Dieses Protokoll beschreibt die Methode zur Einrichtung des Mammosphärenbildungstests, um Apoptosis Inhibitor 5 (Api5)-induzierte Krebsstammbildung in nicht-tumorigenen Brustepithelzellen zu untersuchen. Lysate, die aus Mammosphären der Primärgeneration gesammelt werden, werden auf verschiedene Stammmarker analysiert, um die Induktion stammzellähnlicher Eigenschaften zu bewerten.
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Methodenartikel
Der Mammosphärentest zeigt api5-induzierte Stammbildung in nicht-tumorigenen Brustepithelzelllinien
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Brustkrebs bleibt weltweit die häufigste Krebserkrankung bei Frauen mit den höchsten altersstandardisierten Inzidenz- und Sterblichkeitsraten. Trotz der Fortschritte bei Therapien, die auf Brustkrebs abzielen, zeigen 20 % der Patienten Rückfälle der Krankheit, was möglicherweise auf eine Population therapieresistenter Krebsstammzellen (CSCs) zurückzuführen ist. Diese CSCs können konventionelle Behandlungen überstehen, indem sie sich in einem Ruhestadium befinden oder aufgrund einer unvollständigen Resektion der Tumormasse bestehen, was zu einem späteren Rückfall führt. Daher konzentriert sich die jüngere Forschung auf die Identifizierung, Isolierung und Zielsetzung dieser resistenten Zellpopulation. In vitro dient der Mammosphärenbildungsassay als robustes dreidimensionales Suspensionskultursystem zur Anreicherung und Vermehrung stammähnlicher Zellen in Brustepithelpopulationen. Hier präsentieren wir einen Ansatz, der den Mammosphären-Test nutzt, um den krebsstämmigen Phänotyp zu bewerten, der in nicht-tumorigenen Brustepithelzellen durch die Überexpression von Apoptosis Inhibitor 5 (Api5) ermöglicht wird. Das Protokoll beinhaltet die Fortpflanzung von Mammosphären durch serielle Durchgänge, um die Effizienz der Mammosphärenbildung und die Selbsterneuerungsfähigkeit zu bewerten. Zusätzlich werden aus Mammosphären gewonnene Proteinlysate mittels Immunblotting auf etablierte Stammmarker untersucht. Dieser Test ermöglicht die Untersuchung neuartiger Regulatoren wie Api5 der stammcellähnlichen Eigenschaften von Krebs in Brustepithelzellpopulationen. Der beschriebene Ansatz kann für vergleichende Studien molekularer Interventionen oder für die Screening von therapeutischen Wirkstoffen in vitro angepasst werden.
Einleitung
Der Anstieg chemotherapieresistenter Brustkrebserkrankungen hat zu einem verstärkten Schwerpunkt auf der Identifizierung und Bekämpfung der zugrunde liegenden Ursache von Therapieresistenz und Rückfall, einer Population von Krebszellen, die als Krebsstammzellen bekannt sind, geführt. Diese Zellen zeichnen sich durch ihre Fähigkeit aus, der Differenzierung zu entgehen und ruhig zu bleiben, was ihnen ermöglicht, verschiedenen Krebsbehandlungsmethodenzu widerstehen 1,2. Verschiedene Methoden können zur Identifizierung von Brustkrebsstammzellen eingesetzt werden, darunter der Mammosphärenbildungstest 3,4,5, Zellsortierung basierend auf Zelloberflächenmarkern 6,7, Isolation basierend auf Effluxeigenschaften, in vivo Tumorigenitätstests7 und die Bewertung von Stammzellkernmodulatoren wie Okt48, Nanog9, Sox210 und BMI11. Typischerweise beinhaltet die Identifizierung und Isolierung von Krebsstammzellen eine Kombination aus einem oder mehreren dieser Ansätze.
