Das neuartige Rattenmodell der schweren zerebralen venösen Sinusthrombose (CVST), das durch Semiligation in Kombination mit Eisenchlorid und Thrombin konstruiert wird, kann den pathophysiologischen Mechanismus des schweren CVST beim Menschen effektiver nachahmen.
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Methodenartikel
Neues Rattenmodell der schweren zerebralvenösen Sinusthrombose, etabliert durch Kombination aus Semiligation, Eisenchlorid und Thrombin
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die zerebrale venöse Sinusthrombose (CVST) ist eine eigenständige Art von Schlaganfall, die überwiegend junge Menschen, insbesondere Schwangere, betrifft. Etwa 60 % der CVST-Patienten entwickeln einen venösen Hirninfarkt oder eine Blutung, die als schweres CVST definiert ist. Derzeit werden verschiedene Methoden sowohl im In- als auch im Ausland eingesetzt, um CVST in Tiermodellen zu induzieren. Diese Modelle können jedoch die pathophysiologischen Mechanismen eines schweren CVST nicht vollständig replizieren, was die Grundlagenforschung zu dieser Erkrankung einschränkt. Ein neuartiges Rattenmodell schwerer CVST kann durch Semiligation in Kombination mit Eisenchlorid und Thrombin etabliert werden. Die Semi-Ligation erfolgte durch Messung des zerebralen Blutflusses (CBF) im Interessenbereich (ROI) vor und nach der Ligierung der superioren sagittalen Sinus (SSS) mit einem Perfusions-Speckle Imager (PSI). Die Semi-Ligation des SSS induziert eine Blutstase im venösen Sinus. Die topische Anwendung von Eisenchlorid auf der Oberfläche des SSS führt zu einer Endothelverletzung, während die direkte Injektion von Thrombin in den Sinus einen lokalisierten hyperkoagulablen Zustand erzeugt. Dieser Ansatz ahmt effektiv die drei Schlüsselkomponenten der Thrombosenbildung nach: Stase, Endothelschäden und Hyperkoagulabilität. Das resultierende Modell zeigt eine erhebliche thrombotische Belastung, die mehrere venöse Nebenhöhlen gleichzeitig umfasst. Der induzierte Thrombus bleibt mindestens eine Woche stabil. Die 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC)-Färbung zeigt, dass dieses Modell einen großflächigen venösen Hirninfarkt erzeugen kann, der bis zu 7 Tage anhält. Dieses Modell kann sogar epileptische Anfälle bei Ratten auslösen, eine Fähigkeit, die frühere Modelle nicht erreichen konnten. Die Störung der Blut-Hirn-Schranke wurde mittels Evans Blue (EB) Färbung beobachtet. Daher repliziert das durch Semi-Ligation in Kombination mit Ferrikchlorid und Thrombin-Gabe etablierte Modell des pathophysiologischen Verlaufs eines schweren CVST beim Menschen genauer und zeigt Stabilität und Zuverlässigkeit.
Einleitung
Die zerebralvenöse Sinusthrombose (CVST) ist eine eigenständige Form der zerebrovaskulären Erkrankung, die sich vom arteriellen Schlaganfall unterscheidet. Sie tritt häufiger bei jüngeren Personen 1,2 auf, insbesondere bei schwangeren Frauen3, und ihre Häufigkeit ist in den letzten Jahren stetig gestiegen. Eine epidemiologische Studie in Australien zeigt, dass die jährliche Inzidenz von CVST zwischen 13,0 und 15,7 Fällen pro Million Individuen liegt4. In den Vereinigten Staaten steigt die Häufigkeit von CVST mit zunehmendem Alter an. Dennoch ist das Spitzenalter für den Beginn von Frauen niedriger als bei Männern:5. Zwischen 2021 und 2023 wurden bei 43 pro Million Patienten, die in den Vereinigten Staaten Notaufnahmen waren, CVST6 diagnostiziert. In klinischen Einrichtungen ist die multiple Sinusthrombose die am häufigsten beobachtete Form und macht etwa 57,14 % aller Fälle aus. Darauf folgt die Beteiligung des Sinus superior sagittalis (SSS; 16,19%), des transversalen Sinus (11,43%) und des Sinus sigmoid (8,57%)4. Die wichtigsten klinischen Manifestationen sind Kopfschmerzen, die von Epilepsie, Bewusstseinsstörungen und fokalen neurologischen Symptomen begleitet sein können 7,8,9. Diese Manifestationen sind jedoch nicht spezifisch. Etwa 60 % der Patienten mit CVST entwickeln einen zerebralen Veneninfarkt oder eine Blutung, die als schweres CVST10,11 eingestuft wird. Obwohl die Behandlung von CVST eine Antikoagulationstherapie und chirurgische Eingriffe umfasst, bleibt die Sterblichkeitsrate bei schwerer CVST bis zu 34,2 % hoch. Diese hohe Sterblichkeit könnte darauf zurückzuführen sein, dass die zugrunde liegenden pathophysiologischen Mechanismen eines schweren CVST noch nicht vollständig verstanden sind. Ein geeignetes Tiermodell schwerer CVST ist daher ein wesentliches experimentelles Werkzeug zur Untersuchung seiner Pathogenese, pathophysiologischen Entwicklung und möglichen therapeutischen Strategien12.
