Ein Workflow für Live-Bildgebung und quantitative Analyse acentrosomaler Mikrotubulinetzwerke in Drosophila-Oozyten

Summary

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das Live-Imaging mit automatisierten Analysetools kombiniert, um die Mikrotubulidynamik in der Drosophila-Oozöte zu analysieren. Dieser Workflow ermöglicht eine effiziente und reproduzierbare Messung des Verhaltens der Mikrotubuli, einschließlich Wachstum, Orientierung, Geschwindigkeit und räumlicher Organisation, und kann bei der Optimierung an andere Zelltypen angepasst werden.

Abstract

Das Mikrotubuli-(MT)-Zytoskelett ist für viele zelluläre Funktionen unerlässlich, darunter Zellform, Polarität, Migration und Teilung. Während Centrosomen als Haupt-MT-Organisierungszentrum (MTOC) bei der Teilung tierischer Zellen fungieren, sind viele differenzierte Zellen, einschließlich Drosophila-Oocyten , auf acentrosomale Signalwege angewiesen, um MT-Netzwerke aufzubauen. Im Gegensatz zum umfangreichen Wissen über MT-Organisation in proliferierenden Zellen ist wenig darüber bekannt, wie MT-Netzwerke ohne Centrosome zusammengesetzt werden. Drosophila-Oocyten bieten ein leistungsstarkes Modell zur Untersuchung der Organisation und Dynamik von acentrosomaler MT. Ihr dichtes MT-Netzwerk stellt jedoch konventionelle Bildgebung infrage. Live Imaging ermöglicht eine Echtzeitvisualisierung des MT-Wachstums und der Orientierung, dennoch bleiben standardisierte Analysemethoden begrenzt. Hier präsentieren wir ein Live-Imaging-basiertes Protokoll zur Analyse der MT-Wachstumsdynamik in Drosophila-Oozyten mit End-Binding Protein 1 (EB1)-Green Fluorescent Protein (GFP), einem Plus-End-Tracking-Protein, das Stellen aktiver MT-Polymerisation markiert. Die hochauflösende Airyscan-Konfokalmikroskopie ermöglicht die Erkennung von EB1-Kometen, während benutzerdefinierte Fiji-Makros und Python-Skripte eine schlanke, reproduzierbare Quantifizierung von Kometendichte, Geschwindigkeit, Länge und Orientierung ermöglichen. Wir validierten diese Methode, indem wir Kontrollozyten mit solchen verglichen haben, die einer kaltinduzierten MT-Depolymerisation ausgesetzt waren, sowie mit Patronin-Mutanten (CAMSAP beim Menschen), einem konservierten MT-Minus-Endstabilisator und einer Kernkomponente nicht-zentrosomaler Mikrotubuli-Organisierungszentren (ncMTOC), als positive Kontrolle für beeinträchtigte MT-Dynamik. Unsere Analysen zeigten regionsspezifische MT-Dynamiken, einschließlich der vorderen Anreicherung von EB1-Kometen und charakteristischer Orientierungsverzerrungen, und bestätigten die Empfindlichkeit des Workflows gegenüber subtilen Störungen im MT-Wachstum. Dieser Ansatz bietet einen zuverlässigen, benutzerfreundlichen Rahmen zur Untersuchung des MT-Verhaltens in Oocyten. Das Schritt-für-Schritt-Protokoll ermöglicht die Untersuchung von MT-Regulatoren in diesem Zusammenhang und kann mit entsprechender Optimierung an andere differenzierte Zelltypen wie Neuronen und Epithelzellen angepasst werden. Allgemeiner unterstützt es mechanistische Studien und genetische Screenings, die untersuchen, wie vielfältige MT-Architekturen spezialisierte zelluläre Funktionen zugrunde liegen.

Introduction

Das Mikrotubuli-(MT)-Zytoskelett ist ein wesentlicher Bestandteil der eukaryotischen Zelle und spielt eine entscheidende Rolle bei der Etablierung und Erhaltung von Zellform, Polarität und Teilung. Das dynamische Verhalten von MT-Polymeren, gekennzeichnet durch Wachstum und Schrumpfung, ist für viele MT-basierte Prozesse^{entscheidend 1,2}. Die Zusammensetzung verschiedener MT-Arrays basiert auf der kombinierten Wirkung von Mikrotubuli-organisierenden Zentren (MTOCs), aus denen MTs genucleiert werden, und der Aktivität verschiedener MT-Regulationsproteine, die die Stabilität, Orientierung und Dynamik der MT steuern ^1,2,3. Das am besten untersuchte MTOC ist das Centrosom, das radiale Arrays von MTs erzeugt, die wichtig für die Regulation der Zellform und -polarität in der Interphase sowie für die Mitosespindel-Assemblierung bei Mitose ^4,5 sind. Beim mitotischen Austritt oder der Differenzierung, wie bei Neuronen und Epithelzellen, ist die centrosomale MTOC-Aktivität jedoch oft abgeschwächt, und in Extremfällen, wie bei Oocyten, kann sie ^6,7 eliminiert werden. Dies ist häufig mit zelltypspezifischer Remodellierung des MT-Zytoskeletts verbunden, wobei die MTOC-Funktion anderen zellulären Stellen^{zugeordnet wird (2,3,8}), die üblicherweise als nicht-centrosomale MTOCs (ncMTOCs) bezeichnet werden. Obwohl erhebliche Fortschritte bei der Aufklärung der MT-Organisation in mitotischen Zellen erzielt wurden, ist vergleichsweise wenig darüber bekannt, wie MTs in Tierzellen, die die Mitose verlassen oder sich einer Differenzierung^{befinden, nukleiert}, stabilisiert und räumlich angeordnet sind. Bemerkenswert ist, dass in lebenden Organismen die meisten Zellen sich nicht teilen; Sie haben den Zellzyklus verlassen und/oder differenziert. Daher ist es entscheidend zu verstehen, wie das MT-Zytoskelett in diesen Kontexten zusammengesetzt und reguliert wird. Dieses Wissen ist unerlässlich, um herauszufinden, wie unterschiedliche MT-Architekturen zur Unterstützung spezialisierter zellulärer Funktionen etabliert werden.

Die Drosophila melanogaster-Oozyt bietet ein leistungsstarkes System zur Untersuchung der Organisation und Funktion der acentrosomalen MT. In den mittleren Stadien der Oogenese ist die Aktivität^{des Zentrosoms um 9} abgeschwächt, und MTs werden aus ncMTOCs erzeugt, die im anterolateralen Kortex der Eizelle lokalisiert sind (Abbildung 1B). Dieses MT-Netzwerk ist wesentlich für die Lokalisierung mütterlicher mRNAs, Proteine und Organellen, die wiederum entscheidend für die Etablierung der zukünftigen Embryoachsen^{und -entwicklung sind.} Frühere Arbeiten zeigten, dass die ncMTOCs der Oozyten aus dem MT-Minus-End-Protein Patronin bestehen, das einen Komplex mit dem Spektraplakin-Protein Shot bildet, das am kortikalen Aktin-Zytoskelett verankert ist. Es wurde vorgeschlagen, dass MTs aus kurzen MT-Fragmenten wachsen, die durch abtrennende Enzyme wie Katanin erzeugt werden und als Samen für weitere^{MT-Polymerisation 12} wirken können. Ähnliche Mechanismen wurden in anderen differenzierten Zellen vorgeschlagen, wie etwa bei Neuronen¹³, bei denen die centrosomale Aktivität reduziert ist. Die Mechanismen, durch die das Trennen komplexe MT-Netzwerke erzeugt, wie etwa in der Eizelle, sind jedoch weiterhin wenig verstanden. Es ist noch unklar, ob MTs in diesen Kontexten hauptsächlich durch severing-basierte Umlagerung oder durch eine Kombination aus Severing und de-novo-MT-Keimbildung entstehen. Die Komplexität des Oocyten-MT-Netzwerks macht es zu einem idealen System, um zu untersuchen, wie MTs außerhalb des bekannten zentrosomalen Kontexts erzeugt und organisiert werden. Bemerkenswert ist, dass dies auch eine Herausforderung für Bildgebung und Analyse darstellt: Das dichte MT-Netzwerk innerhalb der Eizelle erschwert es, einzelne MTs mit herkömmlichen Immunfärbungs- oder statischen Bildgebungsmethoden^{aufzulösen 2,14}.

