Dreidimensionale Visualisierung lymphatischer Gefäße in der menschlichen Haut und ihrer strukturellen Veränderungen während des Lymphödems

Summary

Hier wurde eine dreidimensionale Visualisierung der lymphatischen Gefäßstruktur in der menschlichen Haut mittels Konfokal- oder Lichtblattmikroskopie nach Anwendung von drei verschiedenen Gewebereinigungstechniken erreicht. Kombinationen dieser Methoden mit immunhistochemischer Färbung geben Einblicke in funktionelle Veränderungen der Lymphgefäße während des Fortschreitens des Lymphödems.

Abstract

Die Lymphgefäße der Haut, bestehend aus Kapillaren und Sammelgefäßen, spielen eine Schlüsselrolle bei der Abfallentfernung und Immunreaktionen und sind für die Aufrechterhaltung der Gewebehomöostase unerlässlich. Die menschliche Haut mit ihren drei Schichten – Epidermis, Dermis und subkutanes Fett – enthält jedoch eine dichte, extrazelluläre Matrix, die reich an Kollagen ist, sodass die Darstellung lymphatischer Netzwerke in drei Dimensionen schwierig ist. Um diese Einschränkung zu beheben, stellt dieses Papier drei verschiedene Methoden vor, die jeweils auf spezifische Moleküle von Interesse und experimentelle Ziele zugeschnitten sind, um die dreidimensionale Visualisierung menschlicher Hautlymphatiken mittels Gewebereinigungsreagenzien in Kombination mit konfokaler oder Lichtblattmikroskopie zu visualisieren. Durch die gezielte Steuerung von Adhärens-Junction-Molekülen in lymphatischen Endothelzellen durch Immunhistochemie wurden strukturelle Veränderungen mit klaren funktionellen Implikationen, insbesondere die charakteristische Knopf-zu-Reißverschluss-ähnliche Umgestaltung von Kapillarverbindungen, in Hautgeweben von Patienten mit sekundärem Lymphödem untersucht. Diese dreidimensionale Visualisierungstechnik offenbart Gefäßstrukturen, die durch konventionelle histologische Gewebeschnittsanalyse nicht erkennbar sind, wodurch das Verständnis der Struktur und Funktion lymphatischer Gefäße verbessert wird.

Introduction

Das Interesse an der Funktion lymphatischer Gefäße wächst seit der Erkenntnis ihrer Rolle bei der Aufrechterhaltung der Hauthomöostase, jenseits ihrer gut etablierten Beteiligung an Krebsmetastasen ^1,2. Lymphgefäße sind strukturell in Kapillaren und Sammelgefäße unterteilt, die jeweils unterschiedliche Merkmale aufweisen. Lymphkapillaren bestehen aus einer einschichtigen Struktur, die von lymphatischen Endothelzellen gebildet wird, und dienen als erste Sammelstellen für interstitielle Flüssigkeit, Abfallprodukte und Immunzellen. Im Gegensatz dazu haben die Aufnahmegefäße eine doppelschichtige Struktur mit glatten Muskelzellen, die die lymphatische Endothelschicht umgeben, was den aktiven Transport der vom Kapillarnetzwerk gesammelten Lymphflüssigkeit zum zentralen Kreislauf^ermöglicht. Mausmodelle wurden verwendet, um die strukturellen Merkmale, insbesondere der bronchialen Lymphgefäße, aufzuklären und zeigten, wie entzündliche Erkrankungen eine strukturelle Umgestaltung auslösen⁴. Frühere Arbeiten zeigten, dass durch ultraviolett ausgelöste Entzündungen eine abnormale Erweiterung der lymphatischen Kapillaren verursachen, was deren Flüssigkeitsaufnahmefunktion beeinträchtigt. Die molekularen Mechanismen, die dieser Dysfunktion zugrunde liegen, wurden identifiziert und zeigten speziell, dass eine erhöhte VEGF-A-Expression in Verbindung mit einer verringerten VEGF-C-Expression diese strukturellen Veränderungen^{antreibt 5,6,7}.

