Dreidimensionale Kokulturmethode zur Untersuchung indirekter Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Zelltypen auf einer rekonstituierten Basenmembran

Summary

Dieser Artikel beschreibt eine einfache Methode zur dreidimensionalen Kokultur zweier Zelltypen, die durch eine rekonstituierte Basalmembran getrennt sind, die wenig spezialisierte Ausrüstung erfordert und leicht mit verschiedenen experimentellen Techniken analysiert werden kann.

Abstract

Die dreidimensionale (3D) Kokultur ist eine sich schnell entwickelnde Technik für Forscher, die Zell-Cell-Interaktionen mithilfe von In-vitro-Experimenten genau untersuchen möchten. Die Einschränkungen der Monoschicht-Zellkultur, einschließlich begrenzter Wechselwirkungen zwischen zellulärer und extrazellulärer Umgebung sowie gestörter Zellmorphologie, werden durch die Simulation der zellulären Umgebung in vivo angegangen. Mit einem Gerüst zur strukturellen Unterstützung und der Einbeziehung biologisch aktiver extrazellulärer Matrixkomponenten zeigen 3D-Kulturen Verhaltensweisen und Morphologien, die stärker mit dem Gewebe übereinstimmen. Die Integration mehrerer Zelltypen in diese Art von 3D-Umgebung ermöglicht die Untersuchung von Zell-Zell-Interaktionen innerhalb eines biomimetischen Modellsystems. Eine Vielzahl von 3D-Kokultur-Technologien ist entstanden, jede mit ihren eigenen Vor- und Nachteilen. Oft erfordern diese Technologien spezielle Ausrüstung, ein komplexes Setup oder spezielles technisches Wissen. Außerdem existieren einige standardisierte Methoden zur Untersuchung indirekter Zell-Cell-Interaktionen zwischen zwei Zelltypen, die durch eine rekonstituierte Basalmembran getrennt sind. Hier beschreiben wir eine 3D-Kokulturmethode, die nur grundlegende technische Fähigkeiten erfordert und weiter verbreitete Materialien verwendet, um indirekte Zell-Zell-Interaktionen über eine Basalmembran erfolgreich nachzubilden. Eine Monoschicht von Zellen wird mit einer Schicht extrazellulärer Matrix in Form von Matrigel bedeckt, und ein zweiter Zelltyp wird oben angesiedelt. Die resultierende Kokultur wird fünf Tage lang aufrechterhalten, woraufhin die Zellen auf morphologische Veränderungen durch Immunfluoreszenz analysiert oder aus der Kokultur für detailliertere genomische, transkriptomische oder proteomische Analysen extrahiert werden. Dieses Protokoll ist ideal, um die Auswirkungen der Zell-zu-Zell-Kommunikation auf das Zellverhalten zu untersuchen, wenn physischer Kontakt durch eine Basalmembran unterbrochen ist. Da Forscher weiterhin auf in-vivo-relevante Zellkulturmethoden setzen, ist ein vereinfachter Ansatz notwendig, um hohe Markteintrittsbarrieren zu vermeiden.

Introduction

Die In-vitro-Zellkultur ist eine robuste, schnelle und weit verbreitete Forschungstechnik. Obwohl traditionelle Zellkulturmethoden wirkungsvoll sind, unterscheiden sie sich stark von einer in vivo Umgebung. Die räumlich eingeschränkte Natur der Monolayer-Zellkultur führt zu Veränderungen in der Genexpression, Morphologie und Biochemie ^1,2,3. Dreidimensionale (3D) Kulturtechniken beheben diese Ungleichheit, da Zellen in einem Gerüst gezüchtet werden, das die extrazelluläre Matrix (ECM) in Organen und Geweben simuliert. In der 3D-Kultur zeigen Zellen eine Morphologie und ein Verhalten, das eher der in vivo gesehen wird^{. 4,5} Allerdings bildet die allein 3D-Kultur die vielen Komponenten einer in vivo Mikroumgebung nicht vollständig wieder, da ihr die Beiträge anderer Zelltypen⁶ fehlen.