Apoptosehemmer 5 (Api5) ist ein anti-apoptotisches Protein, das in mehreren Krebsarten hochreguliert wurde, darunter Brustkrebs12,13,14, Gebärmutterhalskrebs 15,16,17, B-zellige chronische lymphoide Leukämie 18 und nicht-kleinzelliger Lungenkrebs19. Hohe Api5-Spiegel wurden mit Chemotherapieresistenz bei Gebärmutterhals-16 und dreifach-negativem Brustkrebs12 identifiziert. Es gibt zunehmende Hinweise darauf, dass Therapieresistenz und Rückfall oft durch Krebsstammzellenverursacht werden. Eine interessante Studie von Song et al.22 zeigte, dass die Überexpression von Api5 in Gebärmutterhalskrebszellen zu erhöhten Nanag-Spiegeln führt, was zu einer erhöhten Krebsstammigkeit beiträgt. Frühere Studien aus unserem Labor haben gezeigt, dass eine Überexpression von Api5 zur Transformation nicht-tumorogener Brustepithelzellen führt, die in matrigelgestützten 3D-Kulturen gezüchtet werden. Diese transformierten Zellen weisen eine gestörte Polarität, erhöhte Proliferation, ankerunabhängiges Wachstum und einen Phänotyp ähnlich partiell epithelial-mesenchymal-mesenchymal-ähnlich (EMT) auf. Die phänotypischen Veränderungen, die bei der Überexpression von Api5 in 3D-Kulturen beobachtet wurden, blieben nach der Dissoziation der Sphäroide in Monolayer-Kulturen14 erhalten. Da Api5 bei chemotherapieresistenten dreifach-negativen Brustkrebserkrankungen hochreguliert ist, vermuten wir, dass Api5 auch die Stammeigenschaften von Krebs in Brustepithelzellen regulieren könnte.
In diesem Zusammenhang beschreiben wir den Mammosphärenbildungsassay zur Identifizierung von Krebsstammzellen aus 3D-dissoziierten, nicht-tumorigenen Brustepithelzellen, die durch die Überexpression von Api5 transformiert wurden, gefolgt von einer westlichen Blotting für Stammzellmarker, um die Identität dieser Zellen zu bestätigen. Der Mammosphären-Test beinhaltet die Kultivierung von Brustepithelzellen unter nicht adhärenten, nicht differenzierenden Bedingungen, was die Anreicherung von stammartigen/Vorläuferzellen in dreidimensionalen Strukturen, den sogenannten Mammosphären, ermöglicht. Brustepithelzellen, die keine stammartigen Eigenschaften besitzen, durchlaufen typischerweise Anoikis; Zellen mit stammähnlichen Eigenschaften führen jedoch zu Mammosphären 4,5. Diese Methode wurde ursprünglich von Dontu et al.3 entwickelt und ist inspiriert vom Neurosphären-Assay, der zur Untersuchung und Identifizierung neuronaler Stammzellen und Vorläufer23 verwendet wird. Der hier beschriebene Mammosphären-Test ermöglicht die Beurteilung der Stammzellaktivität und der Selbsterneuerungskapazität in minimalen Medien, die mit B27 ohne Vitamin A und rekombinanten menschlichen epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) ergänzt werden. Api5-überexprimierende 3D-dissoziierte Zellen werden spärlich auf Poly(2-Hydroxyethylmethacrylat) (pHEMA)-beschichteten Platten ausgesaat. Dies ermöglicht es den Zellen, unter nicht haftenden Bedingungen zu wachsen, sodass jede nachfolgende Mammosphäre klonalen Ursprungs ist. Die Mammosphären dürfen bis zum siebten Tag wachsen, danach wird die Effizienz der Mammosphärenbildung berechnet. Um echte Stammzellen von Nicht-Stammzellen zu unterscheiden, die im Laufe der Zeit ihre Proliferationskapazität verlieren, werden nachfolgende Generationen der Mammosphärenbildung durchgeführt. Die serielle Weitergabe von Mammosphären beinhaltet die Dissoziation der von der Primärgeneration gesammelten Kugeln und das Umplattieren der einzelnen Zellen, um sekundäre (und nachfolgende) Mammosphären zu bilden. Dies bestimmt, ob die Zellen wiederholt die Kugelbildung einleiten können, und wird als Selbsterneuerungskapazität derZellen 5 quantifiziert.
Diese Methode kann verwendet werden, um Brustkrebsstammzellen in tumorigenen oder transformierten Brustepithelzellen zu identifizieren. Die Methode kann auch angepasst werden, um Brustkrebsstammzellen aus Patientenproben zu isolieren. Das System kann helfen, neue Ziele gegen Brustkrebsstammzellen zu identifizieren, die mit Chemotherapieresistenz in Verbindung stehen könnten.
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Protokoll
1. Beschichtung von Gewebekulturplatten mit Poly(2 -Hydroxyethylmethacrylat), pHEMA
- Lösen Sie 1,2 g pHEMA (Molekulargewicht ̴ 300.000) in 100 ml 95 % Ethanol durch ständiges Rühren bei 65 °C auf, um eine 1,2 % pHEMA-Lösung herzustellen (siehe Materialtabelle).
- Beschichten Sie Standard-Gewebekulturplatten mit pHEMA, indem Sie pro Bohrloch einer 6-Well-Platte 1 ml auftragen. Das Volumen der pHEMA-Lösung kann je nach Größe des Gewebekulturgefäßes angepasst werden.
