Methodenartikel

Echtzeitvisualisierung des Einflusses von Nährstoffmedien auf die Entwicklung von Biofilmen von Pseudomonas aeruginosa mittels eines mikrofluidischen Systems

DOI:

10.3791/69997

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15. Mai 2026

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1School of Mechanical, Aerospace and Civil Engineering, University of Sheffield, 2School of Chemical, Materials and Biological Engineering, University of Sheffield

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieses Protokoll bewertet den Einfluss von reichhaltigen (TSB) und minimalen (FAB) Nährstoffmedienzusammensetzungen auf die Entwicklung von Biofilmen von Pseudomonas aeruginosa PAO1 und PA14 in einer stationären Strömungsumgebung in einem Mikrokanal.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Das pathogene Bakterium Pseudomonas aeruginosa ist eine Hauptursache zahlreicher nosokomialer Infektionen, und seine wachsende antimikrobielle Resistenz stellt eine erhebliche Bedrohung für die öffentliche Gesundheit dar. Dieser Artikel stellt ein umfassendes Protokoll vor, das die Verwendung eines mikrofluidischen Systems zur Echtzeitvisualisierung und Quantifizierung der Biofilmentwicklung in zwei zentralen P. aeruginosa-Stämmen , PAO1 und PA14, beschreibt. Die Methode verwendet optisch transparente, mehrkanalige Mikrokanalplatten, um Bakterienkulturen einem kontinuierlichen, stetigen Medienfluss auszusetzen, einschließlich tryptischer Sojabrühe (TSB) oder modifizierter minimaler anaerober Brühe (FAB) mit unterschiedlichen Kohlenstoffquellenkonzentrationen, wodurch die Bedingungen in klinischen Umgebungen nachgeahmt werden. Über einen Zeitraum von 24 Stunden erfasst automatisierte Echtzeitbildgebung das Wachstum und die Reifung von Biofilmen in Form von Biofilmoberflächenabdeckung, Dicke und Oberflächenrauheit auf hochreproduzierbare Weise. Das experimentelle Ziel ist es, die Ergebnisse zu nutzen, um zu zeigen, dass die Biofilmbildung beider Stämme durch Veränderungen der Zusammensetzung der Nährstoffmedien signifikant beeinflusst wird. Das Ziel dieses visualisierten Protokolls ist es, Forschenden eine Methode bereitzustellen, Biofilmdynamiken unter stabilen laminaren Strömungsbedingungen zu untersuchen, und die gewonnenen Erkenntnisse könnten genutzt werden, um alternative, nicht-antimikrobielle Strategien zur Eliminierung von frühstufigen P. aeruginosa-Biofilmen in nosokomialen Umgebungen zu entwickeln.

Einleitung

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Ziel dieser Methode ist es, den Einfluss zweier verschiedener Kulturmedien, nämlich tryptischer Sojabrühe (TSB) und modifizierter minimaler anaerober Brühe (FAB), auf das Biofilmwachstum zweier Pseudomonas aeruginosa-Stämme , nämlich PAO1 und PA14, zu beobachten. Obwohl P. aeruginosa PAO1 und PA14 beide gängige Laborreferenzstämme sind, infiziert der PA14-Stamm einen größeren Anteil der Wirte von Pflanzen bis zu Wirbellosen1. Die TSB-Nährstoffbrühe ist ein Allzweckkulturmedium mit 2,5 g/L Glukose als Kohlenstoffquelle und kann aufgrund ihrer Zusammensetzung aus Kasein- und Sojapeptonen für organischen Stickstoff und natürliche Zuckerversorgung sowie Natriumchlorid zur Aufrechterhaltung des osmotischen Gleichgewichts2 eine breite Palette von Bakterien kultivieren. Das minimale FAB-Medium hingegen wird mit minimalen Konzentrationen (50-fache Reduktion) einer einzelnen Kohlenstoffquelle bei Konzentrationen von 0,05 g/L formuliert, um den Wachstumsbedarf anaeroben Bakterien zu untersuchen. Sowohl die PAO1- als auch die PA14-Dehnungen wurden einer unidirektionalen, laminaren Strömung ausgesetzt, was zu einer niedrigen Wandscherspannung von 0,01 Pa führte. Dieser Scherspannungswert ist häufig an von P. aeruginosa besiedelten Stellen vorhanden, einschließlich der Bronchien von Mukoviszidose-Patienten und im Magen-Darm-Trakt. Das Biofilmwachstum wurde über einen Zeitraum von 24 Stunden gemessen, indem die Echtzeit-Biofilm-Oberfläche, die Dicke und der arithmetische Mittelwert der Oberflächenrauheit in Echtzeit bewertet wurden.

Biofilme von P. aeruginosa sind für einen erheblichen Prozentsatz der nosokomialen Infektionen verantwortlich und eine der häufigsten Todesursachen bei Menschen mit Mukoviszidose 3,4,5. Frühere Untersuchungen zur Auswirkung von Kohlenstoffquellen auf die Entwicklung bakterieller Biofilme haben die entscheidende Rolle des hydrodynamischen Flusses während der Biofilmentwicklung vernachlässigt, Scherspannungswerte verwendet, die nicht repräsentativ für die Infektionsstellen von P. aeruginosa sind, oder nach dem Experiment nur Biofilm-kinetische und morphologische Analysen durchgeführt 6,7. Diese Einschränkungen werden in dieser Methode durch die Verwendung von Echtzeitbildgebung der Biofilmentwicklung unter stationären Flussbedingungen innerhalb eines mikrofluidischen Kanals behoben, der physiologische Umgebungen bei Mukoviszidose-Patienten eng nachahmt.