Direkte (Kontakt zwischen Zellen) und indirekte Zell-Zell-Interaktionen spielen eine wichtige Rolle im Verhalten von Zellen in vivo ^7,8. Die Wiederholung dieser Interaktionen erfordert 3D-Kokulturmodelle, bei denen mehrere Zelltypen gemeinsam in einer 3D-Umgebung kultiviert werden. Mit diesen Techniken kann in vitro eine in vivo-ähnliche Wachstumsumgebung etabliert werden, was die biologische Relevanz der Ergebnisse verbessert ^9,10. Je spezifischer die für ein bestimmtes Experiment benötigte Umgebung ist, desto komplexer wird die Methodik. Es fehlt an einem standardisierten Modellsystem, das zur Untersuchung der Zell-Zell-Interaktionen zwischen durch eine Basalmembranmatrix getrennten Zellen verwendet werden kann. Daher wurde dieses Protokoll entwickelt, um Zell-Zell-Interaktionen, die über eine Basalmembranmatrix stattfinden, auf robuste und reproduzierbare Weise zu simulieren. Angepasst aus einem zuvor etablierten 3D-Kulturmodell¹¹ verwendet die Technik eine Schicht Matrigel, im Folgenden als ECM-Gel bezeichnet, um zwei verschiedene Zelltypen in der Kultur physikalisch zu trennen und ausgeschiedene Faktoren durchzulassen. Ursprünglich wurde es entwickelt, um die indirekte Wirkung von Adipozyten auf mesenchymale Brustkrebszellen zu untersuchen, kann aber leicht modifiziert werden, um verschiedene Zelltypen aufzunehmen. Es sollte sorgfältig überlegt werden, ob diese Methode für ein gegebenes experimentelles Design geeignet ist. Diese Methode erlaubt keine direkte Wechselwirkung von Zell zu Zell und sollte daher auf Modellierungen in vivo-Szenarien beschränkt werden, die eine indirekte Kommunikation zwischen Zellen über eine Basalmembranmatrix beinhalten. Dieses System wäre beispielsweise nicht ideal, um die Wechselwirkungen zwischen zytotoxischen T-Zellen und Tumorzellen zu modellieren, da sie häufig direkt interagieren. Betrachten Sie stattdessen biologische Szenarien, in denen eine Basalmembran die beiden interessierenden Zelltypen auf natürliche Weise trennt. So könnte diese Methode beispielsweise auf die Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen Tumorzellen und vaskulären Endothelzellen vor der Intravasation angewendet werden.

Eine gängige alternative 3D-Kokulturmethode ist der Einsatz spezialisierter Mikrofluidik-Chips oder "Organ-on-a-Chip (OoC)". OoC-Systeme sind leistungsstark und können auf einzelne Experimente zugeschnitten werden, erfordern jedoch erhebliche Zeit und Ressourcen für Chipdesign, Materialauswahl, Peripheriegeräte, Optimierung und Datenerhebung^12,13. Außerdem gibt es derzeit kein Standardmaterial oder Methode, das die biologischen und physikalischen Hinweise der Basalmembranmatrix liefern kann, ohne den mikrofluidischen^{Fluss 14} zu beeinträchtigen. Daher stellt die Anwendung der OoC-Technologie auf Studien von Zell-Zell-Interaktionen entlang der Basalmembran weitere Herausforderungen dar. Die in diesem Protokoll beschriebene Methode zielt darauf ab, eine standardisierte Alternative anzubieten, die biologische Relevanz und Zugänglichkeit bewahrt.

