Profilierung von DNA-Mutationen des epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptors in zirkulierenden seltenen Zellen mittels eines Zellisolationssystems und der digitalen PCR des Tröpfchens

Summary

Hier präsentieren wir ein Protokoll, das die Isolierung seltener Krebszellen aus einer künstlichen Probe mit Vollblut und Spitzen in Lungenkrebszellen veranschaulicht. Das Protokoll nutzt eine halbautomatisierte, labelfreie Zellisolationsplattform. Angereicherte Zellen werden anschließend mittels Tropfen-Digital-PCR auf Mutationen des epidermalen Wachstumsfaktorrezeptors untersucht.

Abstract

Mutationen im epidermalen Wachstumsfaktorgen (EGFR) sind entscheidend, um die wirksamsten Behandlungen für Patienten mit Lungenkrebs zu bestimmen. Routineuntersuchungen auf EGFR-Mutationen können in Form von Tumorbiopsien oder Analyse von ctDNA aus dem Plasma von Patienten mit Lungenkrebs erfolgen. Obwohl die Blutproben von Patienten mit Lungenkrebs routinemäßig durchgeführt werden, um Einblicke in das Vorhandensein oder Wiederauftreten von Lungenkrebs mittels ctDNA- oder CTC-Nachweis zu erhalten, beinhaltet dies in der Regel keine anschließende molekulare Analyse der gefangenen Zellen. Der Nachweis einzelner Mutationen im EGFR-Gen, die in seltenen zirkulierenden Tumorzellen (CTCs) vorhanden sind, kann zusätzliche Einblicke in die potenzielle Wirksamkeit gezielter Therapien und darüber hinaus in die Patientenprognose bieten, insbesondere bei nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (NSCLC). Leider stellen die Seltenheit solcher zirkulierenden Tumorzellen und das Fehlen optimierter Verfahren zur Untersuchung ihrer genomischen Informationen eine erhebliche Nachweisherausforderung dar.

Ziel dieses Protokolls ist es, das realistische Potenzial zu veranschaulichen, CTCs aus Vollblut zu erfassen und ihren Molekulargehalt mittels ddPCR zu bewerten. Eine halbautomatisierte, größenbasierte Zellisolationsplattform wurde verwendet, um zirkulierende Tumorzellen einzufangen, die anschließend für eine nachgelagerte molekulare Analyse wiederhergestellt wurden. Um das Vorhandensein spezifischer EGFR-Mutationen in der genomischen DNA gefangener Zellen zu bestimmen, wurde ddPCR mit Tests für EGFR pT790M und EGFR pL858R durchgeführt.

Zwei separate Lungenkrebszelllinien (A549 und H1975) wurden aktiv aus Vollblut angereichert, und eine genaue Quantifizierung der in den Zelllinien vorhandenen Mutationen H1975 wurde mittels ddPCR durchgeführt.

Introduction

Mit fortgesetzter translationaler Forschung zum Wert von Flüssigbiopsien und aktuellen Veröffentlichungen, die speziell den klinischen Wert der ctDNA-Überwachung bei der Therapieauswahl veranschaulichen, kommen Flüssigkeitsbiopsien¹ in die Reife. Flüssigbiopsien bieten eine alternative, weniger invasive Methode zur Krebsüberwachung und -prognose im Vergleich zu herkömmlichen Gewebebiopsiemethoden. Die umfangreiche Forschung konzentrierte sich auf fragmentierte DNA, die im Blut gefunden wird (zellfreie DNA, cfDNA), und speziell auf das subkompartiment, das tumorabgeleitet ist, bekannt als zirkulierende Tumor-DNA (ctDNA). ctDNA wurde in den letzten zwei Jahrzehnten intensiv untersucht und hat nachweislich tumorspezifische Genmutationen, z. B. SNVs und strukturelle Varianten, sowie Methylierungsmarker und ein deutliches Fragmentmuster im Vergleich zu Nicht-Tumor-cfDNA enthalten. Diese spezifischen ctDNA-Eigenschaften werden heute genutzt, um den molekularen Status von Krebspatienten hinsichtlich Früherkennung, Therapieansprache, minimaler Resterkrankung (MRD) und Therapieresistenz zu überwachen. Ebenso haben zirkulierende Tumorzellen (CTCs), die vom primären Tumorstandort in die Blutgefäße abgetrennt werden, kürzlich als vielversprechende Biomarker entwickelt, deren Existenz und Menge im Blut einen engen Zusammenhang mit dem Krankheitsverlauf und dem Rückfallpotenzial zeigen. Während die allerersten Studien zu CTCs hauptsächlich auf deren Proteinmarkerexpression und Enumeration² basierten, gab es bedeutende Fortschritte bei der Untersuchung von CTCs auf molekularer Ebene, einschließlich der genomischen Mutationserkennung im Östrogenrezeptor 1 (ESR1) bei Brustkrebs und dem epidermalen Wachstumsfaktorgen (EGFR) bei verschiedenen Krebsarten.

