Ein Einzelmolekül-FRET-Assay ermöglicht eine quantitative Analyse der Hfq-vermittelten Annealing zwischen bakteriellen sRNAs und mRNAs, was die Messung der Wechselwirkungskinetik und -stabilität ermöglicht. Repräsentative Ergebnisse zeigen, wie Samenlänge, Hfq-Bindungsmotive und Motivabstand die RNA-Duplexbildung beeinflussen.
Forschungsartikel
Einfluss der Samenlänge und der Bindungsmotive auf das Hfq-vermittelte sRNA-mRNA-Anglühen, analysiert mit Einzelmolekül-FRET
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Definition der Regeln, die das Annealing zwischen bakteriellen Small RNAs (sRNAs) und ihren mRNA-Zielen regeln, ist schwierig, da diese RNAs in Sequenz und Struktur stark heterogen sind. Um den Beitrag einzelner Merkmale zu entwirren, variierten wir systematisch wichtige Determinanten, darunter Samenstärken, Hfq-bindende Motive und den Abstand zwischen ihnen. Die Auswirkungen dieser Merkmale auf die Stabilität von sRNA-mRNA-Duplexen wurden mit Einzelmolekül-Förster-Resonanzenergietransfer (smFRET) getestet, was die Überwachung einzelner RNA-Moleküle auf der Millisekundenzeitskala ermöglicht und Zugang zu dynamischen Ereignissen ermöglicht, die in Ensemble-Assays oft verdeckt werden.
Wir zeigen, dass kurze Samenregionen (4–5 bp) instabile, kurzlebige Komplexe bilden, während längere Samen (8–10 bp) stabile Duplexe erzeugen. Die Verlängerung von Hfq-Bindungsmotiven oder das Einführen eines Abstandsabstands zwischen den Bindungsstellen auf mRNA verlängerte die Interaktionslebensdauer weiter und unterstrich die Bedeutung der Motivstärke und räumlichen Anordnung für die Effizienz der Hfq-vermittelten Annealing. Darüber hinaus bietet dieser Ansatz einen robusten und reproduzierbaren Rahmen zur Analyse der RNA-RNA-Interaktionsdynamik in Einzelmolekülauflösung und zur Untersuchung von RNA-Chaperonmechanismen.
Einleitung
Die bakterielle Genexpression wird auf posttranskriptionaler Ebene von kleinen RNAs umfassend reguliert. Diese kurzen (typischerweise 50–300 nt) RNAs wirken durch Basenpaarung mit Ziel-mRNAs1. In vielen Fällen glühen sRNAs zu Ribosombindungsstellen, um die Translation zu unterdrücken oder den mRNA-Zerfall durch die Rekrutierung von RNasen 2,3 auszulösen. Obwohl diese Wechselwirkungen umfassend mit genetischen und biochemischen Tests untersucht wurden, schließen die meisten verfügbaren Ansätze eine Regulierung indirekt aus stationären Effekten auf RNA-Niveaus oder Proteinausgabe, was es erschwert, die zugrunde liegenden Bindungsdynamiken zu erkennen.
Eine effiziente Zielregulierung erfordert oft das RNA-Chaperon Hfq, ein kleines, hexameres, SM-ähnlichesProtein 4,5. Hfq verlängert die Halbwertszeiten von sRNAs, indem es sie vor Nukleasen6 abschirmt, und fördert das Annealing mit Ziel-mRNAs 7,8. Hfq erfüllt diese Funktionen über drei unterschiedliche RNA-Bindungsflächen mit unterschiedlichen Präferenzen: Die distale Fläche erkennt AAN-Motive, die üblicherweise in mRNAs zu finden sind, die proximale Fläche bindet U-reiche Sequenzen, die typisch für sRNA-Terminatoren sind, und der Rand wechselwirkt elektrostatisch mit RNA-Rückgraten9. Hfq ist jedoch in deutlich geringerer Häufigkeit vorhanden als der gesamte Pool der wechselwirkenden RNAs10,11. Trotz dieser scheinbaren Einschränkung finden neu synthetisierte sRNAs ihre Ziele und lösen die Regulation innerhalb von Minuten nachTranskription 12 aus. Dieses Paradoxon legt nahe, dass RNA-Hfq-Interaktionen hochdynamisch sind, wobei RNAs kontinuierlich assoziieren und dissoziieren, anstatt in stabilen Komplexen13,14 gebunden zu bleiben. Um zu verstehen, wie solche transienten Wechselwirkungen eine zuverlässige Regulation erzeugen, ist ein experimenteller Zugang zu einzelnen Bindungsereignissen statt zu Populationsdurchschnitten erforderlich.
Interaktionen zwischen sRNAs und mRNAs werden durch unvollkommen komplementäre Samensequenzen vermittelt, die ihre passenden Stellen innerhalb mRNAs finden müssen, die oft lang und hochstrukturiert sind. Außerdem kann der Abstand zwischen der sRNA-Samenregion und der Hfq-Bindungsstelle auf der mRNA erheblichum 15 variieren, was den Annealing-Prozess weiter erschwert. Hfq hilft, diese Herausforderungen zu überwinden, indem sRNAs flexibel zwischen potenziellen Bindungsstellen auf dem Ziel übertragen werden, wodurch die Wahrscheinlichkeit erhöht wird, auf die richtige Paarungsregion16 zu treffen. Hfq-vermittelte Paarung kann zudem lokale mRNA-Strukturen umstrukturieren, basengepaarte Regionen vorübergehend aufwickeln und sonst unzugängliche Sequenzen freilegen. Solche Umbauten können jedoch auch zu unproduktiven oder abgebrochenen Glühvorgängen führen. Diese transienten Wechselwirkungen können manchmal durch starke Hfq-Bindungsmotive in der Nähe der Paarungsstelle17 stabilisiert werden. Trotz dieser Flexibilität führen nicht alle sRNA-mRNA-Begegnungen zu einer stabilen Duplexbildung, und die Faktoren, die die Annealing-Effizienz bestimmen, sind weiterhin wenig verstanden. Insbesondere bleibt unklar, wie einzelne Sequenzdeterminanten quantitativ zu Bindungslebensdauern und komplexer Stabilität beitragen.