Diese Methode bietet erhebliche Vorteile gegenüber alternativen Techniken, die zur Untersuchung der Biofilmentwicklung verwendet werden. Die Anwendung der Echtzeitbildgebung während der 24-stündigen Biofilm-Wachstumsphase stellt sicher, dass der entwickelnde Biofilm ungestört bleibt, da keine Trocknung oder chemische Veränderungen erforderlich sind, was Veränderungen seiner Zusammensetzung vermeidet und repräsentativere Ergebnisse liefert als Methoden, die Probenmanipulationerfordern 8. Zusätzlich repliziert dieses Verfahren durch die Anwendung stabiler hydrodynamischer Strömungsbedingungen und die Variation der Kohlenstoffquellenkonzentrationen über eine große Größenordnung die physiologischen Umgebungen an Stellen von P. aeruginosa nosokomialen Infektionen genauer. Dies macht sie zu einer repräsentativeren Methode im Vergleich zu statischen Assays wie 96-Well-Mikrotiterplatten oder Coupons, die den kritischen Einfluss des Flüssigkeitsflusses auf die Biofilmentwicklungnicht erfassen.

Das verwendete mikrofluidische Gerät wurde speziell gewählt, da seine Abmessungen denen der Lunge ähneln, wie Bronchiolen undBronchien 12. Darüber hinaus sind P. aeruginosa-Infektionen ein großes Problem für Patienten mit schweren Brandwunden, bei denen der Blutzuckerspiegel deutlich vom Normalbereichvon 13,14 abweichen kann.

Obwohl dieses Protokoll speziell zwei Stämme von P. aeruginosa verwendet, ist die Methode auch für Untersuchungen der frühen Entwicklung anderer Bakterien anwendbar, die Infektionen verursachen oder Gebiete unter ähnlichen Bedingungen besiedeln. Zusätzlich könnten auch andere Zusammensetzungen von Nährstoffmedien sowie Strömungsbedingungen (z. B. pulsierende und oszillierende Strömungen oder höhere Wandscherwerte) mit derselben Methodik untersucht werden.

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Protokoll

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1. Glasbeirrreinigung

  1. Tauchen Sie zwei 200-ml-Glasflaschen für Medien und Agar sowie drei 1-Liter-Glasflaschen in ein 10%iges Salzsäurebad (HCl) für etwa 5 Minuten bei Raumtemperatur.
    VORSICHT: Salzsäure ist ätzend. Führen Sie alle Säurehandhabungen in einer chemischen Abzugshaube durch, während Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung tragen (Laborkittel, Handschuhe und Augenschutz).
  2. Anschließend nehmen Sie das Glas aus dem HCl-Bad und spülen Sie zweimal mit Leitungswasser und einmal mit destilliertem Wasser (dH2O).

2. Tryptische Sojabrühe-Medienzubereitung

  1. Bereite die TSB-Lösung vor, wiege 6 g/200 ml TSB-Pulver mit einem sauberen Wiegeboot und einer Präzisionswaage.
    HINWEIS: Die Zusammensetzung des verwendeten TSB-Pulvers ist wie folgt: Dextrose (2,5 g∙L-1), Dikaliumphosphat (2,5 g∙L-1), Pankreasverdauung von Kasein (17 g∙L-1), Papaic-Verdauung von Sojamehl (3,0 g∙L-1) und Natriumchlorid (5,0 g∙L-1).
  2. Messen Sie 200 ml dH2O mit einem Messzylinder ab und gießen Sie es in eine der zuvor gereinigten Glasflaschen.
  3. Gib die 6 g TSB in die saubere Glasflasche mit 200 ml dH2O, verschließe die Flasche fest und rühre etwa 2 Minuten lang, um das Pulver aufzulösen und so das TSB-Lösungsmedium zu erzeugen.
  4. Autoklav-TSB-Medienlösung für 15–20 Minuten bei einer Temperatur von 121 °C und einem Druck von 1,5 atm, um die Lösung zu sterilisieren.
    Hinweis: (PAUSENPUNKT) TSB-Lösung kann zwischen den Nutzungen bei Raumtemperatur (ca. 20 °C) gelagert und für zukünftige Experimente verwendet werden.

3. Sorgfältige anaerobe Zubereitung des Brühenmediums

  1. Bereiten Sie eine Spurenmetalllösung für das FAB-Medium vor.
    1. Verwenden Sie separate, saubere Waagboote und einen Pfannenwender sowie eine Präzisionswaage beim Gewichten von Massen zwischen 0,5–210 g und eine Analysewaage beim Wägen von Massen zwischen 0,001–0,5 g. Messen Sie folgende Komponenten und deren Mengen ab: CaSO4,2H 2O (200 mg∙L-1), FeSO4,7H 2O (200 mg∙L-1), MnSO4. H2O (20 mg∙L-1), CuSO 4,5H2O (20 mg∙L-1), ZnSO4,7H 2O (20 mg∙L-1), CoSO4,7H 2O (10 mg∙L-1), NaMoO4. H2O (10 mg∙L-1) und H3BO3 (5 mg∙L-1)7,9.
    2. Geben Sie jede der Komponenten in eine 1-Liter gereinigte Glasflasche mit 1 L dH2O und vermischen Sie gründlich mit dem dH2O.
    3. Gib jeweils 1 ml der Mischung zu jeder der beiden verbleibenden 1-Liter-Glasflaschen mit 1 Liter dH2Ound vermische gründlich.
  2. Bereite 20 mM mit Natriumcitrat ergänzte FAB für Übernachtkulturen vor
    1. Messen Sie die folgenden Komponenten und deren Mengen mit separaten, sauberen Waagbooten und einem Spatel ab, einer Präzisionsbilanz beim Abwägen von Massen zwischen 0,5–200 g und einer analytischen Waage beim Abwägen von Massen zwischen 0,001–0,5 g: Natriumcitrat (20 mM), (NH4)2SO4 (2 g∙L-1), Na2HPO 4,2H 2O (6 g∙L-1), KH2PO4 (3 g∙L-1), NaCl (3 g∙L-1), MgCl2 (93 mg∙L-1) und CaCl2 (11 mg∙L-1)7,9.
    2. Fügen Sie alle Komponenten in eine der verbleibenden 1-Liter-Sterilisationsglasflaschen mit 1 Liter dH2O und 1 ml Spurmetalllösung hinzu.
    3. Gründlich mischen.
  3. Bereiten Sie 0,3 mM glukose-supplementierte FAB für das Biofilmwachstum vor.
    1. Ersetzen Sie die 20 mM Natriumcitrat durch 0,3 mM Glukose. Verwenden Sie die gleichen Komponenten und Massen wie in Schritt 3.2.1.
    2. In der verbleibenden gereinigten 1-Liter-Glasflasche geben Sie die 0,3 mM Glukose-FAB-Komponenten zu 1 ml dH2Omit 1 ml Spurenmetalllösung und mischen Sie gut.
  4. Autoklaven 15–20 Minuten bei einer Dampftemperatur von 121 °C und einem Druck von 1,5 atm, um das Medium zu sterilisieren.
    Hinweis: (PAUSENPUNKT) FAB-Mediumlösung kann zwischen den Nutzungen bei Raumtemperatur (ca. 20 °C) gelagert und für zukünftige Experimente verwendet werden.