Während dreidimensionale Visualisierungstechniken das Verständnis des lymphatischen Netzwerks in Mausmodellen ^8,9 erheblich verbessert haben, bleibt eine vergleichbare strukturelle Analyse menschlicher Lymphgefäße eine Herausforderung. Diese analytische Lücke resultiert aus den Schwierigkeiten bei der Arbeit mit menschlichem Gewebe, darunter die begrenzte Probenverfügbarkeit und die technischen Herausforderungen bei der Erreichung umfassender dreidimensionaler Bildgebung. Insbesondere stellt die Haut, die durch eine dreischichtige Struktur aus Epidermis, Dermis und subkutanem Fett gekennzeichnet ist und als Barriere gegen die äußere Umwelt fungiert, größere Herausforderungen dar als andere weiche Organe. Darüber hinaus stellt die menschliche Haut im Vergleich zu Mausmodellen deutliche analytische Herausforderungen dar, darunter eine größere Gewebedicke, was die tiefe Bildaufnahme erschwert. Darüber hinaus schaffen die zahlreichen extrazellulären Matrixkomponenten, insbesondere Kollagen, zusammen mit ihren altersbedingten strukturellen Veränderungen optische Barrieren, die die Wirksamkeit neuer Gewebereinigungstechniken verringern, die die lymphatische Bildgebung bei Mäusen^{revolutioniert} haben.

Verschiedene Gewebereinigungsmittel wurden zuvor getestet, um menschliche Hautkapillaren sichtbar zu machen und ihre Gewebekompatibilität¹¹ nachzuweisen. Im Anschluss an diese Arbeit wurden Gewebereinigungsreagenzien erfolgreich eingesetzt, um menschliche Hautlymphgefäße in drei Dimensionen¹² sichtbar zu machen. Durch die Konzentration auf die Adheren-Verbindungen lymphatischer Endothelzellen wurden strukturelle Veränderungen in lymphatischen Gefäßen, die mit dem Fortschreiten des Lymphödems assoziiert sind, identifiziert¹³. Zweck dieses Artikels ist es, die Verfahren zur dreidimensionalen Visualisierung menschlicher Hautlymphgefäße unter Verwendung von Kombinationen von drei Hautreinigungstechniken, konfokaler Mikroskopie, Lichtblattmikroskopie und immunhistochemischer Färbung, die auf spezifische Forschungsziele zugeschnitten sind, detailliert zu beschreiben. In dieser Studie konzentrieren wir uns zwar ausschließlich auf frisches menschliches Hautgewebe, das am Tag der Exzision fixiert wurde und keine Frost-Tau-Zyklen durchlaufen hat, aber diese Techniken liefern Einblicke nicht nur in die strukturellen Veränderungen lymphatischer Gefäße während Krankheit und Alterung, sondern auch in die damit verbundenen funktionellen Veränderungen.

Protocol

Hautproben menschlicher Probanden wurden im Chiba University Hospital (Chiba, Japan) entnommen. Alle Verfahren mit menschlichen Probanden wurden vom Institutional Review Board des Chiba University Hospital und des Shiseido Global Innovation Center genehmigt, und alle Probanden gaben eine schriftliche informierte Einwilligung. Die Reagenzien und die verwendeten Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Vorbehandlung menschlicher Hautproben

1. Entfernen Sie das subkutane Gewebe entfernter Proben bei der Entnahme.
   HINWEIS: Das Intervall zwischen Hautexzision und -erwerbung betrug ungefähr h. Während des Transports wurde das Gewebe in DMEM eingetaucht und auf Eispackungen aufbewahrt.
2. Legen Sie die Proben mit der Epidermisseite nach unten auf eine 60 °C heiße Platte für 45 Sekunden, um Epidermis und Dermis zu trennen.
3. Tauchen Sie die Exemplare sofort in eiskalten PBS.
4. Trennen Sie Epidermis und Dermis mit einer Pinzette.
5. Fixieren Sie die Dermalstellen in 4 % Paraformaldehyd bei 4°C für 16 Stunden und waschen Sie anschließend vor der Anwendung mit PBS.
   HINWEIS: Nach der Fixierung wurden die Proben in PBS bei 4 °C aufbewahrt, und die Immunfärbungsschritte wurden innerhalb weniger Monate eingeleitet.
   VORSICHT: PFA-Lösung ist giftig. Alle Vorbereitungen und Handhabungen müssen in einer Abzugshaube erfolgen, während geeignete persönliche Schutzausrüstung getragen wird.

