNA-Bibliotheksverschmierens auf einem Agarosegel über die Zykluslängen hinweg zu vergleichen.
4. Endgültiges PCR zur Bibliotheksverstärkung
   1. Mit 18 μL des PCR-Produkts aus Schritt 7.2 fügen Sie Folgendes aus dem KAPA HiFi PCR Kit hinzu: 22,5 μL High-Fidelity PCR Buffer, 3,375 μL dNTP (10 mM), 6,75 μL Barcoding-Premix (oder 3,375 μL einzelne i5- und i7-Unique-Barcoding-Primer), 2,25 μL High-Fidelity Hot-Start-DNA-Polymerase und 59,625 μL nukleasefreies Wasser.
   2. Inkubieren Sie diese Reaktion bei 95 °C und wiederholen Sie [15 s 98 °C, 30 s 62 °C, 30 s 72 °C] für die Anzahl der in Schritt 7.3 bestimmten Zyklen. Beenden Sie die Inkubation von 1 Minute bei 72 °C.
5. Größenauswahl
   1. Führen Sie die Größenauswahl für das PCR-Produkt mittels paramagnetischer perlenbasierter Reinigung durch (z. B. AMPure XP oder Äquivalent). Verwenden Sie das 1,3-fache des Volumens der Perlen (z. B. für eine 50 μL PCR-Reaktion verwenden Sie 65 μL Perlenschlamm) und mischen Sie gut, bis sie homogen sind. Lassen Sie die Perlen die Probe 10 Minuten bei Zimmertemperatur binden.
      HINWEIS: Dieses 1:1,3x Proben-zu-Perlen-Verhältnis ermöglicht die Entfernung von Primeradapter-Dimern und stellt sicher, dass die erhaltenen DNA-Fragmente nicht kleiner als 150 bp und nicht größer als 800 bp sind.
   2. Entfernen Sie das Überlagermittel, ohne die Perlen zu stören, und reinigen Sie die Perlen gemäß dem Protokoll des Herstellers mit 80 % EtOH.
   3. Elutieren Sie das Endprodukt in 11 μL. Führen Sie 1 μL auf einem Agarosegel aus, um Bibliotheken zu überprüfen. Reichen Sie das Endprodukt zur Sequenzierung ein.

8. Datenanalyse

HINWEIS: Das vollständige CoSTseq-Paket und der Analysecode sind auf GitHub (https://github.com/NeugebauerLab/CoSTseq) verfügbar, und der Workflow für die Analyse ist in Abbildung 3 dargestellt. Diese Pipeline ist darauf ausgelegt, sowohl CoSTseq- als auch DMS-MaPseq-Sequenzierungsdaten zu verarbeiten. CoSTseq verwendet Snakemake, einen Bioinformatik-Workflow, der die Analyse leicht parallelisiert, indem er die Anzahl der verfügbaren CPU-Kerne¹⁹ optimiert. Der Workflow wird durch eine Snakefile definiert, die aus einer Reihe von Regeln besteht, die die zu ausführenden Analysen festlegen. Es ist nicht notwendig, die Snakefile, die bei der Installation des GitHub-Pakets verfügbar ist, zu ändern.