Hier haben wir ein minimal rekonstituiertes Einzelmolekülsystem etabliert, das eine schrittweise Manipulation von Sequenzdeterminanten und die direkte Messung der Annealing-Kinetik mittels smFRET ermöglicht. In diesem System entwarfen wir RNA-Paare mit anfänglich ineffizientem Annealing und veränderten systematisch Schlüsselmerkmale wie Samenstärke, Hfq-Bindungsmotivstärke und Abstand zwischen diesen Stellen, um zu analysieren, wie einzelne Parameter die Duplexstabilität beeinflussen. Durch die Isolierung definierter Sequenzmerkmale in einem kontrollierten in-vitro-System ermöglicht dieser Ansatz die mechanistische Zerlegung von sRNA-Zielregeln, die aufgrund der Netzwerkkomplexität und indirekter regulatorischer Effekte in vivo schwer zu entwirren sind.
Protokoll
Dieses Protokoll beschreibt den Einzelmolekül-FRET-Test zur Überwachung der sRNA-mRNA-Annealing. Sie umfasst Verfahren für das Design von Modell-RNAs, die Synthese, die Passivierung und Funktionalisierung des Objektträgers, die Bildgebung von Einzelmolekülen und quantitative Datenanalyse.
RNA-Präparation
Entwerfen Sie die sRNA- und mRNA-Sequenzen in Silico. Jede sRNA sollte mit einem Transkriptionsterminator endet und ein U-reiches Hfq-Bindungsmotiv sowie eine komplementäre Samensequenz zur Ziel-mRNA enthalten. Die entsprechende mRNA sollte AAN-Wiederholungen enthalten, die als Hfq-bindendes Motiv dienen, sowie als komplementäre Sequenz zur sRNA-Samenregion. Sequenzen außerhalb der Hfq-Bindung werden randomisiert, wobei AAN-Motive und U-reiche Trakte vermieden werden, um unbeabsichtigte Hfq-Wechselwirkungen zu vermeiden. Fügen Sie eine tether-komplementäre Sequenz am 3'-Ende der mRNA hinzu, um die Immobilisierung an der Oberfläche während der Bildgebung zu ermöglichen. Vorhersagen von RNA-Sekundärstrukturen ohne Tether-Komplementärsequenz mittels RNAstructure über den Webserver oder lokal18. Für webbasierte Analysen laden Sie FASTA-Sequenzen auf den RNAstructure-Webserver (https://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructureWeb) hoch und wählen Sie Predict a Secondary Structure aus. Verwenden Sie Standardparameter (Temperatur 37 °C, keine Faltungsbeschränkungen). Nach der Berechnung inspizieren Sie das Strukturdiagramm und die Faltwahrscheinlichkeit. Regionen wurden als verstopft klassifiziert, wenn Nukleotide innerhalb des Samen- oder Hfq-bindenden Motivs eine basenpaarungswahrscheinliche >60 % vorhergesagt hatten. Sequenzen, die diese Schwelle überschritten, wurden neu gestaltet.
Bereiten Sie DNA-Vorlagen für die In-vitro-Transkription vor, indem Sie überlappende Oligonukleotide mittels DNA-Polymerase nach dem Protokoll des Herstellers verlängern. Die Primer-Konzentration betrug jeweils 3 μM. Das Thermocycler-Programm wurde wie vom Hersteller empfohlen verwendet, mit der Ausnahme, dass die Anzahl der Verstärkungszyklen auf 8 reduziert wurde, was ausreichte, um die Zündhütchen zu verlängern.
Transkribiere RNA bei 37 °C für 3 Stunden bis über Nacht mit T7-RNA-Polymerase in einem 1× Transkriptionspuffer (80 mM Tris-HCl, pH 8,0, 2 mM Spermidin, 10 mM NaCl), ergänzt mit je 1 mM NTP, 40 mM DTT und 30 mM MgCl2. Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie EDTA zu einer Endkonzentration von 30 mM hinzufügen. Für RNA-Niederschlag fügen Sie 1/10 Volumen 3 M NaOAc (pH 5,4) hinzu, gefolgt von 2,5–3 Volumen ≥99 % Ethanol. Gründlich mischen und 1 Stunde bei -80 °C inkubieren. Pellet-RNA durch Zentrifugation bei ≥20.000 × g für 35 Minuten bei 4 °C. Entferne das Überdachungsmittel, wasche das Pellet mit 70 % Ethanol und lasse es kurz an der Luft trocknen. Lösen Sie das RNA-Pellet in 20 μL 8 m Harnstoff auf und erhitzen Sie das bei 90 °C für 2 Minuten. Reinigen Sie die RNA auf 8%igen Polyacrylamid-Gelen mit 8 M Harnstoff. Entfernen Sie die interessierenden Bänder und eluieren Sie die RNA über Nacht im Elutionspuffer (0,3 M Natriumacetat, pH 5,4, 1 mM EDTA). Die RNA wird durch Ethanolfällung zurückgewonnen (befolgen Sie die Anweisungen für die DNA-Fällung) und löst das Pellet in nukleasefreiem Wasser.
Um RNAs für die fluoreszierende Markierung vorzubereiten, führen Sie wie beschrieben in vitro Transkription durch und ergänzen die Reaktion mit 32 mM GMP, um Transkripte mit einem 5'-Monophosphat zu erzeugen. Behandle die RNA mit 1-Ethyl-3-[3-Dimethylaminopropyl]-Carbodiimid-Hydrochlorid19 (EDC) und Imidazol, um am 5'-Ende eine Amingruppe einzuführen. Inkubieren Sie die sRNA in einem Karbonat-Bicarbonat-Puffer (pH 8,5) mit entweder Alexa Fluor 555 oder Cy3 NHS-Ester und folgen Sie den Anweisungen des Herstellers. Reinigen Sie die modifizierte RNA mittels chromatografischer Spin-Säulen, fällen Sie mit Ethanol aus und lösen Sie das Pellet in nukleasefreiem Wasser. Bestimmen Sie die Markierungseffizienz spektrophotometrisch durch Messung der Absorption bei 260 nm und am farbstoffspezifischen Absorptionsmaximum mit einem Nanodrop- oder gleichwertigen Spektrophotometer. Berechnen Sie RNA- und Farbstoffkonzentrationen anhand des Beer-Lambert-Gesetzes und der entsprechenden Extinktionskoeffizienten, die vom Fluorophorhersteller bereitgestellt werden. Die Markierungseffizienz ist definiert als das molare Verhältnisse von Farbstoff zu RNA und erreichte routinemäßig 100 %. Markierte RNAs können bei -20 °C gelagert werden.
