Immunfärbungs- und Farbstoffpenetrationsexperimente zur Definition von Kern-Plezier-Septaten-Übergangsproteinen in Drosophila-embryonalen Epitheln

Zusammenfassung

Diese Protokolle beschreiben, wie die Organisation und Okklusionsfunktion plissierter Septatenübergänge in Kontroll- und mutanten-embryonalem Epithel von Drosophila charakterisiert werden kann.

Zusammenfassung

Zweck dieser Protokolle ist es, die Organisation und Barrierfunktion von pleierten Septatenübergängen (pSJs) in den ektodermal abgeleiteten Epithelgeweben von Drosophila-Embryonen zu bewerten. pSJ bilden eine verdeckende Barriere auf der lateralen Membran von ektodermalen Geweben, einschließlich Epidermis, Speicheldrüsen, Luftröhre und Hinterdarm, die funktional dem engen Übergang im Wirbeltiergewebe ähnelt. Bei Drosophila wurden 30 Proteine identifiziert, die für die Bildung von pSJs erforderlich sind. Kern-pSJ-Proteine sind zunächst entlang der Länge der lateralen Membran lokalisiert, reichern aber bis Stadium 16 der Embryogenese stark an der apikalen lateralen Region der Verbindung an, direkt basal zum Adherens-Übergang. Im späten Stadium 15 der Embryogenese besitzen diese Gewebe eine voll funktionsfähige Okklusionsverbindung. Dieses Papier beschreibt Immunfärbungs- und Farbstoffpermeabilitätsprotokolle, die zur Untersuchung der Organisation und Funktion von pSJs in Kontroll- und mutierten Embryonen verwendet werden können. Ein erfolgreicher Einsatz dieser Protokolle kann genutzt werden, um die Okklusionsfunktion von pSJs zu demonstrieren und zu testen, ob ein unbekanntes Gen eine Kernkomponente der Verbindung kodiert.

Einleitung

Eine entscheidende Funktion von Epithelgeweben ist es, unterschiedliche Bereiche innerhalb eines Organismus zu trennen. Die Schaffung dieser unterschiedlichen Umgebungen ist für die Organfunktion und den Schutz des Organismus vor äußeren Bedrohungen unerlässlich. Die zwischen den Zellen eines Epithels gebildete Okklusionsverbindung ist dafür verantwortlich, diese Umgebungen zu etablieren und aufrechtzuerhalten, indem sie den parazellulären Fluss von gelösten Stoffen zwischen der apikalen und basalen Seite dieses Epithels^verhindert. Bei Wirbeltieren wird die Okklusionsverbindung als Tight Junction bezeichnet, während sie bei Wirbellosen wie Drosophila melanogaster ^1,3 als Septate Junction (SJ) bezeichnet wird. Es gibt zwei Arten von SJ bei Gliederfüßern, die sich durch ihre Gewebeverteilung und Ultrastruktur^{unterscheiden}. Plissierte Septatverbindungen (pSJs) finden sich in ektodermal abgeleiteten Geweben wie der Epidermis, Speicheldrüsen, Luftröhre und Hinterdarm. Sie sind ultrastrukturell durch ein leiterartiges Array aus elektronendichtem Material im extrazellulären Raum zwischen den Zellen charakterisiert, das direkt basal zur Adherens-Verbindung ^3,5 liegt. Im Gegensatz dazu finden sich glatte Septatverbindungen (sSJ) in endodermal abgeleiteten Geweben wie Mitteldarm- und Malpighian-Tubuli und weisen keine elektronendichten Septae zwischen Zellen⁶ auf.

Genetische Studien in Drosophila haben 30 Proteine identifiziert, die für die Struktur und Funktion von pSJ erforderlich sind, und weitere Proteine identifiziert, die sich in der Verbindung befinden, aber scheinbar keine Funktion bei ihrer Entstehung oder Erhaltung haben (Übersicht in⁷). Aus diesen Analysen haben Wissenschaftler SJ-Proteine in drei Klassen eingeteilt. Kern-SJ-Proteine befinden sich in der Verbindung und sind für die Etablierung und Erhaltung der Verbindung erforderlich. Siebzehn Proteine wurden als Kern-pSJ-Proteine identifiziert, darunter Coracle (Cora), Neurexin IV, Macroglobulin Complement-related (Mcr), Kune-kune und ATPase^alpha 8,9,10,11,12. Neun Proteine wurden als zusätzliche pSJ-Proteine identifiziert, die für die Etablierung und/oder Aufrechterhaltung des Junctions erforderlich sind, aber nicht unbedingt in diesem Junction wohnen. Diese Klasse umfasst Proteine wie Rab5, Rab11 und Coiled^13,14. Schließlich lokalisieren sich pSJ-residente Proteine am pSJ, sind aber für die Etablierung und Aufrechterhaltung der Verbindung entbehrlich. Beispiele für die vier Mitglieder dieser Gruppe sind Discs Large und Fasciclin III^15,16.