Live Imaging hat die Fähigkeit zur Untersuchung von MT-Netzwerken erheblich verbessert, da sie die Visualisierung von MT-Polymerisationsereignissen in Echtzeit ermöglicht und wichtige Einblicke in die Dynamik und Ausrichtung des MT-Wachstums bietet. Frühere Studien haben erfolgreich die Wachstumsdynamik von MT in Eizellen mithilfe von Live-Imaging von Plus-End-Markern ^14,15,16 analysiert. In vielen Fällen werden die Bildanalyseverfahren zur Quantifizierung der MT-Dynamik jedoch nur kurz beschrieben, basieren auf individuellen oder laborspezifischen Implementierungen oder werden nicht öffentlich zugänglich gemacht, was die Reproduzierbarkeit und eine breitere Nutzung einschränkt. Unsere Methode baut auf diesen bisherigen Ansätzen auf, indem sie eine vollständig dokumentierte, offen zugängliche und benutzerfreundliche Analysepipeline bereitstellt, die eine standardisierte Quantifizierung von MT-Wachstumsparametern über Datensätze und experimentelle Bedingungen hinweg ermöglicht. In diesem Protokoll werden MT-Dynamiken in der Mitte der Oogenese abbildet, wenn das MT-Zytoskelett durch acentrosomale MT-Netzwerke organisiert ist. Wachsende MTs werden mit EB1-GFP, einem MT-Plus-End-Tracking-Protein^17,18, visualisiert und mittels laserabtastender Konfokalmikroskopie mit einem Array-Detektor im Hochgeschwindigkeitsmodus erfasst. Die Neuheit unseres Ansatzes liegt in der Bildanalyse: einer vollständig dokumentierten, benutzerfreundlichen Schritt-für-Schritt-Pipeline, die von den Nutzern erfordert, nur interessante Bereiche auszuwählen. Bildverarbeitung und Quantifizierung werden durch individuelle Fiji-Makros und Python-Skripte erleichtert, was eine effiziente, reproduzierbare Erkennung von EB1-Kometen und die Extraktion von Parametern wie Wachstumsorientierung, Geschwindigkeit und räumlicher Organisation ermöglicht. Dieses Rahmenwerk bietet ein standardisiertes und zugängliches Werkzeug zum Vergleich von MT-Dynamiken über experimentelle Bedingungen hinweg.

In diesem Manuskript wenden wir diese Methode an, um das Wachstum von MT in Kontrollozyten und in durch Kältebehandlung depolymerisierten Eizellen zu vergleichen. Dies dient sowohl zur Validierung des Protokolls als auch zur Unterstützung zukünftiger Studien, die darauf abzielen, die Rolle von Kandidatenproteinen in der MT-Regulation zu analysieren.

Protocol

1. Fliegengenetik

HINWEIS: Um MTs in der Eizelle zu visualisieren, verwendet dieses Protokoll ein öffentlich zugängliches Transgen (Materialtabelle), das das MT-Plus-End-Tracking-Protein EB1 exprimiert, das mit einem GFP-Tag (Green Fluorescent Protein)^{Tag 19} markiert ist. EB1-GFP bindet speziell an wachsende MTs plus Ends und erscheint als fluoreszierende "Kometen", die sich entlang der Polymerisationsrichtung^{bewegen 17,18}. Dies ermöglicht die Visualisierung und Quantifizierung der MT-Wachstumsdynamik, einschließlich Wachstumsorientierung, Geschwindigkeit und räumlicher Verteilung innerhalb der Eierzelle ^14,20.

1. Halten Sie alle Fliegenstämme auf Standard-Maismehl-Agar-Medium bei 25 °C unter Verwendung der üblichen Drosophila-Pflegetechniken .
2. Kreuzung von 8–12 jungfräulichen Weibchen mit einem UAS-RNAi-Transgen, das auf die Expression eines interessanten Proteins abzielt, auf 5 Männchen des Genotyps matα4-Gal4-VP16; EB1-GFP.
   HINWEIS: Um die genetischen Kreuzungen zu vereinfachen, erzeugen Sie einen Fliegenstock, indem Sie die V32-Gal4-Linie (Anfügung auf dem zweiten Chromosom) mit der EB1-GFP-Linie (Einfügung auf dem dritten Chromosom) kreuzen. Da EB1-GFP unter der Kontrolle eines UASp-Promotors steht, induziert der V32-Gal4-Treiber die Expression von EB1-GFP sowie bei Wunsch in späteren Kreuzungen eingebrachte UAS-RNAi-Transgen.
3. Nach dem Schlüpfen der F1-Nachkommen (Nachkommen) werden 10–15 weibliche Fliegen des gewünschten Genotyps (weniger als eine Woche alt) ausgewählt.
4. Übertragen Sie die Weibchen zusammen mit 2–3 Männchen in ein frisches Fläschchen mit einer kleinen Menge Hefepaste auf der Futteroberfläche. Hefepaste regt die Oogenese an und fördert die Entwicklung der Eikammer. Die Anwesenheit von Männchen sorgt für die Paarung, was auch die Reifung der Eizellen und die Eiablage fördert. Halten Sie die Fliegen 2 Tage lang bei 25 °C.
   HINWEIS: Um die Rolle spezifischer Gene in der MT-Dynamik zu untersuchen, kann Protein-Knockdown mit dem UAS/GAL4-System²¹ erreicht werden, wobei der öffentlich verfügbare mütterliche Treiber matα4-Gal4-VP16 (auch bekannt als V32-Gal4; Materialtabelle), die die Gal4-Expression in der Keimbahn aus den Zuständen 3–4 der Oogenese einleitet. Wie oben beschrieben, induziert dieser Treiber die Expression von EB1-GFP sowie von UAS-RNAi-Konstrukten, wodurch die Erschöpfung der interessanten Proteine erst nach dem Germariumstadium ermöglicht wird. Diese Strategie umgeht potenzielle frühe Funktionen der Zielproteine während der anfänglichen mitotischen Teilungen und der Oozytenspezifikation. Bei solchen Experimenten sollten Fliegen wie zuvor beschrieben vorbereitet werden.

2. Eierstockdissektion

1. Betäuben Sie die F1-Weibchen mit CO₂ auf einer Standard-Fliegeplattform und wählen Sie ein Weibchen für die Sektion aus.
2. Übertragen Sie das ausgewählte Weibchen direkt auf eine 35-mm-Glasbodenschale (mit einer Glasdicke von 0,13–0,15 mm) und legen Sie einen Tropfen Bildungsöl auf die Fliege.
3. Positioniere die Fliege mit der Bauchseite nach oben (Flügel nach unten). Mit einer Pinzette hält man vorsichtig den unteren Thorax mit einer Pinzette und mit einer zweiten Pinzette ein Stück Bauchhaut am hinteren Bauchende.
4. Entnehmen Sie vorsichtig den Fortpflanzungstrakt, indem Sie ihn vorsichtig durch die Öffnung herausziehen.
5. Isolieren Sie die Eierstöcke und dann die einzelnen Ovariolen, indem Sie sie vorsichtig mit der Pinzette durch das Öl schieben. Bei der Handhabung der Eierstöcke halten Sie sie immer an den älteren Eikammern (Stadien 13–14), um die empfindlicheren Mittelstadien (Stadien 6–9), die für die Bildgebung von Interesse sind, zu vermeiden (Abbildung 1A,B).
6. Greifen Sie die vordere Spitze des Eierstocks, wo sich das Germarium und die frühen Eizellen befinden (Abbildung 1A,B). Trage langsame, gleichmäßige Spannung auf einzelne Ovariole aus. Während du ziehst, entstehen Eikammern in verschiedenen Entwicklungsstadien. Dieser Vorgang kann pro Eierstock mehrfach wiederholt werden, um weitere Oviales²² zu isolieren (siehe Video zur Demonstration).
   HINWEIS: Für Eizellen, die der Kaltbehandlung zur Depolymerisation der MT unterzogen wurden, wurden wie zuvor beschrieben Dissektionen durchgeführt, jedoch mit BRB-80-Puffer anstelle von Bildgebungsöl. Die dissektionierten Eierstöcke wurden dann in Mikroröhren mit BRB-80 übertragen und 15 Minuten²³ auf Eis inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Eierstöcke in eine Glasbodenschale mit bildgebendem Öl verlegt, und das Protokoll wurde von Schritt 3.1 fortgesetzt.

3. Live-Imaging

1. Stelle die Glasbodenschale mit dem entsprechenden Objektträger auf die Mikroskop-Bühne.
2. Wählen Sie Eikammern des Stadiums 7 oder 8 für die Bildgebung aus.
   HINWEIS: Eikammern in diesen Stadien können anhand der Eizellengröße und Kernposition identifiziert werden. Die Eizelle ist eindeutig größer als einzelne Pflegezellen und nimmt etwa ein Drittel (Stadium 7) bis die Hälfte (Stadium 8) der Eikammer ein. Der Eizellkern befindet sich im vorderen Kortex der Eizelle, angrenzend an die^{Pflegezellen 24}.
3. Vermeiden Sie bildgebende Eikammern, die eine Diskontinuität in der äußeren Follikelzellschicht oder andere Anzeichen von Schäden zeigen, die auf eine mechanische Störung durch die Pinzette hindeuten können. Für optimale Bildqualität verwenden Sie ein schnelles konfokales Bildgebungssystem mit einem hohen Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) und einem 63-fachen Objektiv (1,40 NA, Ölimmersion). Stellen Sie sicher, dass Sie die Nyquist-Shannon-Stichprobenkriterien einhalten.
4. Stellen Sie den Fokus an und bestimmen Sie die passende Belichtung, da diese je nach verwendetem EB1-Konstrukt (z. B. verschiedene Promotoren oder fluoreszierende Etiketten) und dem Mikroskopsystem variieren kann. Das Signal sollte hell genug sein, um die Kometendynamik zu verfolgen, aber nicht gesättigt oder von Hintergrundfluoreszenz verdeckt.
5. Stellen Sie den 488-nm-Laser so ein, dass er das GFP-Fluorophor anregt (10 % Laserleistung; Detektorverstärkung = 750 V). Wählen Sie ein geeignetes Emissionsfenster von 500–550 nm oder ein entsprechendes Filterset für das GFP-Fluorophor.
6. Nehmen Sie Zeitrafferfilme von mindestens 4 Minuten Laufzeit auf, wobei ein Bildintervall von 500 ms (2 Bilder/s) verwendet wird, um genügend Daten für die Verfolgung einzelner MT-Plus-Endsequenzen zu erhalten. (Ergänzendes Video 1 zeigt eine repräsentative Zeitrafferaufnahme, die für eine anschließende MT-Tracking-Analyse geeignet ist).
7. Verarbeiten Sie die aufgenommenen Bilder mithilfe des Array-Detektors in der Mikroskopaufnahmesoftware mit der Standardstärke des Verarbeitungsfilters.
   HINWEIS: Nach dem Eintauchen in bildgebendes Öl bleiben die dissektionierten Eierstöcke bis zu 90 Minuten lebensfähig. Während dieser Zeit können Eikammern ohne nennenswerte Anzeichen von Degeneration abgebildet werden. Nach diesem Zeitraum sollte ein neues Weibchen seziert und frische Eikammern für die^{Bildgebung 20} vorbereitet werden.

