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Methodenartikel

Entwicklung und Anwendung von strahleninduzierten Hautverletzungs-Tiermodellen basierend auf Strontium-90-β-Strahlen

432 Ansichten

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DOI:

10.3791/70010

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27. Januar 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Radiation Medicine, West China School of Basic Medical Sciences & Forensic Medicine, Sichuan University, 2Precision Radiation in Oncology Key Laboratory of Sichuan Province, Radiotherapy Center, Sichuan Clinical Research Center for Cancer, Sichuan Cancer Hospital & Institute, Affiliated Cancer Hospital of University of Electronic Science and Technology of China, 3The Second Affiliated Hospital of Chengdu Medical College, China National Nuclear Corporation 416 Hospital, 4School of Medicine, Southwest University of Science and Technology, 5Transformation Foundation of Tianfu Jincheng Laboratory

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll vor, um reproduzierbare Tiermodelle strahleninduzierter Hautverletzungen unter Verwendung von Strontium-90 (90Sr) β-Strahlung zu etablieren. Dieses Protokoll ermöglicht die Untersuchung von Dosiseffekten und entzündlichen Reaktionen bei oberflächlichen Strahlenschäden und bildet die Grundlage für zukünftige mechanistische Studien.

Zusammenfassung

Strahlenbedingte Hautverletzungen sind eine schwere Komplikation, die häufig in nuklearen Notfällen oder strahlenbedingten Tätigkeiten auftreten und die Einrichtung standardisierter, spezifischkeitsorientierter Verletzungsmodelle für mechanistische Forschung erforderlich macht. Konventionelle Gamma- oder hochenergetische Röntgenstrahlen mit starker Eindringkraft verursachen Hautschäden, lösen aber zwangsläufig komplexe Tiefengewebsreaktionen aus, die die Untersuchungen oberflächlicher Hauteffekte beeinträchtigen. Angesichts des Risikos ausgeprägter oberflächlicher Gewebeschäden durch β-Strahlung in Szenarien wie nuklearem Fallout haben wir ein Strontium-90 (90Sr) β-Strahlen-basiertes Tiermodell von strahleninduzierten Hautverletzungen entwickelt, um diese Herausforderung zu adressieren. Dieses Modell nutzt die physikalische Eigenschaft von β-Strahlen, die überwiegend Energie in oberflächlichen Geweben ablagern und so eine präzise Simulation lokaler biologischer Effekte durch den Kontakt mit der Haut von Strahlungsmaterial ermöglichen, während potenzielle systemische Reaktionen durch tief durchdringende Strahlung vermieden werden. Diese Studie skizziert systematisch den gesamten Arbeitsablauf, einschließlich der 90Sr Strahlungsquellenparameterisierung, Tierbestrahlungsprotokollen sowie pathologischer Probenentnahme und -bewertung. Dieses Modell bietet ein zuverlässiges tierisches Werkzeug zur Aufklärung der pathophysiologischen Mechanismen strahlenbedingter Hautverletzungen und zur Förderung der Entwicklung mechanistischer Untersuchungen oder therapeutischer Strategien.

Einleitung

Ionisierende Strahlung wird in mehreren Bereichen weit verbreitet eingesetzt, darunter Energie, Medizin, Industrie und Landwirtschaft. Obwohl es erhebliche Vorteile bringt, stellt es auch direkte und potenzielle Bedrohungen für die menschliche Gesundheit dar, insbesondere für Berufsbeschäftigte und Krebspatienten 1,2. Da die Haut das größte Organ des Körpers ist und seine äußere Hülle bildet, dient sie zwangsläufig als Hauptziel bei der Exposition gegenüber ionisierender Strahlung. Die Haut besteht aus Epidermis, Dermis und subkutanem Gewebe und erfüllt unentbehrliche physiologische Funktionen. Die Mechanismen, die der strahlenbedingten Hautverletzung zugrunde liegen, sowie die wirksamen Strategien zur Prävention und Behandlung sind jedoch weiterhin unzureichend aufgeklärt. Daher besteht ein dringender Bedarf an einem standardisierten und reproduzierbaren experimentellen Modell, das gezielt strahlenbedingte Hautverletzungen in der oberflächlichen Schicht anspricht und für mechanistische und interventionelle Studien geeignet ist. Folglich haben wir zur Weiterentwicklung der Forschung in diesem Bereich erfolgreich ein neuartiges Tiermodell für Strahlenschäden durch Hautverletzungen etabliert.