4. TSB-Agar-Zubereitung

  1. Messen Sie 8 g/200 mL TS-Agar mit der Präzisionswaage ab und wachen Sie Boote und Pfannenwender.
  2. Messen Sie 1 g/200 ml bakteriologischen Agar auf einem separaten Wiegeboot mit derselben Präzisionswaage ab.
  3. Mit einem Messzylinder messen Sie 200 ml dH2O ab und gießen Sie es in die endgültige, zuvor gereinigte Glasflasche.
  4. Gieße beide Agar-Komponenten in die 200 mL dH2O und mische sie gut.
  5. Autoklaven für 15–20 Minuten bei einer Temperatur von 121 °C und einem Druck von 1,5 atm, um das Medium zu sterilisieren.
    HINWEIS: (PAUSENPUNKT) TSB-Agar kann zwischen den Nutzungen bei Raumtemperatur (ca. 20 °C) gelagert werden und muss vor der Verwendung in zukünftigen Experimenten erneut erhitzt werden.

5. Petrischale Pseudomonas Aeruginosa-Kultivierung

  1. Agar etwa 5 Minuten in der Mikrowelle schmelzen lassen, bis die Lösung flüssig ist.
  2. Öffnen und desinfizieren Sie eine Klasse-II-Sicherheitsschrankoberfläche mit einer 70%igen Ethanollösung, die einsatzbereit ist. Führen Sie alle unten aufgeführten Schritte in diesem Abschnitt in diesem Sicherheitsschrank der Klasse II durch.
  3. Messen Sie 25 ml Agarlösung in ein 50-ml-Fläschchen ab und gießen Sie es in eine 90-mm-Petrischale, und warten Sie, bis der Agar fest ist.
  4. Tiefkühlbrühe von P. aeruginosa PAO1 und PA14 aus dem -80 °C Gefrierschrank abholen. Lagern Sie die Bestände etwa 5 Minuten lang bei 37 °C in den Inkubator oder bis der Inhalt vollständig aufgetaut ist.
  5. Tauchen Sie die Impfschleife in einen der aufgetauten P. aeruginosa-Bestände und verteilen Sie die Probe über den Agar.
  6. Wiederholen Sie Schritt 5.5 für den anderen P. aeruginosa-Stamm , wodurch zwei separate P. aeruginosa-Petrischalenkulturen entstehen, eine mit dem PAO1-Stamm und die andere mit dem PA14-Stamm.
  7. Beschrifte jede Petrischale mit dem Stamm von P. aeruginosa , dem Wiederbelebungsdatum und den Initialen und lege sie dann für 16–18 Stunden bei 37 °C in den Inkubator.
    Hinweis: (PAUSENPUNKT) P. AERUGINOSA PAO1 und PA14 Petrischalen können bei 4 °C für eine Lagerdauer von bis zu 4 Wochen gelagert und für zukünftige Experimente verwendet werden.

6. Pseudomonas aeruginosa PAO1 und PA14 Glycerolbestände

  1. Öffnen und desinfizieren Sie einen Klasse-II-Sicherheitsschrank für den Gebrauch, wählen Sie acht 50-ml-Fläschchen aus, um die Übernachtkulturen zu enthalten.
  2. Mit dem zuvor hergestellten TSB und Natriumcitrat FAB-Medien (Abschnitt 3) gibst du 5 ml TSB-Medium in vier der acht Phiolen und das Natriumcitrat-Minimal-FAB-Medium in die verbleibenden vier.
  3. Mit den zuvor inkubierten Petrischalen und einer Impfschleife berühren Sie fünf verschiedene Kolonien in der P. aeruginosa PAO1 Petrischale und geben Sie sie in eine der TSB-Phiolen um. Wiederholen Sie dies für das Natriumcitrat-FAB-Medium und für die P. aeruginosa PA14-Sorten-Petrischale.
  4. Tauchen Sie eine saubere Inokulationsschleife direkt in die verbleibenden vier TSB- und Natriumcitrat-FAB-Medienphiolen ein und bilden Sie Kontrollen.
  5. Inkubieren Sie alle acht Phiolen 16–18 Stunden in einem schüttelnden Inkubator bei 200 U/min und 37 °C und beschriften Sie sie deutlich.
  6. Holen Sie die Kulturphiolen ab, stellen Sie sicher, dass die mit P. aeruginosa impften Trüben sind und die als Kontrollen verwendeten sauber bleiben.
  7. Zentrifugiere die vier mit P. aeruginosa impften Fläschchen bei 4000 × g für 5 Minuten bei 20 °C, um die P. aeruginosa vom Kulturmedium zu trennen. Stellen Sie sicher, dass die Zentrifuge im Gleichgewicht ist.
  8. Ignorieren Sie den Überstandsstoff und suspendieren Sie das P. aeruginosa-Pellet nach der Zentrifugation mit 1 ml Lösung mit 15 % Glycerol, 150 μL Glycerol und 850 μL frischem TSB oder Natriumcitrat FAB-Medien.
  9. Umgespülte Kulturen in 1-ml-Phiolen und in den -80 °C Gefrierschrank legen.
    HINWEIS: (Pausenpunkt) Glycerolbestände können bei -80 °C für die Langzeitlagerung gelagert und für zukünftige Experimente verwendet werden.