4. Bildverarbeitung

Führen Sie den folgenden Workflow durch, um Diagramme und Statistiken zu generieren, die verschiedene Parameter quantifizieren, die mit der MT-Dynamik verbunden sind. Führen Sie jeden Schritt entweder automatisch über ein Makro/Skript aus oder manuell unter Einhaltung des Protokolls (Abbildung 2). Alle Fiji-Makros, Tracking-Skripte und Python-Analysecode, die in diesem Workflow verwendet werden, werden als ergänzende Codierungsdateien 1–7 bereitgestellt.

1. Bildvorverarbeitung – SCHRITT 1
   Die folgenden Schritte bereiten rohe Zeitrafferaufnahmen vor, indem Photobleaching korrigiert und Hintergrundrauschen reduziert wird, um die Signalstabilität für die Verfolgung sicherzustellen. Erstens wird die Sichtbarkeit von EB1 durch einen Differenz-von-Gauß-(DoG)-Filter verbessert, der als räumlicher Bandpassfilter fungiert. Durch das Subtrahieren eines stark verschwommenen Bildes von einem leicht verschwommenen Bild unterdrückt dieser Prozess niederfrequenten zytoplasmatischen Nebel und hochfrequentes Pixelrauschen, während das beugungsbegrenzte Signal der EB1-Kometen isoliert wird. Zweitens wird ein temporaler Gradientenfilter angewendet, um speziell die wachsenden MT-Spitzen zu verbessern. Der Bildstapel wird reliced, um die zeitliche Dimension auf die räumliche Y-Achse abzubilden. Eine 1D-Faltung mit einem [-1 0 1]-Kern wird dann angewendet, um die zeitliche Ableitung für jedes Pixel zu berechnen und die Vorderkante der bewegten Kometen hervorzuheben, an der die Intensität am schnellsten zunimmt. Der Stack wird dann wieder auf seine ursprünglichen Maße zurückverschnitten, zu einem zusammengesetzten Bild zusammengeführt und zur Analyse exportiert.
   HINWEIS: Dieser Schritt kann für alle Dateien in einem Ordner im Batch ausgeführt werden, indem man die Makrodatei File1.Step1_MTs_macro.ijm zieht (Ergänzende Codierungsdatei 1) nach Fidschi und das Makro ausführen.
   1. Voraussetzungs-Plugin-Installation (Einmal-Setup)
      1. Startet Fiji. Navigiere in der Menüleiste zu Plugins > Installieren .
      2. Im Dateibrowser wählen Sie die mit diesem Protokoll bereitgestellte Datei File_7_Kalman_Stack_Filter_Compiled.jar (Supplementary Coding File 7).
      3. Wenn du aufgefordert wirst, das Plugin zu speichern, stelle sicher, dass das Ziel der Standard-Plugins-Ordner in deinem Fiji-Installationsverzeichnis ist, und klicke auf Speichern.
      4. Fidschi neu starten , um die Installation abzuschließen.
         HINWEIS: Diese kompilierte Version des Plugins ist identisch mit der integrierten Version von Fiji, entfällt jedoch die Notwendigkeit einer separaten Java Development Kit (JDK)-Installation und vereinfacht so den Einrichtungsprozess.
   2. Korrektur und Entweichung von Bleichmittel:
      1. Öffne Fiji und öffne dann jede Datei mit dem Bio-Formats Importer-Plugin
      2. Kompensiere den Fluoreszenzabfall im Laufe der Zeit, indem du das Bleach Correction-Plugin mit der Simple-Ratio-Bleichkorrektur (Hintergrund = 0) ausführst.
      3. Führe den Kalman Stack Filter Compiled (acquisition_noise = 0,1; Bias = 0,7) durch, um zufälliges Photonenrauschen zu unterdrücken und gleichzeitig die wahre Signaldynamik über die Zeit zu erhalten
      4. Schneiden Sie die resultierende Bildzeitdimension zu, um die Verarbeitungszeit zu verkürzen, falls gewünscht.
         HINWEIS: Diese Schritte erzeugen ein entrauschtes Bild, das später am Ende von Schritt 1 (4.1.5) als Kanal 1 erscheint (Abbildung 3A). Es wird empfohlen, die ersten 5 bis 10 Frames (Zeitpunkte) auszuschließen, da das Rolling-Fenster des Kalman-Filters diese Anfangsframes nur teilweise filtert.
   3. Unterschied in der Merkmalsverbesserung von Gauß (DoG):
      1. Doppelte das Bild aus 4.1.2.4 zweimal (Rechtsklick auf das Bild und auf Duplizieren).
      2. Wenden Sie das Gaussian Blur Plugin auf eine Kopie mit einem Low Sigma (σ = 1) an.
      3. Wenden Sie das Gaussian Blur Plugin auf die andere Kopie mit einem High-Sigma (σ = 8) an.
      4. Öffnen Sie das Plugin Image Calculator und subtrahieren Sie das High-Sigma-Bild vom Low-Sigma-Bild (= Low – High), um feine Details zu isolieren.
      5. Entfernen Sie den Hintergrund, indem Sie Fiji's Math > Subtract verwenden und einen Wert auswählen (DoG-Schwelle = 100), um bei Bedarf nur das wahre Signal beizubehalten.
         HINWEIS: Diese Schritte erzeugen ein Differenzbild, das später als Kanal 2 am Ende von Schritt 1 (4.1.5) erscheint (Abbildung 3B).
   4. EB1-GFP-Signalverstärkung:
      1. Wählen Sie das Bild aus 4.1.2.4 aus und verwenden Sie das Reslice-Plugin mit den Einstellungen: oben, keine Interpolation.
      2. Verwenden Sie das Convolve 2D-Plugin mit Kernel [–1 0 1], um MT-Tipps zu verbessern.
      3. Verwenden Sie das Reslice-Plugin erneut mit denselben Einstellungen, um die ursprünglichen Bildmaße wiederherzustellen.
      4. HINWEIS: Diese Schritte erzeugen ein Bild mit einem verbesserten EB1-GFP-Signal. Dieses Bild wird später als Kanal 3 am Ende von Schritt 1 (4.1.5) erscheinen (Abbildung 3C).
      5. Kanäle zusammenführen und Bild exportieren:
         1. Das MT EB1-GFP-Image (4.1.2.4) mit dem Difference of Gaussians-Image (4.1.3.5) und dem EB1-GFP-Signal-Enhancement-Image (4.1.4.3) mit dem Merge Channels-Plugin zusammenführen. Stellen Sie sicher, dass das für die weitere Analyse verwendete Bild während des Zusammenführungsprozesses auf Kanal 3 platziert wird.
         2. Speichern Sie die resultierende Datei als .tif Datei und verwenden Sie das Namensformat: "filename"_processed.tif. Stellen Sie sicher, dass das für die nachgelagerte Analyse verwendete Bild mit _processed.tif endet
2. Interessensgebiete (ROI) – SCHRITT 2
   In diesem Schritt werden entlang der anteroposterioren Achse der Oocyt drei ROIs definiert: anterior (ROI1), mittlerer (ROI2) und posterior (ROI3). Führen Sie diese räumliche Segmentierung durch, um die Analyse der MT-Dynamik über verschiedene Bereiche der Oocyt zu ermöglichen.
   HINWEIS: Dieser Schritt 2 kann für jeden "Dateinamen" ausgeführt werden_processed.tif indem man die Makrodatei File_2_Step2_MTs_macro.ijm (Supplementary Coding File 2) nach Fiji zieht und Run drückt. Das Makro fordert den Benutzer auf, manuell ein Rechteck in der Eizelle zu zeichnen. Der Bereich, der dem Beginn des Polygons am nächsten ist (erster Klick), entspricht dem ersten ROI. Der ausgewählte rechteckige Bereich wird automatisch in gleichmäßige rechteckige ROIs aufgeteilt. Wenn keine ROIs gespeichert werden, laufen die nächsten Schritte im vollständigen Image.
   1. Definition von ROIs:
      1. Öffnen Sie die Zieldatei über Plugins → Bio-Formats → Bio-Formats Importer.
      2. Verwenden Sie das Polygon-Werkzeug, um eine interessante Region über den gewünschten Bereich zu zeichnen.
      3. Fügen Sie die ausgewählte Region dem ROI-Manager hinzu (drücken Sie die T-Taste).
      4. Wiederhole Schritt 4.2.1, um zu sehen, wie viele ROIs du brauchst.
   2. Mess- und Exportbereich:
      1. Wählen Sie den ersten ROI
      2. Führen Sie Analyze → Measure aus und speichern Sie den Flächenwert als Datei mit dem Namen "Dateiname"_processed_RoiArea.csv
         HINWEIS: Der Dateiname muss mit dem ursprünglichen Bildnamen übereinstimmen und endet mit: _processed_RoiArea.csv
      3. Nutze den ROI Manager, um die ROIs zu speichern. Verwenden Sie denselben Dateinamen mit dem. ROI-Erweiterung für eine einzelne ROI oder die .zip-Erweiterung für mehrere ROIs.
3. EB1-GFP-Kometen erkennen und verfolgen – SCHRITT 3