Ordnete DNA-Oligonukleotide, die eine 3′-Biotin-Moiety und einen 5′-Amino-C6-Linker tragen. Fälle DNA mit Ethanol und Natriumacetat aus, wie oben beschrieben. Beschriften Sie die Amingruppe mit Cy5 NHS-Ester in einem Karbonat-Bicarbonat-Puffer (pH 8,5) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Bestimmen Sie die Konzentration der markierten DNA spektrophotometrisch wie oben beschrieben. Markierte DNAs können bei -20 °C gespeichert werden.
Hfq-Reinigung
Erziehe Escherichia coli BL21 (DE3) Δhfq::cat-sacB-Zellen , die das Hfq-Expressionsplasmid pET21b-EcHfq tragen, in denen das E.-coli-hfq-Gen aus einem IPTG-induzierbaren Promoter exprimiert wird. Hfq wird ohne Affinitäts-Tag angegeben; das native Protein enthält genügend oberflächenexponierte Hitidinreste, um eine Reinigung durchNi-2+- Affinitätschromatographie zu ermöglichen. Zellen in 1 L LB-Miller-Medium wachsen lassen, ergänzt mit 100 μg/mL Ampicillin bei 37 °C bis zu einem OD600 von 0,6. Induziere die Hfq-Expression durch Hinzufügen von IPTG zu einer Endkonzentration von 1 mM und inkubiere 4 Stunden bei 37 °C. Die Zellen werden durch Zentrifugation bei 5.000 × g für 10 Minuten entnommen und anschließend in 50 mL Lysepuffer (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 500 mM NH4Cl, 250 mM MgCl2, 1 mM 2-Mercapttoethanol, Vorsicht: 2-Mercaptoethanol ist giftig, Griff in einer Abzughaube). Lysieren Sie die Zellen durch Sonikation auf Eis mit einer Pulseinstellung von 50 % Duty Cycle. Übertragen Sie drei 40-Sekunden-Impulse mit 1-minütigen Abkühlintervallen auf Eis zwischen den Pulsen. Zentrifugiere das Lysat bei 27.000 × g für 20 Minuten bei 4 °C. Erhitze den Supernatant bei 85 °C für 45 Minuten und zentrifugiere dann erneut unter denselben Bedingungen. Behandeln Sie das resultierende Supernatant mit RNase A (30 μg/mL) und DNase I (5 U/mL) für 1 Stunde bei Raumtemperatur und sanftem Schütteln, gefolgt von der Filtration durch einen 0,45 μm-Filter. Trage das gekleinigte Lysat auf eine Affinitätschromatographiesäule auf, die mit NiSO4 vorgeladen ist. Waschen Sie die Säule mit einem Puffer (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 500 mM NH4Cl, 0,5 mM 2-Mercapttoethanol). Elutieren Sie das Protein mit demselben Puffer und einer linearen Imidazol-Gradientenkonzentration von 10 mM bis 1 M. Sammeln Sie die Fraktionen mit Hfq und laden Sie sie auf eine HiLoad 16/600 Superdex 200 Größenausschlusschromatographie-Säule, ausgeglichen mit HB-Puffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 250 mM NH4Cl, 1 mM EDTA, 10% Glycerol). Bedienen Sie die Säule gemäß den Anweisungen des Herstellers. Eine repräsentative SDS-PAGE-Analyse der Hfq-Reinigung ist in ergänzender Abbildung 1 dargestellt. Konzentrieren Sie das gereinigte Protein bei Bedarf mit Zentrifugalfiltern (3 kDa MWCO). Gereinigte Hfq-Aliquots können bei -80 °C gelagert werden.
Einzelmolekül-Experimente
Passivierung von Quarzrutschen20
Bereiten Sie Quarz-Schlitten mit fünf parallelen Löchern (0,8 mm Durchmesser) vor, die in der Nähe jeder langen Kante gebohrt werden. Quarz-Objektträger und Deckfolien werden in ein Hellendahl-Färbeglas (Objektträger) gelegt und 20 Minuten lang in Aceton sonikiert (Vorsicht: Aceton ist brennbar und flüchtig; arbeiten Sie in einer Abzugshaube). Wiederholen Sie den Reinigungsschritt mit Methanol (Vorsicht: Methanol ist giftig und brennbar; Griff in einer Abzughaube). Spülen Sie die Objektträger gründlich mit Wasser ab und sonizieren Sie 1 Stunde lang in 1 M KOH (Vorsicht: KOH ist ätzend, tragen Sie Handschuhe und Augenschutz). Spüle die Objektträger mit Wasser ab und sonikiere dann nacheinander 20 Minuten lang in Aceton und Methanol. Wiederholen Sie die KOH-Reinigung mit 5 M KOH für 1 Stunde, gefolgt von gründlicher Wasserspülung (Vorsicht: Konzentriertes KOH mit geeigneter Schutzausrüstung handhaben). Die Objektträger an der Luft trocknen. Bereiten Sie ein sauberes Set Hellendahl-Färbungsgläser vor und spülen Sie sie mit Hexan ab (Vorsicht: Hexan ist hochentzündlich; Bedienung in einem Abzugsbehälter) und lassen Sie sie dann an der Luft trocknen. Legen Sie die Objektträger in den Schlittenhalter und spülen Sie sie zweimal mit Hexan. Gib 75 ml Hexan in den Schlittenhalter und injiziere vorsichtig 50 μL Dichlordimethylsilan (DMDCS) unter die Hexanoberfläche (HINWEIS: DMDCS nicht der Luft ausgesetzt). Inkubieren Sie die Rutschen mit sanftem Schaukeln für 1,5 Stunden. Spülen und sonikieren Sie die Objektträger 1 Minute lang in Hexan und wiederholen Sie diesen Schritt dreimal, um die restlichen DMDCS zu entfernen. Lufttrocknen Sie die Objektträger und vakuumieren Sie sie in 50-mL-Röhren (z. B. Falcon- oder konische Röhren). Vorbereitete Objektträger können bis zur weiteren Nutzung bei −20 °C gelagert werden.