Die Etablierung eines funktionell intakten pSJ ist ein mehrstufiger Prozess, der in der Mitte der Embryogenese beginnt, wenn alle Kernproteine von pSJ vollständig exprimiert sind. Einige zentrale pSJ-Gene werden mütterlich exprimiert, zeigen jedoch alle eine starke zygotische Expression im Stadium 12 bis¹⁷. Im Stadium 12 lokalisieren sich die Kernproteine pSJ entlang der gesamten Länge der lateralen Membran. In den Stadien 13–16 werden die Kernproteine von pSJ endozytisiert und dann zurück zur lateralen Membran im Bereich des pSJ zurückgeführt. Dieser Prozess erfordert pSJ-Zusatzproteine, darunter Rab5 und Rab11¹⁴. In Stadium 16 sind die Kernproteine von pSJ eng im Bereich des pSJ entlang der lateralen Membran lokalisiert. Im Einklang mit diesen Beobachtungen findet die vollständige Okklusionsfunktion der Verbindung im späten Stadium 15 der Embryogenese¹² statt. Dies lässt sich am besten mit einem Farbstoffdurchlässigkeitstest demonstrieren. Vor der Bildung der Verbindung kann eine 10 kDa Dextran-Perle, die mit einem fluoreszierenden Marker wie Rhodamin markiert ist, durch den parazellulären Raum zwischen den Zellen gelangen. Wenn das markierte Dextran in den Hämocoel injiziert wird, sammelt es sich schnell im Lumen von röhrenartigen Epitheln wie Luftröhre, Speicheldrüse und Hinterdarm an. Nachdem das pSJ am Ende von Stadium 15 physiologisch angespannt ist, ist das injizierte Dextran auf die Basalseite des Epithels beschränkt und kann sich nicht im Lumen (apikalen Bereich) dieser Organe ansammeln.

Kern-pSJ-Proteine teilen ein charakteristisches Merkmal, bei dem jedes Kern-pSJ-Protein das Vorhandensein aller anderen Kern-pSJ-Proteine für eine korrekte subzelluläre Lokalisierung^{benötigt 18,19}. Diese gegenseitige Abhängigkeit bei der Bildung von pSJ ist ein prägendes Merkmal der Kernproteine von pSJ und liegt den in diesem Artikel vorgestellten Protokollen zugrunde. Mutationen in Kern- oder Neben-pSJ-Genen führen zu embryonaler Letalität und sind durch die Fehllokalisierung anderer Kernproteine pSJ entlang der lateralen Membran in Embryonen im Stadium 16 gekennzeichnet, anstatt eng auf deren normale apikale laterale Region lokalisiert zu sein. Im Gegensatz dazu führen Mutationen in pSJ-residenten Genen nicht zu einer Fehllokalisierung von Kernproteinen^{pSJ 15}. Die funktionelle Störung des pSJ bei Kern- und Zubehör-pSJ-Genmutationen zeigt sich durch die Ansammlung von markiertem 10 kDa-Dextran im Lumen der Luftröhre, Speicheldrüsen oder Hinterdarme in mutierten Embryonen im Stadium 16 oder 17. Schließlich ist das Unterscheidungsmerkmal zwischen einem Kern- und einem Zusatz-pSJ-Protein ihre subzelluläre Lokalisierung. Kern-pSJ-Proteine sind eng mit dem pSJ verbunden, sobald sie gebildet sind, während zusätzliche pSJ-Proteine für die Assemblage des Junctions entscheidend sind, aber nicht unbedingt in der Verbindung liegen. Die besten Beispiele für ergänzende pSJ-Proteine sind Rab5 und Rab11. Beide sind zytoplasmatische Proteine, die helfen, Fracht von der Plasmamembran früh zu transportieren, Endosomen zu recyceln und dann zurück zur Plasmamembran¹⁴. Um zu unterscheiden, ob ein neues potenzielles pSJ-Protein eine Kernkomponente oder ein Nebenprotein ist, ist es in der Regel hilfreich, einen spezifischen Antikörper zu erstellen oder ein fluoreszenzmarkiertes rekombinantes Protein zu exprimieren, um zu bestimmen, wo sich diese Proteine an verschiedenen Punkten im pSJ-Reifungsprozess lokalisieren.