- Lassen Sie die Teller unter sterilen Bedingungen im Ofen bei 40 °C trocknen.
- Die Platten werden 15 Minuten lang UV-Licht ausgesetzt, gefolgt von drei Washes mit Dulbeccos phosphatgepuffertem Kochsalzlösungslösungsmittel (DPBS), bevor Sie sie zur Vorbereitung des Mammosphären-Formationstests verwenden.
2. Aussäen von Mammosphären der Primärgeneration
- Kultur 3D-dissoziierte MCF10A-Zellen (Kontroll- und Api5-Überexpression), die durch Dissoziation von 3D-Kulturen am Tag 16 im Wachstumsmedium14 gewonnen wurden.
HINWEIS: Zusammensetzung des Wachstumsmediums: DMEM mit hohem Glukosespiegel ohne Natriumpyruvat, ergänzt mit 5 % Pferdeserum, 10 μg/mL Insulin, 0,5 μg/mL Hydrocortison, 20 ng/mL rekombinantem humanem epidermalem Wachstumsfaktor (EGF), 100 ng/mL Choleratoxin und 200 Einheiten/mL Penicillin-Streptomycin (siehe Materialtabelle). - Entferne das verbrauchte Medium, wasche die Zellen mit 1 ml DPBS, gib dann 500 μL 0,05 % Trypsin-EDTA hinzu und inkubiere bei 37 °C in einem befeuchteten 5 % CO2-Inkubator für 12–15 Minuten, bis alle Zellen trypsinisiert sind.
- Nachdem alle Zellen gelöst sind, fügen Sie 2 ml Resuspensionsmedium hinzu, um die Trypsinaktivität zu neutralisieren, und drehen Sie die Zellsuspension bei 112 × g für 10 Minuten bei Raumtemperatur.
HINWEIS: Zusammensetzung des Resuspensionsmediums: Hoher Glukose-DMEM ohne Natriumpyruvat, ergänzt mit 20 % Pferdeserum und 200 Einheiten/mL Penicillin-Streptomycin. - Aspirieren Sie das Supernatant und lassen Sie das Zellpellet in 1 ml Mammosphärenmedium wieder suspendieren. Führen Sie die Zellsuspension durch eine 25-G-Nadel, um eine Einzelzell-Suspension zu erhalten.
HINWEIS: Zusammensetzung des Mammosphärenmediums: DMEM/F12 ergänzt mit 20 ng/mL epidermalem Wachstumsfaktor (EGF), 1 × B27-Präparat ohne Vitamin A und 200 Einheiten/mL Penicillin-Streptomycin (siehe Materialtabelle). - Mit einem Hämozytometer zählen Sie die Anzahl der Zellen und berechnen Sie das Volumen der Zellsuspension, das benötigt wird, um 0,2 × 104 Zellen pro Brunnen zu säen.
HINWEIS: Halten Sie eine niedrige Aussaatdichte aufrecht, um die Effizienz der Mammosphärenbildung genau zu bestimmen und so die Auswirkungen der Zellaggregation zu minimieren. Beim Sammeln von Proteinlysaten zur Immunblottung kann die Zelldichte auf bis zu 2,5 × 105 Zellen pro Welle erhöht werden. - Verdünnen Sie das erforderliche Zellsuspensionsvolumen in 2 ml Mammosphärenmedium und Samen in jedem Brunnen einer 6-Well-Platte. Samenzellen in dreifacher Ausführung für jede Bedingung.
- Inkubieren Sie bei 37 °C in einem befeuchteten 5%igen CO2-Inkubator für 7 Tage.
- Nach sieben Tagen in der Kultur zählen Sie manuell die Anzahl der Mammosphären mit einem Durchmesser von mehr als 50 μm in jedem Bohrloch, entweder mit einem Mikroskop mit einem Graticule oder mit einem Quadrantengitter unter einem Lichtmikroskop.
- Fotografieren Sie die Mammosphären mit einer Digitalkamera, die an ein Lichtmikroskop mit 20-facher Vergrößerung angebracht ist.
- Berechnen Sie die Mammosphärenbildungseffizienz (MFE) mit folgender Formel5
3. Säen von Mammosphären der sekundären Generation
- Sammeln Sie die Mammosphären, die in der ersten Generation entstanden sind, in einem 15-ml-Röhrchen und zentrifugieren Sie bei 300 × g für 10 Minuten bei Raumtemperatur.
- Aspiratiere das Supernatant und lass das Mammosphärenpellet zurück.