Montage und Funktionalisierung von Durchflusskanälen
Ein einfacher Durchflusskanal kann mit einem Quarzschlitten, Glasdeckel, doppelseitigem Klebeband, Pipettenspitzen und Epoxidharz zusammengesetzt werden. Kleben Sie dünne Streifen doppelseitigen Klebebands zwischen die Löcher des Quarzschlittens und legen Sie den Deckmantel darauf. Die längeren Kanten mit Epoxidharz abdichten. Schneiden Sie etwa 5 mm Stücke von einer Pipettenspitze (sowohl der schmalen Spitze als auch vom breiteren Kragen) ab und führen Sie eines in ein Loch als Auslass und das andere in ein paralleles Loch ein, um ein Einlassreservoir zu bilden. Sichern Sie beide mit Epoxidharz. Der Einlassbehälter sollte vor der Injektion Flüssigkeit ohne Auslaufen speichern. Um Lösungen durch den Kanal zu ziehen, verbinden Sie den Schlauch von einer 1-mL-Spritze zum Auslass.
Behandeln Sie die Kanäle sequentiell mit folgenden Reagenzien, um die Oberfläche zu funktionalisieren: biotinyliertes BSA (0,2 mg/mL) für 5 Minuten, Tween-20 (0,2 %) für 10 Minuten und NeutrAvidin (0,1 mg/mL) für 1 Minute. Ungefähr 100 μL jeder Lösung reichen pro Kanal aus. Vermeiden Sie es, mehr Flüssigkeit zu ziehen, als im Einlassreservoir vorhanden ist, da dies Luft in den Kanal einführt und Blasen erzeugt. Lassen Sie zwischen den Schritten eine kleine Menge Lösung im Reservoir, um das Austrocknen des Kanals zu verhindern. Spülen Sie gründlich mit 1× TNK-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl, 50 mM KCl) zwischen jedem Schritt. Diese Behandlung etabliert eine Biotin-NeutrAvidin-Oberfläche für die RNA-Immobilisierung.
Bereite mRNA-Tether-Duplexe unmittelbar vor der Immobilisierung vor, indem 40 nM mRNA mit 20 nM biotinylierter Cy5-markierter DNA-Tether gemischt wird. Denaturieren Sie das Gemisch bei 75 °C für 5 Minuten in einem 1× TNK-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl, 50 mM KCl), dann neu verwandelt bei 37 °C für 15 Minuten und gleicht bei 20 °C aus.
Verdünnen Sie die Probe 50-fach im Bildgebungspuffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl, 50 mM KCl, 4 mM 6-Hydroxy-2,5,7,8-Tetramethylchroman-2-Carbonsäure, 0,01 % Octaethylenglykol-Monododecylether, 0,8 % Glukose, 2 U/mL RNase-Inhibitor) und injizieren Sie sie in den Flusskanal, um die mRNAs zu immobilisieren. Inkubieren Sie 1 Minute, dann mit einem Bildpuffer und einem Sauerstoffabwassersystem (165 U/mL Glukoseoxidase und 2170 U/mL Katalase) waschen, um die Photobleachung zu reduzieren.
Bereite sRNA-Hfq-Komplexe vor, indem die Komponenten im Verhältnis 1:1 zu einer endgültigen Konzentration von 250 nM in einem 1× TNK-Puffer gemischt werden und 5–15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert werden. Verdünnen Sie die Komplexe 50-fach im Bildgebungspuffer mit dem Sauerstoffabtrennsystem und injizieren Sie sie unmittelbar vor der Bildgebung in den Strömungskanal.
Einzelmolekül-Datenerfassung
Richten Sie das prismabasierte Total Internal Reflection Fluoreszenzmikroskop (TIRF) ein, indem Sie die EMCCD-Kamera und die Laser einschalten. Montiere den vorbereiteten Schlitten mit zusammengesetzten Durchflusskanälen auf der Mikroskopstufe und platziere das Prisma obendrauf. Verwenden Sie Single-Software (https://github.com/Ha-SingleMoleculeLab), um Daten zu erfassen. In der Software bestimmen Sie das Hintergrundniveau, indem Sie AutoScale auswählen und den erhaltenen Wert in das Hintergrundfeld kopieren. Stellen Sie die Bildaufnahmerate auf 100 ms ein. Excite Alexa Fluor 555 oder Cy3 mit einem 532 nm Laser und Cy5 mit einem 633 nm Laser. Sammeln Sie Emissionen aus beiden Kanälen gleichzeitig durch ein 60× Wasserimmersionsziel. Für jeden Film beginnt man mit zehn Bildern 633-nm-Anregung, um Cy5-markierte mRNAs im Sichtfeld zu lokalisieren. Nehmen Sie 5 Minuten lang mit 532 nm Erregung auf. Beenden Sie die Aufnahme mit 1 Sekunden à 633 nm Anregung, um die Cy5-Photobleaching zu überprüfen. Dies erzeugt die .pma-Filmdatei, die zur Analyse verwendet werden kann.