Zweck dieser Protokolle ist es, potenzielle Kern- und Zubehörproteine von pSJ-residenten Proteinen eindeutig zu unterscheiden. Mehrere Studien haben zusätzliche, nicht-okkludierende Rollen von pSJ-Proteinen während der Entwicklung aufgedeckt, darunter Rollen bei der Morphogenese und apikal-basaler Polarität ^17,20,21,22. Da das Interesse an der pSJ-Biologie wächst und mehr potenzielle pSJ-Proteine identifiziert werden, werden die hier vorgestellten einfachen, leicht interpretierbaren Protokolle Forschern helfen, die pSJ-Organisation und die Verschlussfunktionen dieser Proteine korrekt zu charakterisieren. In der Literatur wurden viele weitere experimentelle Ansätze zur Charakterisierung von pSJ-Proteinen beschrieben, darunter Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) und Transmissionselektronenmikroskopie ^6,23. Obwohl diese Ansätze oft sehr nützlich sind, bietet der hier vorgestellte Immunfärbungstest eine schnelle Visualisierung der pSJ-Proteinlokalisierung ohne teure und zeitaufwändige ultrastrukturelle Methoden, während der Farbdurchlässigkeitstest eine funktionelle Anzeige der pSJ-Integrität bietet, die nicht allein durch Bildgebung erreicht werden kann. Zusätzlich können diese Tests mit Standardlaborausrüstung wie einem hochwertigen Fluoreszenzmikroskop und einem rudimentären Mikroinjektions-Setup durchgeführt werden. Es sollte beachtet werden, dass diese Assays für die Analyse von Drosophila-Embryonen im Stadium 16 optimiert sind und nicht geeignet sind, um die Organisation oder Funktion von sSJs zu bewerten.

Protokoll

1. Staging von Embryonen

1. Kreuzen Sie gesunde männliche und weibliche Fliegen der entsprechenden Genotypen (siehe Materialtabelle für Beispiele) und setzen Sie sie in Embryonal-Sammelkäfige mit frischen Apfelsaftplatten, die mit Hefepaste bestrichen sind. Lassen Sie die Fliegen sich ein oder zwei Tage an die Eiersammelkäfige gewöhnen, bevor Sie mit der Embryoentnahme beginnen.
2. Sammeln Sie Embryonen auf Apfelsaftplatten und lassen Sie sie sich bis Stadium 16 entwickeln (~13 Stunden nach der Eiablage (AEL) bis 16 Stunden AEL bei 25 °C). Lassen Sie die erwachsenen Eier 1–2 Stunden auf Apfelsaftplatten legen, nehmen Sie die Platte aus dem Käfig und reifen Sie sie dann auf 13–16 AEL bei 25 °C. Alternativ werden Embryonen über Nacht bei 25 °C gesammelt und dann Embryonen im Stadium 16 vor der Fixierung oder während der Bildgebung nach der Fixierung und Immunfärbung ausgewählt.
   HINWEIS: Embryonale Stadieneinteilung kann anhand der Darmmorphologie beurteilt werden, die am einfachsten durch Autofluoreszenz im UV-Spektrum (d. h. DAPI-Kanal) sichtbar wird. In Embryonen im Stadium 16 erscheint der Darm als drei parallele, lange Ovale, die senkrecht zur Längsachse des Körpers stehen (Abbildung 1H).