EGFR-Mutationen sind sowohl für die Bestimmung der Pathogenese und Prognose als auch für die Auswahl der wirksamsten Behandlungen für Patienten mit Lungenkrebs^{entscheidend 3}. Routineuntersuchungen auf EGFR-Mutationen können in Form solider Tumorbiopsien bei Diagnose oder Fortschreitung erfolgen oder, jüngst durch die Entnahme von ctDNA aus Plasma von Patienten mit rezidiviertem/refraktärem Lungenkrebs⁴. Im Gegensatz zu ctDNA-basierten Ansätzen ermöglicht die Analyse von CTC-abgeleitetem genomischem Material jedoch eine direkte Beurteilung intakter Tumorzellen und ihrer Mutationsprofile. Neben ctDNA-MRD-Studien kann der Nachweis von Mutationen im EGFR-Gen seltener CTCs zusätzliche Einblicke in die potenzielle Wirksamkeit von Behandlungsregimen und darüber hinaus die Patientenprognose bieten, insbesondere bei nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (NSCLC). Die Seltenheit von CTCs und das Fehlen optimierter Protokolle mit benutzerfreundlichen Instrumenten für Kliniken stellen ein ernsthaftes Hindernis für eine breitere Einführung dar. Diese Einschränkung unterstreicht die Notwendigkeit eines standardisierten und zugänglichen Arbeitsablaufs, der sowohl eine effiziente CTC-Isolierung als auch eine nachgelagerte molekulare Analyse ermöglicht. Das Ziel dieser Studie ist es daher, einen reproduzierbaren Arbeitsablauf zur Anreicherung zirkulierender Tumorzellen und zur anschließenden Erkennung von EGFR-Mutationen mittels eines kombinierten Zellisolations- und digitalen PCR-Ansatzes zu präsentieren.

Das Genesis Cell Isolation System mit mikrofluidischen Zellfang-Objektträgern kann CTCs in einem halbautomatisierten Prozess mit hoher Lebensfähigkeit und hoher Einfangeffizienz aufnehmen, basierend auf ihrer größeren Größe und geringeren Verformbarkeit im Vergleich zur primären weißen und roten Blutkörperchenpopulation ^5,6. Gefangene CTCs können dann von den mikrofluidischen Zellfangobjektträgern durch Rückfluss vom Objektträger für eine weitere nachgeschaltete genomische Analyse zurückgewonnen werden. Um das Vorhandensein spezifischer EGFR-Mutationen in der genomischen DNA eingefangener Zellen zu bestimmen, wurde ddPCR an CTC-abgeleiteter genomischer DNA anhand von Assays für EGFR T790M und L858R durchgeführt.

Dieses Protokoll, das eine Modell-CTC-Probe und kommerziell erhältliche ddPCR-Assays verwendet, soll einen Einstiegspunkt für den gezielten Nachweis krebsassoziierter Mutationen in CTCs darstellen. Dieses Protokoll bietet einen praktischen Ansatz zur Erkennung krebsassoziierter Mutationen in zirkulierenden Tumorzellen und kann weitere Forschungen zu Anwendungen der Flüssigkeitsbiopsie unterstützen.

Protocol

Ethische Aussage:

Blutproben wurden von autorisierten Quellen für Forschungszwecke entnommen, und vor der Probenentnahme wurde von allen Spendern eine schriftliche informierte Zustimmung eingeholt. Alle experimentellen Protokolle mit menschlichen Blutproben wurden vom Institutional Review Board eines Blutanbieters, Discovery Life Sciences (Alabama, USA), überprüft und genehmigt. Alle Verfahren mit menschlichen Blutproben wurden gemäß den ethischen Standards des institutionellen Forschungsausschusses und der Erklärung von Helsinki durchgeführt.

1. Anreicherung von Krebszellen mit einem halbautomatisierten Zellisolationssystem

Hinweis: Dieser Abschnitt beschreibt die Anreicherung zirkulierender Tumorzellen (CTCs) mittels einer halbautomatisierten Zellisolationsplattform, gefolgt von der EGFR-Mutationserkennung mittels tropfendigitaler PCR. Eine Modell-CTC-Probe wird verwendet, um die Machbarkeit nachzuweisen, und eine Testvalidierung wird vor klinischer Anwendung empfohlen. Zwei nicht-kleinzellige Lungenkrebszellen (NSCLC) wurden verwendet: NCI-H1975 (EGFR L858R/T790M-Mutationen) und A549 (EGFR-Wildtyp), die als Negativkontrolle für die Mutationserkennung dienten.