In konventionellen Studien wird hochenergetische Strahlung, wie Röntgen- oder γ-Strahlen, häufig verwendet, um Hautverletzungen zu induzieren (Modelle 3,4). Diese Arten von Strahlung besitzen eine hohe Durchdringungsfähigkeit, die es ihnen ermöglicht, leicht mit subkutanen und tieferen Geweben und Organen zu interagieren. Folglich verursachen sie zwar Hautschäden, lösen aber auch umfangreiche Reaktionen in tieferen Geweben aus, was die Spezifität des Modells für die hautfokussierte Forschung beeinträchtigt und die Interpretationder Ergebnisse erheblich erschwert. Dieser Mangel an Gewebespezifität stellt eine große Einschränkung dar, wenn das Hauptziel der Forschung die Untersuchung von hautbeschränkter Strahlenschädigung und nicht systemischer Strahlenwirkungen ist.

Im Gegensatz dazu haben wir ein spezifischeres und verfeinertes Hautverletzungsmodell entwickelt, das die Eigenschaften der Strontium-90 (90Sr)-β-Strahlung nutzt, nämlich deren niedrige Energie und begrenzte Gewebepenetration. Forschungen haben gezeigt, dass der durch β-Strahlen verursachte Schaden überwiegend auf die epidermale und dermale Hautschicht beschränktist, wodurch die Interferenz durch die Tiefengewebsreaktion effektiv minimiert wird. Im Vergleich zu Hochpenetrationsstrahlenmodellen ermöglicht dieser Ansatz eine präzise Lokalisierung der Verletzung, eine Reduzierung der Beteiligung der viszeralen Organe und eine verbesserte Interpretierbarkeit hautspezifischer pathologischer und entzündlicher Veränderungen. Darüber hinaus ist die Verwendung von β-Strahlen zur Erstellung eines Radiodermatitis-Modells auch durch kritische Überlegungen potenzieller realer Bedrohungen gerechtfertigt. Lehren aus dem Nuklearunfall von Tschernobyl zeigen, dass hochdosierte äußere Exposition gegenüber β Partikeln zu schweren β Verbrennungen und sogar tödlichen Verletzungen führenkann 7. Darüber hinaus bestehen potenzielle langfristige Gesundheitsrisiken durch β-Strahlung durch Strahlenverunreinigungen 8,9.

Um diese Mechanismen zu erforschen, ist es ebenfalls entscheidend, ein geeignetes Tier für die β-Strahlenbestrahlung auszuwählen. Obwohl Minipigs erfolgreich zur Etablierung von Modellen mit Hautverletzungendurch β-Strahlen 10,11 eingesetzt wurden, ist ihre allgemeine Anwendbarkeit in der Forschung im Vergleich zu Mäusen begrenzter. Darüber hinaus ist ein zentrales Merkmal der Maushaut ihre hohe Haarfollikeldichte, was sie zu einem geeigneten Modell macht, um die Auswirkungen von Strahlung auf Hautanhängsel bei der Untersuchung von Strahlenschäden zu untersuchen. Daher hat die Verwendung eines Mausmodells bemerkenswerte Vorteile. Darüber hinaus bieten Mausmodelle praktische Vorteile, darunter geringere Kosten, höheren Durchsatz, genetische Manipulierbarkeit und eine breitere Kompatibilität mit molekularen und immunologischen Analysen, was sie besonders für mechanistische Studien und Interventionsscreenings geeignet macht.