1. Passen Sie die Konfigurationsdatei (.yaml-Datei) mit den korrekten Dateipfaden an den Speicherort der Rohdaten an. In diesen Einstellungen sollte ein Pfad zu den Adaptersequenzen und den zugehörigen Sample-Namen enthalten sein. Ändern Sie die Konfigurationsdatei, um spezifische Analysen auszuführen, die in der Snakefile definiert sind.
2. Um mit der Analyse zu beginnen, laden Sie rohe gepaarte Endlesungen im fastq.gz Format herunter. Prozesslesungen verwenden Fastp²⁰ , um Adaptersequenzen zu trimmen, und Qualitätsfilter für Lesungen mit Phred-Werten von mindestens 20. Richten Sie diese Lesungen mit STAR²¹ auf das Referenzgenom aus, um BAM-Dateien zu generieren.
3. Als zusätzliche Bestätigung visualisieren Sie die BAM-Dateien, die nach dem Ausführen der CoSTseq-Analysepipeline im Integrated Genome Viewer (IGV)-Browser erzeugt werden. Mit IGV sollten die BAM-Dateien leicht interpretierbar sein, um Reads entlang aller Teile interessierender Gene anzuzeigen, was darauf hinweist, dass Reads entstehende RNA darstellen. Wie erwartet, sollten ausgereifte RNA-Reads eine minimale Abdeckung in intronischen Bereichen zeigen, da diese Reads voraussichtlich aus reifen und wahrscheinlich effizient gespleißten Transkripten stammen.
4. Verwenden Sie die fastp-Ausgabe (eine .html Datei, die im Webbrowser geöffnet werden kann) für einen geschätzten Prozentsatz der doppelten Lesevorgänge. Beachten Sie, dass CoSTseq-Lesungen sehr stark dupliziert sein können, was die Kritikalität des nächsten Schritts hervorhebt.
5. Mit UMICollapse²² dedupliziert man Lesungen, um Lesungen mit identischen UMIs und Ausrichtungen zu kollabieren, was die Erhaltung einzigartiger Lesungen ermöglicht und PCR-Verzerrungen mindert. Die resultierenden Dateien sollten frei von doppelten Lesearten und im BAM-Format sein, wobei Lesungen, die sich an rRNA ausrichten, von denen getrennt werden, die mit Nicht-rRNA-Genen assoziiert sind.
6. Für die letzte Hauptkomponente der modularen CoSTseq-Pipeline verwenden Sie eine benutzerdefinierte Python-Implementierung, um die Mutationszahlen und die Leseabdeckung über jedes Nukleotid zu berechnen. Die Funktionen, die diese Implementierung beschreiben, finden sich im Quellcode auf GitHub, und die Snakefile beschreibt die Eingabe, Ausgabe, Parameter und Funktionen zur Erzeugung dieser Daten, die im .pkl-Format gespeichert sind.
   HINWEIS: Es gibt eine Vielzahl weiterer Analysen, die mit der CoSTseq-Analysepipeline durchgeführt werden können, obwohl Parameter für personalisierte Analysebedürfnisse optimiert werden können. Eine wertvolle Methode, die für CoSTseq angepasst wurde, ist HDProbe, ein R-Paket, das genomweite Vergleiche von Mutationsraten^ermöglicht. Kurz gesagt: HDProbe benötigt Daten von allen Replikaten und kann systematisch signifikante Unterschiede in den Mutationsraten im Vergleich zur Kontrolle kategorisieren. Weitere Arten von Analysen, die man durchführen möchte, umfassen die Strukturvorhersage auf Basis der experimentellen DMS-Reaktivitäten. Dies kann mit dem RNAstructure-Paket²³ durchgeführt werden.

Abbildung 3: Analyseschritte und erwartete Ergebnisse der modularen CoSTseq-Analysepipeline. Analyseschritte, die die empfohlene Nutzung bestehender Werkzeuge sowie die einsatzbereite CoSTseq-Analysepipeline mit den erwarteten Ausgabedateien und Inhalten anzeigen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Results

Dieser Abschnitt präsentiert die tatsächlichen Ergebnisse, die durch die Implementierung des CoSTseq-Workflows und der Analyse erzeugt werden, wie in diesem Protokoll beschrieben. Zunächst beschreibt dieser Abschnitt die erwarteten Ergebnisse nach der Qualitätsbewertung erfolgreicher Bibliotheksvorbereitungen vor und nach der Sequenzierung. Vor der Sequenzierung können Forscher eine Test-PCR- und TapeStation-Analyse verwenden, um das Vorhandensein von RNA nach der Biotinanreicherung zu b...