2. Ganzmontierte Immunfärbung kombiniert mit Reinigungsreagenzien

1. iDISCO-Technik
   1. Schneiden Sie die Exemplare auf etwa 5 mm × 5 mm × 5 mm Größe.
   2. Übertragen Sie die Proben in 5 % Triton X-100 und 2,5 % Tween 20 in PBS auf einem orbitalen Shaker mit 50 U/min bei 24 °C für 16 Stunden zur Permeabilisierung.
   3. Waschen Sie die Proben 1 Stunde lang mit PBS bei 24 °C und wiederholen Sie den Vorgang dreimal.
   4. Tauchen Sie die Proben in frisch vorbereiteten Blockpuffer A (1 % BSA, 0,1 % Tween 20, 0,03 % Natriumazid in PBS) auf einem Orbitalshaker ein, der auf 50 U/min bei 24 °C für 72 Stunden eingestellt ist.
   5. Inkubieren Sie die Proben mit einem primären Antikörper gegen Podoplanin (1:100) in einem Blockpuffer A auf einem Orbitalshaker, der auf 50 U/min bei 37 °C für 72 Stunden eingestellt ist.
   6. Waschen Sie die Proben mit Waschpuffer A (0,1 % Tween-20 in PBS) bei 24 °C für 1 Stunde und wiederholen Sie den Vorgang dreimal. Anschließend werden die Proben in Waschpuffer A auf einem auf 50 U/min eingestellten Orbitalshaker bei 4 °C für 72 Stunden aufbewahrt.
   7. Inkubieren Sie die Proben mit einem sekundären Antikörper gegen Maus-IgG, konjugiert zu Alexa Fluor 647 (1:1000), in einem Blockpuffer A auf einem Orbitalshaker mit 50 U/min bei 37 °C für 72 Stunden.
   8. Wiederhole Schritt 1.6.
   9. Inkubieren Sie die Proben mit 50 % MeOH bei 24 °C für 3 Stunden.
   10. Inkubieren Sie die Exemplare mit 70 % MeOH bei 24 °C für 3 Stunden.
   11. Inkubieren Sie die Exemplare mit 100 % MeOH bei 24 °C für 16 Stunden.
   12. Inkubieren Sie die Proben mit Dichloromethan bei 24 °C für 15 Minuten und wiederholen Sie den Vorgang zweimal.
   13. Reinigen Sie die Proben mit Dibenzyläther bei 24 °C für 16 Stunden.
       HINWEIS: Wenn das Gewebe zu diesem Zeitpunkt noch nicht transparent ist, führt weiteres Warten zu keiner signifikanten Verbesserung.
   14. Nehmen Sie Bilder der Proben mit einem Lichtblattmikroskop auf.
       HINWEIS: Verwenden Sie ein Lightsheet mit einem EC Plan-Neofluar 5×/0,16 Ziel; Beleuchtung (Anregung) auf 63 nm und Erkennung auf 648 nm eingestellt; einen Z-Stack mit einer Schrittweite von 5,8 μm erwerben.
       VORSICHT: Methanol, Dichloromethan und Dibenzyläther sind gefährlich. Alle Vorbereitungen und Handhabungen müssen in einer Abzugshaube erfolgen, während geeignete persönliche Schutzausrüstung getragen wird.
2. Rapiclear 1.52-Reagenz
   1. Schneiden Sie die Exemplare auf etwa 5 mm × 5 mm × 2 mm Größe.
   2. Übertragen Sie die Proben in 2 % Triton-X 100 in PBS auf einem Orbitalshaker, der auf 50 U/min bei 24 °C eingestellt ist, für 16 Stunden zur Permeabilisierung.
   3. Tauchen Sie die Proben in frisch vorbereiteten Blockpuffer B (5 % Eselserum und 1 % Triton-X 100 in PBS) auf einem Orbitalshaker ein, der auf 50 U/min bei 4 °C eingestellt ist, für 16 Stunden.
   4. Inkubieren Sie die Proben mit primären Antikörpern gegen Podoplanin und VE-Cadherin (beide bei 1:100) in einem Blockpuffer B auf einem Orbitalshaker mit 50 U/min bei 4 °C für 72 Stunden.
   5. Waschen Sie die Proben mit Waschpuffer B (3 % NaCl und 0,2 % Triton-X 100 in PBS) bei 24 °C für 1 Stunde und wiederholen Sie den Vorgang dreimal. Anschließend werden die Proben in Waschpuffer B auf einem auf 50 U/min eingestellten Orbitalshaker bei 4 °C für 16 Stunden aufbewahrt.