2. Fixierung und Immunfärbung von Embryonen

1. Stellen Sie einen Embryo-Sammelkorb mit einem Nylonnetz (120 mm Gitter) zusammen. Decke die Öffnung und die Gewinde des Korbs mit dem Nylon-Mesh ab und schraube dann die Kappe auf.
2. Lösen Sie die Embryonen vorsichtig von der Apfelsaftplatte mit einem Pinsel und einer Embryo-Waschlösung. Gießen Sie die Embryomischung in den Embryo-Sammelkorb und spülen Sie die Embryonen mit destilliertem Wasser ab.
   HINWEIS: Seien Sie vorsichtig, das Wasser im Inneren des Embryo-Sammelkorbs hinunterzuleiten und vermeiden Sie, dass die Embryonen auf die Seiten des Korbs spritzen, da dies durch Verwachsung zum Verlust des Embryos führen kann.
3. Dechorionieren Sie die Embryonen, indem Sie den Embryo-Sammelkorb und die Embryonen in ein Tablett mit 50 % kommerzielles Bleichmittel (Endkonzentration von 3,75 % Natriumhypochlorit) eintauchen. Wirbeln Sie die Embryonen im Bleichmittel und lassen Sie sie 3-5 Minuten bei Zimmertemperatur eintauchen. Nehmen Sie den Korb aus dem Bleichmittel und spülen Sie die Embryonen mit destilliertem Wasser, wobei Sie erneut den Wasserfluss im Inneren des Korbs leiten.
4. Bereiten Sie ein Fixationsfläschchen vor, indem Sie gleiche Mengen frischer 4%iger Paraformaldehydlösung und Heptan zu einem 20-mL-Szintillationsfläschchen geben. Stellen Sie Paraformaldehydlösung her, indem Sie die passende Menge Paraformaldehyd in heißer (~90 °C) 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) in einer chemischen Abzughaube auflösen. Um den Lösungsprozess zu beschleunigen, geben Sie 10 μL 14 N Natriumhydroxid (pro 10 ml PBS) in die Fixierung, bis das Formaldehyd in Lösung ist, und geben Sie dann 10 μL 14 N Salzsäure hinzu, um den pH-Wert wieder auf neutral zu stellen.
   VORSICHT: Tragen Sie beim Umgang mit Paraformaldehyd und Heptan immer einen Laborkittel, Schutzbrille und Handschuhe, und verwenden Sie es nur unter einer chemischen Abzughaube. Paraformaldehyd ist ein Karzinogen und korrosiv, während Heptan hochentzündlich ist und Haut- und Augenreizstoff ist.
5. Zerlegen Sie den Embryo-Sammelkorb und tauchen Sie das Nylonnetz mit dechorionierten Embryonen in das Heptan ein. Die Embryonen lösen sich vom Nylon und setzen sich an der Grenzfläche zwischen Heptan (obere Schicht) und Fixierung (untere Schicht) ab. Beheben Sie die Embryonen, indem Sie das Fixationsfläschchen auf einem Plattformschüttler mit 240 Umdrehungen pro Minute (RPM) für 20 Minuten schütteln.
6. Entfernen Sie das Fix aus dem Fixationsfläschchen mit einer Pasteur-Pipette in einer chemischen Abzugshaube. Entsorgen Sie die Lösung in einem zugelassenen Behälter für gefährliche chemische Abfälle. Fügen Sie ein gleiches Volumen Methanol hinzu, schließen Sie die Fixierungskammer und schütteln Sie die Kammer 5–10 Sekunden kräftig. Die fixierten Embryonen lösen sich aus der Vitellinhülle und sinken auf den Boden der Methanol (untere Schicht). Vitelline-Umschläge und alle Embryonen, die sich nicht aus dem Vitellin-Umschlag lösen konnten, bleiben an der Schnittstelle und werden in Schritt 2.7 entfernt.
   VORSICHT: Tragen Sie beim Umgang mit Methanol immer einen Laborkittel, eine Schutzbrille und Handschuhe, da es giftig und entflammbar ist.
7. Entfernen Sie das Heptan mit einer Pasteur-Pipette und entsorgen Sie es in einem zugelassenen Behälter für gefährliche chemische Abfälle. Dann entfernen Sie den Großteil des Methanols, lassen die Embryonen in einem kleinen Methanolpool zurück und entsorgen das Methanol in gefährlichen chemischen Abfällen. Füge 5 ml Methanol hinzu, wirbel die Embryonen und lasse sie sich setzen. Entferne den Großteil des Methanols erneut und wiederhole diesen Vorgang noch zweimal.
8. Übertragen Sie die Embryonen in Methanol in ein 0,8-ml-Glaskulturrohr. Entferne das Methanol und gib 750 ml Blocklösung hinzu (PBS plus 1 % normales Eselserum und 0,1 % Triton X-100). Wasche die Embryonen dreimal in PBS und brüte sie dann 30 Minuten lang in Blocklösung bei Zimmertemperatur mit sanftem Mischen auf einer Plattform-Schaukel.
9. Die Embryonen noch einmal mit PBS ausspülen und dann Block- plus Primärantikörper hinzufügen. Verwenden Sie Antikörper gegen ein Kern-pSJ-Protein (z. B. Coracle) und ein Adherens-Junction-Protein (z. B. E. Cadherin). Inkubieren Sie die Embryonen über Nacht in einem primären Antikörper bei 4 °C oder 3–4 Stunden bei Zimmertemperatur und sanftem Mischen auf einer Plattform-Schaukel.
10. Entfernen Sie den Block mit primären Antikörpern und spülen Sie die Embryonen dreimal mit PBS. Füge Block hinzu und wasche die Embryonen 30 Minuten lang bei Zimmertemperatur auf einer Plattform-Schaukel.
11. Spülen Sie die Embryonen noch einmal in PBS und fügen Sie dann die Blocklösung und fluoreszierend markierte sekundäre Antikörper hinzu, die spezifisch für die primären Antikörper aus Schritt 2.9 sind. Embryonen bei Zimmertemperatur 3-4 Stunden oder über Nacht bei 4 °C inkubieren.
12. Entfernen Sie den Block mit sekundären Antikörpern und spülen Sie die Embryonen dreimal mit PBS. Füge Block hinzu und wasche die Embryonen 30 Minuten lang bei Zimmertemperatur auf einer Plattform-Schaukel.
13. Spülen Sie die Embryonen noch einmal in PBS ab und übertragen Sie sie dann mit einer Pasteur-Pipette auf einen Objektträger. Entfernen Sie überschüssiges PBS mit kleinen Streifen von Whatman-Papier und achten Sie darauf, die Embryonen nicht zu berühren. Decken Sie die Embryonen mit Montagemedium ab (kommerziell erhältlich oder hergestellt aus 90 % Glycerol, 10 % 1 M Tris, pH 8,0, mit 0,5 % n-Propylgallat als Antifading-Mittel). Decken Sie mit einem passend großen Deckglas ab und versiegeln Sie die Ränder mit Nagellack.