Discussion

RNA beginnt, sich ko-transkriptionell zu falten, da die Basenpaarung im Vergleich zur Synthesegeschwindigkeit 24,25,26,27 schneller ist. Unser aktuelles Wissen über die entstehende RNA-Faltung stammt aus Einzelmolekülstudien prokaryotischer RNAs, in-vitro-Sondierung oder in-silico-Ansätzen. In diesem Protokoll wird ein detaillierter Workflow v...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10mM ATP	Invitrogen	18330019
10mM Biotin-11-CTP	Jenaer Biowissenschaften	NU-831-BIOX
10mM GTP	Invitrogen	18332015
10mM UTP	Invitrogen	18333013
10X NEBuffer 1	New England Biolabs	B7001S	Verwendet in Schritt 7.2.1
10-fach phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)	Gibco	70011-044
20 % SDS	RPI	L23100-500
Saures Phenol: Chloroform	Ambion	AM9722
AMPure XP-Perlen zur Größenauswahl	Beckman Coulter	A63880	Verwendet für die Größenauswahl in Schritt 7.5.1
Bacto-Pepton	Gibco	211677
Bacto-Hefeextrakt	Gibco	212750
Bicine	Sigma Aldrich	B3876-100G
Chloroform	Sigma Aldrich	319988
D-(+)-GLUKOSE	Sigma Aldrich	G5767-500G
DIFCO AGAR	BD DIFCO	214010
Dimethylsulfat	Sigma Aldrich	D186309-5ML
Dynaperlen & Handel; MyOne Streptavidin C1 Perlen	Invitrogen	65001	Verwendet für Biotin-Pulldown in Abschnitt 4.1
Dynaperlen & Handel; mRNA DIRECT™ Reinigungskit	Invitrogen	61011	Verwendet für die Poly-A-Auswahl in Abschnitt 5.1
EDTA, pH 8, 0,5M	Sigma Aldrich	03690-100ML
Ethanol	Sigma Aldrich	E7023-500ML
GlycoBlue	Invitrogen	AM9516	Co-Präzipitant verwendet in Schritt 4.2.7 und 5.2.4
Induro®   Umgekehrte Transkriptase	New England Biolabs	M0681S	RT-Enzym verwendet in Schritt 6.3.1
Isoamylalkohol	Sigma Aldrich	W205710-1KG-K
Isopropanol	JT-BAKER	9084-05-01
KAPA HiFi HotStart PCR Kit	Roche	07958889001	Hochpräzises DNA-Pol, verwendet in 7.3.2 und 7.4.1 für PCR-Reaktionen
Magnesiumchlorid	Sigma Aldrich	SLCM2154
MinElute PCR-Reinigungskit	Qiagen	28004	Verwendet für die DNA-Bereinigung in Schritt 6.3.3 und 7.2.2
Mth RNA-Ligase	New England Biolabs	M2611A
Oligo Clean & Konzentrator	Zymo-Forschung	D4060	Vorgeschlagen für die DNA-Oligo-Reinigung in Schritt 7.1.2
Kaliumacetat	Sigma Aldrich	236497-500G
Kaliumchlorid	JT Baker	3040-01
Kaliumhydroxid	Avantor	6984-04-01
RNA Clean & Konzentrator-5	Zymo-Forschung	R1014	RNA-Reinigungskit, das in Schritt 5.3.2 nach der PNK-Behandlung verwendet wird
RNaseOUT™ Rekombinanter Ribonukleaseinhibitor	Thermo Fisher Scientific	10777019	RNase-Inhibitor verwendet in Schritt 5.3.1 während der PNK-Behandlung
Sarkosyl	IBI Scientific	IB07080
Natriumacetat	Qualitätsbiologisch	351-035-721
Natriumchlorid	Sigma Aldrich	S5150-1L
Natriumhydroxid	Macron	7708-10
SUPERase· In™ RNase-Inhibitor (20 U/μ L)	Thermo Fisher Scientific	AM2696	RNase-Inhibitor verwendet in Schritt 6.3.1
T4-Polynukleotid-Kinase	New England Biolabs	M0201S
Thermostabil 5' App-DNA/RNA-Ligase	New England Biolabs	M0319L
Tris-HCl, pH 7,4, 1M	Thermowissenschaftlich	J60202. K2
Triton X-100	TEKNOVA	T1105
TRIzol™ Reagenz	Invitrogen	15596-026	Für die entstehende RNA-Elution in Abschnitt 4.2; auch als "RNA-Reagenz" in Abschnitt 4 bezeichnet
β-Mercapptoethanol	Sigma Aldrich	M6250-1L