Entzündliche Zytokine sind biologisch aktive kleine Moleküle oder Proteine, die sowohl von Immun- als auch von Nicht-Immunzellen ausgeschieden werden und grob als proinflammatorisk oder antiinflammatorisk klassifiziert werden. Bei Hautschäden, die durch ionisierende Strahlung verursacht werden, sind diese Zytokine die Haupttreiber. Tatsächlich ist dieser Schaden im Grunde eine unkontrollierte entzündliche Erkrankung, die hauptsächlich durch ein Netzwerk von Zytokinen und Chemokinenorchestriert wird. IL-6 ist ein wichtiger proinflammatorischer Mediator und eines der entscheidenden Zytokine, die an akuten entzündlichen Reaktionen auf Strahlung und Infektion beteiligt sind. Neuere Studien haben gezeigt, dass Strahlung den IL-6/STAT3-Signalweg und die zelluläre Seneszenz aktiviert, wodurch die Infiltration von Immunzellen gefördert und zu Strahlendermatitis, Hautentzündungen und Haarausfall beiträgt16. Interessanterweise zeigt es auch radioschutzliche Effekte unter bestimmten Kontexten17,18. Im Gegensatz dazu ist IL-10 ein wichtiger entzündungshemmender Regulator. Zu seinen Funktionen gehören die Begrenzung übermäßiger Entzündungsreaktionen, die Stärkung des angeborenen Immunsystems, die Förderung von Gewebereparaturmechanismen sowie die Aufrechterhaltung der Gewebehomöostase während Infektionen und Entzündungen19,20. IL-10 wirkt häufig zusammen mit IL-6 und zeigt positive Effekte bei der Förderung der dermalen Wundheilung, der Verringerung von Narbenbildung und der Linderung bestimmter dermatologischer Erkrankungen 21,22,23. Obwohl bestehende Forschungen gezeigt haben, dass IL-6 und IL-10 auf Strahlung bzw. ultraviolette Exposition reagieren,16, 24, 25, bleiben ihre Reaktionen auf β-Strahlung unklar.

Zusammenfassend hat diese Studie das Ziel, ein stabiles und reproduzierbares Mausmodell der strahleninduzierten Hautverletzung durch 90Sr β-Strahlung zu etablieren. Dieses Modell ist besonders geeignet für Studien, die sich auf Hautstrahlenschäden, β-Strahlenexpositionen, Entzündungsregulation, Hautanhängselschäden und langfristige Geweberemodellierung konzentrieren. Es ist jedoch nicht dazu gedacht, Tiefengewebe- oder solide Tumorstrahlentherapie zu replizieren, was typischerweise eine stark durchdringende Strahlung wie Röntgen- oder γ-Strahlen erfordert. Wir stellen die Verfahren zur Modellbildung und zur systematischen Validierung seiner Machbarkeit durch mehrstufige Bewertungen vor, einschließlich Strahlenschadenswertung, histologischer Untersuchung und molekularer Expression wichtiger Zytokine (IL-6 und IL-10). Die dynamische Analyse dieser Parameter wird dazu beitragen, die regulatorischen Rollen von IL-6 und IL-10 im Verletzungsprozess zu klären und so eine solide experimentelle Grundlage und theoretische Referenz für die Entwicklung gezielter Interventionsstrategien in der Zukunft bieten.

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Protokoll

Alle experimentellen Verfahren mit Tieren wurden vom Ethics Committee für Tierversuche der West China School of Basic Medical Sciences & Forensic Medicine (Chengdu, China) überprüft und genehmigt.

1. Tiervorbereitung

  1. Tierhaltung und Gruppierung
    1. Weisen Sie zwölf weibliche C57BL/6J-Mäuse der SPF-Qualität (Gewichtsklasse: 18–25 g, Alter: 3 Monate) vier Standard-Belüftungskäfige zu und teilen Sie sie zufällig in vier Gruppen (n=3) für die Exposition gegenüber unterschiedlichen Dosen externer Bestrahlung (eine nicht-bestrahlte Kontrollgruppe und 3 experimentelle Bestrahlungsgruppen).
    2. Halten Sie alle Tiere in einem 12-Stunden-Licht/Dunkel-Zyklus mit ad-libitum-Zugang zu normaler Nagetiernahrung und Wasser.
    3. Verwenden Sie nummerierte Ohrmarken, um jede Maus eindeutig zu identifizieren und zwischen experimentellen Gruppen zu unterscheiden.
    4. Lassen Sie die Versuchstiere drei Tage lang an die neue Umgebung gewöhnen, bevor weitere Eingriffe durchgeführt werden.
    5. Setzen Sie eine Sprague Dawley (SD) Ratte (Alter: 2 Monate; Gewicht: ca. 160 g) unter identischen Bedingungen auf.
  2. Anästhesie
    1. Betäuben Sie die Mäuse durch intraperitoneale Injektion von 1,25 % Tribromoethanol-Lösung. Um eine sichere Anästhesie zu gewährleisten, berechnen Sie das Injektionsvolumen basierend auf dem Körpergewicht und verabreichen Sie 15–20 mL/kg Körpergewicht gemäß festgelegten Referenzstandards.
  3. Vorbereitung der Bestrahlungsstelle
    1. Nach der Narkose wird das Fell über der vorgesehenen dorsalen Bestrahlungsstelle mit elektrischer Schermaschine entfernt.
    2. Mit einem roten Markerstift und einer vorgefertigten, starren Schablone von etwa 3 cm Durchmesser markieren Sie eine kreisförmige Fläche zur Bestrahlung auf der rasierten Rückenhaut.
      HINWEIS: Enthaarungscremes werden nicht verwendet, da sie Hautreizungen verursachen und möglicherweise die histologische Architektur verändern können, was die experimentellen Ergebnisse verwirrt.