- Wasche das Pellet mit DPBS.
- Fügen Sie dem Mammosphere-Pellet 200 μL 0,05 % Trypsin-EDTA hinzu und inkubieren Sie bei 37 °C in einem befeuchteten 5 % CO2 % Inkubator für 2–3 Minuten. Führen Sie die Mammosphären in der Trypsinlösung dreimal durch eine 25-G-Nadel, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten.
- Gib 0,5 ml Resuspensionsmedium hinzu, um die Trypsinaktivität zu neutralisieren, und drehe die Zellsuspension bei 112 × g für 10 Minuten bei Raumtemperatur.
- Aspirieren Sie den Supernatant und lassen Sie das Zellpellet in 0,5 mL Mammosphärenmedium wieder suspendieren.
- Mit einem Hämozytometer zählen Sie die Anzahl der Zellen und berechnen Sie das Volumen der Zellsuspension, das benötigt wird, um 0,2 × 10 bis4 Zellen pro Bohrloch zu säen.
HINWEIS: Halten Sie eine niedrige Zelldichte aufrecht, um die Selbsterneuerungskapazität zu bewerten und so die Wirkung der Zellaggregation zu minimieren. - Verdünnen Sie das erforderliche Zellsuspensionsvolumen in 2 ml Mammosphärenmedium und Samen in jedem Brunnen einer 6-Well-Platte. Samenzellen in dreifacher Ausführung für jede Bedingung.
- Inkubieren Sie bei 37 °C in einem befeuchteten 5%igen CO2-Inkubator für 7 Tage.
- Nach 7 Tagen in der Kultur zählen Sie die Anzahl der Mammosphären mit einem Durchmesser von mehr als 50 μm in jeder Platte entweder mit einem Mikroskop mit einem Graticule oder einem Quadrantengitter.
- Fotografieren Sie die Mammosphären mit einer Digitalkamera, die an ein Lichtmikroskop mit 20-facher Vergrößerung angebracht ist.
- Berechnen Sie die Selbsterneuerungskapazität mit folgender Formel5
4. Western-Blotting zur Erkennung der Veränderungen der Pluripotenzmarker bei Api5-Überexpression
- Sammeln Sie die in der ersten Generation entstandenen Mammosphären in einem 15-mL-Rohr und zentrifugieren Sie bei 300 × g für 10 Minuten bei Raumtemperatur.
- Aspiratiere das Supernatant und lass das Mammosphärenpellet zurück.
- Wasche das Pellet mit DPBS.
- Sammeln Sie das Pellet in einem eiskalten RIPA-Puffer, um das Proteinlysat zu erhalten, und führen Sie Immunoblotting gemäß Standardprotokoll24 durch.
HINWEIS: Zusammensetzung des RIPA-Puffers: 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 150 mM NaCl, 1 % Triton X-100, 0,5 % Natriumdeoxycholat, 0,1 % Natriumdodecylsulfat (SDS), 1 mM Ethylendiaminetetraessigsäure (EDTA), 1 mM Phenylmethysulphonylfluorid (PMSF), 10 mM Natriumfluorid, 1 mM Natriumorthovanadat. - Sonde für Stammmarker – Okt3/4, Nanog, Sox2 und Bmi1 sowie Belastungskontroll-GAPDH (siehe Materialtabelle für Antikörperverdünnungen).
- Quantifizieren Sie die Proteinspiegel mittels densitometrischer Analyse auf ImageJ. Wählen Sie die interessante Region auf Western-Blot-Bildern aus und erstellen Sie für jede Spur ein Dichteprofil.
- Normalisiere die relativen Dichten des interessierenden Proteins zu denen von GAPDH für jede Spur. Berechnen Sie die Faltungsänderung für jedes Protein.
- Plotte die Faltung der Proteinwerte mit einer beliebigen Plottsoftware.
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Ergebnisse
Zur Bewertung der Effizienz der Mammosphärenbildung unter nicht-adhärenten Bedingungen wurden Kontroll- und Api5-überexprimierende 3D-dissoziierte MCF10A-Zellen gemäß dem Protokoll auf polyHEMA-beschichtete Platten ausgesaat. Api5-überexprimierende Zellen zeigten eine 1,58-fache Steigerung der durchschnittlichen Effizienz der Mammosphärenbildung im Vergleich zu den Kontrollen (Abbildung 1B,C). Dieser Anstieg zeigt, dass eine höhere Expression von Api5 den Anteil der stammzel...
