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Methodenartikel

Ein thermisches Verletzungsmodell mittels Monopolar Radiofrequenz am Ischiasnerv bei Mäusen

197 Ansichten

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DOI:

10.3791/69998

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3. April 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pain Management, Xuanwu Hospital, Capital Medical University, 2National Medical Center for Neurological Diseases, 3National Clinical Research Center for Geriatric Diseases

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Diese Studie wandte Radiofrequenzsysteme auf die Ischiasnerven von Mäusen an und etablierte ein Radiofrequenzablationsmodell für Thermalnervenschädigungen. Dieser Ansatz löst Probleme der Kontrollierbarkeit in Modellen für periphere Nervenverletzungen von Mäusen und bietet eine praktische Modellierungsmethode für die Forschung zur Reparatur von Nervenverletzungen und neuropathischen Schmerzen.

Zusammenfassung

Eine periphere Nervenverletzung führt häufig zu neuropathischen Schmerzen und löst Nervenreparaturprozesse aus. Während kontrollierbare Modelle für körperliche Verletzungen inzwischen gut etabliert sind, bleiben bestehende Modelle für thermische Verletzungen explorativ und zeigen eine schlechte Kontrollierbarkeit. In der klinischen Praxis werden häufig Radiofrequenzablationssysteme (RFA) eingesetzt, um thermische Schäden an Geweben und Nerven zu induzieren. RFA ist eine therapeutische Methode, die nachweislich die Schmerzübertragung effektiv blockiert, indem sie thermische Schäden an den Nerven verursacht. Das Ausmaß der Ablation kann durch Anpassung spezifischer Parameter sowie des Ausmaßes von Taubheit und motorischer Dysfunktion im betroffenen Nervenverteilungsbereich angepasst werden. Diese Studie nutzte ein monopolares Radiofrequenzsystem, um ein stabiles, kontrollierbares Nervenschädigungsmodell im Ischiasnerv von Mäusen zu erstellen, indem 75°C für 30 Sekunden angewendet wurde. Ein signifikanter Anstieg des mechanischen Entzugsschwellenwerts (MWT) wurde von den Tagen 7 bis 14 nach der Operation beobachtet, wobei die Genesung bis Tag 28 erfolgte. Diese Forschung adressiert die aktuelle Lücke in RFA-Nervenverletzungsmodellen, repliziert die klinisch beobachtete Nervenschädigung nach RFA-Verfahren und bietet einen methodischen Rahmen für nachfolgende Studien zu RFA-induzierten Nervenverletzungen.

Einleitung

Neuropathische Schmerzen stellen weiterhin Herausforderungen in der klinischen Behandlung dar, da ihre Schmerzmechanismen weiterhin erforscht werden. Zur Untersuchung der molekularen und zellulären Mechanismen neuropathischer Schmerzen wurden die Ligation des Wirbelsäulennervs (SNL)1, die chronische Verengungsverletzung (CCI)2, die partielle Ischiasnervligation (pSNL)3, die Ischiasdurchtrennung (SNT)4 sowie die versparte Nervenverletzung (SNI)5 erfolgreich bei Nagetieren eingesetzt, um eine periphere Nervenverletzung zu simulieren. Um die Steuerbarkeit und Stabilität des Modells zu verbessern, schlugen frühere Studien Verbesserungen wie Druckmesser und selektiven Schaden vor, die umgesetzt wurden.

Obwohl die Radiofrequenztechnologie günstige klinische Ergebnisse erzielt hat, ist sie auch mit mehreren Nebenwirkungen verbunden. Zum Beispiel kann die Radiofrequenzablation (RFA), die bei der Hämostase während Operation6 eingesetzt wird, thermische Schäden am umliegenden Gewebe verursachen und aufgrund der hohen Temperatur der Spitze7 thermische Schäden an peripheren Nerven darstellen. Zusätzlich reduzieren RFA zur Behandlung trigeminusneuralgie8, postherpetische Neuralgie9 und andere neuropathische Schmerzerkrankungen die primären Schmerzen nach der Operation, gehen jedoch mit langfristiger postoperativer Taubheit im innervierten Bereich, oberflächlicher Hyperalgesie und anderen Unannehmlichkeiten10,11 einher. Folglich hat die Forschung zur thermischen Verletzung peripherer Nerven allmählich an Aufmerksamkeit gewonnen. Bestehende Tiermodelle sind jedoch nicht in der Lage, Temperatur, Dauer und Ort der thermischen Verletzung präzise zu kontrollieren, was die Gleichmäßigkeit des Verletzungsschweres einschränkt.