2. Dosisberechnung für die Bestrahlung

HINWEIS: 90Sr emittiert durch seinen Zerfall auf 90Y hochenergetische β-Strahlen (Abbildung 1A). β-Strahlen haben eine schlechte Durchschlagsleistung und betreffen typischerweise nur die Epidermis. Die präzise Bestimmung der Bestrahlungszeit bei Mäusen erfordert die Berechnung der absorbierten Dosisrate (D, cGy/s).

  1. Berechnen Sie die Zerfallskonstante (λ) aus der physikalischen Halbwertszeit (T1/2) mit folgender Formel:
    T1/2 ≈ 0,693/λ
    Da die Halbwertszeit von 90Sr etwa 28,6 Jahre beträgt, ≈ λ 0,02423 Jahr-1.
  2. Berechnen Sie die Anzahl der Radionuklide (N) mit folgender Formel:
    A = λ N
    Wobei:
    A: Radioaktivität (mCi)
    N: Anzahl der Radionuklide nach der Zeit t (Jahre)
    Mit einer anfänglichen Radioaktivität A0 = 30 mCi (1 Ci = 3,7x1010 Bq) und λ ≈ 0,02423,
    N0 = A0/λ = 1238,13454
    Dann wenden wir das allgemeine Strahlungsabfallgesetz an, d. h. die Anzahl der Radionuklide nimmt im Laufe der Zeit exponentiell ab:
    dN/dt = -λ N
    Integration ergibt:
    N = N0 е-λt
    Wobei:
    N0: Anfangszahl der Radionuklide bei t = 0
    N: Anzahl der verbliebenen Radionuklide nach der Zeit t
  3. Schließlich berechnet man die absorbierte Dosisrate D in cGy/s mit folgender Formel:
    Umwandlungsformel für die absorbierte Dosisrate eines 90 Sr-90Y-Applikators:
    D = [(A×1770/S) ×(E90Y/E32P) ×Fm] /3600 = (A/S) ×0,6347
    Wobei
    D: Absorbierte Dosisrate (cGy/s)
    A: Millicurie (mCi)
    S: Fläche (cm2)
    1770: Ionisationskonstante für 32P
    E90Y: Durchschnittsenergie = 0,93 MeV
    E32P: Durchschnittsenergie = 0,693 MeV
    FM: Expositions-zu-Dosis-Umwandlungsfaktor (0,962)
    3600: Stunden-zu-Sekunde-Umrechnungsfaktor
    HINWEIS: Die Berechnungen der 90Sr-Parameter sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Eine Beispielberechnung ist unten dargestellt:
    Am 3. März 2023:
    Applikator-Außendurchmesser = 3 cm, Innendurchmesser = 2,47 cm, Radius = 1,235 cm, Radioaktivität A = 30 mCi
    S = π ×1,2352
    D=(A/S) ×0,6347 ≈ 3,9738 cGy/s
    Am 3. November 2023 (t = 0,583 Jahre später):
    N(t) = N0 е-λt = 1238,13454×e-0,02423×0,583 ≈ 1220,7675
    A(t) = λN(t) = 0,02423×1220,7675 ≈ 29,579 mCi
    D = (A/S) ×0,6347 ≈ 3,918 cGy/s
    Nach t = 2,25 Jahre:
    N = N0 е-λt ≈ 1238.13454×e-0.02423×2.25 ≈ 1172.4391
    A = λN ≈ 0,02423×1172,4391 ≈ 28,408 mCi
    D = (A/S) ×0,6347 ≈ 3,7629 cGy/s
  4. Berechnen Sie die Bestrahlungszeit jeder Dosisgruppe anhand der erhaltenen Daten (siehe Tabelle 2).

