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Methodenartikel

Intranasale Abgabe von mRNA-Polyplexen über Rayleigh-Breakup-Aerosole: Eine in-vitro-Methode zur Nasenablagerung und funktionellen Tests

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DOI:

10.3791/70000

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20. Januar 2026

 ,  , 
1GKT School of Medical Education, Faculty of Life Sciences and Medicine, King's College London, 2Genetics, Faculty of Life Sciences and Medicine, King's College London, 3Institute of Pharmaceutical Science, King's College London

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll stellt die Rayleigh-Zersetzung als einen milden Prozess zur Aerosolisierung nicht-viraler mRNA-Vektoren dar. Die regionale Ablagerung für aerosolisierte mRNA-Vektoren wird mit dem Alberta Idealized Nasal Inlet (AINI)-Modell ausgewertet. Die Expression des grünen Fluoreszenzproteins (GFP) in menschlichen Lungenzellen stellt die Aufrechterhaltung physikochemischer und biologischer Funktionen post-aerosolisierter mRNA-Vektoren dar.

Zusammenfassung

Die intranasale Abgabe von mRNA-Therapeutika ist eine vielversprechende Strategie für Impfungen und die Behandlung von Atemwegserkrankungen und bietet eine direkte Immunaktivierung am Ort des Erregereintritts. Konventionelle Aerosolisierungsmethoden (z. B. Ultraschall- oder Hochdruckvernebler) verschlechtern jedoch nicht-virale mRNA-Vektoren durch übermäßige Scherkräfte, wodurch mRNAs ihre strukturelle Integrität und biologische Aktivitäten verlieren. Ein Rayleigh-Zerlegungs-Nasenverdampfer wurde verwendet, um Polyethyleneimin (PEI)-mRNA-Vektoren sanft in gleichmäßige Tröpfchen zu aerosolisieren. Das grüne fluoreszierende Protein (GFP)-kodierende mRNA wurde in kationische Polyplexe formuliert und charakterisierte die Vor- und Nach-Aerosolisation. Der Rayleigh-Zerfallprozess bildet einen kontinuierlichen Mikrojet von Tröpfchen mit minimaler Scherung, wodurch die physikochemischen Eigenschaften der Nanopartikel erhalten bleiben. Eine konstante Partikelgröße, ein niedriger Polydispersitätsindex und ein stabiles Zeta-Potenzial vor und nach der Aerosolisation wurden beobachtet, was bestätigte, dass die physikochemischen Eigenschaften der mRNA-Polyplexe durch Rayleigh-Zerstörung zur Aerosolisierung gut erhalten blieben. Mit einem Alberta Idealized Nasal Inlet (AINI)-Modell der nasalen Atemwege wurden die PEI-mRNA-Aerosole abgegeben. Die aerosolisierten mRNAs wurden hauptsächlich in den Nasenmuschelregionen abgelagert. Vernachlässigbare Fraktionen wurden im Nasopharynx- oder lungenäquivalenten Abschnitten gefunden. Zusätzlich wurden die post-aerosolisierten mRNA-Polyplexe erfolgreich an menschliche Lungenepithelzellen von A549 geliefert und erzeugten nachweisbare GFP-Expression. Dieses Protokoll demonstriert eine zerstörungsfreie intranasale mRNA-Abgabemethode unter Verwendung von Rayleigh-Breakup-Aerosolisierung. Es erhält effektiv die physikochemischen Eigenschaften und biologischen Funktionen nicht-viraler mRNA-Vektoren aufrecht, indem es die wässrige Phase in Tröpfchen geeigneter Größe für gezielte nasale Ablagerungen atomisiert. Dieses Protokoll offenbart einen neuartigen Ansatz zur effektiven Aerosolisierung mRNAs und zur Bewertung ihrer regionalen Ablagerung in der Nasenhöhle.