Protocol

Dieses Protokoll (Abbildung 1A) beschreibt ein 3D-Kokultursystem, das darauf ausgelegt ist, Zell-Cell-Interaktionen über eine Basalmembranmatrix nachzubilden. Eine nachgelagerte Analyse ist mit Konfokalmikroskopie (Abbildung 1B) oder durch Zellentnahme aus der Kokultur möglich (Abbildung 1C). Durch die Verwendung einer "Sandwich"-Konstruktion, bei der eine Schicht ECM-Gel zwischen zwei Zellpopulationen eingebettet wird, benötigt das Protokoll keine spezialisierte Ausrüstung und kann mit grundlegendem Wissen moderner Zellkulturtechniken durchgeführt werden.

1. 3D Kokulturvorbereitung

HINWEIS: Das beschriebene Protokoll ist als repräsentative Anwendung der 3D-Kokulturmethode mit 3T3-L1-Adipozyten und MDA-MB-231-Brustkrebszellen gedacht. Der Einsatz verschiedener Zelltypen erfordert eine Optimierung der Zellsamendichte und Vortests von ECM-Gel-Chargen, um die Wirksamkeit sicherzustellen. Dieses Protokoll behandelt die Verwendung einer Kontrolle ohne Adipozyten und einer konditionierten Medienkontrolle. Je nach experimentellem Ziel können weitere Kontrollen erforderlich sein.