7. Messung der optischen Dichte von Übernachtkulturen

  1. Wiederholen Sie die Schritte 6.1–6.5 nur für zwei TSB-Mittelphiole, wobei eine als Kontrolle und die andere mit dem PAO1 P. aeruginosa-Stamm dient.
  2. Pipettieren Sie 1 ml TSB-Medium in ein 1-mL Spektrophotometer-Ampullchen in einem Sicherheitsschrank der Klasse II und übertragen Sie 0,9 ml TSB-Medium in das zweite Fläschchen, ergänzt durch 0,1 ml der Übernachtkultur.
  3. Stellen Sie das Spektrophotometer auf eine Lichtwellenlänge von 600 nm ein und messen Sie mit dem 1-mL-TSB-Spektrophotometer-Fläschchen zur Kalibrierung der Maschine die optische Dichte des 0,1-mL-Aufhängungsfläschchens15.
    1. Wenn die gemessene Absorption nicht 0,1 anzeigt, wird das benötigte Aufhängungsvolumen neu berechnet.
      HINWEIS: Das für eine Absorptionsmessung von 0,1 (V1) benötigte Suspensionsvolumen kann anhand der anfänglichen 0,1 mL Suspension Vial Absorptionsmessung C1, der gewünschten Absorptionskraft, auf die die Federung eingestellt wird, C2 und dem gewünschten Volumen der konzentrierten Übernachtsuspension, V2, berechnet werden:
      C1V1 = C2V2
      Im obigen Beispiel gilt: Wenn C1 = 3,59, C2 = 0,1 und V2 = 10 mL gilt, beträgt das gewünschte Volumen der nächtlichen Aufhängung 0,279 mL in einer 10-mL-Lösung.
  4. Messen Sie 10 ml TSB-Medium in ein 50-ml-Fläschchen ab und entfernen Sie das gleiche Volumen TSB-Mediums wie das Volumen der Aufhängung, das für eine 10 mL 0,1 OD 600 nm Federung benötigt wird. Mit der Übernachtkultur geben Sie das berechnete Suspensionsvolumen und den Wirbel für etwa 5 Sekunden zum Mischen hinzu.
  5. Übertragen Sie 1 ml der 10 mL eingestellten Suspension in ein Spektrophotometer-Fläschchen und messen Sie die Absorption erneut, um sicherzustellen, dass sie 0,1 beträgt.
  6. Wiederholen Sie die oben genannten 7,1–7,5 für PA14 und TSB-Medium sowie für beide P. aeruginosa-Stämme und das Natriumcitrat-FAB-Medium.

8. Zahl lebensfähiger Zellen

  1. Übertragen Sie dH2O in eine quadratische Petrischale innerhalb eines Sicherheitsschranks der Klasse II und verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um 180 μL in die Säulen 2–9 einer klaren 96-Well-Polystyrolplatte16 zu übertragen.
  2. Übertragen Sie die 10 mL 0,1 OD 600 Suspension in eine separate quadratische Petrischale und übertragen Sie mit der Mehrkanalpipette 200 μL der Suspension in Säule 1 der 96-Well-Polystyrolplatte.
  3. Übertragen Sie über 20 μL Suspension mit der Mehrkanal-Pipette von Säule 1 der 96-Well-Polystyrolplatte in Kanal 2, gefolgt von der Übertragung von 20 μL verdünnter Suspension in Kanal 2 auf Kanal 3, Wiederholung auf Kanal neun, wodurch Suspensionsverdünnungen von 10-1 auf 10-8 entstehen.
  4. Geben Sie 50 ml TS-Agar (Abschnitt 4 und Schritt 5.1) in einem Sicherheitsschrank der Klasse II mit einem Fläschchen in eine quadratische Petrischale und lassen Sie es stehen, bis der Agar trüb wird.
  5. Übertragen Sie 10 μL von jedem der Brunnen entlang der Säulen 2–9 in einer Säulenformation auf die TS-Agar-Petrischale mit einer Mehrkanalpipette, wobei sichergestellt wird, dass die Säulen nicht miteinander in Kontakt kommen.
  6. Inkubieren Sie TS-Agar 24 Stunden bei 37 °C, nachdem Sie gewartet haben, bis die übertragenen Verdünnungen eingeklungen sind.
  7. Berechnen Sie die koloniebildenden Einheiten (CFU) pro Milliliter (mL), indem Sie bestimmen, ob die Petrischale abzählbar ist (zwischen 30 und 300 Kolonien).
  8. Bestimmen Sie den Verdünnungsfaktor der verwendeten 10-mL-Federung; in diesem Fall wurde die Federung auf 1/10 (0,1 OD 600) verdünnt.
  9. Berechnen Sie die individuellen Verdünnungsfaktoren jeder beschichteten Säule. Dies ist die Menge der verdünnten Suspension, die jeder Säule hinzugefügt wird, geteilt durch das Gesamtvolumen der Säule, nachdem die Federung hinzugefügt wurde. Im Fall von Spalte 2 der 96-Well-Platte (Spalte 1 der Petrischale) gilt 20 μL/200 μL = 1/10.
  10. Berechnen Sie den Gesamtserienverdünnungsfaktor, indem Sie die einzelnen Verdünnungsfaktoren jeder einzelnen Spalte miteinander multiplizieren.
    HINWEIS: In diesem Fall, da 20 μL von jeder Säule in die nächste übertragen wurden, sodass das Gesamtvolumen jeder Spaltenbrunnen 200 μL betrug, betrug jede einzelne Serienverdünnung 1/10. Dadurch beträgt die Gesamtverdünnung der Serie 1 × 10-8.
  11. Bestimmen Sie den Verdünnungsfaktor der Beschichtung, während die Verdünnung von der 96-Well-Platte auf die Petrischale übertragen wird. Um CFU/mL zu bestimmen, teilen Sie das Volumen jeder verschichteten Säule (10 μL) durch 1 mL. In diesem Fall: figure-protocol-1.
  12. Bestimmen Sie den Endverdünnungsfaktor, indem Sie den ursprünglichen Suspensionsverdünnungsfaktor (0,1) mit dem Gesamtserienverdünnungsfaktor (1 × 10-8) und dem Verdünnungsfaktor der Beschichtung (figure-protocol-2) multiplizieren.
  13. Berechnen Sie die CFU∙mL-1 in der ursprünglichen Probe und multiplizieren Sie die CFU auf der Platte mit dem Inversen des Endverdünnungsfaktors.
    HINWEIS: Wenn 200 CFU gezählt werden, bedeutet das, 200 × 1/1 × 10-8 durchzuführen, was dazu führt, dass die CFU/mL 2 × 1010 CFU∙mL-1 17 beträgt.