3. Bildgebung und Datenanalyse immungefärbter Embryonen

1. Für beste Ergebnisse bilden Sie Embryonen mit einem konfokalen Mikroskop mit einem 40-fachen Öl-Immersionsobjektiv ab. Verwenden Sie Kontrollembryonen, um die Laserintensität und -verstärkung am Konfokal einzustellen, um ein starkes fluoreszierendes Signal zu erzielen, ohne Pixel zu übersättigen. Identifizieren Sie Sta-16-Embryonen der Wahl (d. h. solche, die kein Balancer-codiertes GFP zur Identifizierung mutierter Embryonen exprimieren) mittels Mitteldarmmorphologie. Konzentrieren Sie den Scan auf die Speicheldrüse oder den Hinterdarm, da diese Organe polarisiert sind und lange laterale Membranen besitzen, die ideal sind, um die Adhärensverbindung, das pSJ und die verbleibende Seitenfläche zu unterscheiden. Bild in einer z-Position, die den größtmöglichen Durchmesser des Lumens der Speicheldrüse oder des Hinterdarms umfasst, um die vollständige laterale Membran der Epithelzelle zu betrachten.
   HINWEIS: Das in Abbildung 1C gezeigte Beispiel wurde mit einem Konfokalmikroskop mit einer HC PL APO 40x/1,3 CS2 Ölimmersionslinse mit einer Laserintensität von 1,59 und einer Verstärkung von 3,3 für den 561-nm-Laser sowie einer Laserintensität von 2,0 und einer Verstärkung von 21,7 für den 638-nm-Laser aufgenommen (siehe Materialtabelle).
2. Bild ein polarisiertes Gewebe in mindestens 20 Kontroll- und mutierten Embryonen im Stadium 16 ab. Nur Daten von Embryonen aufzeichnen, bei denen der Adherens-Junction-Marker eng im apikalen lateralen Bereich der Membran lokalisiert ist, um sicherzustellen, dass der Embryo korrekt fixiert und gefärbt wurde. Als Nächstes wird die Verteilung des pSJ-Markers entlang der lateralen Membran erfasst. Bei Wildtyp-Embryonen im Stadium 16 sollte eine starke Anreicherung von pSJ-Proteinen entlang der ~10–15 % der lateralen Membran direkt basal zum Adherens-Übergang suchen.
   HINWEIS: Eine Fehllokalisierung von selbst 10–20 % des pSJ-Proteins entlang der Länge der lateralen Membran ist diagnostisch für einen pSJ-Organisationsdefekt. pSJ-Organisationsdefekte sind in allen Kern- und Zusatz-pSJ-mutierten Embryonen stark penetrant, daher sollten Sie erwarten, dass 75–100 % der mutierten Embryonen ein eindeutig fehllokalisiertes pSJ-Protein zeigen.

4. Vorbereitung für die Farbstoffinjektion

1. Stellen Sie eine frische Farbstofflösung her, indem Sie rhodamin markierte 10 kDa Dextran auf 1 mg/mL in 0,5 m Natriumphosphat, pH 7,5 und 5 mM Kaliumchlorid auflösen.
2. Ziehe ein Kapillarrohr (1,0 mm OD x 0,5 mm Innendurchmesser mit Faser) mit einem Nadelzieher in eine Glasnadel.
   HINWEIS: Nadelzieher sind eigenwillig und die Einstellungen für ideale Nadeln unterscheiden sich oft von Tag zu Tag. Gute Nadeln haben eine allmähliche Verjüngung zu einer scharfen Spitze und sollten zwischen den in Abbildung 2A gezeigten Formen liegen. Die Nadel links ist länger und kann sich biegen, wenn sie in den Embryo gestoßen wird. Das kann korrigiert werden, indem man die Nadel weiter vom Punkt entfernt wieder bricht. Die Nadel rechts ist gut, hat aber beim ersten Bruch eine größere Bohrung und kann zu viel Flüssigkeit in den Embryo drücken. Wenn das passiert, wechsle zu einer neuen Nadel mit feiner Spitze. Am besten zieht man mehrere Nadeln auf einmal, wenn die Bedingungen am Nadelzieher die richtige Form erzeugen. Überschüssige Nadeln können in einem geschlossenen Behälter mit einem Stück Schaumstoff oder Klebeband aufbewahrt werden, um die Nadeln unabhängig zu sichern.
3. Lade die Nadel in den Nadelhalter auf einem Mikromanipulator. Stellen Sie den Mikromanipulator neben ein umgekehrtes Mikroskop (Abbildung 2F) an. Richten Sie die Nadel so nah wie möglich parallel zum Objektträger aus und senken Sie sie so, dass sie sich in derselben Z-Ebene wie die Seite des Objektträgers befindet.
4. Brechen Sie die Spitze der Nadel, indem Sie auf die Seite des Objektträgers schlagen. Heben Sie die Nadel über das Niveau des Schlittens hinaus und nehmen Sie sie zum Laden ab.
5. Füllen Sie das Kapillarrohr mit Farbstoff mit der kleinsten verfügbaren Pipettenspitze (P2- oder P10-Spitze) oder durch Kapillarwirkung, indem Sie das hintere Ende der Nadel in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenrohr mit dem Farbstoff legen.
6. Füllen Sie die gefüllte Nadel erneut in den Nadelhalter und testen Sie den Durchfluss des Dextran, indem Sie einen Tropfen Halokarbonöl auf der Oberfläche eines Objektträgers injizieren.
   HINWEIS: Eine gut gebrochene Nadel leckt nicht, ohne zusätzlichen Druck hinzuzufügen, und die Durchflussrate kann anhand des Druck auf den Kolben der Spritze angepasst werden.