Derzeit lassen sich die Methoden zur Induzierung von CVST-Tiermodellen im Allgemeinen in folgende Typen einteilen: permanente Ligation13,14, chemische Induktion 15,16,17, interventionelle Ansätze 18,19, Implantation selbstgemachter Grafts 20,21,22 und bipolare Elektrokoagulation 23,24. Der von früheren Tiermodellen induzierte Thrombus hatte eine kurze Dauer und konnte nicht gleichzeitig multiple venöse Sinusthromben und einen großflächigen venösen Hirninfarkt auslösen. Daher ist die Entwicklung eines schweren CVST-Modells, das mehrere venöse Nebenhöhlen gleichzeitig umfasst, zu einer dringenden Priorität geworden. Die Methode der Semiligation in Kombination mit Eisenchlorid und Thrombin kann ein neuartiges Rattenmodell für schweres CVST etablieren. Darüber hinaus simuliert das neuartige Modell schwerer CVST den menschlichen pathophysiologischen Prozess eines schweren CVST anhand von drei zentralen Aspekten: venöse Sinusthrombuslast, venösen Hirninfarkt und Störung der Blut-Hirn-Schranke. Dieses Modell ist für die Forschung zu pathophysiologischen Mechanismen und Behandlungsstrategien für schweres CVST anwendbar. Dieses neue Rattenmodell kann in Zukunft zur Untersuchung des pathophysiologischen Mechanismus schwerer CVST verwendet werden.
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Protokoll
Das experimentelle Protokoll wurde vom Animal Experiments and Experimental Animal Welfare Committee der Capital Medical University (AEEI-2020-119) in Peking, China, genehmigt und in Übereinstimmung mit den Vorschriften des Animal Care and Use Committee der Institution durchgeführt.
1. Tiervorbereitung
- Zufällig werden gesunde erwachsene männliche Sprague-Dawley (SD) Ratten mit einem durchschnittlichen Körpergewicht von 300 ± 10 g entweder der Versuchsgruppe oder der Schein-Operationsgruppe zugeordnet. Alle Tiere wurden in einem abwechselnden 12-Stunden-Licht-/Dunkelzyklus gehalten, mit Zugang zu Futter und Wasser ad libitum.
2. Anwendung von PSI
- Verwenden Sie PSI, um Veränderungen des zerebralen Blutflusses (CBF) innerhalb der SSS von Ratten während des gesamten Modellierungsprozesses kontinuierlich zu überwachen. Wählen Sie einen festen kreisförmigen Bereich innerhalb des SSS als Interessensgebiet (ROI) aus. Durch das Überwachen der Veränderungen der CBF des ROI während der Operation kann der Abschluss der Semiligation und der Erfolg der Thrombusinduktion festgestellt werden.
3. Einführung des strengen CVST-Rattenmodells
- Betäuben die Ratten mit 5 % Enfluran, wobei ein Gasgemisch aus 70 % Lachgas und 30 % Sauerstoff über eine Anästhesiemaske abgegeben wird. Halten Sie die Enflurankonzentration während des gesamten Operationsprozesses im Bereich von 1 % bis 2 %. Legen Sie die narkosierten Ratten in die Bauchlage mit dem Kopf in der Mittellinie und verwenden Sie einen stereotaxischen Rahmen. Halten Sie die Körpertemperatur während des gesamten Operationseingriffs mit einem Thermostatheizkissen bei 37 ± 0,5 °C.