3. Bestrahlung

HINWEIS: Obwohl β-Strahlen, die von 90Sr emittiert werden, nur begrenzt durchdringen und typischerweise nur die Epidermisschicht betreffen (Abbildung 1D), stellen sie dennoch potenzielle Risiken für die menschliche Gesundheit dar. Stellen Sie sicher, dass alle Verfahren mit 90Sr-Quellen angemessene Schutzmaßnahmen einhalten, um die Strahlenbelastung für Betreiber und Umwelt zu minimieren. Bediener müssen eine spezialisierte Schulung im Umgang mit Strahlungsquellen absolvieren. Die Verfahren zum Umgang und zur Nutzung von Strahlungsquellen hielten sich strikt an die internationalen Standards, die in den Empfehlungen der Internationalen Kommission für Strahlenschutz 2007 (ICRP-Publikation 103) festgelegt sind.

  1. Vorbereitung vor der Nutzung: Reichen Sie einen Antrag auf Nutzung von 90Sr-Quellen ein. Nach Genehmigung durch den Vorgesetzten sammeln Sie den Laborschlüssel und den Entschärfungscode des Alarmsystems.
  2. Bereiten Sie alle benötigten Materialien vor, darunter Mäuse mit rasierten und markierten Rückenbereichen, 1-ml-Spritzen, Tribromoethanol-Lösung, lebensmittelfähige Plastikfolie, Zeitschaltuhren, Klebeband und Schaumstoffplatten.
  3. Mausvorbehandlung
    1. Betäuben Mäuse durch intraperitoneale Injektion von Tribromoethanol-Lösung (siehe Schritt 1.2).
    2. Sobald sie vollständig sediert ist, legen Sie die Maus mit dem Rücken oben auf ein starres Brett, bedecken Sie die Rückenseite mit Frischhaltefolie und sichern Sie die Folie mit Klebeband.
  4. Bestrahlungsverfahren
    1. Betreten Sie den Raum für Strahlungsquellen, deaktivieren Sie das Alarmsystem, ziehen Sie Schutzkleidung an (Schutzanzug, Kappe, Schutzbrille und persönliches Dosimeter) und holen Sie dann die 90Sr-Quelle aus dem Bleischild.
    2. Befestige eine Metallstange am oberen Knopf der Quelle, um den Applikator anzuheben und zu bewegen.
    3. Um β strahlenbedingte Hautverletzung zu simulieren, die für Nuklearunfälle oder berufliche Exposition relevant ist, positionieren Sie die emittierende Oberfläche (Abbildung 1B) des 90Sr Applikators über dem markierten rasierten dorsalen Bereich der anästhesierten Maus (Abbildung 1C). Starte den Timer sofort nach der Platzierung. Genau nach der voreingestellten Dauer zieht man den Applikator zurück und lagert ihn vorübergehend im ursprünglichen Behälter.
      VORSICHT: Schauen Sie niemals den Po des Applikators zum Personal.
    4. Stelle die 90Sr-Quelle nach der Nutzung wieder an den Führungsschild zurück.
      HINWEIS: Für die 10-Gy×5-Gruppe bestrahlen Sie einmal täglich an 5 aufeinanderfolgenden Tagen, um eine Gesamtdosis von 50 Gy zu erreichen.
  5. Schritte nach der Bestrahlung
    1. Schließen Sie den Inspektionsprotokoll der Strahlungsquelle und das Nutzungsprotokoll der Strahlungsquelle aus, aktivieren Sie das Alarmsystem erneut, schließen Sie die Tür ab, geben Sie den Schlüssel zurück und melden Sie den Quellstatus.
    2. Sammeln Sie alle während des Verfahrens entstehenden radioaktiven Abfall ein und entsorgen Sie ihn gemäß den institutionellen Vorgaben.