   Verwenden Sie das TrackMate-Plugin²⁵ , um EB1-GFP-Kometen zu erkennen und deren Bewegung über die Zeit zu verfolgen.
   HINWEIS: STEP 3 kann auf jeden "Dateinamen" angewendet werden_processed.tif indem man die Makrodatei File_3_Step3_MTs_macro_tracking.py (Supplementary Coding File 3) nach Fiji zieht und RUN drückt. Wählen Sie dann einen Ordner aus, der verarbeitet werden soll. Die ROIs werden automatisch geladen und die Analyse für jede Datei durchgeführt, wobei entsprechende Spot- und Track-Ausgaben generiert werden. Vor der Batch-Verarbeitung wird empfohlen, 2–3 repräsentative Bilder zu analysieren, um visuell zu überprüfen, ob die Standard-Detektor- und Trackereinstellungen für die Größe und Dynamik der Kometen geeignet sind. Wenn die Einstellungen geeignet sind, kann der Benutzer die entsprechenden Parameter anpassen, um EB1-Tipps genau zu verfolgen und so Fehlnegativ- und Fehlalarme zu minimieren.
   1. Öffnen Sie die Zieldatei über Plugins → Bio-Formats → Bio-Formats Importer
   2. Öffne das TrackMate-Plugin. Wähle JA, wenn du gebeten wirst, T und Z zu tauschen.
   3. Wähle Log-Detektor. Stellen Sie den Partikeldurchmesser auf 0,5 μm ein (nach Bedarf anpassen)
   4. Stellen Sie die Qualitätsschwelle auf 30 Punkte ein (passen Sie es bei Bedarf an). Aktivieren Sie sowohl Subpixel-Lokalisierung als auch Vorverarbeitung mit einem Medianfilter.
   5. Entfernen Sie alle zusätzlichen Punktfilterungen. Wählen Sie die Kalman-Tracking-Methode
   6. Setze einen anfänglichen Suchradius auf 0,5, einen Suchradius von 0,7 und den maximalen Frame-Gap von 2 (passe bei Bedarf an – der anfängliche Suchradius besetzt den Tracker, der Suchradius steuert, wie weit ein Spot zwischen den Frames wechseln kann, und der maximale Frame-Gap ermöglicht kurze Verschwinden in der Trajektorie).
   7. Überspringe das Track-Filtern, das erscheinen wird. Sobald der Track abgeschlossen ist, gehe zu Spots → Export to CSV und nenne die Datei "Dateiname"_ROI01_spots.csv
   8. HINWEIS: Die Dateibenennung sollte die Anzahl der analysierten ROIs widerspiegeln. Wenn mehrere ROIs verwendet werden, speichere jede Ausgabedatei mit einer entsprechenden Kennung wie _ROI01, _ROI02 usw.
4. Datenvisualisierung und quantitative Analyse – SCHRITT 4
   Verwenden Sie die Python-Skripte, um die Tracking-Daten zu verarbeiten und wichtige Parameter zu berechnen, darunter Kometenzahl, Geschwindigkeit, Lebensdauer, Winkelkonsistenz und Ausrichtung. Diese Skripte erzeugen Zusammenfassungstabellen (CSV-Dateien), Diagramme und statistische Analysen, um die quantitative Analyse der MT-Dynamik zu unterstützen (Abbildung 4).
   1. Software-Umgebungsaufbau:
      1. Installiere die Python-Distribution (3.12). Stellen Sie sicher, dass folgende externe Python-Bibliotheken installiert sind (über pip install pandas numpy scipy matplotlib seaborn ipython statsmodels notebook): Pandas und NumPy (für die Verarbeitung von Datenstrukturen und numerische Berechnungen), SciPy und Statsmodels (speziell scipy.stats, für zirkuläre Statistiken und Hypothesentests), Matplotlib und Seaborn (für die Erstellung von Rosendiagrammen und statistischen Balkendiagrammen), IPython (für Anzeigetools im Notizbuch), Jupyter Notebook (für die Nutzung des Notizbuchs).
      2. Legen Sie die benutzerdefinierten Analysemodule (File_5_MTModule1.py und File_6_MTModule2.py – Supplementary Coding Files 5 und 6) im Root-Verzeichnis neben dem Analysenotizbuch (Datei 4_Step4_MTs_results.ipynb – Supplementary Coding File 4) ein.
      3. Öffnen Sie das Jupyter-Notebook, indem Sie den Befehl "jupyter notebook" im Python-Terminal ausführen und die Datei 4_Step4_MTs_results.ipynb – Supplementary Coding File 4 notebook laden.
   2. Eingabedaten und Parameterdefinition:
      1. Füllen Sie die Datenbank aus, um biologische Replikaten auf deren experimentelle Metadaten abzubilden.
      2. Geben Sie für jedes Experiment Folgendes an: Basisname: Die eindeutige Identifikationszeichenkette, die in den Dateinamen gefunden wird, Bedingung: Die experimentelle Gruppe (z. B. "Kontrolle", "Behandelt"), Korrekturwinkel: Der Winkel, der erforderlich ist, um die ROI mit der biologischen Achse auszurichten (z. B. Vorderer = 0°).
      3. Passe die Parameter an: Bildformat und DPI exportieren, Farben plotten und die Standardgröße für Winkelberechnungen
      4. Stellen Sie die Datenfilterparameter so ein, dass sie kurze Spuren ausschließen: Minimale Streckenlänge: Spuren, die kürzer als diese Dauer sind, werden verworfen
   3. Ausführung der Analysepipeline:
      1. Lesen und führen Sie alle Codezellen aus, um die rohen Tracking-Daten zu verarbeiten. Das Skript durchläuft die Datenbankliste, um die folgenden prozeduralen Schritte durchzuführen:
         1. Identifizieren Sie alle ROI-spezifischen CSV-Dateien, die mit jedem Basisnamen verknüpft sind.
         2. Filterspuren basierend auf der minimalen Länge (es werden nur Trajektorien beibehalten, die länger als 3 Frames bestehen), berechnen die momentanen Geschwindigkeiten, berechnen die Gesamtverschiebung und wenden die Referenzwinkelkorrektur auf alle Trajektorien an.
         3. Normalisiere die Kometenzahl anhand des ROI-Bereichs (geladen aus Metadaten), um die Kometendichte zu berechnen.
      2. Verarbeitete Daten werden zu einem Master-Datensatz (df_all) zusammengefasst und für jeden ROI allgemeine Zusammenfassungsstatistiken (mittlere Geschwindigkeit, Streckendauer und Winkelkonsistenzvektorlänge) berechnet.
      3. Führe die Funktion make_combined_rose_panel aus, um gruppierte Rosendiagramme zu erzeugen. Dies erzeugt einen nebeneinander-Panel-Vergleich der Winkelverteilungen für alle ROIs innerhalb jeder experimentellen Bedingung. Führen Sie create_comprehensive_analysis_plots_enhanced aus, um Balkendiagramme für skalare Kennzahlen zu erstellen.
      4. Führen Sie die run_angle_analysis_pipeline-Funktion aus, um eine spezifische Orientierungsanalyse durchzuführen:
         1. Segmentieren Sie Spuren in Orientierungsbehälter mit zwei Strategien: Cardinal Binning (4 Bins mit 90° Breite: Nord/Anterior, Ost/Rechts, Süd/Posterior, West/Links) und Anterior/Posterior Binning (2 Bins mit 180° Anterior vs. Posterior).
         2. Berechnen Sie den Prozentsatz der Spuren, die sich in jeder definierten Ausrichtung pro Eizelle bewegen.
   4. Statistische Analyse und Ergebnisgenerierung:
      1. Iterieren Sie durch definierte skalare Metriken: mittlere Kometenzahl pro Bild und Fläche, mittlere Kometenspur-Dauer und mittlere Kometengeschwindigkeit. Für jede Metrik führt sie Folgendes aus:
         1. Führen Sie Kruskal-Wallis- oder Mann-Whitney-U-Tests für unabhängige Vergleiche über experimentelle Bedingungen durch.
         2. Führen Sie Friedman- oder Wilcoxon-Tests durch, um die Konsistenz über die ROIs hinweg zu bewerten.
         3. Führen Sie Friedman- und Wilcoxon-Signed-Rank-Tests durch (mit der Pratt-Methode), um Orientierungspräferenzen (z. B. Nord vs. Süd) innerhalb jeder ROI zu bewerten.
         4. Exportieren Sie die folgenden Ergebnisse in das Results-Verzeichnis : Zusammenfassende CSVs (metrics_table.csv, track_table.csv, roi_metrics.csv), Statistische Berichte (z. B. Mean Comet velocity_mwu.csv) und Plots (hochauflösende PNG-Dateien).
            HINWEIS: Schritt 4 kann nur in Python ausgeführt werden. Öffne die File_4_Step4_MTs_results.ipynb und lies und führe alle Zellen aus. Jede Zelle enthält Anweisungen zur Ausführung und das jeweilige erwartete Ergebnis.