9. Aufbau und Versuchslauf mikrofluidischer Systeme

  1. Inokulieren Sie 5 ml Brühe aus Kulturmedium mit jedem Stamm von P. aeruginosa , um eine Übernachtkultur zu bilden, und inkubieren Sie 16–18 Stunden bei 37 °C.
  2. Richte das mikrofluidische System und die zugehörige Software ein.
    1. Aktivieren Sie die Komponenten des mikrofluidischen Systems in folgender Reihenfolge: Stromversorgung, mikrofluidischer Systemcontroller, CMOS-Kamera, Gehäuseheizungen, Mikroskop, Computer und zugehörige Monitore.
    2. Aktivieren Sie die mikrofluidische Software und starten Sie die begleitende Steuerungsmodulschnittstelle, indem Sie den 48-Well-0–2 Pa Multikanal-Platten-assoziierten Barcode eingeben, der sich auf der Seite der Multikanalplatte befindet.
  3. Stellen Sie das Inokulationsverfahren für P. aeruginosa Multikanal-Plattenbrunnen ein.
    1. Passen Sie die optische Dichte der Übernachtkultur auf 0,1 OD600 an.
    2. Übertragen Sie 50 μL 0,1 OD 600 Suspension parallel in den Auslassschacht jedes der sechs Kanäle in einem Sicherheitsschrank der Klasse II.
      HINWEIS: Sechs Kanäle wurden gleichzeitig parallel betrieben, um die Wahrscheinlichkeit einer anomalen Ergebnisidentifikation zu maximieren.
    3. Ersetzen Sie die 48-Wellen-Mehrkanalplattenabdeckung und übertragen Sie sie auf die bewegliche Stufe im Systeminkubator und sichern Sie sie.
  4. Stellen Sie das Verfahren zur Impfung des P. Aeruginosa-Mehrkanal-Plattenkanals ein.
    1. Säen Sie die mikrofluidischen Kanäle mit dem Steuermodul des mikrofluidischen Systems aus, indem Sie auswählen: Manual > Spalten 1–4 > Fluid: TSB bei 37 °C > maximale Scherung (Pa): 0,1 (1 dyne∙cm-2 = 0,1 Pa) und wählen Sie einen Auslassbrunnen des 48-Bohrlochs 0–2 Pa Multikanalplattendiagramms aus.
    2. Wähle den Abbruchknopf , um den Fluss nach 2–4 Sekunden zu stoppen, und lass die Platte 30 Minuten stehen, um sicherzustellen, dass die Zellen vor Beginn des kontinuierlichen Flusses am Kanalsubstrat anheften.
      HINWEIS: Eine Dauer von 30 Minuten ermöglicht es der Gravitationskraft, die planktonischen P. aeruginosa-Bakterien an der unteren Kanalwand zu binden. Diese Zeit variiert je nach Bakterie und Art des Nährstoffmediums.
    3. Entfernen Sie die Mehrkanalplatte aus der beweglichen Inkubatorstufe und leiten Sie 1 ml frisches TSB in den Einlassschacht jedes der sechs Kanäle in einem Sicherheitsschrank der Klasse II.
    4. Übertragen Sie die Mehrkanalplatte auf die bewegliche Stufe im Inkubator und sichern Sie sie an Ort und Stelle.
  5. Richte AutoRun ein.
    1. Stellen Sie sicher, dass der während der 24-Stunden-Experimente verwendete Durchfluss relevant für den natürlichen Vorkommen von P. aeruginosa ist, indem Sie manuell > Scherspannung: 0,01 Pa navigieren und die angezeigte Volumendurchflussrate (μL⋅h-1) aufzeichnen. Stellen Sie sicher, dass dieser Wert für die 48-Well-Mikrokanalplatte 8,2 μL⋅h-1 ist.
    2. Man rechnet die Volumenmenge in m3∙s-1 um, berechnet die Kanalquerschnittsfläche (m2) und berechent die Strömungsgeschwindigkeit bei einer hydrodynamischen Scherspannung von 0,01 Pa.
      HINWEIS: Durch Verwendung und Neuanordnung der Gleichung für die Flüssigkeitsvolumenflussrate kann die Flüssigkeitsgeschwindigkeit durch den Kanal berechnet werden:
      figure-protocol-3
      Dabei ist U die Flüssigkeitsgeschwindigkeit (m∙s-1) und A die Mikrokanal-Querschnittsfläche (m2) der Kanäle in der Mehrkanalplatte.
    3. Berechnen Sie die Strömungs-Reynolds-Zahl anhand der Dichte, ρ und der dynamischen Viskosität, μ, des TSB-Mediums und stellen Sie sicher, dass P. aeruginosa-Biofilme innerhalb eines Fluidflussbereichs gefunden werden. Für eine hydrodynamische Scherspannung von 0,01 Pa ist sicherzustellen, dass die Reynold-Zahl für TSB- bzw. FAB-Medien 0,0117 bzw. 0,0165 beträgt. Wenn Sie außerhalb dieses Bereichs liegen, überprüfen Sie, ob die Flüssigkeitsbedingungen auf TSB eingestellt sind.