Einleitung

Die Verabreichung von Impfstoffen an die Nasenschleimhaut (das Eingangsportal für viele Atemwegskrankheitserreger) kann eine starke lokale Immunität hervorrufen und Infektionen an ihrer Quelle blockieren. Der Erfolg der intranasalen Grippeimpfstoffe und die jüngste Zulassung von intranasalen COVID-19-Impfstoffen unterstreichen die Wirksamkeit des nasalen Weges bei der Auslösung sowohl schleimhautiger als auch systemischer Immunantwort1. Die intranasale Abgabe von mRNA-Impfstoffen erregt daher großes Interesse als Strategie zur Vorbeugung von respiratorischen Viralinfektionen. Eine große technische Herausforderung besteht jedoch darin, empfindliche mRNA-Polyplexe in inhalierbare Aerosole umzuwandeln, ohne deren Stabilität zu beeinträchtigen.

Die Rayleigh-Zerfall-Aerosolisierung bietet eine sanfte Alternative, da sie nach einem anderen physikalischen Prinzip funktioniert. In einem Rayleigh-Zerfallgerät wird ein unter Druck stehender Flüssigkeitsstrom durch eine mikroskalige Öffnung gedrückt, um einen kontinuierlichen Mikrostrahl zu bilden. Der Jet zerfällt aufgrund der Plateau-Rayleigh-Instabilität2 natürlich in gleichmäßig große Tröpfchen. Die Oberflächenspannung führt dazu, dass die Flüssigkeitssäule bei einer charakteristischen Wellenlänge fragmentiert, die etwa doppelt so groß ist wie der Düsendurchmesser. Im Gegensatz zur Ultraschallverneblung führt dieser Prozess praktisch keine turbulente Scherung ein; Tröpfchen entstehen natürlich durch die Selbstinstabilität des Strahls, nicht durch äußere Splitterkräfte. Infolgedessen erfahren Nanopartikel-Formulierungen nur minimalen Stress. Es wurde gezeigt, dass die Verwendung von Rayleigh-Zerstörung Lipid-Nanopartikel-(LNP)-mRNAs aerosolisieren kann, ohne signifikante Veränderungen in ihrer Größe, Oberflächenladung oder Kapseleffizienz vor im Vergleich zu nachdem Sprühen 3,4,5. Bei dieser Methode bleibt die PEI-mRNA nach der Aerosolisierung intakt und funktionsfähig, im Gegensatz zur Verschlechterung bei härteren Verneblungstechniken.

Ein weiterer Vorteil der Rayleigh-Zerstörung ist die Kontrolle über die Tropfengröße. Die erzeugten Tröpfchen sind relativ groß (etwa 20–30 μm). Diese Tröpfchengröße ist ideal für die nasale Verabreichung: Partikel >10 μm im aerodynamischen Durchmesser neigen dazu, sich in der Nase und den oberen Atemwegen abzulagern, anstatt in die Lunge zu driften. Durch die Produktion von Tröpfchen, die größtenteils über dieser Schwelle liegen, zielt der Rayleigh-Zerstäuber auf natürliche Weise auf die Ablagerung in der Nasenhöhle ab. Die Zielerfassung wird weiter verbessert durch die Verwendung des Alberta Idealized Nasal Inlet (AINI)-Modells, um die Verabreichungstechniken zu optimieren. Der AINI ist eine 3D-gedruckte Nachbildung der nasalen Atemwege, die in vivo Sprühablagerungsmuster genau vorhersagt6. Mit diesem Modell wurde festgestellt, dass das Sprühen mit einem Winkel von 45° in das Nasenloch die Ablagerung der Nasenmuscheln starkerhöht. Der Verabreichungsaspekt beeinflusst das Absetzungsmuster7 erheblich. Ablagerungen in nicht-Zielbereichen wie Nasopharynx oder Lunge sind unerwünscht, da sie Halsreizungen, schlechten Geschmack oder systemische Nebenwirkungen verursachen können. In diesem Protokoll wurden diese Bedingungen repliziert (ein Sprühwinkel von 45° und kontrollierter Inhalationsluftstrom), um die Ablagerung der Turbinaten des mRNA-Aerosols3 zu maximieren. Frühere Daten zeigen, dass mehr als die Hälfte der abgegebenen mRNA-Masse unter optimalen Bedingungen in die Nasenmuschelregion konzentriert werden kann, während <10 % den Nasopharynx oder darüberhinaus 3 erreichen. Diese gezielte Abgabe soll die Wirksamkeit des Impfstoffs verbessern, indem die Dosis an den induktiven Immunstellen konzentriert wird (die gut gefäßgefässt und reich an Immunzellen sind) und gleichzeitig eine abweichende Ablagerung, die zu Abfall oder Nebenwirkungen führen könnte, minimiert wird.