   6. Waschen Sie die Proben 1 Stunde lang mit PBS bei 24 °C.
   7. Inkubieren Sie die Proben mit sekundären Antikörpern gegen Maus-IgG und Kaninchen-IgG, konjugiert zu Alexa Fluor 647 bzw. 568 (beide bei 1:1000), im Blockpuffer B auf einem Orbitalshaker mit 50 U/min bei 4 °C für 16 Stunden.
   8. Wiederholen Sie Schritte 1.5. und 1,6.
   9. Reinigen Sie die Proben mit mindestens dem 5-fachen Probenvolumen von Rapiclear 1,52 bei 24 °C für 16 Stunden.
      HINWEIS: Die Räumung der peripheren Gewebebereiche wurde in weniger als 1 Stunde beobachtet.
   10. Lassen Sie die freigegebenen Proben in eine Polydimethylsiloxan-Gelkammer einbetten, die auf einem Deckzettel mit frischem Rapiclear 1.52-Reagenz platziert wird.
   11. Fotografieren Sie die Proben mit einem konfokalen Mikroskop.
       HINWEIS: Verwendung eines konfokalen Mikroskops mit einem Plan-Apochromat 10×/0,45 M27 Objektiv; die Anregung auf 633 nm und 561 nm sowie den Detektionsbereich auf 641–754 nm und 566–628 nm mit einem GaAsP-Detektor eingestellt; einen Z-Stack mit einer Schrittweite von 3,15 μm erwerben.
3. CUBIC-Technik
   1. Schneiden Sie die Exemplare auf etwa 5 mm × 5 mm × 3 mm groß.
   2. Tauchen Sie die Proben 24 Stunden lang in 50 % CUBIC-L bei 24 °C als Vorbehandlung zur Delipidierung ein.
   3. Übertragen Sie die Proben in 100 % CUBIC-L auf einem Orbitalshaker, der auf 50 U/min bei 37 °C eingestellt ist, für 7 Tage zur Entfettung.
   4. Waschen Sie die Proben 24 Stunden lang mit PBS bei Raumtemperatur.
   5. Tauchen Sie die Proben in frisch vorbereiteten Sperrpuffer A auf einem Orbitalshaker ein, der auf 50 U/min bei 24 °C eingestellt ist, für 72 Stunden.
   6. Inkubieren Sie die Proben mit einem primären Antikörper gegen VE-Cadherin, Podoplanin und CD31 (1:100, 1:100 bzw. 1:200) im Blockpuffer A auf einem orbitalen Shaker mit 50 U/min bei 37 °C für 72 Stunden.
   7. Waschen Sie die Proben 1 Stunde lang mit Waschpuffer A bei 24 °C. Wiederholen Sie den Vorgang dreimal und halten Sie die Proben dann in Waschpuffer A auf einem auf 50 U/min eingestellten Orbitalshaker bei 4 °C für 72 Stunden.
   8. Inkubieren Sie die Proben mit sekundären Antikörpern gegen Maus-IgG, Kaninchen-IgG und Schaf-IgG, konjugiert zu Alexa Fluor 647, 568 bzw. 488 (alle bei 1:1000), in Blockpuffer A auf einem Orbitalshaker mit 50 U/min bei 37 °C für 72 Stunden.
   9. Wiederhole Schritt 3.7.
   10. Vorklären Sie die Proben mit 50 % CUBIC-R+(M) bei 24 °C für 16 Stunden.
   11. Reinigen Sie die Proben mit 100 % CUBIC-R+(M) bei 24 °C für 16 Stunden.
       HINWEIS: Wenn das Gewebe zu diesem Zeitpunkt noch nicht transparent ist, führt weiteres Warten zu keiner signifikanten Verbesserung.
   12. Fotografieren Sie die Proben mit einem konfokalen Mikroskop.
       HINWEIS: Verwenden Sie ein Konfokalmikroskop mit einem Plan-Apochromat-Objektiv von 20×/0,8 M27; Stellen Sie die Anregung auf 633 nm, 561 nm und 488 nm sowie den Nachweisbereich auf 641–754 nm, 566–628 nm und 479–550 nm mit einem GaAsP-Detektor ein; einen Z-Stack mit einer Schrittweite von 0,78 μm erwerben.