5. Statistische Analyse:

HINWEIS: Aufgrund der nicht-gaußschen Verteilung der Tracking-Daten wurden für alle Vergleiche nichtparametrische statistische Tests verwendet.

1. Bewerten Sie unabhängige Unterschiede zwischen experimentellen Bedingungen (z. B. Kontrolle vs. behandelt) mit dem Mann-Whitney U-Test (für zwei Gruppen) oder dem Kruskal-Wallis-Test, gefolgt von post-hoc-paarweisen Mann-Whitney-Vergleichen (für >2 Gruppen)).
2. Bewerten Sie orientierungsbezogene Präferenzen mit demselben ROI mit dem Friedman-Test (globale Differenz), gefolgt vom Wilcoxon-Signed-Rank-Test (paarweise).
3. Behandle Nulldifferenz-Gleichtöne mit der Pratt-Methode.
4. Berichte paarweise Vergleiche als unkorrigierte p-Werte, um die statistische Stärke zu erhalten. Verwenden Sie die bereitgestellten Skripte, um sowohl rohe als auch angepasste p-Werte zu berichten, wobei die Signifisie auf 0,05 gesetzt ist. Berichte alle zusammenfassenden Statistiken als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM), sofern nicht anders angegeben).

Results

Dieses Protokoll wurde erfolgreich eingesetzt, um die Wachstumsdynamik und Polarität von MT in Drosophila melanogaster-Oozyten in mittleren Stadien der Oogenese mit EB1-GFP zu analysieren, einem Plus-End-Tracking-Protein, das Stellen der aktiven MT-Polymerisation^{markiert 17,18}. Bei der Abbildung mit einer Laser-konfokalen Mikroskopie erscheint EB1-GFP als helle, punktierte "Kometen", die sich in der Orientierung des MT-Wachstums^{bewegen 17,18} (Abbildung 3A; Ergänzendes Video 1). Die Verfolgung und Quantifizierung dieser Kometen ermöglicht eine präzise Einschätzung der Keimbildung, Verlängerung und Organisation von MT innerhalb der Eizelle. Mit diesem Workflow-Protokoll wurden die MT-Dynamiken in Kontroll-Oozyten und in Oocyten untersucht, die experimentell dem MT-Netzwerk unterworfen waren. Konkret wurde das Verhalten von EB1-Kometen über drei Zustände hinweg verglichen: unbehandelte Kontrollozyzyten, kaltbehandelte Kontrollozyzyten und kaltbehandelte heterozygoteP-Atronin-mutierte Ozyzyten ^12,26. Die Kaltbehandlung induziert eine MT-Depolymerisation, wodurch die Beurteilung des MT-Nachwuchs während der Genesung möglich ist. Heterozygotep-Atronin-mutierte (+/patr⁰⁵²⁵²) Oozyten wurden als positive Kontrollgruppe für eine beeinträchtigte MT-Dynamik eingeschlossen. Patronin ist ein konservierter MT-Minus-End-Stabilisator²⁷ und ein Kernbestandteil von ncMTOCs in Oozyten¹² und anderen Geweben². Frühere Arbeiten zeigten, dass Patroninmutanten, die der MT-Depolymerisation unterzogen wurden, nach dem Regrowth¹² einen signifikanten Rückgang der EB1-Kometenzahl zeigen. Daher ermöglichte die Einbeziehung heterozygoter Patronin-Mutanten die Validierung der Methode gegen einen bekannten MT-Regrowth-defekten Hintergrund. Ozyten im Stadium 7–8 wurden abgebildet, wenn Centrosomen abgeschwächt und MTs über acentrosomale Signalwege erzeugt werden.

Im Einklang mit früheren Beobachtungen wurde die höchste Dichte von EB1-Kometen im vorderen Bereich der Eizelle nachgewiesen, mit einer allmählichen Abnahme in Richtung der hinteren^14,15 (Abbildung 5B; Tabelle 1; Ergänzende Tabellen 1 und 2). Um zwischen echten MT-Polymerisationsereignissen und stationären oder außerhalb der Ebene liegenden Signalen zu unterscheiden, unterscheidet dieses Protokoll zwischen der Gesamtzahl der detektierten EB1-GFP-Brennpunkte und der Teilmenge der beweglichen Brennpunkte. Der unbewegliche Anteil stellt wahrscheinlich stationäre Kometen oder Kometen dar, die sich überwiegend in der Axialebene bewegen (Abbildung 5A,B). Analysen der MT-Spurlänge und der Wachstumsgeschwindigkeit wurden ausschließlich an den mobilen EB1-GFP-Kometen durchgeführt, um die Einbeziehung stationärer Signale oder axialer Bewegungen zu vermeiden, die die Schätzung von Streckenlänge und -geschwindigkeit beeinträchtigen könnten. Totale EB1-GFP-Brennpunkte und der bewegte Anteil werden in separaten Diagrammen dargestellt, um einen direkten Vergleich zwischen der Gesamtdetektion und dem dynamischen Verhalten zu ermöglichen (Abbildung 5A,B). Bei Kontrollozyten maß das Protokoll 0,189 ± 0,02 SEM EB1 bewegliche Kometen/μm² (18,9 EB1 Kometen/100 μm²) im vorderen Bereich, gefolgt von 0,064 ± 0,02 SEM und 0,043 ± 0,01 SEM EB1 beweglichen Kometen/μm² im mittleren bzw. hinteren Bereich (6,4 und 4,3 EB1 Kometen/100 μm²) (Abbildung 5B; Tabelle 1; Ergänzende Tabellen 1 und 2). Eine frühere Studie²⁸, die EB1-Kometen im gleichen Entwicklungsstadium maß, entdeckte 48,54 EB1-Kometen/100μm², was höher ist als die hier für mobilile EB1-GFP-Kometen festgestellten Werte. Die gemessenen Werte sind jedoch konsistent, wenn man die Gesamtzahl der detektierten EB1-GFP-Kometen berücksichtigt (Abbildung 5A; Tabelle 1; Ergänzende Tabellen 1 und 2). Der Abschnitt Materialien und Methoden dieser Studie gibt nicht an, wie viele Z-Stacks zur Abbildung der Eizellen verwendet wurden. Es ist daher möglich, dass mehr als ein Z-Stack in die Analyse einbezogen wurde, was zur höheren Anzahl der entdeckten EB1-GFP-Kometen beigetragen haben könnte. Ein weiterer Faktor, der die gemeldeten Werte beeinflussen kann, ist die Region der Eizelle, die für die Kometenquantifizierung ausgewählt wird. Wenn Interessensgebiete näher am vordersten Pol gewählt worden wären, wo die EB1-Kometendichte am höchsten ist, hätte dies die durchschnittliche Kometendichte im Vergleich zu den hier vorgestellten Messungen erhöhen können. Dennoch sind die hier erhaltenen Ergebnisse von derselben Größenordnung und spiegeln eine konstante Abnahme der EB1-Kometendichte in Richtung des posterioren Bereichs wider, wie zuvor berichtet^14,15.

Nach kälteminduziertem MT-Nachwuchs zeigten die Kontroll-Oozyten EB1-Kometenzahlen, die mit unbehandelten Kontrollgruppen vergleichbar sind, was auf eine robuste MT-Genesung hinweist. Im Gegensatz dazu zeigten Patronin-Mutanten gemäß den vorherigen Berichten¹² eine signifikante Verringerung der Anzahl der beweglichen EB1-Kometen im vorderen Bereich (ROI1) im Vergleich zu beiden Kontrollgruppen (Abbildung 5B; Tabelle 1; Ergänzende Tabellen 1 und 2). Obwohl die Kometenzahlen in den mittleren und hinteren Regionen (ROIs 2 und 3) ebenfalls nach unten tendierten, waren diese Unterschiede statistisch nicht signifikant (Abbildung 5B). Die hier beobachtete Reduktion war weniger ausgeprägt als in Nocodazol-basierten Tests¹². Dies spiegelt wahrscheinlich die Verwendung heterozygoter Patroninmutanten wider, bei denen nur ein Allel mutiert ist. Außerdem kann das kaltinduzierte Depolymerisationsprotokoll nicht alle MTs vollständig depolymerisieren, und das 5–15-minütige Intervall zwischen Entfernung aus dem Eis und der Bildgebung ermöglicht wahrscheinlich eine gewisse MT-Keimbildung und Nachwuchs vor der Datenerfassung. Im Gegensatz dazu werden nocodazolbasierte Tests unmittelbar nach der Colcemidinaktivierung mit einem^{UV-Laser 12} im Mikroskop durchgeführt. Dennoch zeigen diese Ergebnisse, dass dieses Protokoll biologisch relevante, regionsspezifische Veränderungen in der MT-Organisation nachweisen kann. Sie stimmen auch mit der Anreicherung von ncMTOCs und von Patronin, einem Kernbestandteil von ncMTOC, an der vorderen Seite der Eizelle überein. Die schwächere Reduktion der Kometenzahlen in den mittleren und hinteren Regionen könnte auch auf den entwicklungsbedingten Ausschluss von ncMTOCs und Patronin aus dem hinteren Kortex in diesen Stadien¹² zurückzuführen sein.