4. Strahlenverletzungswerte

  1. Beurteilen Sie den Hautschadensverlauf bei Mäusen, indem Sie die Bestrahlungsstelle alle 2–3 Tage während der Anfangsphase untersuchen. Bei Beobachtung eines abnormalen Hautbildes erhöhen Sie die Häufigkeit der Untersuchung auf täglich. Sobald sich das Fortschreiten der Läsion stabilisiert hat, wird das Untersuchungsintervall auf alle 2–3 Tage zurückgesetzt.
    HINWEIS: Während des gesamten Prozesses durchlief die unbestrahlte Kontrollgruppe identische Verfahren wie die bestrahlten Gruppen, einschließlich anschließender Wertung und Gewebesammlung. Die Probenzeitpunkte für die Kontrollgruppen sind so geplant, dass sie mit der Fortschreitungsphase der Hautverletzung in den bestrahlten Gruppen zusammenfallen.
  2. Fotografieren Sie regelmäßig die bestrahlten Hautbereiche und bewerten Sie den Zustand der strahleninduzierten Dermatitis am Mausdorsum.
  3. Bewerten Sie Hautreaktionen innerhalb des bestrahlten Feldes mit einer validierten Skala (siehe Tabelle 3).
    HINWEIS: Bei der Bewertung der Verletzungen sollten drei Forscher unabhängig voneinander blinde Untersuchungen durchführen, ohne Kenntnis der Bestrahlungsdosis. Basieren Sie die Bewertung auf den vorherrschenden Wundmerkmalen gemäß den festgelegten Kriterien. Setze eine Endpunktzahl durch Konsens, wobei anerkannt wird, dass manche Wunden nicht jedem Beschreibungspunkt im Bewertungssystem entsprechen, aber dennoch die wesentliche Pathologie widerspiegeln.