Frühere Studien verwendeten wärmeleitende Stäbe, die mit einem Konstanttemperatur-Wasserbad12 oder einer Warmwasserpumpe verbunden sind, um heißes Wasser in ein Gummischlauch mit direktem Kontakt zum Nerv13 zu injizieren, mit dem Ziel, die thermischen Auswirkungen von RFA auf Nervenschäden zu simulieren. Frühere Modelle für thermische Schäden haben jedoch nur thermische Schäden verursacht und somit den Einfluss des Hochfrequenzstroms und seiner Parameter auf Nerven eliminiert. Ob der Schaden durch RFA ausschließlich auf thermische Effekte zurückzuführen ist oder ob Faktoren wie Veränderungen der Radiofrequenzparameter ebenfalls unterschiedliche Auswirkungen auf Nerven haben, bleibt noch zu erforschen. Das derzeitige Fehlen von Tiermodellen, die direkt radiofrequente thermische Gerinnungssysteme für Nervenverletzungen verwenden, behindert den Fortschritt der Forschung zu Nervenschäden im Zusammenhang mit RFA. Diese Studie nutzte direkt ein monopolares RFA-System, um Nervenschäden im Zusammenhang mit RFA-Verfahren in klinischen Umgebungen zu simulieren, indem RFA-Verletzungen an den Ischiasnerven von Mäusen induziert wurden. Es dient als methodische Referenz für die Grundlagenforschung zur RFA-Verletzung peripherer Nerven.

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Protokoll

Tierversuche wurden vom Tierethikkomitee des Experimental Animal Center, Xuanwu Hospital, Capital Medical University, genehmigt und gemäß dem NIH-Leitfaden für die Pflege und Nutzung von Labortieren14 durchgeführt. Erwachsene männliche C57BL/6 Mäuse (8–10 Wochen alt, 20–25 g) wurden unter kontrollierten Umweltbedingungen (22 ± 2 °C, 50–60 % Luftfeuchtigkeit, 12 Stunden Hell/Dunkelheit-Zyklus mit Lichteinschaltung um 07:00 Uhr) in Gruppe (4–5 pro Käfig) unter kontrollierten Umweltbedingungen (22 2 °C, 5 % Luftfeuchtigkeit) untergebracht, mit ad-libitum-Zugang zu Standard-Nagerfutter und Wasser. Alle Verhaltensanalysen wurden während der Lichtphase zwischen 08:00 und 12:00 Uhr durchgeführt. Details zu den Reagenzien, der Software und der Ausrüstung sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Anästhesie und Steigerung von Mäusen

  1. Mäuse werden durch intraperitoneale Injektion einer 20 mg/mL Tribromoethanol-Lösung mit einer Dosis von 0,2 mL pro 10 g Körpergewicht betäubt.
  2. Decken Sie beide Augen mit einer Augensalbe mit einem Watteapplikator ab.
  3. Setzen Sie die Mäuse in die linke seitliche Position. Entfernen Sie die Haare auf der rechten Körperseite (1 cm × 1 cm Fläche) mit einem Elektrorasierer (Abbildung 1).
    HINWEIS: Dieser Schritt vergrößert die Kontaktfläche zwischen Torso und der negativen Platte der Schaltung, um den Schaltungswiderstand zu verringern.
  4. Stellen Sie einen Teil des Mauskörpers in Kontakt mit der Metall-Negativelektrodenplatte in rechtser Richtung. Mehrere Tropfen ionische Flüssigkeit (0,9 % NaCl oder modifizierte Ringer-Lösung; siehe Materialtabelle zur Zusammensetzung ) auf die Kontaktfläche zwischen Torso und Platte auftragen, um die elektrische Leitfähigkeit zu verbessern.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Kopf und Gesicht nicht von der negativen Platte entfernt sind, um unbeabsichtigte Strahlbelastung der Augen oder anderer Organe zu vermeiden.
  5. Sichern Sie das linke Hintergliedmaß in einer nach oben gerichteten Position mit angespanntem Knie mit Klebeband auf der negativen Elektrodenplatte. Entferne Haare im linken Oberschenkelbereich und desinfiziere die Operationsstelle dreimal mit 75 % Ethanol.
  6. Überprüfen Sie die ausreichende Tiefe der Anästhesie, bevor Sie voranschreiten, indem Sie überprüfen, ob keine Entzugsreaktion auf einen Klemmreiz auf das Hintergliedmaß oder den Schwanz angewendet wird.
    HINWEIS: Vermeiden Sie die Verabreichung von lokalen Anästhetika (z. B. Lidocain) oder nichtsteroidalen entzündungshemmenden Medikamenten (z. B. Paracetamol) während der perioperativen Phase, da diese Wirkstoffe postoperative neurobehaviorale Bewertungen beeinflussen können.