Die Analyse der EB1-Spurlänge in Kontroll-Oocyten zeigte längere Kometenspuren im vorderen Bereich der Eizelle (0,613 μm ± 0,04 SEM) und kürzere Kometen in den mittleren und hinteren Regionen (0,463 μm ± 0,04 SEM bzw. 0,488 μm ± 0,05 SEM) (Abbildung 5C; Tabelle 1; Ergänzende Tabellen 1 und 2). Dieser Befund stimmt mit früheren Daten überein, die zeigen, dass MTs am hinteren Pol kürzer bleiben als am vorderen Pol, was darauf hindeutet, dass MTs am hinteren Pol kürzer sind,¹⁴. Bei kaltbehandelten, heterozygoten Patronin-mutierten Oozyten war die EB1-Kometenlänge im Vergleich zu kaltbehandelten Kontrollgruppen in den vorderen und hinteren Bereichen signifikant verkürzt. Ein ähnlicher nicht statistisch signifikanter Trend wurde im mittleren Bereich beobachtet (Abbildung 5C; Tabelle 1; ergänzende Tabellen 1 und 2), was auf eine teilweise Verringerung der MT-Stabilität hindeutet. Zusammengenommen stützen diese Ergebnisse die bekannte Rolle von Patronin als Minus-End-MT-Stabilisator und stimmen mit früheren Beobachtungen in Drosophila-kultivierten Zellen überein, bei denen der Verlust von Patronin zu kürzeren MT-Spindeln^{führt, 12,27}. Diese Ergebnisse unterstreichen auch die Sensibilität dieses Protokolls bei der Erkennung subtiler, aber biologisch bedeutsamer Störungen in der MT-Dynamik.

Bei der Messung der EB1-Kometengeschwindigkeit in Kontroll-Oozyten ergab die Analyse mittlere Geschwindigkeiten von 0,208 ± 0,01 μm/s, 0,207 ± 0,01 μm/s und 0,202 ± 0,01 μm/s in den vorderen, mittleren und hinteren Bereichen (Abbildung 5D; Tabelle 1; ergänzende Tabellen 1 und 2), was mit früheren Arbeiten^14,15 übereinstimmt. Kontrollozyten zeigten eine leichte Abnahme der MT-Wachstumsgeschwindigkeit vom vorderen bis zum hinteren Bereich. Dies könnte die Anreicherung von ncMTOCs sowie möglicherweise anderer nicht identifizierter mikrotubuliassozoziierter Proteine (MAPs) in den anterolateralen Regionen widerspiegeln, die das Wachstum und die Ausdehnung der MT fördern und so zur beobachteten posterioren Abnahme beitragen. Bei kaltbehandelten Oozyten zeigten Patronin-heterozygote Mutanten einen nicht-statistisch signifikanten Trend zu einer leichten Verringerung der MT-Wachstumsgeschwindigkeit im Vergleich zu Kontrollen, obwohl dieser Unterschied keine statistische Signifikansstellung erreichte (Abbildung 5D; Tabelle 1; Ergänzende Tabellen 1 und 2). Dieser Befund stimmt mit früheren Beobachtungen bei neuronalen Stammzellen von Drosophila überein, die Patroninmutanten exprimieren ²⁹.

Die Lokalisierung von ncMTOCs im anterolateralen Bereich der Eizelle sowie deren Ausschluss aus dem hinteren Bereich führen dazu, dass die meisten MTs mit ihren Minusenden am anterolateralen Kortex verankert werden. Folglich wird innerhalb der Eizelle ein antero-posteriorer Gradient von MTs mit einer moderaten Orientierungsverzerrung etabliert: 60 % der MTs wachsen zur hinteren und 40 % zur vorderen¹⁴. Unser Protokoll hat diese Verzerrung bei den Kontroll-Oocyten in allen Bereichen der Eizelle erfolgreich erkannt (Abbildung 5E). Die Verzerrung der MT-Orientierung war am hinteren Bereich ausgeprägter, wie zuvor berichtet¹⁴. Bemerkenswert ist, dass dieser posteriore Orientierungsbias nach der Kältebehandlung bei Kontroll- und heterozygoten Patronin-mutierten Oozyten verloren ging (Abbildung 5E,F). Bei kaltbehandelten Kontrollozyten verlagerte sich die MT-Orientierung in allen Regionen hin zu anterior-gerichtetem Wachstum. Diese Verschiebung zeigte sich als Trend in den vorderen und mittleren Regionen und wurde im hinteren Bereich statistisch signifikant (Abbildung 5F). Eine mögliche Erklärung für diesen Verlust der Verzerrung auf die hintere Seite ist, dass unter kaltbehandelten Bedingungen neu polymerisierte MTs Zeit benötigen könnten, um sich mit MAPs wie motorischen Proteinen zu verbinden, die die MT-Stabilisierung und/oder Vernetzung fördern. Eine verzögerte Rekrutierung dieser Faktoren könnte die Verstärkung posterior orientierter MTs beeinträchtigen. Zusammenfassend ermöglicht dieses Protokoll eine sensible, quantitative Analyse des MT-Wachstums, der Länge, der Geschwindigkeit und der Ausrichtung der Eizellen. Sie erkennt zuverlässig regionsspezifische, biologisch bedeutsame Veränderungen in der MT-Dynamik, im Einklang mit früheren Studien, und zeigt eine Sensitivität, subtile Unterschiede im MT-Verhalten zu erkennen, wie die Beobachtungen bei heterozygotenp-Atronin-Mutanten zeigen.

Abbildung 1: Oogenese von Drosophila melanogaster (A) Überblick über die Oogenese im Eierstock von Drosophila. Jeder Eierstock enthält 12–16 Ovariole, die als Eiproduktionslinie fungieren. Die Oogenese beginnt im Germarium, wo sich 2–3 Keimbahnstammzellen asymmetrisch teilen und eine Stammzelle und eine Tochterzelle bilden, die zu differenzieren beginnt. Diese Zellen durchlaufen vier mitotische Teilungen, um eine 16-Zell-Zyste zu bilden, die durch Ringkanäle verbunden ist. Aus diesen Zellen wird eine zur Eizelle, während die anderen als Pflegezellen dienen und das Wachstum und die Entwicklung der Eizellen bis zu einem Stadium 14 Eizelle am hinteren Ende unterstützen. (B) Schema der Drosophila-Eikammer in Stufe 9. MTs werden aus ncMTOCs erzeugt, die im anterolateralen Kortex lokalisiert sind und von der hinteren Seite der Oocyte¹² ausgeschlossen sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 2: Protokoll-Workflow-Diagramm. Überblick über die wichtigsten Schritte von der Eierstockdissektion und Live-Imaging bis hin zur Kometenverfolgung und quantitativer Analyse. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 3: Repräsentative Bilder, die durch die Verarbeitung von Ozyten im Stadium 7–8 erzeugt wurden. (A-E) Repräsentative Bilder, die den Bildverarbeitungsablauf in Schritt 1 illustrieren, angewendet auf Stadium-7–8-Eizellen aus Kontroll-, kontroll-kaltbehandelten und heterozygoten Patronen in⁰⁵²⁵² kaltbehandelten Oocyten. Kanäle sind ein repräsentatives Bild aus einer maximalen Projektion von 2 Bildern eines 150-Bilder-Zeitrafferfilms, aufgenommen mit 0,5 Sekunden pro Bild. (A) Kanal 1, der der Erzeugung eines entrauschten Bildes aus der entsprechenden abgebildeten Eizelle entspricht. (B) Kanal 2, was der Erzeugung einer Differenz des Gaußschen Bildes entspricht. (C) Kanal 3, der der Erzeugung eines Bildes entspricht, bei dem das Signal der EB1-GFP-Kometen verstärkt wurde, um die Spitzen der Kometen zu zeigen. (D) Verschmelzung der Kanäle 2 und 3, die hilft, die resultierenden Kometenspitzen aus der Verarbeitung von Kanal 2 zu visualisieren. (E) EB1-GFP-Kometenbahnen, die aus Zeitraffer C in FIJI mit dem Temporal Color Code-Plugin generiert werden, um MT-Dynamiken zu veranschaulichen. Der Farbcode gibt die Zeitprojektion für 20 Bilder an (0,50 s zwischen den Bildern). Maßstabsleiste = 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 4: Screenshot eines Abschnitts im STEP 4 Jupyter Notebook. Das Notizbuch ist mit Markdown-Zellen aufgebaut, die selbsterklärende Anweisungen liefern, gefolgt von Code-Zellen, die Echtzeitergebnisse und Protokolle liefern. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 5: Analyse der EB1-GFP-Kometendynamik in Kontroll- und kaltbehandelten Ozyten im Stadium 7-8. Die Daten stellen den Durchschnitt ± SEM pro ROI (ROI1–ROI3) für Kontroll-, Kontroll-, kaltbehandelte und ^{Patronin-05252} kaltbehandelte Ozyten dar. EB1-GFP-Kometenmessungen wurden aus Zeitrafferbildern aus FIJI erstellten Zeitrafferbildern gewonnen; sofern nicht anders angegeben, wurden Analysen an in Channel 3 verarbeiteten Bildern durchgeführt. Die Gesamtzahl der EB1-GFP-Kometen wurde aus Kanal-2-Bildern analysiert (DoG-Bild). Die statistische Signifikanz wurde mit dem Kruskal–Wallis-Test bewertet, gefolgt von Mann–Whitney-Post-hoc-Vergleichen oder dem Friedman-Test, gefolgt von Wilcoxon-Matched-Pairs-Tests, je nach Bedarf (S. < 0,05; S. < 0,001; S. < 0,0001). (A) Streupunktdiagramm, das die durchschnittliche Anzahl der gesamten EB1-GFP-Kometenzahlen zeigt. (B) Streupunktdiagramm, das die durchschnittliche Anzahl der beweglichen EB1-GFP-Kometen zeigt. (C) Streupunktdiagramm, das die durchschnittliche EB1-GFP-Kometenspurlänge zeigt. (D) Streupunktdiagramm, das die durchschnittliche EB1-GFP-Kometengeschwindigkeit zeigt. (E) Rose zeigt die Orientierung der EB1-GFP-Spuren innerhalb von ROI1–ROI3 in Kontroll- (n = 14), Kontroll-Kaltbehandlung (n = 12) und Patronin⁰⁵²⁵² kaltbehandelten (n = 11) Oocyten. Der durchschnittliche Prozentsatz jeder Spur pro Eizelle, ausgerichtet auf den vorderen (A) oder posterioren (P), ist für jede Erkrankung und ROI angegeben. (F) Balkendiagramm, das den mittleren Prozentsatz der EB1-GFP-Kometenspurwinkel zeigt, die auf die vordere und hintere Seite der Eizelle ausgerichtet sind. Die Prozentsätze pro Eizelle wurden berechnet und stellen die relative Verteilung der Kometenorientierung innerhalb jeder ROI dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Metrik	ROI	Kontrolle (n=14)	Kontrolliert kaltbehandelt (n=12)	Patronin05252 kaltbehandelt (n=11)
Gesamtzahl EB1-GFP Kometen (#/μm²)	ROI 1 (vorder)	0,667 ± 0,18	0,691 ± 0,20	0,570 ± 0,17
	ROI 2 (Mitte)	0,394 ± 0,11	0,532 ± 0,15	0,400 ± 0,12
	ROI 3 (posterior)	0,353 ± 0,09	0,561 ± 0,16	0,378 ± 0,11
Motile EB1-GFP-Kometennummer (#/μm²)	ROI 1 (vorder)	0,189 ± 0,02	0,175 ± 0,03	0,099 ± 0,03
	ROI 2 (Mitte)	0,064 ± 0,02	0,091 ± 0,02	0,056 ± 0,02
	ROI 3 (posterior)	0,043 ± 0,01	0,104 ± 0,03	0,047 ± 0,02
EB1-GFP Kometenspurlänge (μm)	ROI 1 (vorder)	0,613 ± 0,04	0,621 ± 0,03	0,478 ± 0,07
	ROI 2 (Mitte)	0,463 ± 0,04	0,535 ± 0,03	0,410 ± 0,05
	ROI 3 (posterior)	0,488± 0,05	0,543 ± 0,04	0,393 ± 0,05
EB1-GFP-Kometengeschwindigkeit (μm/s)	ROI 1 (vorder)	0,208 ± 0,01	0,198 ± 0,01	0,188 ± 0,01
	ROI 2 (Mitte)	0,207 ± 0,01	0,199 ± 0,01	0,186 ± 0,01
	ROI 3 (posterior)	0,202 ± 0,01	0,194 ± 0,01	0,177 ± 0,01