5. Probenahme und Färbung

  1. Hautgewebe gewinnen: An den Tagen 13, 19, 27 und 32 nach der Bestrahlung werden serielle volldicke Hautbiopsien von Mäusen jeder Behandlungsgruppe innerhalb des vordefinierten zirkulären Bestrahlungsfeldes entnommen.
    1. Betäuben Sie die Mäuse durch intraperitoneale Injektion von Tribromoethanol-Lösung (15–20 mL/kg) wie in Schritt 1.2.
    2. Desinfizieren Sie den Operationsbereich mit 75 % Alkohol. Anschließend verwenden Sie sterile feine Pinzette, um die Zielhaut zu stabilisieren.
    3. Entnehmen Sie eine vollständige Hautprobe von etwa 0,5 cm² vertikal mit einer chirurgischen Schere entlang der Übergangszone zwischen geschädigtem Gewebe, wobei der zentrale verletzte Bereich eingeschlossen wird. Halten Sie die Schere senkrecht zur Hautoberfläche und verlängern Sie den Schnitt bis zur subkutanen Faszienschicht.
    4. Geben Sie das entnommene Gewebe sofort in 4% Paraformaldehyd zur Fixierung.
    5. Üben Sie sanften Druck auf die Wunde aus zur Hämostase. Für jede Probenahme folgt man einer Strategie, bei der man sich von einer von vier Richtungen zum Zentrum des Bestrahlungsfeldes bewegt.
  2. Histologische und immunfluoreszenzartige Färbung
    HINWEIS: H&E- und Immunfluoreszenzfärbungen wurden mit Unterstützung eines kommerziellen Dienstleisters (Servicebio Biotechnology, Wuhan, China) gemäß deren standardoptimierten Protokollen durchgeführt.
    1. Führen Sie eine Färbung von Hämatoxylin und Eosin (H&E) an den an allen vier Zeitpunkten (Tag 13, 19, 27 und 32 nach der Bestrahlung) entnommenen Hautproben durch.
      1. Zuerst werden die fixierten Gewebeproben in Paraffin eingebettet und Gewebeschnitte erstellt.
      2. Entwachsen und hydratisieren, indem Sie die Abschnitte nacheinander in Umweltfreundliche Entwachs-Transparente Flüssigkeit I (20 Min), Umweltfreundliche Entwachs-Transparente Flüssigkeit II (20 Min), wasserfreies Ethanol I (5 Min), wasserfreies Ethanol II (5 Min) und 75 % Ethanol (5 Min) eintauchen und anschließend mit Leitungswasser spülen.
      3. Behandle alle Abschnitte 1 Minute lang mit der HD-Konstant-Färbe-Vorbehandlungslösung. Anschließend 3–5 Minuten mit der Hämatoxylinlösung färben und anschließend mit Leitungswasser abspülen.
      4. Als Nächstes tauchen Sie die Schnitte in eine Hämatoxylin-Differenzierungslösung ein und spülen Sie erneut mit Leitungswasser. Anschließend behandeln Sie sie mit einer Hämatoxylin-Bläulösung und anschließend mit einer weiteren Spülung.
      5. Anschließend werden Abschnitte 1 Minute lang in 95 % Ethanol gegeben und 15 Sekunden lang mit Eosinfarbe gefiltert.
      6. Als Nächstes dehydrieren Sie die Abschnitte mit einer Reihe von absolutem Ethanol (drei Wechsel, jeweils 2 Min), normalem Butanol (zwei Wechsel, jeweils 2 Min) und Xylol (zwei Wechsel, jeweils 2 Min) und versiegeln Sie sie schließlich mit neutralem Kaugummi.
    2. Führen Sie eine Immunfluoreszenzfärbung durch, um die entzündlichen Zytokine IL-6 und IL-10 sichtbar zu machen.
      HINWEIS: Basierend auf dem Gesamtverlauf der Verletzung werden Gewebe ausgewählt, die am Tag 13 erhalten wurden, wenn sichtbare Läsionen zu erscheinen begannen, und am Tag 27, wenn sich der Verletzungsfortschritt stabilisiert und Anzeichen einer Genesung zeigt, für eine Immunfluoreszenzfärbung zur Visualisierung der entzündlichen Zytokine IL-6 und IL-10.
      1. Deparaffinisieren und rehydrieren Sie die Abschnitte mit Xylol (drei Wechsel, jeweils 10 Minuten) und Graduiertem Ethanol (drei Wechsel von reinem Ethanol, jeweils 5 Minuten), und spülen Sie sie dann in destilliertem Wasser.
      2. Zur Antigengewinnung werden die Objektträger in 1× Zitronensäure-Antigenreparaturlösung (pH 6,0) bei 70°C für 20 Minuten erhitzt. Lassen Sie die Objektträger natürlich abkühlen und waschen Sie sie dann in PBS (pH 7,4) auf einem Entfärbungsshaker (drei Waschen, jeweils 5 Minuten).
      3. Anschließend trage 3 % BSA auf, um die unspezifische Bindung bei Raumtemperatur 30 Minuten lang zu blockieren.
      4. Bereiten Sie eine gemischte primäre Antikörperlösung mit Anti-IL-6 (1:3000) und Anti-IL-10 (1:2000) vor und inkubieren Sie die Abschnitte dann über Nacht bei 4 °C in einer befeuchteten Kammer.
      5. Am folgenden Tag waschen Sie die Objektträger in PBS (dreimal, jeweils 5 Minuten) und inkubieren Sie mit geeigneten sekundären Antikörpern bei Raumtemperatur 50 Minuten im Dunkeln.
      6. Nach dem Waschen in PBS (dreimal, jeweils 5 Minuten) die Kerne mit DAPI für 10 Minuten im Dunkeln abfärben. Dann erneut mit PBS waschen (dreimal, jeweils 5 Minuten), 5 Minuten mit dem Autofluoreszenz-Quencher behandeln und 10 Minuten unter fließendem Wasser spülen.
      7. Anbringen Sie schließlich Coverslips mit Anti-Fade-Montagemedium.
  3. Quantitative Analyse
    1. Verwenden Sie die Image J-Software, um die epidermale Dicke von H&E-gefärbten Schnitten zu quantifizieren.
      1. Kalibrieren Sie den Bildmaßstab in Bild J, indem Sie die Skalenleiste mit dem Geradelinienwerkzeug nachzeichnen und die bekannte Länge in Analyze > Set Scale einstellen.
      2. Dann gehen Sie zu Analyze > Tools > ROI Manager , um die Interessensbereiche auszuwählen und sie dem ROI Manager hinzuzufügen.
      3. Klicken Sie schließlich im ROI-Manager auf Messen, um die tatsächlichen Längen zu erhalten.
    2. Verwenden Sie die Image J-Software, um die mittlere Immunfluoreszenzintensität von IL-6 und IL-10 zu messen.
      1. Importiere das Bild und splitte die Kanäle über Image > Color > Split Channels. Wählen Sie dann den Kanal, der der Zielfluoreszenz entspricht (z. B. rot für IL-6, grün für IL-10).
      2. Wende Auto-Thresholding unter Image > Adjust > Auto-Threshold an > Try All. Im Schwellenwertfenster wählen Sie den optimalen Algorithmus aus und passen den Schieberegler manuell an, um der tatsächlichen Fluoreszenz gerecht zu werden.
      3. Stellen Sie Messungen unter Analysieren > Mengenmessungen ein, indem Sie den Mean Gray Value prüfen und die Grenze bis zum Schwellenwert aktivieren.
      4. Führen Sie schließlich Analyze > Measure aus, um Intensitätsdaten zu erhalten.