- Machen Sie einen 1,5 cm langen Längsschnitt entlang der Mittellinie des Schädelbereichs der Ratte. Sezieren Sie das subkutane Gewebe, um den darunterliegenden Schädel freizulegen.
- Unter mikroskopischer Visualisierung wird mit einem Hochgeschwindigkeitsbohrer ein längs Schädelfenster (10 x 4 mm) zwischen Bregma und Lambda erzeugt. Die SSS und den beidseitigen Großhirnrinde freilegen, während die Integrität der Dura Mater erhalten bleibt. Während des Schädelbohrprozesses kühlen Sie den Bohrer kontinuierlich mit normalem Kochsalzlösungswasser, um thermische Schäden an Dura Mater und Kortex zu vermeiden.
- Nach der Exposition gegenüber SSS bewerten Sie die CBF des ROI im SSS mit dem PSI und erfassen Sie die entsprechenden Daten. Semi-ligate die SSS rostral und kaudal mit einem 8-0 Polyamidnähte unter mikroskopischer Beobachtung.
HINWEIS: Beim Ligieren des SSS sollte die Kraft moderat und nicht übermäßig sein. Andernfalls kann kein Semiligationseffekt erreicht werden. Die Ligation sollte idealerweise in einem einzigen kontinuierlichen Eingriff durchgeführt werden. Wiederholte Ligationsversuche können zu einer Perforation des SSS führen und damit den Erfolg der Modellfertigung beeinträchtigen. - Nutzen Sie das PSI, um den ROI des CBF im ligatierten Abschnitt des SSS zu bewerten, wobei bestätigt wird, dass der CBF auf etwa 50 % des vor der Semiligation gesunken ist. Zeichnen Sie die Ergebnisse systematisch auf.
- Unter lichtgeschützten Bedingungen tauchen Sie einen 7 mm langen 3-0-Seidenfaden in 40 % Eisenchlorid und verwenden Sie dies, um die Oberfläche der SSS-Ligamentstelle für eine Dauer von 5 Minuten zu bedecken. Waschen Sie das Feld mit normaler Kochsalzlösung, nachdem der Seidenfaden entfernt wurde.
- Injizieren Sie 0,1 ml Thrombinlösung (500 U/mL) innerhalb von 1 Minute mit einem Mikroinjektor in die Sinushöhle des ligierten Segments. Wiederholen Sie die Injektion zweimal hintereinander, sodass eine Gesamtthrombindosis von 150 ΜU erreicht wird. Thrombinrückfluss in den Epiduralaraum führte nicht zu einer schlechten Thrombose.
- Um die Injektion von Thrombin in das SSS zu erleichtern, biegen Sie die Mikroinjektornadel vor dem Einsetzen sanft. Diese Einstellung ermöglicht eine bessere Kontrolle des Nadelwinkels während des Einstichs und hilft, unbeabsichtigte Penetration durch das SSS zu verhindern.
- Bewerten Sie den CBF des ROI mit dem PSI nach der Thrombininjektion erneut. Stellen Sie sicher, dass die Ergebnisse einen signifikanten Rückgang der CBF im Vergleich zu der nach der Halbligation bestätigen, was auf eine erfolgreiche Thromboseninduktion hinweist. Erfassen Sie die Daten systematisch für weitere Analysen.
- Versiegeln Sie das Knochenfenster mit Knochenwachs und vernähen Sie anschließend den Schnitt. Nach dem chirurgischen Eingriff wird jeder Ratte subkutan Ketoprofen (5 mg/kg) verabreicht, um postoperative Schmerzen zu lindern.
- In der Scheinoperationsgruppe wird nur die Kraniotomie durchgeführt, ohne weitere chirurgische Eingriffe.
4. Venöse Sinusthrombose und Hirninfarkt
- Bewerten Sie die Belastung der venösen Sinusthrombose zu drei Zeitpunkten: 1 Tag, 2 Tage und 7 Tage nach Etablierung des Modells. Opfere Ratten und führe eine Herzperfusion mit normaler Kochsalzlösung zu verschiedenen Zeitpunkten durch.