      figure-protocol-4
      Wobei Dh der hydraulische Durchmesser des verwendeten Mikrokanals ist, ermittelt mit:
      figure-protocol-5
      Wobei w und h die Breite (m) und Höhe (m) des verwendeten Mikrokanals darstellen.
    4. Berechnen Sie die Flüssigkeitsentwicklungslänge, um sicherzustellen, dass der Flüssigkeitsfluss im Bildaufnahmebereich vollständig entwickelt ist.
      HINWEIS: Die Entwicklungslänge für laminare Flüssigkeit durch einen Kanal kann mit der Reynolds-Zahl Re und dem hydraulischen Durchmesser der Kanäle, Dh, berechnet werden:
      Ldev = 0,06ReDh
    5. Richte das Autorun ein: AutoRun bearbeiten > Protokollaufbau > Zeitdauer: 24 H, mit einer Wiederholung von 1 und einer Scherspannung von 0,01 Pa. Speichere das Protokoll.
    6. Erstellen Sie eine neue Sequenz im Reiter Sequence Setup , indem Sie das neu erstellte Protokoll mit einer Wiederholung auf die Kanäle 1–6 anwenden und Flüssigkeit auswählen: TSB bei 37 °C. Speichere diese Sequenz.
  6. Richten Sie die Bildaufnahme über das Multidimensionale Aufnahmefenster ein.
    1. Wählen Sie mit der Systemsoftware die Mehrdimensionale Erfassung aus, dann die Live-Taste (unten links im Fenster Mehrdimensionale Erfassung ). Navigieren Sie durch die Mikroskopstufe, um die Kanäle 1–6 mit der Live-View-Taste und den Kameravergrößerungen von 5× bis 40× auf dem Touchscreen des Mikroskops anzuzeigen, wobei jeweils ein Kanal im Kamerafeld angezeigt wird.
    2. Bereiten Sie die Kamera auf die Bildaufnahme vor: Mehrdimensionale Erfassung > Speichern: Wählen Sie ein Verzeichnis aus, in das die zu speichernden Bilder gespeichert werden > Zeitraffer: Dauer: 24 st, gleiche Dauer wie der hydrodynamische Fluss > Zeitintervall: Zeit zwischen jedem aufgenommenen Bild, auf 10 Minuten eingestellt.
    3. Geben Sie die Kameraeinstellungen ein, indem Sie Wellenlänge > Beleuchtung auswählen. Hellfeld: Hellfeld 50 % Kamera: 50 %: Schwarzweiß > Automatikbelichtung: jede Aufnahme > Aufnahme: jeden Zeitpunkt > Autofokus: nie.
    4. Bestimmen Sie die Kamerapositionen, um die Biofilmbilder aufzunehmen, indem Sie die Vergrößerung auf 20× stellen, wodurch ein Sichtfeld mit den Abmessungen 665,6 μm × 665,6 μm erzeugt wird, und navigieren Sie zur Mitte des Kanal-Sichtbereichs, wo die Kanalnummer in der Mitte eingraviert wird.
    5. Füge die Bühnenposition hinzu, damit sie von der Kamera erfasst wird, navigiere zur Bühnenbeschriftung und wähle die Hinzufügenstaste, um sie dem Verzeichnis hinzuzufügen.
      1. Wiederholen Sie dies für Upstream-Punkte 0,9984 mm und Downstream-Punkte 3,0016 mm vom Einlass des Kanal-Viewing-Bereichs entfernt, wobei die Position den Mittelpunkt des Kamerasichtfelds darstellt.
        HINWEIS: Diese Bildpositionen wurden ausgewählt, um Darstellungen des Biofilmwachstums entlang des Betrachtungsbereichs zu liefern und gleichzeitig sicherzustellen, dass der Fluss im Inneren vollständig entwickelt wird. Dies führt dazu, dass für jeden Mikrokanal drei Bilder aufgenommen werden, was in diesem Fall zu 18 Bildern alle 10 Minuten führt.
  7. Durchführen von experimentellen Läufen
    1. Im Systemsteuerungsmodul-Fenster wählen Sie AutoRun > Run Setup > Sequence: Wählen Sie die erstellte 0,01 Pa-Sequenz und wählen Sie dann Start.
    2. Direkt danach navigiere zum Fenster Multidimensionale Erwerbung > Erwerben. Damit beginnt die Aufnahme der 18 Bilder alle 10 Minuten des 24-stündigen experimentellen Verfahrens, wodurch 2610 Bilder entstehen, wenn das Experiment endet.
      HINWEIS: Der obige Abschnitt wurde über weitere sechs Mikrokanäle etwa 48 Stunden nach dem ersten Experiment unter identischen Bedingungen reproduziert.