1. Blutprobe
   1. Stellen Sie sicher, dass vor der Blutentnahme eine informierte Zustimmung von Blutspendern/Patienten eingeholt wird. Einholen Sie gegebenenfalls die Genehmigung des Institutional Review Board (IRB) für Forschung mit menschlichen Proben, einschließlich Blut, ein.
   2. Für die Machbarkeitsprüfung sollten Sie eine Blutprobe von autorisierten Drittanbietern einholen, nur für Forschungszwecke.
   3. Peripheres Blut wird in Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)-Röhren gesammelt und die Probe innerhalb von 48 Stunden mit dem Genesis-Anreicherungsprotokoll verarbeitet.
      Hinweis. Für nachgelagerte Analysen und das Genesis-Anreicherungsprotokoll werden EDTA-Röhrchen empfohlen. Streck- und EDTA-Röhrchen können für die Immunfärbung auf dem Objektträger mit Genesis Enumeration-Protokollen (direkt/indirekt) verwendet werden.
   4. Bewahren Sie Blutproben in EDTA-Röhrchen bei 2–8 °C bis zur Verwendung auf. Für die Genesis-Zellisolation ist keine Vorbehandlung erforderlich, und Vollblut bis zu 10 ml kann für das Anreicherungsprotokoll verwendet werden.
2. Modell CTC-Stichprobe/klinische Probenvorbereitung
   1. Bereiten Sie eine Zelllagerlösung mit einer Konzentration von 100–1.000 Zellen in einem geeigneten Zellkulturmedium von 10 μL oder einem phosphatgepufferten Kochsalzlösungspuffer (PBS) vor. Überspringen Sie diesen Schritt, wenn klinische Proben verwendet werden.
      HINWEIS: Die in dieser Studie verwendeten Spitzenkonzentrationen sind höher als die typischerweise beobachteten klinischen CTC-Werte und dienen ausschließlich der Methodendemonstration.
   2. Gib die 10 μL der Zellstofflösung zu bis zu 10 ml Vollblut eines gesunden Spenders hinzu, um eine Modell-CTC-Probe herzustellen. Bei klinischen Proben sollten keine Krebszellen in die Vollblutproben der Patienten aufgenommen werden.
   3. Mische die Blutprobe mit einem gleichen Volumen PBS (1x) und rühre vorsichtig auf einem Blutwippegerät bei Raumtemperatur, bis du es benutzt. Wenn die Lagerung eine Stunde überschreitet, wird bei 4 °C gelagert.
3. CTC-Anreicherung
   1. Schalten Sie das Genesis Cell Isolationssystem ein und warten Sie, bis das System initialisiert wird. Das kann bis zu 5 Minuten dauern.
   2. Stellen Sie das Abfallglas an die Basis der Stationsschächte und befestigen Sie das Abfallglas mit dem Abfallglas.
   3. Drücke den Schlauch in das Klemmventil, bis du spürst, dass er klickt, und befestige das Genesis-System-Schlauch am Auslass des Abfallbehälters.
   4. Führe einen Selbsttest durch, indem du auf dem Startbildschirm auf "Start" drückst und auf den Bildschirm "Selbsttest" tippst.
   5. Wenn der Selbsttest abgeschlossen ist, wählen Sie '2.0 Kit Enrichment' in den Optionen für das Select Protocol.
   6. Befolgen Sie die Anweisungen auf dem Bildschirm, füllen Sie die erforderlichen Dateneingabefelder aus und beenden Sie das Priming- und Assemblerverfahren. Ein erfolgreiches Priming mit 70 % Ethanol und 1x PBS liefert die beste Zellfangleistung und Wiedergewinnung für die DNA-Extraktion. Das Grundieren dauert etwa 20 Minuten.
   7. Stellen Sie sicher, dass das richtige Anreicherungsprogramm (2.0 Kit Enrichment) ausgewählt ist und dass alle Rohranschlüsse und Schlittenplatzierungen vor Beginn des Laufs ordnungsgemäß gesichert sind. Vermeiden Sie das Einführen von Luftblasen während des Probenladens, da dies die Durchflusskonsistenz und die Erfassungseffizienz beeinträchtigen kann.