In diesem Methodenartikel wird das experimentelle Verfahren zur Aerosolisierung von mRNA mittels Rayleigh-Zerlegung ausführlich beschrieben, wobei regionale Ablagerungen im AINI-Modell bewertet und die biologische Aktivität der abgelagerten mRNA in vitro bewertet werden. Eine Reporter-mRNA, die GFP codiert, wird verwendet, um Transfektionsergebnisse in menschlichen Zellen zu visualisieren. HEK293T Zellen werden ausgewählt, um die Funktionalität der aerosolisierten Komplexe zu testen. Um die zelluläre Aufnahme der aerosolisierten mRNA in vitro zu verbessern, wird die mRNA mit PEI verzweigt, um PEI-mRNA-Polyplexe zu bilden, bevor sie Zellen hinzugefügt werden. PEI ist ein kationisches Polymertransfektionsmittel, das die mRNA-Abgabeeffizienz verbessern kann, und hier wurde ein N:P-(Stickstoff: Phosphat)-Molarverhältnis von 24:1 verwendet, basierend auf früherer Optimierung für die Genlieferung. PEI wird in dieser Studie nur für den Zellkultur-Validierungsschritt verwendet und ist kein Teil der Aerosolabgabe an eine tatsächliche Nase (in vivo würde man sich ausschließlich auf LNP-mRNA verlassen, aber in der Zellkultur hilft dies, die Genexpression für den Nachweis zu maximieren).

Dieses Protokoll hebt einen neuen Ansatz zur intranasalen mRNA-Impfstoffabgabe hervor, der das Stabilitätsproblem der Aerosolisierung von mRNA adressiert. Die Rayleigh-Zerlegung wurde erst kürzlich ineinigen Studien auf die Nukleinsäureabgabe angewendet, 3,4,4,5,9, und diese Arbeit bietet einen detaillierten methodischen Leitfaden zur Umsetzung dieser Technik. Durch das Befolgen dieses Schritt-für-Schritt-Verfahrens können Forscher die sanfte Aerosolisierung von mRNA-Nanoträgern reproduzieren und deren Ablagerungs- und Transfektionseigenschaften bewerten. Der folgende Abschnitt zum Protokoll ist in aufeinanderfolgende Teile gegliedert: (1) PEI-mRNA-Formulierung; (2) Nanopartikelcharakterisierung (Größe und Zetapotenzial) vor und nach der Aerosolisation; (3) Betrieb des Rayleigh-Zerstörungsverdampfers und AINI-Nasenablagerungsverfahren. Wichtige Überlegungen für den Erfolg, wie das Aufrechterhalten von RNase-freien Bedingungen und die korrekte Ausrichtung der Geräte, werden notiert. Die Ergebnisse und Diskussion umfassen repräsentative Ergebnisse, Vorteile der Methode gegenüber herkömmlichen Ansätzen, potenzielle Anwendungen (z. B. Nasenimpfstoffe gegen Influenza oder COVID-19 10,11,12) sowie Einschränkungen und Tipps zur Fehlersuche. Diese umfassende Methodik zielt darauf ab, reproduzierbare intranasale mRNA-Abgabeexperimente zu ermöglichen und die Entwicklung nadelfreier mukosaler RNA-Impfstoffe zu beschleunigen.