- Führen Sie eine Kraniotomie durch, um das Ausmaß der venösen Sinusthrombose visuell zu beurteilen. Isoliere den Thrombus und unterziehe sie einer quantitativen Analyse. Schneide das Gehirngewebe heraus und teile es in 2 mm dicke koronale Schnitte.
- Tauchen Sie die Scheiben in eine 2%-TTC-Lösung und befruchten Sie sie 20 Minuten in einem 37 °C Wasserbad, um die Färbung zu erleichtern. Anschließend wird der zerebrale Veneninfarkt visuell beurteilt und das Infarktvolumen mit der Software ImageJ quantifiziert, um anschließend statistisch zu analysieren.
Infarktvolumen = Infarktfläche in Quadratmillimeter x Dicke [2 mm]
5. Störung der Durchlässigkeit der Blut-Hirn-Schranke (BBB)
- Am zweiten Tag nach der Operation werden Ratten zufällig sowohl aus der Modellgruppe als auch aus der Scheinoperationsgruppe ausgewählt und eine intravenöse Injektion von 2 % Evans Blue (EB) durch die Schwanzvene verabreicht.
- Nach 2 Stunden erfolgreicher Verabreichung der Injektion wird die Ratten eingeschläfert und durch den linken Ventrikel mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) perfundiert. Entnehmen Sie das Gehirngewebe und schneiden Sie sie in 2 mm dicke Scheiben, um das Ausmaß der EB-Penetration zu beurteilen.
6. Statistische Analyse
- Führen Sie statistische Analysen mit SPSS 17.0 Software durch. Präsentieren Sie Messdaten als Mittelwert ± Standardabweichung. Verwenden Sie eine Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) oder einen unabhängigen Stichproben-t-Test für Gruppenvergleiche.
- Für die Analyse kontinuierlicher Variablen, die an mehreren Zeitpunkten innerhalb derselben Gruppe gemessen werden, verwenden Sie wiederholte ANOVA-Messungen, um Unterschiede zwischen den Gruppen über Zeitpunkte hinweg zu bewerten. Ein p-Wert von weniger als 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.
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Ergebnisse
Modellierungsprozess
Abbildung 1A zeigt die SSS der Ratte, wie sie durch den Pfeil angezeigt wird. Das Rostral- und Schwanzgewebe des SSS wurden halb-ligiert (Abbildung 1B), gefolgt von der Anwendung von mit Eisenchlorid getränktem Faden auf die Oberfläche der ligaierten Regionen (Abbildung 1C). Anschließend wurde Thrombin in die ligierten Segmente injiziert, um eine Thrombose a...
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Diskussion
Ein neuartiges Rattenmodell schwerer CVST, konstruiert durch Semiligation in Kombination mit Eisenchlorid und Thrombin, kann nicht nur Blutstasis und Endothelverletzungen simulieren, sondern auch den hyperkoagulierbaren Zustand des Blutes, das heißt, es simuliert die drei Elemente der Thrombosenbildung25. Noch spannender ist, dass das mit dieser Methode entwickelte Rattenmodell epileptische Anfälle zeigen kann. Epileptische Anfälle stellen eine bemerkenswerte klin...
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.
Danksagungen
Wir danken dem Institute of Critical Brain Diseases der Capital Medical University für seine technische Unterstützung. Diese Studie wurde von der Beijing Natural Science Foundation (Nr. 7182064) unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid | Sigma-Aldrich | ||
| 40 % Eisenchlorid; | Tianjin Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., China | ||
| Evans blue | Sigma-Aldrich | ||
| Heizkissen | Harvard-Apparat Holliston, MA, USA | 50-7061-f, | |
| Hochgeschwindigkeitszahnbohrer | Saeshin, Busan, Südkorea | Strong-207B | |
| Laser-Speckle-Messer | PeriCam PSI System, Schweden | ||
| Mikroskop | Carl Zeiss, Inc., Berlin, Deutschland | ||
| Polyamidnaht | Ningbo Chenghe Mikrogerätefabrik, China | ||
| Stereotaxischer Rahmen | David Kopf Instruments, Tujunga, Kalifornien, USA | ||
| Thrombin | Chang Chun Lei Yunshang Pharmaceutical Co., Ltd., China |
Referenzen
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