   8. Geben Sie vorsichtig die Modellprobe aus Schritt 1.2.3 (Model CTC Sample/Clinical Sample Preparation) in den Einlasstrichter ab und setzen Sie das Anreicherungsprotokoll fort, indem Sie auf dem Systembildschirm auf 'Resume' drücken.
   9. Wenn die CTC-Erfassung abgeschlossen ist, fordert das halbautomatisierte Zellisolationssystem den Benutzer auf, das Abfallglas zu entfernen und das Zündreservoir wieder anzuschließen.
   10. Trennen Sie das Genesis-System-Rohr vom Abfallbehälter und leiten Sie 4 ml Verdünnungspuffer in das Priming-Reservoir.
   11. Schließen Sie den Rückflussadapter am Priming-Reservoir an und verbinden Sie ihn wieder mit dem Rohr des Genesis System. Drücke auf dem Bildschirm auf Fortsetzen, um das Anreicherungsprotokoll fortzusetzen. Dadurch werden die gefangenen Zellen im Mikrofluid-Slide durch Rückfluss in den Einlasstrichter freigesetzt.
   12. Sammeln Sie die geborgenen Zellen, indem Sie vom Einlasstrichter zu einem 5,0-mL Eppendorf-Rohr pipettieren. Stellen Sie sicher, dass Sie alle wässrigen Proben im Einlasstrichter sammeln, der oft 4 ml überschreiten kann.
   13. Zentrifugiere die gewonnene Probe bei 600 g für 5 Minuten, um die gefangenen Zellen vor der Zelllyse zu pelletieren.
   14. Entfernen Sie das Supernatant sorgfältig und fahren Sie zum DNA-Extraktionsprotokoll (Abschnitt 1.4) über.
4. DNA-Extraktion
   Vorsicht: DNAzol BD ist schädlich, wenn es mit der Haut in Kontakt kommt oder eingenommen wird. Vermeiden Sie Kontakt mit Haut und Augen. Verwenden Sie nur in einer chemischen Abzugshaube und atmen Sie keinen Nebel, Dampf oder Spray ein. Bei Hautkontakt sofort mit Wasser waschen.
   1. Gib ab Schritt 1.3.14 1 ml DNAzol BD direkt in die Tube ein.
   2. Übertragen Sie das gesamte Volumen der Probe in ein neues Eppendorf DNA LoBind 1,5 mL Mikrozentrifugenrohr und schütteln Sie kräftig.
   3. Inkubiere das Röhrchen bei Zimmertemperatur für 5 Minuten. Wirbeln Sie das Rohr kräftig und inkubieren Sie mindestens 4 Minuten bei Raumtemperatur.
   4. Stellen Sie während der Lyse und Fällungsschritte eine vollständige Mischung sicher, um die DNA-Rückgewinnung zu maximieren. Eine optionale RNase-Behandlung kann einbezogen werden, wenn eine RNA-Kontamination ein Problem darstellt.
   5. Fügen Sie 400 μL Isopropanol direkt zur DNAzol-BD-Zell-Lysatprobe-Mischung hinzu.
   6. Zentrifugiere das Rohr bei 10.000 g für 6 Minuten, um DNA auszufällen.
   7. Nach der Zentrifugation wird das Supernatant entfernt und vorsichtig 0,5 ml DNAzol BD zur pelletierten DNA hinzugefügt.
   8. Vortex das Rohr, bis das DNA-Pellet vollständig verteilt ist.
   9. Zentrifugiere die Mischung bei 10.000 g für 5 Minuten.
   10. Entfernen Sie das Supernatant und waschen Sie das DNA-Pellet, indem Sie 1 ml 75 % Ethanol pipettieren.
   11. Wiederholen Sie die Schritte 9–10 für insgesamt zwei Waschgänge.
   12. Entfernen Sie alle Reste von Ethanol am Boden des Röhrchens mit einer Mikropipette.
       HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das Pellet nicht vollständig austrocknet.
   13. Fügen Sie 20 μL DNase-/RNase-freies, deionisiertes (DI) Wasser hinzu, um die DNA aus den CTC-Proben zu lösen.
   14. Quantifizieren Sie doppelsträngige DNA (dsDNA) in der Probe mit dsDNA-Quantifizierungs-Assay-Kits/-Plattformen, wie dem Qubit 1x dsDNA High Sensitivity Assay Kit oder Bioanalyzer High Sensitivity DNA Analysis.
   15. Bewahren Sie extrahierte DNA-Proben bei 4 °C oder -20 °C auf, um einen Abbau zu verhindern.
       Pausenpunkt: Die extrahierten DNA-Proben können bei -20 °C für Kurzzeitlagerung oder bei -80 °C für Langzeitlagerung gelagert werden, bevor mit nachgelagerten Analysen übergefahren wird.