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Protokoll

HINWEIS: Kultivierung HEK293T und A549-Zelllinien im vollständigen Medium, bestehend aus Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM), ergänzt mit 10 % fetalem Rinderserum (FBS) und 2 % Penicillin-Streptomycin vor der PEI-mRNA-Transfektion. Durchqueren Sie beide Zelllinien etwa alle 48 Stunden nach Erreichen der Zusammenfluss. Samenzellen mit einer Dichte von 40.000 Zellen pro cm² und Kultur für ~48 Stunden. Entfernen Sie das Kulturmedium und waschen Sie die Zellen unmittelbar vor der Transfektion mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), um Restserum zu entfernen und die Transfektionsbedingungen zu standardisieren. Autoklaven alle Zellkulturflaschen, 24-Well-Platten, PBS, Pipetten und Pipettenspitzen vor der Verwendung verwenden.

1. PEI-mRNA-Formulierung

  1. Bildung von PEI-mRNA-Komplexen (für In-vitro-Transfektion )
    HINWEIS: Dieser Schritt ist nur erforderlich, wenn PEI zur Steigerung der Transfektion in der Zellkultur verwendet wird.
    1. Berechnen Sie den erforderlichen PEI-Wert für das gewünschte N:P-Molarverhältnis.
      HINWEIS: N:P = 24 (das heißt 24 Mol positiv geladene Amine pro Mol negativ geladene Phosphate auf mRNA) wird verwendet; und eine Menge von 10 μg mRNA würde ~31 μg PEI erfordern, um PEI-mRNAs bei diesem N/P-Verhältnis zu bilden.
    2. Eine verdünnte PEI-Lösung (z. B. 1 mg/mL Brühe in Wasser) und autoklavieren.
    3. Verdünnen Sie die mRNA auf eine geeignete Konzentration (z. B. 0,2 μg/μL).
    4. Gib die PEI-Lösung der mRNA-Lösung beim sanften Mischen hinzu (nicht vortexen).
      HINWEIS: Die Mischung kann sich in einem kleinen Röhrchen befinden; Pipette vorsichtig auf und ab oder schnippe das Rohr zum Mischen an.
    5. Inkubieren Sie bei Raumtemperatur für ~20 Minuten, um die elektrostatische Bindung von PEI an mRNA zu ermöglichen.
      HINWEIS: Ohne PEI kann die nackte mRNA direkt aerosolisiert werden. Das zusätzliche PEI verbesserte die Genexpression in A549-Zellen erheblich, ist jedoch optional und könnte aufgrund von Toxizitätsüberlegungen nicht für die tatsächliche In-vivo-Verabreichung verwendet werden.

2. Nanopartikelcharakterisierung (Größe und Zetapotenzial)

HINWEIS: Richten Sie die Messparameter in der Software ein und speichern Sie die Methode, bevor Sie den Analysator zur Messung der Größe oder des Zeta-Potentials verwenden. Die Methodenkonfiguration ist erforderlich, um das Instrument zu betreiben, und die Parameter hängen von der Messumgebung, der verwendeten Cuvette und den Eigenschaften der Probe ab.