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Diskussion
Während Monoschichtkulturen etablierter Krebszelllinien oder tumorabgeleiteter Zellen Einblicke in die verschiedenen molekularen Wege geben, die die Krebsphänotypen regulieren, kann Forschung zu Krebsstammzellen nicht in zweidimensionalen Kulturen durchgeführt werden. Da angenommen wird, dass Krebsstammzellen ein wesentlicher Faktor für Rückfälle nach aktuellen Behandlungsstrategien sind, ist es notwendig, robuste Tests zur Untersuchung dieser Zellen
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Offenlegungen
Die Autoren geben keinen potenziellen Interessenkonflikt an.
Danksagungen
Diese Studie wurde durch einen Zuschuss der SERB-POWER (SPG/2021/002661-G) und teilweise durch IISER, Pune Core gefördert. S.B. wurde durch ein UGC-SRF-Stipendium finanziert. Wir möchten Prof. Raymond C. Stevens (Scripps Research Institute, USA) für die großzügige Bereitstellung der MCF10A-Zellen und Dr. Abhijith K (Ahammune Biosciences Pvt. Ltd.) für seine wertvollen Beiträge zum Manuskript danken.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 0,05% Trypsin EDTA | Invitrogen | 25300062 | |
| 37 °C humidifizierter Inkubator | New Brunswick | Galaxy 170 R | |
| Anti-Bmi1 Kaninchen pAb | ABclonal | A13472 | 1:1000 Verdünnung, über Nacht bei 4 °C inkubieren |
| Anti-GAPDH Antikörper | Sigma | G9545-200UL | 1:10000 Verdünnung, 1 h Inkubation bei Raumtemperatur |
| Anti-Nanog Kaninchen mAb | ABclonal | A22625 | 1:5000 Verdünnung, über Nacht bei 4 °C inkubieren |
| Anti-Oct3/4 Antikörper (C-10) | Santa Cruz | sc-5279 | 1:300 Verdünnung, über Nacht bei 4 °C inkubieren |
| Anti-Sox2 Antikörper (E-4) | Santa Cruz | sc-365823 | 1:300 Verdünnung, über Nacht bei 4 °C inkubieren |
| B-27 Ergänzung (50x), ohne Vitamin A | Invitrogen | 12587010 | |
| Zentrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-15R | |
| Cholera Toxin | Sigma | C8052-1MG | 1 mg/mL Stammlösung in dH2O |
| DMEM/F12 | Thermo | 11330032 | |
| Dulbecco's Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (DPBS) | Invitrogen | 14190-144 | |
| Epidermales Wachstumsfaktor (EGF) | Sigma | E9644-0.2MG | 100 mg/mL Stammlösung in dH2O |
| Ethanol absolut 99,9% | Jebsen & Jessen GmbH & Co. Germany | 58051 L05 | |
| Ethylendiamintetraessigsäure Dinatriumsalz Dihydrat (EDTA) | SRL | 43272 | |
| Hochglukoses DMEM ohne Natriumpyruvat | Invitrogen | 11965126 | |
| Pferdeserum | Invitrogen | 16050122 | |
| Salzsäure (HCl) | Qualigens | Q29145 | Zum Einstellen des pH-Werts von Tris-HCl (pH 8,0) |
| Hydrocortison | Sigma | H0888 | 1 mg/mL Stammlösung in Ethanol |
| ImageJ | Bildverarbeitungssoftware | ||
| ImageQuant LAS 4000 | Cytiva | ||
| Immobilon Western Chemiluminiszenz HRP-Substrat | Merck | WBKLS0500 | |
| Insulin | Sigma | I1882 | 10 mg/mL Stammlösung in 1% eisige Essigsäure |
| Nikon Eclipse TS-100 Mikroskop | Nikon | BM-1919 | |
| MCF10A Zellen | Geschenk von Prof. Raymond C. Stevens (Scripps Research Institute, USA) | ||
| Penicillin-Streptomycin | Lonza | 17-602E | |
| Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) | Sigma | 78830-5G | |
| Plotting-Software | GraphPad Prism 10 | ||
| Poly(2-hydroxyethyl methacrylat) (pHEMA) | Santacruz | sc-253284 | 1,2% pHEMA in 95% Ethanol |
| Natriumchlorid (NaCl) | SRL | 41721 | |
| Natriumdeoxycholat | Amresco | 0613-100G | |
| Natriumdodecylsulfat (SDS) | SRL | 54468 | |
| Natriumfluorid (NaF) | HiMedia | RM1081-500G | |
| Natriumorthovanadat | Sigma-Aldrich | S6508-10G | |
| Tris-Puffer | SRL | 71033 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-250ML |
Referenzen
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