2. EGFR-Mutationsanalyse mit ddPCR

Digitale PCR ist eine geeignete Methode zur Erkennung seltener Mutationen mit hoher Empfindlichkeit und Präzision. ddPCR-Mutationsnachweis-Assays in einem einzelnen Rohr umfassen typischerweise eine FAM-markierte Sonde, die auf ein mutiertes Allel abzielt, und eine zweite HEX-markierte Sonde, die auf ein Wildtyp-Allel abzielt.

1. Reaktionsaufbau und Tröpfchengenerierung
   1. Tau ddPCR Supermix, ddPCR Mutationserkennungstests auf Eis.
   2. Wirbel jede Röhre an, um einen homogenen Inhalt zu gewährleisten, da sich während der Lagerung bei -20 °C ein Konzentrationsgradient bilden kann.
   3. Zentrifugieren Sie kurz, um den Sediment am Boden des Rohrs zu erzeugen, und stellen Sie das Rohr auf Eis.
   4. Bereite extrahierte DNA-Proben in der gewünschten Konzentration vor, bevor die Reaktionsmischung gemäß dem Rezept in Tabelle 1 hergestellt wird.
   5. Erstellen Sie eine Vormischung mit Supermischung, Assays und Restriktionsenzymen sowie Wasser für alle erforderlichen Proben für die Tests und fügen Sie als letzte Reaktionskomponente einzeln die DNA hinzu. Stellen Sie sicher, dass die Endkonzentration der DNA-Proben 50 fg bis 100 ng beträgt.
      Hinweis: DNA-Fragmentierung durch Restriktionsverdauung vor der Tröpfchenentstehung wird empfohlen, um die Genauigkeit zu verbessern, die Viskosität zu reduzieren und die Barrierefreiheit für Vorlagen zu erhöhen. Eine direkte Verdauung mit 2–5 U Restriktionsenzym während des ddPCR-Aufbaus wird empfohlen. Für EGFR-Punktmutationstests (T790M/L858R) wird MseI empfohlen; Siehe Prüfdatenblätter für kompatible Enzyme vor der Anpassung. Datenblätter stehen zum Download für einzelne Assays vom Bio-Rad Digital Assays Portal (Bio-Rad Droplet Digital PCR Assays | Zuhause)
   6. Bereiten Sie für mindestens einen Brunnen eine negative Kontrolle vor, die nur Wildtyp-Vorlagen in einer Konzentration enthält, die der Konzentration unbekannter Proben ähnelt.
   7. Wirbel die Reaktionsröhren aus, um sie gründlich zu mischen, und zentrifugiere kurz, um alle Proben bis zum Boden jedes Reaktionsrohrs abzusetzen. Lassen Sie die Reaktionsröhren 2 Minuten bei Raumtemperatur ausgleichen.
   8. Laden Sie 20 μL jeder Reaktionsmischung in eine Probenbohrung einer Mikrofluidkartusche (DG8-Kartusche) ein, gefolgt von 75 μL Tropfenerzeugungsöl für Sonden in die Ölquellen.
   9. Decken Sie die Kartusche mit einer Dichtung ab und legen Sie sie in den QX200 Tropfengenerator.
   10. Drücke den Knopf oben auf dem Tropfengenerator, um den Deckel zu schließen. Wenn der Deckel geschlossen ist, beginnt die Tröpfchenerzeugung automatisch. Dieses Verfahren kombiniert die Proben und das Öl in den Mikrokanälen der mikrofluidischen Kartusche, um eine Emulsion von ~20.000 nanolitergroßen Tröpfchen pro Probe zu erzeugen.
2. PCR-Verstärkung (Thermische Zyklenbedingungen)
   1. Programmiere thermische Zyklenbedingungen auf einem thermischen Zyklus, wie in Tabelle 2 empfohlen
   2. Wenn die Tröpfchenerzeugung abgeschlossen ist, sind alle Lichter des Instruments dauerhaft grün. Öffnen Sie das Instrument, indem Sie erneut den Knopf am Tropfengenerator drücken und den Patronenhalter sowie die Patrone entfernen.
   3. Entfernen Sie die Einwegdichtung und saugen Sie 45 μL Tröpfchen aus der Kartusche, wobei Sie darauf achten, einen leichten Winkel an der Pipettenspitze zu gewährleisten, um ein Zerreißen der Tropfen zu verhindern.
   4. Dosiere Tröpfchen in die ddPCR 96-Well-Platten und versiegele die Platte mit PCR Plate Heat Seal mit dem PX1 PCR Plate Sealer.
   5. Nachdem die 96-Well-Platte mit den Tröpfchen versiegelt ist, wird die 96-Well-Platte vorsichtig auf den in Schritt 2.2.1 vorbereiteten Thermocycler übertragen und mit dem thermischen Zyklus begonnen.
3. Tröpfchenauslesung und Datenanalyse
   1. Starten Sie das ddPCR Droplet Reader-Instrument (QX200 Droplet Reader oder QX600 Droplet Reader) und einen angeschlossenen Computer, auf dem die QX Manager Software installiert und konfiguriert ist.
   2. Sobald der thermische Zyklusschritt abgeschlossen ist, wird die versiegelte 96-Well-Platte zu einem Tropfenleser übertragen.
   3. Open QX Manager Software, um ein neues Plattenlayout basierend auf dem experimentellen Design zu konfigurieren. Klicken Sie auf den Tab 'Platte hinzufügen' und die Software aktiviert die Schaltfläche "Platte konfigurieren". Klicken Sie auf 'Plate konfigurieren', um Probendetails der Platte zuzuweisen.
   4. Füllen Sie die Platten- und Bohrlochinformationen aus, wählen Sie die Bohrungen aus, geben Sie den Probenzustand, den Experimenttyp, Zielnamen, Zieltypen und Referenz: Kapitel 1 für FAM und Kapitel 2 für HEX-Farbe.
   5. Klicken Sie auf 'Anwenden' , um den Brunnen zu laden, und nach Abschluss wählen Sie 'OK'.
   6. Wenn das Plattenlayout für alle Proben abgeschlossen ist, wählen Sie 'Ausführen', um den Tröpfchenablesungsprozess zu starten.
   7. Nach der Datenerhebung werden Proben im Brunnenselektor unter 'Analysieren' ausgewählt und der passende Schwellenwert für den ddPCR Mutation Detection Assay festgelegt, um Mutanten von Wildtyp-Signalen zu unterscheiden.
   8. Für Duplexmutations-Assays wie in diesem Protokoll verwendete können Schwellenwerte automatisch mit den Standardeinstellungen der QX-Manager-Software eingestellt werden (siehe Ergebnis).
   9. Alternativ können Schwellenwerte manuell mittels Fadenkreuz- oder Lassomethoden festgelegt werden, wobei sichergestellt wird, dass Schwellenwerte oder Lassogrenzen positive und negative Cluster trennen und basierend auf den Clusterpositionen positioniert werden, die sowohl von positiven als auch negativen Kontrollen in jedem Durchlauf definiert sind.
      HINWEIS: Schwellenwerte sollten über Proben innerhalb einer Charge mit positiven und negativen Kontrollen konsistent festgelegt werden, um eine reproduzierbare Mutationsaufrufe sicherzustellen.
   10. Die gemeldete Konzentration sind Kopienzahlen pro μL der finalen 1x-ddPCR-Reaktion.

Results

Das Genesis-Zellisolationssystem mit mikrofluidischen Zellfang-Objektträgern isolierte durchschnittlich 84 % der gespitzten Krebszellen in Blutproben bei einer Konzentration von 25–250 Zellen·^mL-1 (Abbildung 3A). Diese hohe Fangeffizienz demonstriert die Wirksamkeit des Anreicherungsschritts zur Isolierung seltener zirkulierender Tumorzellen aus Vollblutproben. Optionale Immunfärbung von Zellen, die in mikrofluidischen Zellfangobjekten mit dem System Enumeration-Protokoll erfasst wurden, zeigte die Identifikation seltener Zellen anhand von zwei positiven Antikörpern gegen Zytokeratin, DAPI zur Identifikation von nukleierten Zellen und einem negativen Antikörper gegen CD45, der auf den meisten weißen Blutkörperchen exprimiert wird, aber typischerweise nicht auf CTCs exprimiert wird (Abbildung 3B). Dieses Färbungsmuster bestätigt die erfolgreiche Identifizierung zirkulierender Tumorzellen, während Hintergrund-weiße Blutkörperchen ausgeschlossen werden.