Einzelmolekül-Datenanalyse
Analysiere rohe .pma-Dateien mit benutzerdefinierten IDL-Skripten, um Donor-Akzeptor-Kanal-Mapping durchzuführen und Fluoreszenzintensitätstrajektorien zu extrahieren. Zuerst nehmen Sie einen Kalibrierungsfilm mit mehrfarbigen fluoreszierenden Perlen auf, die sowohl im Donor- als auch im Akzeptorkanal bei der Anregung mit dem 532-nm- oder 633-nm-Laser nachweisbar sind. Verwenden Sie dieses Kalibrierungsfilm, um eine Mapping-Datei zu erzeugen, die Spender- und Akzeptorkanäle ausrichtet. Wenden Sie die resultierende Mapping-Datei auf alle experimentellen Aufzeichnungen an, um entsprechende Donor-Akzeptor-Paare zu identifizieren, fluoreszierende Flecken zu erkennen und Intensitätszeitspuren für die nachgeschaltete FRET-Analyse zu exportieren. Detaillierte Schritt-für-Schritt-Anweisungen werden zusammen mit dem Skript (https://github.com/Ha-SingleMoleculeLab) bereitgestellt.
Prozessintensitäts-Traces in MATLAB mit dem Skript s_tr_E.m. Starten Sie das Skript und geben Sie das Verzeichnis ein, das die .traces- und .pks-Dateien enthält, gefolgt vom Dateiindex und der Zeitauflösung. Wählen Sie bei Aufforderung das Rahmenfenster aus, das zur Fleckenerkennung verwendet wird. Das Skript zeigt dann Spender- und Akzeptorintensitäten pro einzelner Stelle an. Navigiere durch Moleküle mit Tastaturbefehlen (b zurück, g um zu einem bestimmten Molekül zu springen). Definieren Sie Donor- und Akzeptor-Baselines (k) und korrigieren Sie Leckage (l), indem Sie bei Bedarf auf die Diagramme klicken. Speichere akzeptierte Spuren einzeln als Dateien .dat, die Zeit-, Spender- und Akzeptorintensitäten enthalten, indem du s drückst. Verwenden Sie die exportierten Dateien für die quantitative Analyse nachgelagert.
Verwenden Sie das Peak-Finder-Programm, um einzelne smFRET-Spuren zu analysieren und Bindungsereignisse zur Quantifizierung zu extrahieren, einschließlich Dwell-Time-Analyse und Verteilungen des FRET-Zustands. Starte das Programm und öffne den Ordner mit den exportierten .dat Trace-Dateien im Dateimenü. Stellen Sie die Basiswerte und die zuvor mit dem MATLAB-Skript berechneten Spender-zu-Akzeptor-Leckwerten ein. Als Nächstes stellen Sie die Intensitätsschwellenwerte so ein, dass sie die automatische Spitzenerkennung steuern, sodass alle visuell verifizierten Bindungsereignisse über den ausgewählten Werten liegen. Wenn Rauschen dazu führt, dass ein einzelnes Ereignis in mehrere Spitzen aufgeteilt wird, führen Sie diese manuell mit der integrierten Merge-Funktion zusammen. Klicken Sie auf Peaks speichern, um erkannte Ereignisse als .csv Dateien zu exportieren, die Startzeit, Endzeit und mittlere RET-Effizienz für jedes Ereignis enthalten. Ausgabedateien werden im Peaks-Verzeichnis gespeichert, während frame-aufgelöste FRET-Werte für jedes Ereignis in das Peak-Fret-Verzeichnis geschrieben werden. Die FRET-Effizienz wird berechnet, indem die Fluoreszenzintensität des Akzeptors durch die Summe der Donator- und Akzeptorintensitäten geteilt wird, wobei Werte verwendet werden, die für Hintergrund- und Donor-Leckage in den Akzeptorkanal korrigiert werden. Inspizieren Sie Spuren manuell auf Cy5-Photobleaching, die durch einen abrupten Rückgang der FRET-Effizienz und einer Erhöhung der Cy3-Intensität festgestellt wird. Wenn Photobleaching auftritt, nehmen wir an, dass die Bindung so lange anhält, wie Cy3-Fluoreszenz nachweisbar ist, und korrigieren die Peak-Dauern durch Bearbeiten der entsprechenden .csv-Dateien.
Importiere frame-aufgelöste FRET-Effizienzwerte aus den Peak-Fret-Dateien in GraphPad Prism. FRET-Histogramme mit der Funktion Frequenzverteilung erstellen und die Verteilungen mit Gaußschen Modellen anpassen, um die dominante FRET-Population zu identifizieren.
Bestimmen Sie Verweilzeiten für einzelne Bindungsereignisse, indem Sie die Assoziation von Dissoziationszeitpunkten mit einer Tabelle abziehen. Berechnen Sie den Anteil der transienten Ereignisse (<10 s) für jede experimentelle Wiederholung. Statistische Analysen wurden in GraphPad Prism durchgeführt. Vergleiche zwischen zwei Bedingungen wurden mit ungepaarten t-Tests ausgewertet, und Vergleiche zwischen drei oder mehr Bedingungen wurden mit Einweg-ANOVA und Tukey-Post-hoc-Test analysiert.
Ergebnisse
Die Samenlänge bestimmt das dynamische Regime der sRNA-mRNA-Paarung
Wir haben einen minimalen Einzelmolekül-Assay eingerichtet, um zu testen, wie Sequenzmerkmale das Hfq-vermittelte Annealing steuern. Modell-RNAs wurden nach zuvor beschriebenen Architekturen von Hfq-abhängigen sRNA-mRNA-Paaren16,17 entwickelt und trugen ein adenosinreiches Hfq-Bindungsmotiv auf der mRNA sowie eine uridinreiche Randbindungsstelle auf der sRNA (Abbildung 1A). Die sRNA wurde am 5ʹ-Ende mit Alexa Fluor 555 (Donor) und dem mRNA-DNA-Tether mit Cy5 (Akzeptor) markiert, was den Nachweis der durch Basenpaarung induzierten Nähe durch FRET ermöglichte.