10. Z-Stack-Akkumulation

  1. Am Ende jedes experimentellen Durchlaufs wählen Sie drei Kanäle aus und erhalten Sie Z-Stapel aus drei Abschnitten entlang dieser mit 40× Vergrößerung, indem Sie die Multidimensionale Erfassung > Main öffnen: Alle Optionen außer 'Z-Serie' deaktivieren.
  2. Navigiere zu Z-Serie, nachdem ein Abschnitt entlang eines Kanals im Multidimensionalen Erwerb ausgewählt wurde, und ändere > Interaktiven Einstellungen: Inkrement: 0,5 und entkreuze beide Kästchen.
  3. Benutze den Fokussierknopf des Mikroskops und drehe ihn so lange, bis der Biofilm unscharf wird, und gib die Z-Distanz ein, indem du Set Top To Current wählst. Wiederholen Sie dieses Verfahren, aber indem Sie den Fokussierknopf in die entgegengesetzte Richtung drehen und Unten auf Strom setzen. Dadurch erhält das Mikroskop die Reichweite, um den Z-Stack zu erfassen.
  4. Wähle einen Ordner im Speicherfenster aus, um den z-stack zu speichern, und wähle unten rechts im Fenster Erwerben , um die Erfassung zu starten.

11. Nachverlaufsbild und Datenanalyse

  1. Beziehen Sie Daten zur Abdeckung von Biofilm-Prozentflächen.
    1. Laden Sie die aufgenommenen Bilder in die Systemsoftware, indem Sie wählen: Analysewerkzeuge > Mehrdimensionale Daten prüfen > Basisdatei auswählen > Verzeichnis auswählen: Navigieren Sie zu und wählen Sie den Ordner mit den gespeicherten Bildern > Ansicht > Wellenlänge 1 und klicken Sie im zentralen Quadratbereich horizontal die Anzahl der aufgenommenen Bilder mit der rechten Maustaste auf das kleine, graue Feld oben, Linke Ecke.
    2. Laden Sie die Bilder jedes Kanalabschnitts einzeln, wählen Sie Stage-Position: Wählen Sie die Position zum Ansehen > Laden Sie das Bild. Speichere die Bildreihe als TIFF-Datei.
    3. Threshold das Bild, indem du Threshold Image > Auto Threshold for Dark Objects , die den Biofilm hervorheben, auswählen und dann das Bild mit dem Werkzeug Rechteckiger Bereich eingrenzen.
      HINWEIS: Der Schieberegler auf der linken Seite des Schwellenbilds kann nach oben und unten bewegt werden, um die Schwellenwerte zu verändern und so besser zwischen Biofilm und Hintergrund zu unterscheiden. Wenn das Bild Schatten enthält, umrahmen Sie den Abschnitt, ohne die Messwerte zu ändern, da die Schatten möglicherweise standardmäßig hervorgehoben wurden.
    4. Erhalten Sie Daten zur prozentualen Flächenabdeckung des Biofilms im Bild über das 24-Stunden-Experiment, indem Sie im Systemsoftwarefenster MM Standard > Measure > Region Measurements auswählen, um eine Tabelle mit Daten zum hervorgehobenen Biofilm innerhalb des rechteckigen Randes einschließlich Schwellenflächen % zu erstellen. Wählen Sie Open Log, um eine Logdatei zu öffnen und zu speichern, und F9: Log Data, um die Daten in die Logdatei einzugeben.
    5. Öffnen Sie eine Tabelle und erstellen Sie mit den 24-Stunden-Biofilmdaten für jeden Kanalabschnitt ein Diagramm, das die Abdeckung der Biofilm-Prozentsate über 24 Stunden zeigt.
  2. Ermittele die Biofilmdicke und die arithmetische mittlere Oberflächenrauheit.
    1. Den Z-Stack wurde in Fiji (ImageJ) gespeichert, indem ich die gespeicherte Datei in die Fiji-Steuerleiste gezogen und in ein 8-Bit-Bild konvertierte: Image > Typ> 8-Bit.
    2. Erhöhen Sie den Kontrast zwischen Biofilm und Kanaloberfläche, um unerwünschtes Rauschen zu vermeiden: Bild > Stellen Sie > Helligkeit/Kontrast an.
    3. Schwelle des Bildes einstellen, den Biofilmpixelwert 255 (weiß) und den Hintergrundpixelwert 0 (schwarz) einstellen: Bild > > Schwellenwert anpassen.
    4. Stellen Sie den Bildmaßstab ein, analysieren Sie > Skalierung > Entfernung in Pixeln: 2048 > Bekannte Entfernung: 332,8 > Pixel-Seitenverhältnis: 1,0 > Längeneinheit: μm.
      HINWEIS: Die bekannte Entfernung beträgt 332,8 μm, da die verwendete Hamamatsu-Kamera ein Sichtfeld von 2048 × 2048 Pixeln hat, wobei jeder Pixel eine Größe von 6,5 μm hat und die Bilder mit 40 × Vergrößerung aufgenommen wurden.
    5. Analysieren Sie den Z-Stack mit einem benutzerdefinierten Makro18 (Supplementary File 1), das die Oberfläche des Biofilms auf jedem Z-Stack-Schnitt berechnet und summiert und die Eingabeskalenwerte verwendet, um die Dicke der Serie zu berechnen, wodurch das Volumen gefunden werden kann. Alternativ wird die Biofilmdicke berechnet, indem man das berechnete Volumen durch die Oberfläche teilt.
    6. Erhalten Sie die arithmetischen mittleren Oberflächenrauheitswerte des Biofilms aus jeder z-Serie, indem Sie das ImageJ (nicht Fiji) Plugin SurfCharJ herunterladen und im Plugins-Ordner speichern.
    7. Laden Sie den Z-Stack in ImageJ hoch, indem Sie den gespeicherten Stack in die Steuerleiste ziehen und in ein 32-Bit-Bild umwandeln: Bild > Typ: 32-Bit.
    8. Erstellen Sie ein Oberflächendiagramm, das die Variation der Grauwerte über die Oberfläche des Stapels zeigt: Analysieren Sie > Diagrammprofil > mehr: Hochauflösendes Diagramm. Konvertiere das hochauflösende Diagramm auf 32-Bit.
    9. Erhalten Sie den arithmetischen mittleren Wert der Oberflächenrauheit, indem Sie das SurfCharJ-Plugin starten: Plugins > SurfCharJ > Rauheitsberechnung: mittlere Stichprobenlänge (): 10.
      HINWEIS: Das SurfCharJ-Plugin verwendet die verschiedenen Grauwerte entlang der Oberfläche des z-Stacks, um die arithmetische mittlere Oberflächenrauheit zu berechnen. Es wird eine Tabelle mit Oberflächenrauheitsparametern erstellt, der einzige interessante Parameter ist die arithmetische Mittelgrenze der Oberflächenrauheit, Ra. Die Tabellenwerte müssen aus Pixeln in Mikrometer umgewandelt werden.

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Ergebnisse

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Dieser Abschnitt beschreibt die repräsentativen Ergebnisse bei Anwendung des obigen Protokollverfahrens. Alle Experimente wurden mit mindestens drei unabhängigen biologischen Replikaten durchgeführt, die jeweils aus sechs parallelen Kanälen bestehen, und die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung präsentiert. Fehlerbalken in allen Graphen stellen die Standardabweichung dar, wie sie in den Abbildungslegenden definiert ist.