5. Embryonen montieren und Farbstoffinjektion

1. Wählen Sie Embryonen im Stadium 16 oder 17 (Kontroll- und Mutanten) unter Verwendung der Mitteldarmmorphologie als Stufenmarker.
2. Erzeugen Sie eine eingekerbte Linie auf einer Apfelsaftplatte mit einem 22 x 22 # 2 dicken Deckblatt. Richten Sie etwa 25 stufenweise Embryonen auf der Apfelsaftplatte auf, wobei ihre hinteren Enden die Linie berühren und die Bauchseite nach oben zeigt.
3. Kleben Sie ein Stück doppelseitiges Klebeband auf einen 22 x 22 #2 großen Deckdeckel. Berühren Sie das Klebeband mit der Embryoleitung und reiben Sie leicht den Deckel, um die Embryonen von der Platte auf das doppelseitiges Klebeband auf dem Deckzettel zu bewegen (Abbildung 2B).
4. Befestigen Sie den Deckmantel an einem Objektträger, indem Sie einen Tropfen Halokarbonöl zum Objektträger geben und mit Kapillarwirkung eine Verbindung herstellen. Richte den Deckdeckel näher an der Seite der Rutsche aus, die gegenüber von einem mattierten Teil gegenüberliegt. Trockne die Embryonen 3–5 Minuten in einem Behälter mit Trockenmittel oder 10–15 Minuten in der Luft auf einer Laborbank (Abbildung 2C–E). Decken Sie die Embryonen vollständig mit Halokarbonöl ab.
   HINWEIS: Die Embryonen sind nach dem Austrocknen etwas weniger schwer, aber nicht stark schlaff. Die in Abbildung 2E gezeigten Embryonen wurden in einem Raum mit 42 % relativer Luftfeuchtigkeit bei 21,2 °C 15 Minuten an der Luft trocknen lassen.
5. Montiere den Objektträger mit Embryonen auf das umgekehrte Mikroskop, wobei die Embryonen nach oben (weg vom Ziel) zeigen. Richten Sie den Mikromanipulator so aus, dass die Nadel dem hinteren Ende der Embryonen in einem Winkel so nahe wie möglich parallel zu den Embryonen zeigt (Abbildung 2G). Stellen Sie die Z-Achse des Mikromanipulators so ein, dass die Nadelspitze zur Mitte des Embryos (entlang der dorsal-ventralen Achse) ausgerichtet ist.
6. Injizieren Sie die Embryonen, indem Sie die Stufe schnell in die Nadel bewegen, sodass die Nadelspitze in das Hämocoel des Embryos eintritt. Injizieren Sie eine kleine Menge Farbstoff (~0,2–0,5 nL) mit einer 10-, 25- oder 50-ml-Spritze. Ziehen Sie die Nadel schnell heraus, bewegen Sie die Stufe zum nächsten Embryo und wiederholen Sie den Vorgang. Injiziere so viele Embryonen wie möglich in 10 Minuten.
   HINWEIS: Es ist wichtig, dass die Nadel etwa 25 % tief in den Embryo eingeführt wird, damit der Farbstoff nicht direkt in den perivitelleninen Raum injiziert wird, der mit dem Lumen des Vorder- und Hinterdarms zusammenhängt. Der injizierte Farbstoff sollte so wirken, als würde er den Embryo "aufblähen", sodass er stärker gespannt wirkt. Eine Überinjektion führt dazu, dass eine Blase aus Farbstoff und Hämolymphe die Injektionsstelle verlässt, was vermieden werden sollte.
7. Fügen Sie zusätzliches Halokarbonöl hinzu und decken Sie die Embryonen mit einem 22 x 22 #2 Deckdeckel ab. Das zusätzliche Halokarbonöl bildet eine gleichmäßigere Schicht zwischen den beiden Deckfolien und verhindert, dass die Embryonen zerquetscht werden.