  1. Dynamische Lichtstreuung (DLS) vor der Aerosolisierung
    1. Mit einem Partikelgrößenanalysator wird eine verdünnte Probe der Formulierung in eine Einweg-Größenküvette geladen (z. B. 500 μL bei 0,2 μg/μL).
    2. Schalte den Analysator ein und öffne Software13 auf dem angeschlossenen Computer.
    3. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Messen " oben im Fenster.
    4. Klicken Sie auf das blaue Dateisymbol oben im Fenster, um die voreingestellte Größenmethode auszuwählen.
    5. Umbenenne das Protokoll so, dass es mit dem Sample-Namen übereinstimmt.
    6. Drücke den Deckelknopf des Analysators, um die Kammer zu öffnen.
    7. Führe die Cuvette in die Kammer.
    8. Klicken Sie auf die grüne Schaltfläche "Ausführen " oben im Softwarefenster. Warte, bis die Messung13 abgeschlossen ist.
    9. Klicken Sie oben im Softwarefenster auf die Schaltfläche Analysieren und dann auf der Ergebnisseite13 auf die Schaltfläche "Größe".
    10. Erhalten Sie den durchschnittlichen hydrodynamischen Durchmesser (Z-Durchschnitt) und den Polydispersitätsindex (PDI) aus der Statistiktabelle.
    11. Drücken Sie den Deckelknopf des Analysators, um die Kammer zu öffnen, nehmen Sie die Cuvette heraus und schließen Sie den Deckel.
    12. Entsorgen Sie die Cuvette und spülen Sie den Zerstäuber mit RNAase-freiem Wasser und 70 % V/V-Ethanol, um zu desinfizieren und das Trocknen zwischen den Größenmessungen zu erleichtern.
      HINWEIS: Beim Rayleigh-Verdampfer sollten keine Salzablagerungen oder Rückstände in der Düse verbleiben, da diese die Sprühleistung beeinträchtigen können.
  2. Zeta-Potential vor der Aerosolisierung
    1. Verwenden Sie dasselbe Gerät (oder einen Zeta-Potentialanalysator) und laden Sie eine verdünnte Probe der Formulierung in eine gefaltete Kapillarzelle (z. B. 700 μL bei 0,2 μg/μL).
    2. Schalte den Analysator ein und öffne Software13 auf dem angeschlossenen Computer.
    3. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Messen " oben im Fenster.
    4. Klicken Sie auf das blaue Dateisymbol oben im Fenster, um die voreingestellte Zeta-Methode auszuwählen.
    5. Umbenenne das Protokoll so, dass es mit dem Sample-Namen übereinstimmt.
    6. Drücke den Deckelknopf des Analysators, um die Kammer zu öffnen.
    7. Führe die Cuvette in die Kammer.
    8. Klicken Sie auf die grüne Schaltfläche "Ausführen " oben im Softwarefenster. Warte, bis der Automat13 läuft.
    9. Klicken Sie oben im Softwarefenster auf die Schaltfläche Analysieren und dann auf die Zeta-Schaltfläche auf der Ergebnisseite13.
    10. Erhalten Sie das Zeta-Potential (Oberflächenladung) durch Betrachtung der Statistiktabelle.
    11. Drücken Sie den Deckelknopf des Analysators, um die Kammer zu öffnen, nehmen Sie die Probe heraus und schließen Sie den Deckel.
    12. Spülen Sie die Cuvette und den Zerstäuber mit RNAase-freiem Wasser und 70 % V/V-Ethanol, um die Trocknung zwischen den Zeta-Potenzialmessungen zu desinfizieren und zu erleichtern.
      HINWEIS: Beim Rayleigh-Verdampfer sollten keine Salzablagerungen oder Rückstände in der Düse verbleiben, da diese die Sprühleistung beeinträchtigen können.