2. Radiofrequenzablationsoperation

  1. Nutze den Oberschenkelknochen als Referenz. Verwenden Sie eine Mikroschere, um einen 1 cm langen Hautschnitt in Richtung der Längsachse des Oberschenkelknochens zu schneiden, mit einer 0,5 cm seitlichen Verschiebung zur Schwanzseite (Abbildung 2).
  2. Schneiden Sie den Musculus Bizeps femoris (BFM) entlang des Hautschnitts schockiert und suchen Sie mit einer Mikropinzette nach dem Hauptstamm des Ischiasnervs. Der Ischiasnerv teilt sich in der Nähe des Kniegelenks (Abbildung 3).
  3. Verwenden Sie eine Mikrozange, um den Ischias-Stamm vom umgebenden Gewebe etwa 2 mm oberhalb der Bifurkation des Ischiasnervs bis zu einer Länge von etwa 5 mm zu zerschneiden. Vermeiden Sie Verletzungen der Blutgefäße während der stumpfen Trennung.
    HINWEIS: Im Falle einer unbeabsichtigten Gefäßverletzung verwenden Sie einen sterilen Wattestäbchen, um das Blut aufzusaugen, und üben Sie den entsprechenden Druck aus, um die Blutung zu stoppen. Setzen Sie die Operation fort, wenn kein weiteres Blutversickern vorliegt.
  4. Verbinden Sie die RFA-Gerinnungsnadel mit dem Radiofrequenzbehandlungsgerät. Legen Sie die Nadelspitze flach auf das Muskelgewebe, um den Widerstand zu testen. Wenn der Widerstand höher als 1 kΩ ist, wird eine ionische Flüssigkeit zwischen den Mäusekörper und die negative Platte mit einem Tropfen hinzugefügt, bis der Widerstand unter 1 kΩ fällt.
  5. Heben Sie vorsichtig den getrennten Ischiasnerv mit einem Glas-Minutenzeiger an. Setzen Sie die RFA-Nadel unterhalb des Ischiasnervs, wobei die freiliegende Metallspitze 3 mm von der Ischias-Bifurkation entfernt positioniert ist (Abbildung 4).
  6. Stellen Sie die Parameter des radiofrequenztherapeutischen Instruments wie folgt ein: thermischer Koagulationsmodus, 75 °C, 30 s, 2 Hz Frequenz und 1 ms Pulsbreite. Aktivieren Sie die RFA-Energielieferung.
  7. Ziehen Sie die RFA-Nadel vorsichtig heraus. Umpositionieren Sie den Ischiasnerv mit einer Pinzette, um das Muskelgewebe anzuheben. Schließen Sie den Muskel mit einer 6-0 resorbierbaren Polyglykolsäure (PGA)-Naht. Schließe den Hautschnitt mit einer 4-0 absorbierbaren PGA-Naht.
  8. Nach der Operation legen Sie die Mäuse auf eine zirkulierende Warmwasserdecke (38 °C) oder ein thermostatisch gesteuertes Heizkissen (37–38 °C), das mit Toilettenpapier oder einem Handtuch bedeckt ist, damit das Haar trocknen kann und direkte hitzebedingte Schäden verhindert werden.
  9. Bringen Sie die Mäuse zurück in den Käfig und warten Sie auf die Erholung von der Narkose. Regelmäßig Haus- und Kontrolle täglich auf die Integrität des Schnitts sowie Überwachung der Nahrungsaufnahme, Wasseraufnahme und des allgemeinen Körperzustands.