6. Bildgebung und Datenanalyse

1. Führen Sie Bildgebung entweder mit einem fluoreszierenden Verbindungsmikroskop oder einem Konfokalmikroskop durch (10- oder 20-fache Luftobjektive reichen aus, um eindeutige Ergebnisse zu erzielen). Beim Konfokal zeigt eine Z-Stack-Bildgebung durch etwa ein Viertel der Tiefe (entlang der dorsalen ventralen Achse) des Embryos, ob das markierte Dextran in das Lumen der Luftröhre und des Hinterdarms eingedrungen ist (tiefere Abschnitte oder eine Neuausrichtung der Embryonen mit der ventralen Oberfläche oben ist notwendig, um die Speicheldrüsen zu sehen).
   HINWEIS: Die in Abbildung 3 gezeigten Beispiele wurden mit einem Konfokalmikroskop mit einer HC PL APO 10x/0,4 CS2 Trockenlinse mit einer Laserintensität von 2,0 und einer Verstärkung von 13,6 für den 561 nm Laser aufgenommen. 24 z-Schnitte wurden mit einer z-Schrittlänge von 2,4 nm erhalten (siehe Materialtabelle).
2. Lassen Sie den injizierten Embryo 10 Minuten altern und untersuchen Sie dann das Lumen der Luftröhre, Speicheldrüse oder Hinterdarm auf die Ansammlung des markierten Dextrans. Erfassen Sie den Genotyp und das Stadium jedes Embryos und ob sich markierte Dextran in einem röhrenförmigen Organ anhäuft. Beachten Sie alle Embryonen, in denen der perivitelline Raum ebenfalls stark mit Farbstoff gefärbt ist, da dies Embryonen darstellen können, die versehentlich in diesen Raum injiziert wurden.

Ergebnisse

Die hier vorgestellten Protokolle werden verwendet, um die Organisation und Funktion von pSJs im ektodermalen Gewebe in Drosophila-Embryonen im Stadium 16 zu untersuchen. Diese Protokolle sind nur auf pSJs anwendbar und können nicht zur Abfrage von sSJs verwendet werden. Eine Mutation in einem Gen, die dazu führt, dass andere pSJ-Proteine nicht in der pSJ-Region in Embryonen im Stadium 16 lokalisiert und in Stadium 16 eine okkludierende Verbindung entstehen, befindet sich entweder in ein...