3. Rayleigh-Zerstörung, Aerosolisierung und Nasenablagerung

  1. Atomizer und AINI-Setup
    1. Stellen Sie das Rayleigh-Zerstörungs-Nasenverdampfer-Gerät und das Alberta Idealized Nasal Inlet (AINI)-Modell zusammen.
      HINWEIS: Das AINI-Modell besteht aus anatomisch repräsentativen Hohlschnitten, die verschiedenen Bereichen der menschlichen Nasenhöhle entsprechen (z. B. Nasenlochvestibül, Nasenmuschelregion, olfaktorische Region, Nasopharynx).
    2. Stellen Sie sicher, dass alle AINI-Komponenten vor der Verwendung sauber und trocken sind (Rückstände können die Abscheidungsergebnisse beeinflussen). Reinigen Sie durch Waschen mit deionisiertem Wasser9 und dann mit Ethanol oder einem organischen Lösungsmittel.
    3. Schließen Sie das AINI an einen Next Generation Impactor (NGI) an, der an einer Vakuumpumpe am Ausgang angeschlossen ist, um Luftstrom durch die Nasengänge zu leiten.
    4. Stellen Sie die Durchflussrate auf 7,5 L/min ein – ein Fluss, der bei einem erwachsenen6 eine langsame, tiefe Naseninhalation darstellt. Verwenden Sie ein kalibriertes Durchflussmessgerät (oder ein Rotationsmessgerät), das am Induktionsport des NGI befestigt ist. Stellen Sie die Pumpe ein, bis das Durchflussmessgerät 7,5 L/min anzeigt.
      HINWEIS: Verwenden Sie ein Durchflussmessgerät, um den Luftstrom bei der erforderlichen Durchflussrate für die Prüfung zu messen.
    5. Halten Sie diesen Luftstrom während der gesamten Sprühdauer aufrecht. Verwenden Sie Parafilm, um das Gerät richtig am AINI abzudichten.
  2. Positionierung des Verdampfers
    1. Setzen Sie die Düse des Rayleigh-Zerstäubers in den Eingang des AINI-Nasenlochs (Vestibülabschnitt) in einen Winkel von 45° ein.
    2. Sichern Sie den Verdampfer so, dass er sich während des Betriebs nicht verschiebt (alle Verbindungen, Modellabschnitte, Schläuche zur Pumpe) sind luftdicht.
  3. Laden der Probe
    1. Mischen Sie die vorbereitete PEI-mRNA-Suspension vorsichtig, um die Homogenität zu gewährleisten (Blasen zu vermeiden).
    2. Nehmen Sie die Probe in das Verdampferreservoir.
      HINWEIS: Je nach Gerätedesign kann dies das Einfüllen einer Spritze oder Pipettenspitze beinhalten, die am Verdampfer befestigt wird.
    3. Laden Sie die Probe in das Gerät.
      HINWEIS: Zum Beispiel entferne eine zentrale Kappe oder Kammer im Verdampfer, pipettiere die Probe ein und setze das Gerät dann sicher wieder zusammen. Stellen Sie sicher, dass keine Undichtigkeiten vorhanden sind und das Gerät bei Bedarf richtig grundiert ist.
  4. Erzeugung des Aerosols
    1. Schalten Sie den Luftstrom (7,5 L/min durch den AINI) der Luftpumpe vor oder gleichzeitig mit dem Sprühen ein, gemäß den Anweisungen des Geräts.
    2. Aktiviere den Rayleigh-Zerstäuber, um mit der Aerosolisierung zu beginnen.
      HINWEIS: Bei einem manuellen, spritzengetriebenen Verdampfer sollte man den Spritzenkolben stetig drücken, um die Flüssigkeit durch die Öffnung zu drücken. Sprühe das gesamte Probevolumen in einem durchgehenden Durchgang ein, wenn möglich. Der Kolben sollte sanft gedrückt werden, um einen stabilen Betriebsdruck zu erzeugen, da die Formulierung erst nach erhöhtem Druck und der Aussetzung einer Wandscherrate imMikro-Orifice 14 aerosolisiert wird. Schnelle Kolbenbewegungen verändern den Druck und verändern somit sowohl die Scherrate als auch die Scherbelichtungszeit14.
    3. Stellen Sie sicher, dass die Durchflussmenge durchgehend bei 7,5 L/min bleibt. Die Aerosoltröpfchen sollten durch das Nasengängmodell wandern und je nach aerodynamischer Größe an verschiedenen Regionen abgelagert werden.