Das Wachstum der PAO1- und P...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die mehreren kritischen Schritte, die dieses Protokoll zusammen bilden, ermöglichen eine umfassendere und genauere Analyse der Biofilmbildung als alternative, traditionellere Methoden. Ein zentrales Element ist die Verwendung einer 48-Well-Mikrokanalplatte mit mikroskaligen Kanälen von 350 μm × 70 μm × 4 mm (W × H × L). Diese Maße spiegeln speziell die Flussbedingungen und Mikroumgebungen wider, die in Krankenhäusern wie Harnkatheter oder Lungenbronchiolen von Mukoviszidose-Patienten

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren möchten der School of Mechanical, Aerospace and Civil Engineering (MAC) der University of Sheffield für die Förderung danken.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
(NH4)2SO4Acros Organics7783-20-2Für modifizierte FAB-Medium
48-Bohrloch 0-2 Pa Mikrokanalplatte – GlasabdeckungZellmikrosysteme910-0047-5PackMikrokanäle für den Medienfluss und Biofilm
Wachstum mit Echtzeitbildgebung
-80 & Grad; C-GefrierschrankThermo Fisher Scientific1.16057E+15Zur Lagerung von Glycerolbrühen bis zur weiteren Verwendung
Agar, bakteriologische QualitätAcros Organics443570010Für Agarplatten – Bakterienkultivierung
Analytisches GleichgewichtVWRVWRI611-2297Zur Messung der verwendeten Medienkomponenten
AutoklavPriorklave4304Um Glaswaren zu sterilisieren
BioFlux 1000HTI& L Biosystemshttps://il-biosystems.com/cell- Mikrosysteme/Geräte/Bioflux-1000HT-
Scherflusssystem/ 		Für Mikrokanalfluss- und Biofilmwachstumsexperimente
BioFlux-SteuerungsmodulI& L Biosystemshttps://il-biosystems.com/cell-
Mikrosysteme/Gerät/Bioflux-1000HT- Scherfluss-System/ 		Einrichtung und Überwachung des Medienflusses und Biofilmwachstums innerhalb der Mikrokanäle
BioFlux Montage SoftwareI& L Biosystemshttps://il-
biosystems.com/app/uploads/2025/01/Bi oFlux_Overview_.pdf		Einrichtung und Überwachung des Medienflusses und Biofilmwachstums innerhalb der Mikrokanäle
CaCl2Fisher Scientific10043-52-4Für modifizierte FAB-Medium
CaSO4.2H2OChemCruzA1719Für 1 L minimale Metalllösung
Klare Polystyrol-96-Well-PlatteCorning, CostarCLS7007Für die lebensfähige Zellanzahl
CoSO4.7H2OSigma-Aldrich10026-24-1Für 1 L minimale Metalllösung
CuSO4.5H2OHoneywell209198-100GFür 1 L minimale Metalllösung
Eppendorf-Röhren 3810XEppendorf30125150Für P. aeruginosa Glycerol-Aktien
FeSO4.7H2OVWR International Ltd.284005EFür 1 L minimale Metalllösung
Fiji (ImageJ)Nationale Gesundheitsinstitutehttps://imagej.net/software/fiji/downloa
DS		Z-Stack-Bildverarbeitung
GlukoseSigma-Aldrich50-99-7Für glukosemodifiziertes FAB-Medium
GlycerolSigma-Aldrich56-81-5Für P. aeruginosa Glycerol-Aktien
H3BO3Fisher Scientific10043-35-3Für 1 L minimale Metalllösung
Hamamatsu Orca-Blitz 4.0 Kamera Modell C11440-
42U		HamamatsuC11440-42UFür Mikrokanalfluss und Biofilmwachstum
Echtzeitbildgebung
KH2PO4Fisher-BioReagenzien7778-77-04Für modifizierte FAB-Medium
SpiritusSigma-Aldrich2857Zur Reinigung des Mikrobiologieschranks vor und nach
Verwendung
MgCl2Sigma-AldrichM8266-100GFür modifizierte FAB-Medium
Mikrobiologie-Kabinett Klasse IIThermo Fisher Scientific42111226Um Protokollschritte durchzuführen, ohne Bakterien, Brühe oder Agar zu kontaminieren
Mini-InkubatorLabnet Internationalsn03171014Um PAO1 und PA14 nach -80 °C aufzutauen; C-Gefrierschrank und
für das anfängliche Wachstum der bakteriellen Agarplatten in 24 Stunden
MnSO4. H2OSigma-Aldrich10034-96-5Für 1 L minimale Metalllösung
Na2HPO4.2H2OSigma-Aldrich10102-40-6Für modifizierte FAB-Medium
NaClSigma-AldrichS5886-500GFür modifizierte FAB-Medium
NaMoO4. H2OSigma-Aldrich10102-40-6Für 1 L minimale Metalllösung
PräzisionsbalanceVWRVWRI611-2299Zur Messung der verwendeten Medienkomponenten
Gekühlte ZentrifugeHeraeus40289841Trennung der P. aeruginosa-Kultur von
Supernatant für Glycerolbestände
Semi-Mikro-CuvettenAlpha LaboratoriesX72053Für optische Dichtemessungen
Schüttelnder BrutkastenINFORS HThttps://infors- ht.com/en/products/incubator- Shaker/Multitron-StandardFür Übernachtkulturen
NatriumcitratSigma-Aldrich71498-250GFür Natriumcitrat modifiziertes FAB-Medium
Sterile Kunststoff-InokulationsschleifenMikrospecifikation15782105Für P. aeruginosa PAO1- und PA14-Impfungen in Agarplatten und Falkenröhren
Tryptische Soja-Agar, GemüseMillipore14432-500G-FFür Agarplatten – Bakterienkultivierung
Tryptische SojabrüheSigma-AldrichT8907Getrocknetes Kulturmedium – 6 g/200 mL
Typ-1-WasserspenderThermo Fisher Scientificsn42103311Für destilliertes Wasser
ZnSO4.7H2OFisher Scientific7446-20-0Für 1 L minimale Metalllösung

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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