Diskussion

Hier stellen wir ein Protokoll zur Identifizierung von Kern- und Zubehör-pSJ-Proteinen anhand von zwei relativ einfachen Assays vor, die in bescheiden eingerichteten Laboren mit Fluoreszenzmikroskopie-Fähigkeiten durchgeführt werden können. Der erste Test untersucht die molekulare Organisation des pSJ in reifen polarisierten Epitheln mittels konfokaler Bildgebende fixierter mutanter Embryonen. Der zweite Test prüft die Integrität der Okklusionsfunktion des pSJ, indem er farbstoffmarkiert...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Kapillarröhre für Nadeln (Boro 1 x 0,5/Faser)	FHC	30-30-1
Konfokalmikroskop	Leica	Stellaris 5
Abdeckglas 22 x 22 x 22 Zoll Dicke für Injektionen	Fisher Scientific	12-540-B
Abdeckglas 22 x 30 1,5 Dicke für Bildgebung	Corning	2980-233
Kulturröhre zur Immunfärbung (6 x 50 mm)	Fisher Scientific	14-958-A
Embryo-Sammelkäfig	Genesee Scientific	59-100
Fluoreszenzstereomikroskop	Leica	MZ10 F
Halocarbonöl (700)	Genesee Scientific	59-131
Heptan	Fisher Scientific	H350-4
Invertiertes Fluoreszenzmikroskop	Leica	DMi8
Netzkörbe zum Dechorionieren von Embryonen	Genesee Scientific	46-101
Methanol	Fisher Scientific	A412-4
Mikromanipulator	Narishige	MN151
Objektträger mit dem Mikroskop	Fisher Scientific	12-544-2
Nadelzieher	David Kopf-Instrumente	Modell 720
Normales Eselserum	Jackson ImmunoReseaerch	017-000-121
Nylon-Mesh (120 μm)	Genesee Scientific	57-102
Objektiv HC PL FLUOTR 10X/0,32 PH 1	Leica	11506537
Objektivobjektiv HC PL APO 10x/0,40 CS2	Leica	15506407
Objektivobjektiv HC PL APO 40x/1.30 CS2	Leica	15506358
Petriplatten 60 x 15 mm	Corning	351007
Bahnsteig-Kippe	Globe Scientific	GTR-FS
Primärer Antikörper (Coracle)	DSHB	C566.9
Primärer Antikörper (Coracle)	DSHB	C615.16
Primärer Antikörper (E. Cadherin)	DSHB	DCAD2
Primärer Antikörper (Mcr)	Ward-Labor, CWRU	Meerschweinchen polyklonal
Rhodamin als 10 kDa Dextran gekennzeichnet	Molekulare Sonden	D1824
Sekundärer Antikörper (Esel-Anti-Meerschweinchen Cy3)	Jackson ImmunoReseaerch	706-165-148
Sekundärer Antikörper (Esel-Anti-Maus Cy2)	Jackson ImmunoReseaerch	715-225-151
Sekundärer Antikörper (Esel-Antiratte Cy5)	Jackson ImmunoReseaerch	712-175-150
Tischschauspieler	New Brunswick Scientific	C2-Plattformschüttler
Tegosept (Methyl4-Hydroxybenzoat)	TCI	H0216
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151500
Phiolen zur Fixierung (20 ml WHEATON flüssige Szintillationsphiolen)	Fisher Scientific	03-341-73C
Whatman 3MM  Chromatographie-Papier	Fisher Scientific	05-716-6H
Fliegenstock	Voll-Genotyp	Bestand Nummer	Quelle
cor4	w*; P{neoFRT}43D cora4/CyO	52232	BDSC
W1118	w[1118]	5905	BDSC
Lösung	Rezept
10x PBS	Mische 90 g NaCl, 20 g Na2HPO4 und 8,3 g NaH2PO4.H2O und dH20 zu 1 L. Filtersterilisieren. Verdünne auf 1X mit dH2O für Waschschritte bei der Immunfärbung.
10% Triton X-100 Lösung	Mische 1 ml Triton X-100 bis 9 ml dH2O auf einem Plattform-Rocker, bis es aufgelöst ist. Lagern Sie bei Zimmertemperatur.
50 % Bleichmittel	Mischen Sie 10 ml kommerzielles Bleichmittel (7,5 % Natriumhypochlorit) mit 10 ml Wasser, bevor die Embryonen entchorioniert werden.
Apfelsaftteller	Kochen Sie 15 g Drosophila-Agar in 725 ml dH2O. Fügen Sie 25 g Zucker und 250 ml Apfelsaft hinzu und rühren Sie sie bis zum Pürieren. Die Lösung auf 55 °C abkühlen lassen, dann 1,3 g Tegosept hinzufügen und vorsichtig rühren. Gieße sie in 60 x 15 Petriteller und lasse sie abkühlen. Lagere bei 4 °C.
Blockierungslösung	Mische 9,8 ml 1x PBS mit 100 μl 10% Triton X-100 und 100 μl Normal Donkey Serum in einem 15-fachen konischen Rohr.
Embryo-Waschlösung	Stellen Sie eine 10-fache Embryo-Waschlösung her, indem Sie 70 g NaCl und 2 ml Triton X-100 auf 1 L dH2O mischen. Verdünne auf 1X mit dH2O für eine funktionierende Lösung.
Fix	Erhitze 10 ml 1x PBS in der Mikrowelle vor. Fügen Sie 0,4 g  hinzu; aus Paraformaldehyd und Pipet zum Mischen. Füge 10 μl 14N NaOH hinzu, um die Auflösung zu beschleunigen. Auf einen 90-C-Heizblock legen, bis er sich auflöst. Sobald kein festes Paraformaldehyd mehr übrig ist, fügen Sie 10 μl 14N HCL hinzu, um den pH-Wert auf neutral zu stellen. Trage immer einen Laborkittel, Handschuhe und eine Brille, wenn du Paraformaldehyd verwendest.
Montagemedien	Mischen Sie 9 ml Glycerol und 1 ml 1 ml 1M Tris Basis-pH-Wert 8,0. Fügen Sie 0,05 g n-Propylgallat hinzu, oon; Mischen und erhitzen, damit es sich auflöst. Aliquot 0,5 ml in Eppendorf-Röhren.
Rhodamin-Dextran-Lösung	Frische Farblösung herzustellen, indem man Rhodamin-markiertes 10 kDa Dextran auf 1 mg/ml in 0,5 M Natriumphosphat, pH 7,5 und 5 mM Kaliumchlorid auflöst.
Hefepaste	Mische 50 g kommerzielle Hefe (Red Star) mit einer Prise Saccharose und genug Wasser, um eine dicke Paste zu machen. Lagere bei 4 °C.