Tabelle 1. Zusammenfassung der EB1-GFP-Kometenmessungen über vorder-hintere Regionen in analysierten Oozyten. Messungen wurden von Kontroll-, Kontroll-kaltbehandelten und heterozygoten Patronen in⁰⁵²⁵² kaltbehandelten Ozyten durchgeführt. Die Interessensgebiete wurden als ROI1 (vorder), ROI2 (mittler) und ROI3 (posterior) definiert.

Ergänzende Tabelle 1. Statistische Analyse von EB1-GFP-Kometenmessungen zwischen experimentellen Bedingungen. P-Werte zeigen Unterschiede zwischen Kontroll-, Kontroll-kaltbehandelten und heterozygoten Patronen für^jede ROI (ROI1-ROI3) an. Globale Vergleiche zwischen den drei Bedingungen wurden mit dem Kruskal–Wallis-Test durchgeführt, gefolgt von paarweisen Mann–Whitney-Post-hoc-Vergleichen.  Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen

Ergänzende Tabelle 2. Statistischer Vergleich der EB1-GFP-Kometenmessungen zwischen den ROIs innerhalb jeder experimentellen Bedingung. P-Werte zeigen Unterschiede zwischen ROI1 (anterior), ROI2 (mittler) und ROI3 (posterior) bei kontrollierten, kältebehandelten und heterozygoten ^{Patronin 05252} kaltbehandelten Ozyten. Die Gesamtunterschiede zwischen den ROIs innerhalb jeder Erkrankung wurden mit dem Friedman-Test bewertet. Paarweise Vergleiche der ROIs wurden anschließend mit Wilcoxon-Matched-Pairs-Signed-Rank-Tests durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen

Ergänzendes Video 1. Zeitrafferbildgebung des Plus-End-Tracking-Proteins EB1-GFP in einer Kontrollphase 7–8 Eizelle zeigt eine repräsentative Aufnahme, die für eine anschließende MT-Tracking-Analyse geeignet ist (siehe Abbildung 3). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen

Ergänzende Codierungsdatei 1: File_1_Step1_MTs_macro.ijm. Ein Fiji/ImageJ-Makro zur Bildvorverarbeitung. Es automatisiert die Korrektur der Photobleaching, Kalman-Filterung und Hintergrundsubtraktion mit einem Differenz-von-Gauß-(DoG)-Filter. Außerdem wird eine temporale Gradientenverstärkung (Reslicing und 1D-Konvolution) angewendet, um die Vorderkanten von MT-Spitzen zu schärfen und so die Spurgenauigkeit zu verbessern. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen

Ergänzende Codierungsdatei 2: File_2_Step2_MTs_macro.ijm. Ein Fiji/ImageJ-Makro für eine halbautomatisierte Definition der Region of Interest (ROI). Sie fordert den Nutzer auf, die Oocytengrenze zu definieren und segmentiert die Auswahl automatisch in gleich entfernte Zonen (in unserem Beispiel 3 Zonen: Anterior, Zentral und Posterior), um eine regionale Stratifizierung der Analyse zu ermöglichen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen

Ergänzende Codierungsdatei 3: File_3_Step3_MTs_macro_tracking.py. Ein Python-Skript (ausgeführt in Fiji/ImageJ), das die automatisierte Verfolgung von EB1-Kometen mit Trackmate durchführt. Es verarbeitet vorverarbeitete Bilder im Batch, erkennt Kometen mit definierten Qualitätsparametern, verknüpft sie in Trajektorien und exportiert die Rohkoordinatendaten als CSV-Dateien. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen

Ergänzende Codierungsdatei 4: File_4_Step4_MTs_results.ipynb. Ein Jupyter Notebook, das als primäre Schnittstelle für quantitative Analysen dient. Es lädt die Rohverfolgungsdaten, führt die Analysepipeline aus und generiert alle endgültigen Ausgaben, einschließlich Rosendiagramme, statistische Übersichtstabellen und Vergleichsdiagramme für Kometendichte, Geschwindigkeit und Lebensdauer. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen

Ergänzende Codierungsdatei 5: File_5_MTModule1.py. Ein benutzerdefiniertes Python-Modul mit grundlegenden Utility-Funktionen für die Datenextraktion und grundlegende geometrische Berechnungen. Es enthält Funktionen zur Suche nach ROI-Dateien, zur Berechnung momentaner Geschwindigkeiten und zur Berechnung grundlegender Winkelverschiebungen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen

Ergänzende Codierungsdatei 6: File_6_MTModule2.py. Ein individuelles Python-Modul mit erweiterten Analyse- und Visualisierungsfunktionen. Es beherbergt die Algorithmen für die Orientierungsanalyse-Pipeline (Kardinal- vs. Axial-Binning), robuste statistische Tests (Friedman/Wilcoxon mit Pratt-Methode) und die Erstellung von Publikationsqualität-Polardiagrammen (Rosendiagramme). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen

Ergänzende Codierungsdatei 7: File_7_KalmanStackFilterCompiled.jar. Ein kompiliertes Java Kalman Filter-Plugin für Fiji/ImageJ ist für die Rauschunterdrückungsschritte im Vorverarbeitungs-Makro erforderlich. Diese eigenständige Version überflüssig macht ein separates Java Development Kit (JDK) überflüssig und vereinfacht die Softwareeinrichtung des Benutzers. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen

Discussion

Live-Imaging der MT-Dynamik in Oocyten stellt besondere Herausforderungen dar, da hochwertige Datensätze und quantitative Analysen erforderlich sind, um aussagekräftige Informationen zu extrahieren. Während frühere Studien Live-Imaging-Ansätze 14,15,16 ^berichteten, sind die Bildanalyseschritte oft stark angepasst, und die Protokolle liefern nicht genügend Details für die Reproduzierbarkeit. Daher können Forscher ohne umfangreiche Bild- oder Computerkenntnisse auf Hürden bei der Reproduktion dieser Analysen stoßen. Um diese Herausforderungen zu bewältigen, wurde ein optimierter Arbeitsablauf entwickelt, der hochauflösende Airyscan Live-Imaging mit benutzerfreundlichen, automatisierten Makros und Skripten kombiniert. Diese Pipeline ermöglicht eine effiziente Erkennung und Verfolgung von EB1-Kometen, gefolgt von einer quantitativen Analyse der MT-Orientierung, Geschwindigkeit und räumlicher Organisation. Durch die Minimierung manueller Eingriffe und klare Schritt-für-Schritt-Anweisungen fördert der Workflow die Zugänglichkeit und Reproduzierbarkeit der MT-Dynamikanalyse in Oocyten.