Results

Unterschied in der Lichtdurchlässigkeit des geklärten menschlichen Hautgewebes mit und ohne Epidermis
Abbildung 1 zeigt repräsentative Fotografien menschlicher Hautproben mit und ohne Epidermis, nach Permeabilisierung und Reinigung mit Rapiclear 1.52-Reagenz. Die Epidermalentfernung verbessert die Gewebetransparenz, indem Melanin, ein starker Lichtabsorber, entfernt wird, was durch die verbesserte Sichtbarkeit der schwarzen Linie unter d...

Discussion

Die dreidimensionale Visualisierung lymphatischer Netzwerke in biologischen Geweben ist von entscheidender Bedeutung, um ihre strukturellen Eigenschaften und physiologischen Funktionen sowie pathologische Veränderungen zu verstehen. Dieses Protokoll stellt drei unterschiedliche Methoden zur Gewebereinigung vor, die für menschliches Hautgewebe optimiert sind und jeweils auf spezifische Beobachtungsziele zugeschnitten sind.

Die Epidermalentfernung gilt als entsc...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-CD31-Antikörper	R& D-Systeme	AF806	Verdünnung bei 1:200
Anti-Podoplanin-Antikörper	Dako	M3619	Verdünnung bei 1:100
Anti-VE-Cadherin-Antikörper	Zell-Signaltechnik	#2500	Verdünnung bei 1:100
CUBIC-L	Tokioter Chemieindustrie	T3740
KUBISCH-R+(M)	Tokioter Chemieindustrie	T3741
DMEM, niedriger Blutzucker, Pyruvat	Thermo Fisher WISSENSCHAFTLICH	11885084
Donkey Anti-Maus IgG (H+L) Stark kreuzadsorbierter sekundärer Antikörper, Alexa Fluor 647	Thermo Fisher WISSENSCHAFTLICH	A-31571	Verdünnung bei 1:1000
Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Hoch kreuzadsorbierter sekundärer Antikörper, Alexa Fluor 568	Thermo Fisher WISSENSCHAFTLICH	A10042	Verdünnung bei 1:1000
Donkey Anti-Schaf IgG (H+L) kreuzadsorbierter sekundärer Antikörper, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher WISSENSCHAFTLICH	A-11015	Verdünnung bei 1:1000
Rapiclear 1.52	Sunjin-Labor	RC152001
ZEISS Lightsheet Z.1 Mikroskop	Carl Zeiss
ZEISS LSM 880 Konfokales Laser-Rastermikroskop	Carl Zeiss