Die Variation der Samenkomplementarität von 4, 5, 8 bis 10 bp erzeugte unterschiedliche dynamische Verhaltensweisen. Mit einem 4-bp-Samen waren die Interaktionen überwiegend vorübergehend und zeigten heterogene SET-Effizienzen, was auf eine unvollständige Basenpaarung hindeutet (Abbildung 1B-D). Im Gegensatz dazu ergaben 8-bp- und 10-bp-Samen stabile Duplexe, die oft während des Beobachtungsfensters bestehen blieben (Abbildung 1C). Die Interaktionen führten zum erwarteten hohen FRET-Zustand (EFRET ≈ 0,79–0,80, Abbildung 1D), was mit einer vollständigen Basenpaarung zwischen RNAs übereinstimmt. Ein 5-bp-Samen erzeugte kurzlebige, aber klar definierte Bindungsereignisse (EFRET ≈ 0,66) und bot einen arbeitsfähigen dynamischen Bereich für spätere Modifikationen der RNA-Sequenz (Abbildung 1B-D). Daher haben wir für alle nachgelagerten Tests 5-Basis-Komplementarität verwendet.
Stärkere Hfq-Bindungsmotive erhöhen die Stabilität des sRNA-mRNA-Komplexes
Anschließend fragten wir, wie die Bindungsfestigkeit von Hfq die Bindungslebensdauern bei fester 5-bp-Komplementarität moduliert. Die Erweiterung des mRNA-Motivs von AAN4 auf AAN6 erhöhte die Wahrscheinlichkeit, stabile Komplexe zu bilden, signifikant (S. < 0,001). Die mittleren Lebensdauern stiegen von 7,5 Sekunden auf 18 Sekunden, und der Anteil instabiler Ereignisse < 10 Sekunden sank von 80 ± 2 % auf 68,3 ± 2,9 % (Abbildung 2A-C).
Anschließend testeten wir die Wirkung des Hfq-bindenden Motivs auf die sRNA. Die Verkürzung der Randbindungsstelle von UUAUUUUUUUU auf CUUC (sRNA-SR, "kurzer Rand") führte zu hochgradig instabilen Wechselwirkungen (mittlere Lebensdauer 1,9 s mit AAN4), und die Verstärkung des mRNA-Motivs in diesem Zusammenhang hatte nur einen moderaten Effekt (Mittelwert 3,0 s mit AAN6, nicht signifikant, Abbildung 2B,C). Somit tragen beide Partner zur Stabilität des produzierten Komplexes bei, aber schwache sRNA-Hfq-Kontakte begrenzen die Vorteile eines stärkeren mRNA-Motivs.
Ein Spacer zwischen Hfq- und Samenstellen auf der mRNA fördert langlebigere Komplexe
Hfq kann an die AAN-Region gebunden bleiben, während sie deren Randoberfläche nutzt, um die Suche nach dem optimalen sRNA-Paarungsstandort16 zu erleichtern. Diese Eigenschaft deutete darauf hin, dass ein größerer Abstand zwischen den beiden Bindungsregionen auf der mRNA die Stabilität der Interaktion beeinflussen könnte.
Um dies zu testen, setzten wir einen 15-nt-Einzelsträng-Spacer zwischen den Hfq- und sRNA-Bindungsstellen (N15) ein. Diese Modifikation erhöhte die Lebensdauer stabiler Annealing-Ereignisse signifikant von 7,5 s (AAN4) auf 47 s (AAN4-N15) (S. < 0,01) (Abbildung 3A,B). Der Anteil der bindenden Ereignisse, die weniger als 10 Sekunden dauerten, sank ebenfalls von 80 ± 2 % auf 44 ± 6 % (Abbildung 3C). Diese Daten zeigen, dass zusätzliche Flexibilität zwischen Bindungsmodulen die Annealing-Intermediates stabilisieren und langlebigere Duplexe fördern kann.
DATENVERFÜGBARKEIT:
Alle Daten, die die Ergebnisse dieser Studie unterstützen, einschließlich Einzelmolekül-FRET-Trajektorien, verarbeiteter Datensätze und Analyseskripte, sind öffentlich im Mendeley Data-Repository verfügbar: doi:10.17632/3z8fng2c8g.1
Abbildung 1: Einfluss der sRNA-mRNA-Komplementarität auf die Bindungseffizienz. (A) smFRET-Test für sRNA-mRNA-Glühung. Die Basenpaarung zwischen der Alexa-Fluor-555-markierten sRNA und dem immobilisierten mRNA-Cy5-DNA-Tether-Komplex erzeugt ein hochfrequentes RET-Signal. Modell-mRNAs enthalten eine Hfq-Bindungsstelle (AAC)4 (blau) und eine sRNA-Bindungsstelle (S5, rot), gefolgt von fünf Nukleotiden und der RNA-DNA-Hybridregion. sRNAs enthalten eine Randbindungsstelle (orange). Die Panels in (B-D) sind nach experimenteller Bedingung (Saatgutlänge) gruppiert. (B) Repräsentatives sRNA-Bindungsereignis auf einem einzelnen mRNA-Molekül. Fluoreszenzintensitätsspuren von Alexa Fluor 555-markierten sRNA (Spender, grün) und Cy5-DNA-Anker (Akzeptor, rot) werden gezeigt. Cy5 war direkt während der ersten und letzten zehn Frames der Aufnahme begeistert. (C) Rastergramme, die 50 repräsentative mRNA-Moleküle zeigen, gebunden durch sRNA-Hfq. Jeder horizontale Balken repräsentiert eine einzelne sRNA-mRNA-Interaktion. (D) Histogramme von FRET-Effizienzen für Interaktionen zwischen mRNAs und sRNAs mit 4 bp (N = 416 mRNAs), 5 bp (N = 513 mRNAs), 8 bp (N = 191 mRNAs) oder 10 bp (N = 105 mRNAs) komplementären Regionen. RET-Effizienzen wurden anhand von Baseline- und Leak-korrigierten Donor- und Akzeptorintensitäten für einzelne Bindungsereignisse in 0,1-Sekunden-Intervallen berechnet. Gaußsche Anpassungen (blau) zeigen die dominante FRET-Population an und wurden nicht zur Berechnung E_FRET Werte verwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.