1. Zellkultur und Lösungsvorbereitung
   1. Erwerb und etabliere Kulturen von 3T3-L1-Präadipozyten- und MDA-MB-231-Brustkrebszelllinien. Wachsen und pflegen Sie alle Zellen unabhängig mit aseptischer Technik in einem biologischen Sicherheitsschrank der Klasse II und standardisierten adhärenten Zellkulturmethoden¹⁵. Halten Sie 3T3-L1-Zellen in Dulbeccos Modified Eagle Media (DMEM), ergänzt mit 10 % (v/v) Neugeborenenkalbserum (NBCS) und 1 % Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml). Halten Sie MDA-MB-231-Zellen in RPMI 1640 aufrecht, ergänzt mit 10 % fetalem Rinderserum (FBS) und 1 % Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml).
      HINWEIS: Lassen Sie während der Pflege niemals die 3T3-L1-Zellen 80 % Konfluenz überschreiten und verwenden Sie keine Kulturen jenseits der 20^{. Durchgangszahl} .
   2. Entnahme oder Herstellung einer Standardlösung aus 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 1,8 mM KH₂PO₄, pH 7,4.
   3. Bereiten Sie 50 ml PBS-Glycin-Waschlösung vor, indem Sie 0,375 g Glycin zu 50 ml PBS hinzufügen, um eine Endkonzentration von 100 mM zu erreichen. Lagern Sie die Lösung bei 4 °C bis zu 12 Monate.
   4. Bereiten Sie 10 mL Permeabilisierungspuffer vor, indem Sie 50 μL Triton X-100 zu 9,5 mL PBS hinzufügen. Fülle auf 10 mL für eine Endkonzentration von 0,5 % (v/v) Triton X-100. Lagere bei 4 °C und benutze sie innerhalb eines Monats.
   5. Bereiten Sie 50 ml Immunfluoreszenzpuffer (IF) vor, indem Sie 50 μg Rinderserumalbumin (BSA), 100 μL Triton X-100 und 25 μL Tween-20 bis 45 ml PBS hinzufügen. Füllen Sie auf 50 mL für eine Endkonzentration von 0,1 % (w/v) BSA, 0,2% (v/v) Triton X-100 und 0,05% (v/v) Tween-20. Lagere bei 4 °C und benutze sie innerhalb eines Monats.
   6. Bereiten Sie 10 ml Blockpuffer vor, indem Sie 1 ml Tierserum zu 9 ml IF-Puffer hinzufügen, um eine Endkonzentration von 10 % Serum zu erreichen. Lagere bei 4 °C und benutze sie innerhalb eines Monats.
      HINWEIS: Die Artidentität des Serums hängt von der Wirtsart der verwendeten sekundären fluoreszierenden Antikörper ab (siehe 2.2.4).
   7. Über Nacht das ECM-Gel (Gesamtproteinkonzentration ~9-9,5 mg/mL) bei 4 °C auftauen. Bereite 500 μL Aliquots in 1,5 mL Mikrozentrifugenröhren vor und lagere bei -20 °C.
      HINWEIS: ECM-Gel ist sehr variabel und muss überprüft werden, um das erwartete Verhalten in jedem Zelltyp zu induzieren. Verschiedene Zelltypen erfordern unterschiedliche Proteinkonzentrationen oder Matrixsteifigkeit.
      HINWEIS: Verwenden Sie beim Umgang mit ECM-Gel immer vorgekühlte Pipettenspitzen und -behälter, um Polymerisation bei Raumtemperatur zu vermeiden. Halte das ECM-Gel während der Handhabung immer auf Eis.
2. Adipozytendifferenzierung
   1. Säen Sie 50.000 bis 80.000 3T3-L1-Prä-Adipozyten in 0,5 ml Standardwachstumsmedium in zwei Brunnen eines 4-Brunnen-Kammer-Objektträgers. Die leeren Brunnen werden für Kontrollen ohne Adipozyten und konditionierte Medien verwendet.
      HINWEIS: Kammer-Diazellkulturen sind anfällig für mechanische Störungen. Vermeiden Sie die Vakuumaspiration von Medien und verwenden Sie eine sanfte Pipettiertechnik mit manuellen Pipettoren.
   2. Säe 50.000 bis 80.000 3T3-L1-Prä-Adipozyten in 0,5 mL Standardwachstumsmedium in einen einzigen Brunnen einer 24-Wellen-Gewebekulturplatte. Dies wird verwendet, um konditionierte Medien für die konditionierte Medienkontrolle zu sammeln.
   3. Lassen Sie beide Kulturen innerhalb von 24 Stunden zu 100 % zusammenkommen.
   4. Adipogenese wird eingeleitet, indem das Wachstumsmedium durch ein Adipogenese-Initiierungsmedium ersetzt wird, das aus DMEM besteht, ergänzt mit 10 % FBS, 0,5 mM 3-Isobutyl-1-Methylxanthin (IBMX) und 1 μM Dexamethason. Inkubieren Sie die Zellen 48 Stunden bei 37 °C in einem 5%igen CO2-Inkubator.
   5. Nach 48 Stunden wird das verbrauchte Medium durch frisches Adipogenese-Progressionsmedium ersetzt, bestehend aus DMEM mit 10 % FBS und 10 μg/mL Insulin. Cellen weitere 48 Stunden bei 37 °C in einem 5%igen CO2-Inkubator inkubieren.
   6. Bevor die 3D-Kokultur fortgesetzt wird, sollten Sie visuell das Vorhandensein von Lipidtröpfchen in >60 % der Zellen bestätigen. Wenn die Lipidtröpfchenansammlung langsam ist, ersetzen Sie das Progressionsmedium durch DMEM mit 10 % FBS ergänzt und überwachen Sie den Lipidgehalt alle 24 Stunden.
3. Überlagerung und Pflege der 3D-Kokultur
   1. ECM-Gel über Nacht bei 4 °C auftauen, bevor man mit dem Overlay fortfährt.
      HINWEIS: Um Auswirkungen von Lot-zu-Lot-Variabilität zu vermeiden, wird empfohlen, für alle Experimente innerhalb einer einzigen Studie denselben Batch ECM-Gel zu verwenden.