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Ergebnisse

Befunde der körperlichen Untersuchung
Mäuse wurden β-Strahlung aus einer 90-Sr-Quelle bei drei verschiedenen Dosierungsregimen ausgesetzt: 0 Gy, 25 Gy, 10 Gy×5-Fraktionen und 50 Gy. Gleichzeitig wurden Vor-Ort-Untersuchungen durchgeführt, um das Fortschreiten der Hautschäden bis zur Stabilisierung des Verletzungsfortschritts zu dokumentieren. Die experimentellen Ergebnisse zeigten, dass 90Sr β-Strahlung strahleninduzierte Hautschäden in allen Gruppen verursachte und das Ausmaß de...

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Diskussion

Bei der Entwicklung eines Tiermodells für Strahlenschäden haben wir das langlebige Radionuklid 90Sr als Quelle für β-Strahlung verwendet. Die präzise Berechnung der Strahlendosisrate und Bestrahlungszeit stellte einen entscheidenden Schritt für die erfolgreiche Entwicklung dieses Modells dar. Die klinische Anwendung von 90Sr in der Tumortherapie wurde dokumentiert, wobei ihre Zuverlässigkeit teilweise validiertwurde (27,28

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Offenlegungen

Die Autoren geben an, dass sie keine bekannten konkurrierenden finanziellen Interessen oder persönlichen Beziehungen haben, die die in diesem Artikel berichtete Arbeit beeinflusst haben könnten.

Danksagungen

Diese Arbeit wird von der National Natural Science Foundation of China (U25A20151, 82473574 und 82203973), dem Key Innovation Project aus der Provinz Xizang (XZ202501ZY0131) und der Transformation Foundation des Tianfu Jincheng Laboratory (2025ZH006) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Anti-IL-6 Rabbit pAbServicebioGB11117Immunfluoreszenzfärbung
Anti-IL-10 KaninchenpAbServicebioGB11108Immunfluoreszenzfärbung
Zitronensäure-Antigenreparaturlösung (PH6.0)ServicebioG1202Immunfluoreszenzfärbung
DörrautomatDIAPATHDonatelloH& E und Immunfluoreszenz  Flecken
Digital  KameraKanonEOS 70DDokumentieren Sie den Verlauf der Hautverletzung während des Experiments
Einwegsterilisierte SpritzeProfessioneller Hersteller von einweg-sterilen medizinischen Geräten.GB20163140107Für die intraperitoneale Injektion
Einweg-LatexhandschuhMedicom1186Schutz
Umweltfreundliche Entwachs-Transparente FlüssigkeitServicebioG1128-1LH& E und Immunfluoreszenz  Flecken
Eingefrorene PlattformWuhan Junjie Electronics Co., LtdJB-L5H& E  Flecken
Hämatoxylin-Eosin (H& E) HD-Konstantfärbe-KitServicebioG1076H& E  Flecken
Bild JNationale InstituteBildverarbeitungErmöglichen Sie eine präzise Quantifizierung histologischer Färbungsdaten
BleischürzeShandong Oureixin Radiation Protection Engineering Co., Ltd.N/ASchützen Sie das Personal vor Strahlenbelastung
Flüssigblocker PAP-StiftServicebioG6100Immunfluoreszenzfärbung
Medizinischer Film3M10163337409520Verunreinigung der Strahlungsquelle durch biologische Oberflächen verhindern
Neutraler GummiSCRC10004160H& E  Flecken
Nuklear  Strahlung  DetektorFNIRSI100128262296Echtzeitüberwachung der Umgebungsstrahlung rund um den Bediener zur Gewährleistung der Personalsicherheit
Paraformaldehyd-Fixativ (4 %)BiosharpBL539AHautgewebeproben reparieren
Pathologie-SlicerShanghai Leica Instrument Co., LtdRM2016H& E und Immunfluoreszenz  Flecken
Paraffin-EinbettungsmaschineWuhan Junjie ElektronikJB-P5H& E und Immunfluoreszenz  Flecken
Strontium-90Khlopin Radium Institute Aktiengesellschaft (Radium Institute JSC, Russland)N/ABereitstellen Sie β-rays
TribromoethanolNanjing Aibei Biotechnology Co., LtdM2910Mäuse betäuben
Wasserbade-RutschtrocknerZHEJIANG JINHUA KEDI INSTRUMENTALAUSRÜSTUNGKD-PH& E und Immunfluoreszenz  Flecken

Referenzen

  1. Talapko, J., et al. Health effects of ionizing radiation on the human body. Medicina (Kaunas). 60 (4), 653(2024).
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