Abbildung 2: Wirkung der Länge des Hfq-Bindungsmotivs auf sRNA-mRNA-Interaktionen. Die Basenpaarungsregion in allen Varianten ist 5 bp lang. (A) Rastergramme, die 50 repräsentative mRNAs zeigen, die durch sRNA-Hfq-Komplexe gebunden sind. Jeder horizontale Balken stellt eine einzelne Interaktion dar. Die obigen Cartoon-Diagramme zeigen die entsprechenden RNA-Designs mit Änderungen in der Anzahl der (AAC)-Wiederholungen in der mRNA und der Länge der randbindenden Region in der sRNA (SR = "kurzer Rand"). Kolorierung wie in Abbildung 1A. (B) Streudiagramme der sRNA-mRNA-Bindungslebensdauern. Jeder Punkt repräsentiert ein einzelnes Bindungsereignis. Mittlere Lebensdauern (rote horizontale Linie): 7,5 s für mRNA-AAN4 + sRNA (N = 188 mRNAs), 18 s für mRNA-AAN6 + sRNA (N = 142 mRNAs), 1,9 s für mRNA-AAN4 + sRNA-SR (N = 85 mRNAs) und 3 s für mRNA-AAN6 + sRNA-SR (N = 149 mRNAs). (C) Balkendiagramm, das den Prozentsatz der Bindungsereignisse kürzer als 10 Sekunden zeigt. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung von zwei unabhängigen Datensätzen dar. Statistische Analyse mittels Einweg-ANOVA mit Tukeys Post-hoc-Test für Mehrfachvergleiche. p < 0,001, ****p < 0,0001; NS, nicht signifikant. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.
Abbildung 3: Einfluss der Spacer-Länge zwischen Hfq- und sRNA-Bindungsstellen auf sRNA-mRNA-Interaktionen. Die Basenpaarungsregion in allen Varianten ist 5 bp lang. (A) Rastergramme, die 50 repräsentative mRNAs zeigen, gebunden durch einen sRNA-Hfq-Komplex. Jeder horizontale Balken repräsentiert ein einzelnes bindendes Ereignis. Die obigen Cartoon-Diagramme illustrieren das entsprechende RNA-Design. N15 = 15 nt Spacer einer zufälligen Sequenz. Kolorierung wie in Abbildung 1A. (B) Streudiagramme der sRNA-mRNA-Bindungslebensdauern. Jeder Punkt repräsentiert ein einzelnes Bindungsereignis. Mittlere Lebensdauern (rote horizontale Linie): 7,5 s für mRNA-AAN4 + sRNA (N = 188 mRNAs) und 47s für mRNA-AAN4-N15 + sRNA (N = 289 mRNAs). (C) Balkendiagramm, das den Prozentsatz der Bindungsereignisse kürzer als 10 Sekunden zeigt. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung von zwei unabhängigen Datensätzen dar. Statistische Analyse mittels ungepaarter t-Test. **p < 0,01. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.
Ergänzende Abbildung 1: Reinigung von E. coli Hfq. SDS-PAGE-Analyse der Hfq-Expression und -Reinigung. (Oben) Proben, die während der Reinigung auf einerNi-2+- Affinitätssäule (HiTrap) gesammelt werden, einschließlich vor der Induktion, nach der Induktion, Pellet, Lysat, Ladung, Durchfluss, Waschfraktionen und elutierten Spitzenfraktionen. (Bottom) SDS-PAGE der Spitzenfraktionen nach Größenausschlusschromatographie auf einer HiLoad 16/600 Superdex 200-Säule. Monomere (~11 kDa) und hexamere (~66 kDa) Formen von Hfq sind angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Diskussion
Diese Studie etabliert einen minimalen Einzelmolekül-Test, um zu analysieren, wie spezifische RNA-Sequenzmerkmale die Effizienz der Hfq-vermittelten sRNA-mRNA-Annealing bestimmen. Durch Variation der Seed-Länge, der Hfq-Bindungsmotivstärke und dem Abstand zwischen den Bindungsmodulen quantifizierten wir direkt, wie jeder Parameter zur Duplexstabilität bei Einzelmolekül-Auflösung beiträgt. Im Gegensatz zu Ensemble-Messungen, die populationsgemittelte Effekte berichten, löst dieser Ansatz individuelle Bindungs- und Dissoziationsereignisse direkt auf, was die Messung kinetischer Heterogenität und vorübergehender Interaktionen ermöglicht. Unsere Ergebnisse zeigen, dass selbst kurze Samenregionen vorübergehend interimitieren können, während längere Samen stabile Duplexe mit verlängerter Lebensdauer erzeugen. Diese Ergebnisse stimmen mit früheren In-vivo- und Ensembledaten überein, die zeigen, dass natürliche Samenregionen in bakteriellen sRNAs typischerweise 6–12 Nukleotide umfassen und selten vollständig komplementäre Duplexebilden.
Wir fanden außerdem heraus, dass sowohl die mRNA- als auch die sRNA-Hfq-Bindungsmotive die Duplexstabilität stark beeinflussen. Die Verlängerung des AAN-Motivs auf der mRNA verlängerte die Bindungslebensdauer, während die Verkürzung der sRNA-Randbindungsstelle sie deutlich destabilisierte. Dies unterstützt ein kooperatives Modell, bei dem das distale Gesicht von Hfq adenosinreiche mRNA-Motive verankert und der Rand uridinreiche sRNAs rekrutiert, um eine effiziente Ausrichtung komplementärer Regionenzu fördern 9,17. Im Gegensatz zu genetischen oder reporterbasierten Assays, die typischerweise nur produktive regulatorische Ergebnisse erkennen, trennt dieses System quantitativ die Bindungsstabilität von nachgelagerten Effekten und ermöglicht so einen direkten Vergleich dessen, wie einzelne Sequenzmerkmale die Lebensdauer der physischen Interaktionen modulieren. Ein starkes Randbindungsmotiv ist besonders wichtig, wenn strukturelle Umstrukturierungen für die sRNA-mRNA-Paarung erforderlich sind, da es die RNA-Retention bei Hfq17 verbessert. Der Rand soll auch die laterale Scanning von mRNAs durch sRNA-Hfq-Komplexe16 fördern, eine Eigenschaft, die besonders wichtig sein kann, wenn Zielstellen weit von der Hfq-bindenden Region entfernt sind. Unsere Ergebnisse mit einem 15-NT-Abstandshalter zwischen den Bindungsstellen unterstützen diese Sichtweise und zeigen, dass zusätzliche Flexibilität zwischen Samen- und Hfq-Motiv die Paarungsstabilität verbessert, möglicherweise durch die Reduzierung sterischer Einschränkungen während des Strangwechsels.