ddPCR-Mutationsnachweistests ermöglichten die Identifizierung und Profilierung von EGFR-Mutationen in angereicherten Krebszellen. Diese Studie demonstrierte den Nachweis von gDNA-Mutationen in Zellen, die zunächst durch die Genesis-Plattform angereichert wurden, mittels ddPCR und Mutationserkennungstests. ddPCR-Diagramme (Abbildung 4) der Krebszelllinien A549 (EGFR Wildtyp) und H1975 (L858R/T790M) für die beiden getesteten EGFR-Mutationen zeigten, dass ddPCR Mutationen in der Zelllinie H1975 nach dem Übergang ins Vollblut und anschließender Anreicherung über die Genesis-Plattform sensibel nachweisen kann. Positive Mutationssignale wurden in H1975-Zellen beobachtet, während in A549-Zellen keine Mutationssignale nachgewiesen wurden, was die Assay-Spezifität bestätigt. Die mit der Kontrollzelllinie A549 versehenen Proben zeigten keine vorhandenen Mutationströpfchen, was bestätigt, dass der Nachweis von Mutationen bei L858R und T790M speziell mit der H1975-Zelllinie assoziiert ist. Diese Demonstration der CTC-Isolation auf der Genesis-Plattform, gefolgt von molekularer Analyse unter Verwendung von ddPCR, kann ein leistungsstarkes molekulares diagnostisches Werkzeug für Flüssigbiopsiestudien und präklinische Studien bieten, bei denen klinische Proben zur Überwachung des Krankheitsverlaufs und personalisierte Behandlung verwendet werden. Insgesamt zeigen diese Ergebnisse, dass der kombinierte Enrichment- und ddPCR-Workflow EGFR-Mutationen in zirkulierenden Tumorzellen zuverlässig nachweisen und quantifizieren kann.

Abbildung 1: Flüssigbiopsie-Workflow zur Profilierung von EGFR-DNA-Mutationen bei Lungenkrebs. (A) Illustration der Tumorheterogenität, die verschiedene EGFR-Mutationsprofile zeigt, die mit herkömmlicher Gewebebiopsie und zirkulierenden Tumorzellen (CTCs) aus der Flüssigkeitsbiopsie nachgewiesen wurden. (B) Schematischer Workflow für EGFR-DNA-Mutationsprofilierung in zirkulierenden Tumorzellen mittels Flüssigkeitsbiopsie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 2: Demonstration der EGFR-DNA-Mutationsprofilierung mit konstruierten Proben. (A) Herstellung einer Modell-CTC-Probe durch Spiking von Lungenkrebszelllinien mit definiertem EGFR-Mutationsstatus in Vollblut von einem gesunden Spender. (B) Arbeitsablauf zur Demonstration der EGFR-DNA-Mutation in zirkulierenden Tumorzellen unter Verwendung kommerziell verfügbarer Plattformen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 3: Labelfreie Isolierung und Identifizierung zirkulierender Tumorzellen. (A) Erfassungseffizienz von Lungenkrebszelllinien (A549 und H1975), die mittels einer halbautomatisierten Isolationsplattform seltener Zellen in Vollblutproben gesunder Spender eingeschleust wurden. (B) Immunfärbung gefangener Zellen mit zytokeratinpositiven Tumorzellen. Maßstabsleiste = 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 4. EGFR-Mutationsprofilierung mittels tröpfchenbasierter digitaler PCR. Zweidimensionale Amplitudendiagramme, die die Erkennung der EGFR-Mutation in angereicherten Krebszellen nach Zelllyse und DNA-Extraktion zeigen. A549-Zellen (Wildtyp) zeigen keine mutationsspezifischen Signale, während H1975-Zellen positive Signale für EGFR L858R- und T790M-Mutationen zeigen. Der Assay ermöglicht eine sensible Detektion und Quantifizierung mutanten- und Wildtyp-DNA-Populationen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Komponente	Volumen pro Reaktion (μl)	Abschließende Schwerpunkte
2x ddPCR Supermix für Sonden (ohne dUTP)	10	1x
20x Ziel- (FAM) und Wildtyp-(HEX) Zündhütchen/Sonde	1	1x
Restriktionsenzym, verdünnt (Msel)	1	2-5 U/Reaktion
Zielprobe und/oder DNase-freies Wasser (NTA)	Variable	Variable
Gesamtvolumen	20	-

Tabelle 1: Reaktionsaufbau für tropfenbasierte digitale PCR-Mutationserkennung. Zusammensetzung und endgültige Konzentrationen der Reagenzien, die zur Erkennung seltener EGFR-Mutationen in von Krebszellen abgeleiteten DNA-Proben verwendet werden.

Thermischer Zyklus* Schritt	Temperatur	Zeit	Rampenrate	Anzahl der Zyklen
	(ºC)		(ºC/sec)
Enzymaktivierung	95	10 Minuten	2	1
Denaturierung	94	30 Sekunden	2	40
Glühen/Verlängern	55	1 Min.	2	40
Enzymdeaktivierung	98	10 Minuten	2	1
Kühlung	4	30 Minuten	2	1
Halten (optional)	4	∞ (unendlich)	1	1
Verwenden Sie einen beheizten Deckel auf 105ºC und stellen Sie das Probenvolumen auf 40μl für den C1000 Touch Thermal Cycler ein mit einem 96-tiefen Bohrloch-Reaktionsmodul.