Eierstockdissektion und Probevorbereitung sind entscheidende erste Schritte. Die Eizellen müssen sorgfältig seziert werden, um mechanische Schäden zu vermeiden, und die Bildgebensdauer sollte auf 90 Minuten begrenzt werden, um die Lebensfähigkeit^zu erhalten. Die Stadienauswahl ist wichtig: Nach der mittleren Oogenese vergrößert sich die Eizelle und sammelt sich Eigelb im Zytoplasma an, was die Visualisierung des EB1-Signals ab Stadium 9 zunehmend erschwert. Daher wird eine Bildgebung über Stadium 9 hinaus^{nicht empfohlen.} Für reproduzierbare Quantifizierungen sind außerdem Ozyten vergleichbarer Größe vorzuziehen, da dies sicherstellt, dass definierte Interessenbereiche mit äquivalenten vorder-hinteren Positionen über Proben hinweg übereinstimmen.

Temperaturregelung ist für die Reproduzierbarkeit unerlässlich. Fliegenbestände sollten unter Standardkulturbedingungen (25 °C) gehalten werden, um eine normale Entwicklung und eine konstante EB1-GFP-Expression zu unterstützen, insbesondere bei Verwendung des GAL4/UAS-Systems, das empfindlich auf Temperaturschwankungen reagiert. Die Temperaturstabilität während der Bildgebung ist ebenso wichtig, da Schwankungen die MT-Dynamik beeinflussen können. Obwohl keine temperaturkontrollierte Kammer erforderlich ist, wird empfohlen, Temperaturschwankungen während der Aufnahme zu vermeiden.

Für die Bildaufnahme wurde die konfokale Bildgebung des Array-Detektors wegen ihrer hohen Empfindlichkeit und verbesserten SNR ausgewählt, wodurch der Bedarf an Nachaufnahme-Denoising minimiert wurde. Objektive mit hoher numerischer Apertur (so hoch wie möglich) in Kombination mit geeigneter Anpassung des Brechungsindex sollten verwendet werden, um die laterale und axiale Auflösung zu maximieren, was für die Auflösung einzelner Kometen in dichten Netzwerken entscheidend ist. Darüber hinaus sollten die Nyquist-Shannon-30-Stichprobenkriterien in XYZ und Zeit befolgt werden, um einen Verlust der Genauigkeit bei der Kometenverfolgung zu vermeiden. Ebenso wichtig ist die sorgfältige Auswahl der Bildfläche entlang der z-Achse. Eine zu tiefe Bildgebung führt zu einem Fluoreszenzverlust durch Lichtstreuung, während die Beschränkung der Aufnahme auf die kortikale Oberfläche die volle Dynamik der EB1-Kometen nicht erfasst. Die informativsten Daten werden an einer zwischenliegenden z-Position gewonnen. Oocyten, in denen der Kern innerhalb der ausgewählten Ebene liegt, sollten vermieden werden, da das Kernkompartiment einen großen Teil des Zytoplasmas verdrängt und keine EB1-Spuren besitzt, wodurch die Anzahl der nachweisbaren Kometen reduziert wird.

Obwohl sie für konfokale Bildgebung auf Basis eines Array-Detektors optimiert ist, ist diese Analysepipeline hardware-agnostisch und mit anderen Modalitäten kompatibel, wie z. B. der Spinnscheiben-Konfokalmikroskopie. Nutzer sollten jedoch wissen, dass Systeme mit niedrigerem NA oder SNR möglicherweise Anpassungen an den Vorverarbeitungsparametern des Makros (z. B. Rauschtoleranz/DoG-Sigmas) erfordern und zu einer geringeren Kometenerkennungsdichte im Vergleich zu den in dieser Studie dargestellten Werte führen können. Dennoch können Absolutwerte zwischen Systemen variieren, aber die relativen Trends zwischen experimentellen Bedingungen und ROIs werden voraussichtlich robust bleiben.

Aufgrund der großen 3D-Struktur der Oozyt erfasst die 2D-Bildgebung nur einen optischen Abschnitt des MT-Netzwerks. Folglich können Kometen, die sich steil entlang der z-Achse bewegen, die Brennebene verlassen, was potenziell zu einer Unterschätzung der Bahnlebensdauer und absoluten Geschwindigkeit führen kann (da nur die xy-Komponente des Geschwindigkeitsvektors gemessen wird). Eine hochgeschwindigkeits-3D-Volumenbildgebung der gesamten Oozyte würde jedoch kleinere Sichtfelder (FOV), kürzere Belichtungszeiten und schnellere Detektorreaktionszeiten erfordern, wodurch SNR reduziert und die Erfassungszeit auf mehrere Z-Schnitte verteilt wird, was die zeitliche Auflösung für die Verfolgung schneller EB1-Kometen beeinträchtigt. Um nicht bewegende Kometen und unscharfe Artefakte zu mindern, wurden Faltungs- und Minimalspuren-Filter (ohne Spuren < 3 Bilder) eingesetzt, um transiente Flecken in der Brennebene zu entfernen. Darüber hinaus bleiben die beobachteten relativen Unterschiede in Kometendichte, Geschwindigkeit und Orientierung stabil, da diese geometrische Einschränkung einheitlich über experimentelle Bedingungen hinweg gilt. Während aufkommende Techniken wie Lichtfeldmikroskopie idealerweise die gesamte 3D-Struktur gleichzeitig erfassen würden, sind sie noch nicht weit verbreitet. Dennoch stimmen die für alle MT-Dynamikparameter gemessenen Werte mit früheren Berichten überein, was darauf hindeutet, dass dieses Protokoll geeignet ist, MT-Dynamiken in verschiedenen experimentellen Einrichtungen zu untersuchen.

Vor der Verwendung der Makros in diesem Protokoll wird empfohlen, die ersten Bilder manuell zu verarbeiten, um sicherzustellen, dass die Softwareparameter korrekt optimiert sind. Faktoren wie Bildauflösung, Vergrößerung, Signal-Rausch-Verhältnis, Bildrate und ob die Daten eine Einzelebene oder Z-Stack sind, können alle die Verfolgungsgenauigkeit beeinflussen. Iteratives Anpassen der Parameter bei visueller Inspektion der resultierenden Spuren, um Fehlalarme und Falsch-Negative zu minimieren. Nach der Optimierung wenden Sie die Parameter konsistent über Datensätze hinweg an, um die Reproduzierbarkeit sicherzustellen.

Abschließend sollten einige Einschränkungen hinsichtlich der biologischen Interpretation bemerkt werden. EB1-GFP markiert selektiv wachsende MT-plus-Enden und berichtet daher über Stellen aktiver MT-Polymerisation und nicht über die gesamte MT-Population. Stabile, nicht polymerisierende MTs, die während der Bildgebungsphase vorhanden sind, werden mit dieser Methode nicht nachgewiesen. Obwohl diese Einschränkung bei Oozyten mit mittlerer Oogenese, wo die Mehrheit der MTs hochdynamisch ist, weniger restriktiv ist, sollte sie bei der Anwendung des Protokolls auf andere Zelltypen mit erheblich stabilen MT-Populationen, wie etwa Neuronen³¹, berücksichtigt werden.

Abschließend ermöglicht dieser Workflow eine hochauflösende, quantitative Analyse der MT-Dynamik in Drosophila-Oocyten . Durch die Integration optimierter Dissektion, konfokaler Live-Bildgebung von Array-Detektoren und automatisierter Analysetools bietet es eine rigorose, aber zugängliche Methode zur Untersuchung von MT-Regulatoren im acentrosomalen Kontext. Obwohl sie hauptsächlich in Oozyten validiert sind, sind die Prinzipien dieses Ansatzes nach Optimierung an andere Zelltypen anpassbar, einschließlich nicht-teilender Zellen wie Neuronen und Epithelle, und bieten eine skalierbare Plattform für genetische Screenings und mechanistische Studien zur MT-Organisation.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dumont #5 Zange	Feine wissenschaftliche Werkzeuge	11252-20
EB1::GFP	Von Dr. Antoine Guichet, CNRS, Institut Jacques Monod, Frankreich		Genotyp: w; +/CyO; UASp-EB1::GFP/TM3
Petrischalen mit Glasboden	MatTek	P35G-1.0-14-C
Matα 4-Gal4-VP16	Bloomington Drosophila Aktienzentrum	7062	Genotyp: w[*]; P{w[+mC]=matalpha4-GAL-VP16}V2H
Oil 10S, VOLTALEF	VWR Chemicals	24627.188
Patronin-Mutant	Bloomington Drosophila Aktienzentrum	16647	Genotyp: y[1] w[67c23]; P{y[+mDint2] w[+mC]=EPgy2}Patronin[EY05252]/CyO
W1118	Bloomington Drosophila Aktienzentrum	3605
Zeiss LSM 980 mit Airyscan 2	Zeiss