Über natürliche Systeme hinaus sind die Ergebnisse für die Entwicklung synthetischer oder technisch entwickelter sRNAs relevant. Die meisten bestehenden Designstrategien konzentrieren sich auf die Optimierung einer Samenregion oder eines allgemeinen Gerüsts 23,24,25, aber unsere Daten heben weitere Determinanten hervor, wie den Abstand zwischen dem Hfq-Bindungsmotiv und der Zielregion. Da Sequenzmerkmale kontrolliert und modular eingeführt werden, bietet der Assay einen systematischen experimentellen Rahmen zur Überprüfung von Designregeln. Dieses Prinzip könnte den zukünftigen Bau künstlicher sRNAs mit verbesserter regulatorischer Effizienz leiten.
Obwohl der Ansatz eine quantitative und reproduzierbare Analyse von RNA-RNA-Interaktionen ermöglicht, weist er auch Einschränkungen auf. Der Test untersucht vollständig komplementäre Regionen, während die meisten physiologischen sRNA-mRNA-Interaktionen Fehlanpassungen und Vorwölbungen aufweisen, die die Erkennung und Regulation beeinträchtigen können. Die Methode misst die Bindungslebensdauer von sRNA-mRNA, adressiert jedoch nicht direkt nachgelagerte regulatorische Ergebnisse wie Translationshemmung oder mRNA-Zerfall. Zukünftige Anpassungen dieses Tests könnten unterschiedliche Samenregionen, unterschiedliche GC-Gehalt oder Ribosomen und Abbauosomen umfassen, um systematisch zu untersuchen, wie diese Faktoren die Bindungskinetik beeinflussen.
Offenlegungen
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.
Danksagungen
Wir danken Prof. Sarah Woodson für den Zugang zu Einzelmolekülinstrumenten. Diese Studie wurde vom National Science Centre Polen (2022/46/E/NZ1/00462 an EMM) und einem EMBO-Installationsstipendium (IG 5730-2024 an EMM) finanziert.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 0,45 μ M-Filter | Millipore | HABG04700 | |
| 5 mL Hi-Trap-Säule | Cytiva | GE17-0408-01 | |
| Aceton | Merck | 270725 | HPLC-Grad |
| Acrylamid: Bis-Acrylamid-Lösung | Merck | A2792-100ML | |
| ALEXA555 NHS Succinimidylester | Thermo Fischer | A20009 | |
| Amicon Ultra-Zentrifugalfilter (NMWL, 3 kDa) | Merck | UFC900308 | |
| Ammoniumchlorid | Merck | 1330-500G | |
| Ampicylin | Merck | A9518-5G | |
| ATP | Linegal Chemicals | K054.1 | |
| Beta-Mercapptoethanol | Merck | M3148-500ML | |
| BIO-BSA | Merck | A8549-10MG | |
| Bio-Spin-Säulen mit Bio-Gel P-30 | Bio Rad | 7326231 | Zur Reinigung markierter RNA |
| Catalase | Merck | C9322 | |
| CTP | Linegal Chemicals | K057.4 | |
| Cy3 HNS Ester | Cytiva | PA13105 | |
| Cy5 NHS Succinimidylester | Cytiva | PA15101 | |
| DDT | Thermo Fischer | R0861 | |
| Dichlordimethylsilan | Merck | 440272 | |
| DNA-Oligomere (Tether) ein 5&prim;-Amino-Linker C6 | Thermowissenschaftlich | n/a | |
| Dnase I | Thermowissenschaftlich | 18047019 | |
| EDC | Thermowissenschaftlich | PG82079 | |
| EDTA | Merck | ED2SS-1KG | |
| EMCCD-Kamera | Andor | ||
| Ethanol | Merck | 1085430250 | |
| Glukose | Merck | D9434-1KG | |
| Glukoseoxidase | Merck | G2133-50KU | |
| Glycerol | Merck | G5516-1L | |
| GMP | Merck | G8377 | |
| GTP | Linegal Chemicals | K056.4 | |
| Hcl | Merck | 1.00318 | |
| Hexan | Thermo Fischer | 045652.M1 | |
| HiLoad 16/60 Superdex 200 Größe Ausschlussspalte | Cytiva | GE28-9893-35 | |
| IPTG | Merck | 420322-1GM | |
| KCl | Merck | P9541-1KG | |
| KOH | Merck | 484016-1KG | |
| Magensiumchlorid | Merck | M8266-1KG | |
| Methanol | Merck | 34885-M | HPLC-Grad |
| Neutravidin | Thermo Fischer | 31000 | |
| Nickelsulfat | Merck | 1067261000 | |
| Nikkol | Merck | P8925-1G | |
| Q5-Polymerase | NEB | M0491S | Verwendet zur Herstellung einer In-vitro-Transkriptionsvorlage |
| RNase A | Thermowissenschaftlich | EN0531 | |
| RNasin Plus | Promega | N2611 | |
| Natriumacetat | Merck | S7545-100G | |
| Natriumchlorid | Sigma-Aldrich | S3014-1KG | |
| Spermidin | Merck Life Science | S2626 | |
| Tris Base | Thermowissenschaftlich | 17926 | |
| Trolox | Merck | 238813-1G | |
| Harnstoff | Merck | U1250-5KG | |
| UTP | Linegal Chemicals | K055.3 |
Referenzen
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