Tabelle 2: Thermische Zyklusbedingungen für digitale PCR-Verstärkung. Thermische Zyklusparameter, die zur Amplifikation von EGFR-Mutationszielen mit einem thermischen Zyklus mit einem 96-Well-Reaktionsmodul verwendet werden.

Discussion

Das Vorhandensein zirkulierender Tumorzellen im Blut von Patienten mit soliden Tumoren ist seit über 60^{Jahren ein} Untersuchungsthema 7 und wurde als primäre flüssige Biopsie anerkannt, bevor sie 2010 erstmals in den Sammelbegriff aufgenommen^wurden. CTCs sind jedoch selten und schwer selektiv aus Vollblut-9 zu isolieren. Es gibt jedoch zahlreiche Methoden zur Erfassung und Anreicherung von CTCs, wie die folgenden Übersichtsartikel^10,11 zeigen, die sowohl physikalische/mikrofluidische Ansätze als auch Methoden zur Auswahl von Zelloberflächenmarkern abdecken. Viele dieser Methoden sind zeitaufwendig, arbeitsintensiv und erfordern oft mehrere Schritte/Systeme, um die erforderliche Selektivität zu erreichen.

Die Aufnahme von CTCs aus Vollblut in diesem Protokoll hängt von ihrer Größe (> 8 μm) und dem Fehlen von Deformitäten im Hintergrund der phenotypisch normalen roten und weißen Blutkörperchen ab, die durch die Mikrofluidikporen innerhalb der Mikrofluidikzellen-Capture-Objektträger passieren. Daher sind korrekte Probenbeladung, richtiges Primieren des Schlittens und die Verhinderung von Verstopfungen wichtige Schritte zur Aufrechterhaltung der Fangeffizienz und Probenentnahme.

Für den Erfolg des Arbeitsablaufs ist das Blutprobenmanagement der entscheidende Faktor; Es wird sichergestellt, dass frisches Blut für die Probenverarbeitung verwendet wird und die korrekten Transport- und Lagerbedingungen aufrechterhalten werden, um Hämolyse zu verhindern. Der Abbau roter oder weißer Blutkörperchen beeinflusst die Qualität der CTC-Erfassung bzw. die Sensitivität bei der Detektion seltener genomischer Varianten. Wenn Hämolyse, Gerinnung oder sichtbare Probendegradation festgestellt werden, sollte die Probe nicht verarbeitet werden, da diese Bedingungen die CTC-Rückgewinnung und die nachgelagerte Mutationserkennungssensitivität verringern können.

Da CTCs in Konzentrationen unter 1 CTC pro 10 Millionen weiße Blutkörperchen im Vollblut vorhanden sein können, ist es unerlässlich, so großes Volumen wie für die Anreicherung zulässig zu erfassen. Die Mikrofluidik-Zellfang-Objektträger können 10 ml Blut aufnehmen, entsprechend Standard-Blutaufnahmeröhrchen wie Streck und EDTA, die typischerweise ~7,5–10 ml Blut aufnehmen. Eine Verringerung des gesammelten Blutvolumens wirkt sich direkt auf die CTC-Erfassungssensitivität und die anschließende Erkennung genomischer Varianten aus. Es kann sowohl klinisch als auch ethisch herausfordernd sein, Mengen über diese Routine hinaus zu erhalten. Abgesehen von einer Erhöhung des Volumens über 10 ml oder der Nutzung diagnostischer Leukaphereseproben zur Erhöhung der WBC/CTC-Populationen^{um 12} liegt eine Erhöhung der Sensitivität bei größeren Volumina derzeit außerhalb des Anwendungsbereichs der Genesis-Plattform.

Das Protokoll wurde wie im Standard-SOP beschrieben durchgeführt, jedoch mit Sorgfalt auf die frische Blutentnahme, eine umfassende Mischung von EDTA mit Blut bei der Entnahme und sorgfältige Aufbewahrung des gesammelten Blutes vor der Anwendung, was das Potenzial dieses Protokolls in einem klinischen Umfeld verdeutlicht, in dem routinemäßige Standardverfahren geschätzt werden. Da dieses Protokoll jedoch mit konstruierten Proben demonstriert wurde, ist eine Validierung mit klinischen Patientenproben vor der routinemäßigen klinischen Anwendung erforderlich.

Die Sensitivität bei der Erkennung von Mutationen innerhalb einer CTC-Population hängt sowohl vom Vorhandensein von CTCs in einer Standard-Vollblutprobe als auch von der anschließenden Detektion somatischer Mutationen in dieser CTC-Population ab, was wiederum von der Häufigkeit der Mutation in der CTC-Subpopulation abhängt. Diese beiden Störfaktoren werden letztlich die Gesamtsensitivität bei der Erkennung von Mutationen in einer gefangenen CTC-Population einschränken; dies hat einen größeren Einfluss auf Früherkennungsproben als späte Proben, die wahrscheinlich höhere CTC-Zahlen und höhere mutationsführende CTC-Populationen aufweisen.