3. Versuchsgruppe

  1. RFA-Gruppe: Führen Sie das vollständige RFA-Operationsprotokoll wie in den Schritten 2.1–2.9 beschrieben durch.
  2. Sham-Gruppe: Führen Sie identische Verfahren wie die RFA-Gruppe durch (Schritte 2.1–2.5 und 2.7–2.9), aktivieren Sie jedoch nicht die RFA-Systemlieferung in Schritt 2.6. Halten Sie die RFA-Nadel 30 Sekunden lang unter dem Ischiasnerv in Position ohne aktuelle Aktivierung und fahren Sie dann mit Schritt 2,7 fort.
    HINWEIS: Die Sham-Gruppe kontrolliert chirurgische Traumata, Anästhesie, Nervenmanipulation und Nadelplatzierung unabhängig von thermischer Verletzung.

4. Von-Frey-Bewertung für MWT

  1. Vor jedem Test werden die Mäuse zufällig in die von Frey-Testplattform gesetzt. Lassen Sie die Akklimatisierung für 15 Minuten zu, bis das erkundliche Verhalten aufhört.
    HINWEIS: Die Plattform besteht aus einem Metallgitter mit 0,6 cm × 0,6 cm langen Löchern am Boden und mehreren roten transparenten Behältern für die Mäuse, die in verschiedenen Behältern platziert sind, ohne sich gegenseitig zu stören.
  2. Führen Sie die von-Frey-Bewertung mit der Up-Down-Methode15 durch. Trage den von Frey-Faserdraht auf, um die Mitte der linken Hinterpfote mit genügend Kraft zu stimulieren, um eine leichte Biegung zu verursachen. Halten Sie 3 Sekunden oder bis eine Entzugsreaktion16 eintreten.
    HINWEIS: Beginnen Sie mit dem 0,4-g-Filament. Trage den nächsthöheren Faden nach einer negativen Antwort oder den nächstniedrigeren Filament nach einer positiven Antwort auf. Fahren Sie nach der ersten Richtungsänderung für vier weitere Bewerbungen fort. In der Praxis wurde das 2-g-Filament in dieser Studie als obere Grenze gesetzt, da bei dieser Kraft die von-Frey-Faser die Vorderpfote vom Boden hob, ohne Flucht- oder Rückzugsreaktionen zu zeigen.
  3. Erfassen Sie Antworten und berechnen Sie den 50%-MWT mit dem Up-Down-Methodenrechner (Up-Down-Methode für von Frey-Experimente, https://bioapps.shinyapps.io/von_frey_app/).
  4. Führen Sie von Frey-Tests am Baseline (präoperativ) und an den postoperativen Tagen 7, 14, 21, 28 und 35 durch.

5. DRG-Gewebesammlung und Immunfluoreszenzfärbung

  1. Am postoperativen Tag 7 werden L4–L6 DRG von den RFA- und Sham-Gruppen gesammelt.
  2. Fixieren Sie das Gewebe mit 10 % Saccharose-Paraformaldehyd bei 4 °C für 6–12 Stunden.
  3. Kryoprotect die Gewebe in 30 % Saccharose-PBS bei 4 °C über Nacht.
  4. Einbetten Sie das Gewebe in Verbindungsstoff17 bei optimaler Schneidtemperatur.
  5. Schneiden Sie 13 μm Kryosektionen und permeabilisieren Sie die Schnitte mit einem nicht-ionischen Tensid.
  6. Blockieren Sie mit einem Blockierreagenz und inkubieren Sie über Nacht mit dem polyklonalen Antikörper bei 4 °C.
  7. Nach dem Waschen inkubieren Sie mit dem sekundären Antikörper 2 Stunden bei Zimmertemperatur.
  8. Montiere mit Antifade-Medium.