    4. Schalten Sie die Luftpumpe umgehend ab, um zu verhindern, dass bereits abgelagerte Tröpfchen weiter nach unten gezogen werden oder ungleichmäßig austrocknen.
  5. Probenentnahme vom AINI
    1. Zerlegen Sie das AINI-Modell sorgfältig in einzelne anatomische Segmente, um abgelagerte Nanopartikel aus jeder Region zu sammeln.
      HINWEIS: Beachten oder markieren Sie vor dem Zerlegen die Ausrichtung, um die Abschnitte im Blick zu behalten.
    2. Sammeln Sie Ablagerungen aus sechs Kompartimenten: (i) dem Verdampfergerät, (ii) dem Nasenvestibülabschnitt, (iii) dem Nasenmuschelabschnitt, (iv) dem Riechbereich, (v) dem Nasopharynx-Abschnitt und (vi) jeglichen nachgelagerten Aufnahmen (z. B. Stufen eines angesetzten NGI oder eines Endfilters, der die lungendurchdringende Fraktion repräsentiert)
    3. Für jedes Kompartiment verwenden Sie ein gemessenes Volumen an Zellkulturmedium, um das abgeschiedene Material auszuwaschen.
      HINWEIS: Um beispielsweise die Turbinatenablagerung aufzufangen, wird der Nasenmuschelabschnitt abgetrennt und die Innenflächen gründlich mit 5 ml Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) mit einer Einwegpipette gespült. Wasche alle Oberflächen vorsichtig und gieße die Spülung dann in ein beschriftetes 15-mL-Zentrifugenrohr (benutze einen Trichter zur Unterstützung des Überflusses). Während des Spülens wurde das Segment horizontal oder leicht geneigt gehalten, um einen vollständigen Kontakt mit der inneren Oberfläche zu gewährleisten und das Ausweichen von Flüssigkeit zu verhindern. Wiederholen Sie dies ähnlich für das Vestibül, den Geruchssinn, den Nasopharynx und alle anderen Abschnitte, verwenden Sie für jeden 5 ml frisches DMEM und sammeln Sie sie in separaten beschrifteten Röhren.
    4. Nehmen Sie alle Restproben aus dem Verdampfergerät zurück.
      HINWEIS: Bei einer Spritze spülen Sie die Spritze und die Düse in ein Rohr.
    5. Holen Sie die Flüssigkeit aus den NGI-Stufen (Cascade Impactor), wenn das AINI mit einem NGI verbunden war, um feine Partikel einzufangen (z. B. durch Abspülen der Stufen mit DMEM).
    6. Decke den Schlauch mit der gesammelten Flüssigkeit ab.
      HINWEIS: Vermeiden Sie den Verlust von Tröpfchen auf der Werkbank oder durch Verdunstung.
  6. Nach-Sammlungs-Bearbeitung
    1. Unmittelbar nach der Entnahme wurden die PEI-mRNA-Proben separat auf Zellen zur Transfektion eingesetzt.
      HINWEIS: Die PEI-mRNA-Proben dürfen für ~1–2 Stunden (maximal 6 Stunden) im Kühlschrank liegen, bevor sie für die Transfektion verwendet werden. Ein bestimmtes Volumen (maximal 1 ml) wird aus jeder gesammelten PEI-mRNA-Probe entnommen, um die post-aerosolisierten Vektoren (d. h. DLS- und Zeta-Messungen) zu charakterisieren.
  7. Reinigung des Geräts
    1. Reinigen Sie den Zerstäuber und das AINI-Modell nach jedem Durchlauf gründlich, um eine Kreuzkontamination nachfolgender Experimente zu vermeiden.
    2. Spülen Sie alle AINI-Abschnitte und die Zerstäuberteile mit deionisiertem Wasser, um Medien und Nanopartikel zu entfernen, und anschließend mit 70 % Ethanol zur Desinfektion und Erleichterung des Trocknens.
      HINWEIS: Wenn das Gerät oder Modell kleine Öffnungen hat, spülen Sie diese mit einer Spritze.
    3. Trockne alle Teile vollständig zum Luften (oder stelle sie in einen Trockenschrank bei niedriger Hitze), bevor du sie wieder zusammenbaust. Beim Rayleigh-Verdampfer sollten keine Salzablagerungen oder Rückstände in der Düse verbleiben, da diese die Sprühleistung beeinträchtigen können.