Aktuelle blutbasierte Flüssigkeitsbiopsiestudien sind stark zugunsten zirkulierender Tumor-DNA im Plasma als Hinweis auf das Tumorvorhandensein ausgerichtet. Typischerweise basiert der Nachweis von ctDNA auf dem Vorhandensein tumorspezifischer genomischer Marker, z. B. SNVs, strukturelle Varianten, MSI-H, TMB und CGP. CTCs als weniger genutzter und dennoch ebenso wirksamer Biomarker in Flüssigkeitsbiopsie sind dafür bekannt, durch wachsende und potenziell metastasierende Tumore in den Blutkreislauf abzustoßen⁸. Die Analyse von CTCs konzentriert sich hauptsächlich auf Zelloberflächenmarker, die für ihre Erfassung oder für die Post-Capture-Validierung verwendet werden, wobei etablierte oder maßgeschneiderte Antikörperpanels verwendet werden, z. B. Pan-Cytokeratin, Vimentin, PD-L1, EpCAM usw. Im Gegensatz dazu ist die molekulare Analyse von CTCs aufgrund der Herausforderungen bei der selektiven Anreicherung und Erfassung von CTCs aus Vollblut begrenzt, gefolgt von einer präzisen Analyse der CTC-Subpopulation. Die aktuelle Methode verwendet einen standardisierten Arbeitsablauf, der etablierte Protokolle für CTC-Erfassung integriert, gefolgt von molekularer Analyse mit ddPCR und handelsüblichen Assays für bekannte pathologisch relevante genomische Mutationen in konstruierten Vollblutproben. Dieser Ansatz ist bedeutsam, da er ein Mutationsprofiling direkt aus angereicherten CTCs ermöglicht und damit Plasma-ctDNA-basierte Flüssigkeitsbiopsieansätze ergänzt.

Mit dem aktuellen Ansatz können erfasste seltene CTCs sowohl auf ihr Vorhandensein im Vollblut als auch auf das Vorhandensein pathologisch relevanter genomischer Marker in der CTC-Population untersucht werden. Studien haben den Wert gezeigt, sowohl das ctDNA-Profil von Krebspatienten als auch das CTC-Reservoir, das parallel zu ctDNA¹³ zirkuliert, zu bewerten, wobei die Bewertung beider Mutationsquellen die gesamte molekulare Landschaft einzelner Patienten erweitert. Dies hat das Potenzial zur Entwicklung pathologischer Testparadigmen im Rahmen der translationalen Forschung zunächst jedoch, letztlich jedoch im klinischen Umfeld. Das neue Paradigma würde sowohl die Präsenz von CTC als Hinweis auf Krebspräsenz/-progression als auch pathologische Mutationen in den CTC-gefangenen Zellen einbeziehen, die potenziell auf klonale Expansion oder therapeutische Resistenz^{hinweisen könnten}. Die Implikation ist, dass die Entwicklung von Metastasen und klonaler Expansion, gefolgt von anschließender Medikamentenresistenz, sowohl auf ctDNA- als auch auf CTC-Ebene gemeinsam überwacht werden könnte, was sich direkt auf die Therapieauswahl im späteren Stadium von Krebs auswirkt.

Zukünftige Anwendungen könnten die Anpassung dieses Arbeitsablaufs an weitere krebsassoziierte Mutationen und das Testen seiner Leistung in longitudinalen klinischen Proben umfassen.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Genesis Cell Isolation System	Bio-Rad Laboratories	12019822	Instrument (Bezeichnet als „Halbautomatisiertes Zellisolierungssystem“)
QX200 Droplet Generator	Bio-Rad Laboratories	1864002	Instrument
QX200 Droplet Reader oder QX600 Droplet Reader	Bio-Rad Laboratories	1864003 oder 12013328	Instrument (Bezeichnet als „Droplet Reader-Instrument“)
PX1 PCR Plate Sealer	Bio-Rad Laboratories	1814000	Instrument
C1000 Touch Thermal Cycler mit 96–Deep Well Reaction Module	Bio-Rad Laboratories	1851197	Instrument
Qubit 4 Fluorometer	Thermo Fisher Scientific Inc.	Q33226	Instrument
Celselect Slides			Verbrauchsmaterial (Bezeichnet als Microfluidic Cell Capture Slides)
Celselect Slides Enrichment Kit 2.0	Bio-Rad Laboratories	17009455	Verbrauchsmaterial
DNAzol BD	Molecular Research Center, Inc.	DN129	Reagenz
MseI Restriktionsenzym	New England Biolabs	R0525S	Reagenz
ddPCR Mutation Detection Assay: EGFR T790M	Bio-Rad Laboratories	Assay ID dHsaMDV2010019	Assay
ddPCR Mutation Detection Assay: EGFR L858R	Bio-Rad Laboratories	Assay ID dHsaMDV2010021	Assay
Qubit 1X dsDNA High Sensitivity Assay Kit	Invitrogen	Q33230	Assay-Kit
DG8 Cartridges für QX200 Droplet Generator	Bio-Rad Laboratories	1864008	Verbrauchsmaterial
Droplet Generation Oil for Probes	Bio-Rad Laboratories	1863005	Verbrauchsmaterial
Automated Droplet Generation Oil for Probes	Bio-Rad Laboratories	1864110	Verbrauchsmaterial (optional)
ddPCR Supermix for Probes (No dUTP)	Bio-Rad Laboratories	1863023	Reagenz
PCR Plate Heat Seal	Bio-Rad Laboratories	1814040	Durchstechbare Foliendichtung
DNA LoBind Microcentrifuge Tube, 1,5 ml	Eppendorf	022431021	Verbrauchsmaterial
ddPCR 96-Well Plates	Bio-Rad Laboratories	12001925	Verbrauchsmaterial