   2. Nach erfolgreicher Differenzierung von 3T3-L1s wird das verbrauchte Kulturmedium entfernt, sodass ein kleiner Puffer von ~50 μL Medium bleibt.
   3. Fügen Sie vorsichtig 110 μL ECM-Gel zu jedem adipozytenhaltigen Brunnen des Kammerobjekts hinzu, wobei Sie darauf achten, die Adipozytenmonoschicht nicht zu stören.
      HINWEIS: ECM-Gel erstarrt bei Raumtemperatur schnell. Um vorzeitige Matrixpolymerisation zu vermeiden, lassen Sie das ECM-Gel immer auf Eis und verwenden Sie Vorkühlspitzen bei -20°C.
   4. Fügen Sie 110 μL ECM-Gel in den leeren No-Adipozyten-Kontrollbrunnen hinzu. Um eine gleichmäßige Verbreitung der Matrigel zu gewährleisten, geben Sie die Ecken des Brunnens und in die Mitte des Brunnens hin. Verwenden Sie die Pipettenspitze, um das Matrigel vorsichtig über die Kulturoberfläche zu verteilen, ohne zu kratzen.
   5. Inkubieren Sie den Schlitten 1 Stunde bei 37 °C, damit das ECM-Gel polymerisieren kann.
   6. Während dieses Inkubationsschritts sammeln und zählen Sie MDA-MB-231-Zellen
      OPTIONAL: Siehe Schritt 1.4 für Details zur fluoreszierenden Markierung dieser Zellen.
   7. Bereiten Sie eine verdünnte Suspension von MDA-MB-231-Zellen bei 30.000 Zellen/mL in einem Milchwachstumsmedium mit 2 % ECM-Gel (v/v) her.
      HINWEIS: Die optimale Zellsamendichte variiert je nach Zelltyp und muss vor Experimenten optimiert werden. HINWEIS: Das Milchwachstumsmedium ist ein kommerziell erhältliches Zellkulturmedium, das für Milchepithelzellen optimiert ist. Es enthält 0,4 % Hypophysenextrakt aus Rindern, 10 ng/mL epidermalen Wachstumsfaktor (rekombinant Mensch), 5 μg/mL Insulin (rekombinant Mensch) und 0,5 μg/mL Hydrocortison. Das Kokulturmedium muss sorgfältig gewählt werden, um den Bedürfnissen beider Zelltypen gerecht zu werden.
   8. Sobald das ECM-Gel polymerisiert ist, geben Sie vorsichtig 450 μL MDA-MB-231-Suspension zu jedem Bohrloch. Dies ergibt eine Gesamtzellzahl von 13.500 Zellen pro Well.
      HINWEIS: Eine ungleichmäßige Überlagerung der Zellsuspension über dem Gel ist in diesem Schritt möglich. Untersuchen Sie die Kammerseiten visuell und klopfen Sie sanft auf allen Seiten der Kammer, um sie gleichmäßig zu verteilen.
   9. Zur Adipozytenkultur auf der 24-Well-Platte werden 450 μL Milchwachstumsmedium mit 2 % ECM-Gel (v/v) hinzugefügt. Alle 48 Stunden ernten und das Medium wechseln.
   10. Halten Sie die Kokultur maximal 5 Tage aufrecht, mit Medienwechsel alle 48 Stunden.
       HINWEIS: Verzichten Sie auf Vakuumaspiration und verwenden Sie sanftes Pipetteren. Die Ablösung des ECM-Gels ist ein mögliches Problem, das während der Kokultur-Wartung auftreten kann.
   11. Nur für den konditionierten Medienkontrollbrunnen verdünnen Sie die geernteten Adipozyten (aus Schritt 1.3.9) konditionierte Medien 1:1 mit frischem Medien, bevor Sie an den Tagen 2 und 4 das verbrauchte Co-Kulturmedium ersetzen.
       HINWEIS: An diesem Punkt ist die Kokulturperiode abgeschlossen und muss entweder durch Fixieren und Färben der Kulturen zur Bestimmung der Morphologie und Markerexpression analysiert werden (siehe Abschnitt 2) oder durch Extraktion von Zellen aus der Kokulturumgebung und Vorbereitung der Zellen für die nachgelagerte Analyse (siehe Abschnitt 3).
4. Fluoreszierende Zellkennzeichnung (optional)
   HINWEIS: Die Markierung überlagerter Zellen kann vor Schritt 1.3.7 durchgeführt werden, um die überlagerten Zellen während der Immunfluoreszenzbildaufnahme zu identifizieren.
   1. Bereiten Sie eine 5 mM große Lösung aus Carboxyfluorescein Diacetat Succinimidylester (CFSE) vor, indem Sie 10 mg CFSE in 4,22 mL DMSO auflösen. Lagern Sie in 500 μL Aliquots bei -20 °C, geschützt vor Licht.
   2. Nach dem Zählen der Zellen aus Schritt 1.3.6 Waschen Sie die Zellen einmal mit 5 ml PBS. Das resultierende Pellet wird in 1x PBS auf eine Endkonzentration von 1.000.000 Zellen/ml wieder suspendiert.
   3. Fügen Sie 1 μL 5 mM CFSE pro mL Zellsuspension hinzu, um eine endgültige Arbeitskonzentration von 5 μM zu erreichen. Inkubieren Sie die Zellsuspension 20 Minuten bei Raumtemperatur, geschützt vor Licht.
   4. Löschen Sie die CFSE-Färbung, indem Sie 5 Bände Kulturmedium hinzufügen. Inkubiere weitere 5 Minuten bei Zimmertemperatur.
   5. Pelletzellen und zweimal mit PBS waschen, um die restlichen CFSE zu entfernen. Zellen in vorgewärmtem Milchwachstumsmedium wieder aufhängen. Inkubiere weitere 10 Minuten bei Zimmertemperatur, um sicherzustellen, dass kein Farbstoff zurückbleibt.
   6. Fluoreszierend markierte Zellen wie in Schritt 1.3.7 beschrieben. Der Rest des Protokolls kann wie beschrieben durchgeführt werden.