6. Statistische Analyse

  1. Stellen Sie normalverteilte kontinuierliche Daten als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) dar.
  2. Führen Sie Gruppenvergleiche mit dem unabhängigen Stichproben-t-Test durch.
  3. Analysieren Sie Gruppenvergleiche über verschiedene Zeitpunkte hinweg mit wiederholten Varianzanalysen (ANOVA).
  4. Wenden Sie die Bonferroni-Korrektur für post-hoc paarweise Vergleiche an.
  5. Verarbeiten Sie alle Daten mit einer Statistiksoftware und setzen Sie die statistische Signifikanz auf P < 0,05.

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Ergebnisse

Die erfolgreiche Modellbildung wurde sowohl durch intraoperative als auch postoperative Indikatoren bestätigt. Nach Abschluss der RFA (75 °C, 30 s) wurde beim Abzug eine leichte Verwachsung zwischen der RFA-Nadelspitze und dem Ischiasnerv festgestellt. Diese Adhäsion resultiert aus lokaler Proteindenaturierung und -gerinnung an der Kontaktstelle und deutet auf eine angemessene thermische Energieabgabe zusammen mit direktem Nervenkontakt hin. Das Fehlen einer Adhäsion kann auf eine Nadelv...

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Diskussion

Mit der raschen Entwicklung minimalinvasiver Chirurgie ist die Radiofrequenztechnologie immer weiter verbreitetgeworden 6,7,18. Mit der Ausweitung der Radiofrequenztechnologie in der klinischen Praxis hat die verwandte Forschung deren breitere Verbreitung erleichtert. Die Auswirkungen des Radiofrequenzstroms auf Gewebe erfordern jedoch weitere Untersuchungen, insbesondere nachdem Radiofrequenzte...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Danksagungen

Diese Studie wird vom Xuanwu Hospital Talent Convergence Program (HZ2025PYDTR009) und den Capital's Funds for Health Improvement and Research (2.CFH2024.2011) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
4-0-NahtJinhuan MedicalC412Schließe die Haut
6-0 NahtJinhuan MedicalKCR631Schließe die Muskelschicht
Alexa Fluor 488 SekundärantikörperInvitrogenA-11008Sekundärer Antikörper
ATF3-Kaninchen-Polyklonaler AntikörperNovus BiologicalsNBP1-85816Polyklonaler Antikörper
Gebogene feine PinzetteBeyotime BiotechnologieFS031Schnittmuskel und Faszie
DAPI-Antifade-MontagemediumBeyotime BiotechnologieP0131Antifade-Medium
Glas-MinutenzeigerYuyan InstrumenteBLFZ10Heb den Nerv hoch
GraphPad-PrismaGraphpad Software, LLCVersion 9.0Ausgabedatenbilder
Mikro-SchereBeyotime BiotechnologieFS217Hautschnitt
Modifizierte Ringer' s LösungSelbstvorbereitetN/ANatriumlaktat 3,10 g/L; NaCl 6,00 g/L; KCl 0,30 g/L; CaCl2&Middot; 2H2O 0,20 g/L
NadelhalterYuyan InstrumenteY32010Nadeln halten
QuickBlock-Block-LösungBeyotime BiotechnologieP0260Blockierendes Reagenz für Immunfluoreszenz
Radiofrequenz-Therapeutisches GerätCosman MedicalRFG-1AHochfrequenzsystem
Radiofrequenz-Thermokoagulationselektrode-TrokarCosman MedicalTCD-10Isolierte HF-Nadel
Natriumlaktat-Ringer-InjektionSichuan  Kelun  Pharma  Co.,  Ltd86902180001566Ionische Flüssigkeit zur Reduzierung der Widerstandsfähigkeit
SPSS-StatistikenIBM CorpVersion 27.0Statistische Analysesoftware
Gerade feine PinzetteBeyotime BiotechnologieFS027Schnittmuskel und Faszie
Von Frey-FaserdrahtDanmic GlobalAesthesio Semmes-WeinsteinVerhaltenstest

Referenzen

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