4. Zellbildgebung

HINWEIS: Nach der Transfektion werden das Transfektionsmedium entfernt und durch ein frisches, vollständiges Medium ersetzt, um die Belichtung zu beenden. Zellen für 48 Stunden kultivieren, um die Expression des Reporters und die Zellwiederherstellung zu ermöglichen. Bei ~80 % Konfluenz fixieren Sie die Zellen mit 4 % Formaldehyd für 8 Minuten, dann färben Sie die Kerne mit 4',6-Diamidino-2-Phenylindol (DAPI; 300 nM) für 5 Minuten, gefolgt von einer zweifachen PBS-Spülung vor der Bildgebung.

  1. Fluoreszenzbildgebung
    1. Verwenden Sie ein Fluoreszenzmikroskop mit Filtersätzen für DAPI und GFP.
    2. Beginnen Sie mit dem Blauen Kanal (Anregungswellenlänge = 385 nm, Emissionswellenlänge = 477,5 nm), um DAPI-gefärbte Kerne zu visualisieren.
    3. Wechsel zum Grünen Kanal (Anregungswellenlänge = 488 nm, Emissionswellenlänge = 525 nm), um GFP-positive Zellen zu visualisieren.

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Ergebnisse

Als methodenorientiertes Manuskript sind detaillierte Ergebnisse nicht das Hauptziel; repräsentative Ergebnisse werden jedoch präsentiert, um die erwarteten Ergebnisse jedes Teils des Protokolls zu veranschaulichen. Die unten genannten Abbildungen zeigen Beispieldaten (z. B. Grafiken oder Bilder), die die Validität der Methode stützen, aber es sind keine neuen quantitativen Analysen über die Demonstration hinaus enthalten.

Tröpfchengröße und Ablagerung...

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Diskussion

In diesem Protokoll wird die mRNA vor der Aerosolisierung der Formulierung mit PEI verzweigt, um die zelluläre Aufnahme zu verbessern. Dies dient als Ersatz für die LNP-mRNA-Lieferung während der In-vitro-Validierung 10,15. PEI-mRNA bewahrt die meisten Funktionen von LNP-Formulierungen, einschließlich wichtiger biologischer und funktionaler Eigenschaften10. Die positiv geladenen Amingruppen in PEI...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Die Autoren würdigten die finanzielle Unterstützung durch das King's Undergraduate Research Fellowship (KURF) und den Student Opportunity Fund des King's College London.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
50-mL-ZentrifugenröhrenSigma-Aldrich Company LimitedCLS430829-500EA
50 & Dash; 1000 & mu; L-PipettenspitzenSigma-Aldrich Company LimitedZ740031-1000EA
A549-ZellleitungSammlung der amerikanischen TypkulturATCC CRM-CCL-185
LuftdurchflussmesserN/AN/AEin generischer Luftstrommesser kann verwendet werden.
Alberta Idealized Nasal Intake (AINI) ModellTSI Incorporated (über Copley Scientific, UK)0001-01-8540
Autoklav-IndikatorbandSigma-Aldrich Company LimitedZ744090
DAPISigma-Aldrich Company LimitedD1306
DMEM (Dulbeccos modifizierter Eagle Medium)Gibco, Thermo Fisher Scientific11966025
Reiner EthylalkoholSigma-Aldrich Company Limited32221-MGekauft über Merck
Fetales Rinderserum (FBS)Gibco, Thermo Fisher ScientificA5256701
FormaldehydSigma-Aldrich Company LimitedF8775
HEK293T ZelllinieSammlung der amerikanischen TypkulturATCC CRL-3216
Heraeus HERAsafe HS 12 BiosicherheitsschrankHeraeusN/A
Nächste Generation des ImpaktorsMSPs, eine Abteilung des TSI0170-01-1000Dieses Produkt ist auch im Copley-Katalog, Teilenummer 5201, enthalten.
Nikon DS-Qi2 Monochrome MikroskopkameraNikonN/A
Nunc Zellkultur behandelte MultidishesThermo Fisher Scientific142475
Nunc EasYFlask-Zellkultur-behandelte FlaschenThermo Fisher Scientific156340
ParafilmSigma-Aldrich Company LimitedP7793-1EA
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/mL)Gibco, Thermo Fisher Scientific15140148
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) TablettenThermo Fisher Scientific18912014
PolyethyleniminhydrochloridSigma-Aldrich Company Limited764965-1GGekauft über SLS
Rayleigh Jet NasenverdampferResyca BV EnschedeWeicher Nasenspray-Adapter
RNAse-freies WasserThermo Fisher ScientificJ60610. EQC
Größen-CuvetteMalvern PanalyticalZEN0040
Die gefaltete KapillarzelleMalvern PanalyticalDTS1070
Zetasizer ProMalvern PanalyticalZetasizer Pro
Zetasizer Ultra-Pro ZS Xplorer SoftwareMalvern PanalyticalN/A

Referenzen

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