2. Immunfluoreszenz

1. Fixierung
   HINWEIS: Um eine Depolymerisation des ECM-Gels und den Verlust von Proben beim Waschen zu vermeiden, lassen Sie alle Reagenzien vor der Anwendung für ~30 Minuten auf Raumtemperatur ausgleichen.
   1. Nach 5 Tagen Kokultur wird das Medium durch 500 μL PBS ersetzt.
      HINWEIS: Die Schritte 2.1.2 bis 2.3.7 können unter nicht-sterilen Bedingungen durchgeführt werden.
   2. Entfernen Sie PBS und ersetzen Sie durch 2 % Paraformaldehyd (PFA) in PBS (frisch zubereitet) bei Zimmertemperatur für 10 Minuten.
      HINWEIS: ECM-Gel ist empfindlich gegenüber PFA und kann zu einer Ablösung der Gelschicht führen.
      VORSICHT: PFA zersetzt sich mit der Zeit zu Formaldehyd. Vermeiden Sie das Einatmen von Dämpfen, sorgen Sie für ausreichende Belüftung und tragen Sie beim Umgang mit PFA stets geeignete persönliche Schutzausrüstung (z. B. Handschuhe, Laborkittel, Augenschutz).
   3. Entfernen Sie PFA und waschen Sie die Brunnen mit 500 μL PBS-Glycin-Waschlösung für 15 Minuten bei Zimmertemperatur und sanftem Rühren.
      HINWEIS: Der Einsatz von PBS-Glycine-Wash ist entscheidend, um zu verhindern, dass freie Aldehyde eine Hintergrundfluoreszenz erzeugen. Waschen Sie nicht in PBS ohne Glycin.
   4. Wiederhole Schritt 2.1.3 zweimal für insgesamt drei Waschgänge. Siehe 2.1.5 für Speicherbedingungen, überspringe Schritt 2.2.2, falls nicht benötigt.
   5. An diesem Punkt kann das Protokoll bis zu einer Woche pausiert werden, und der Objektträger kann bei 4 °C gelagert werden. Um den Objektträger zu lagern, füllen Sie alle Schächte mit 1 ml PBS und versiegeln Sie den Deckel des Kammerobjekts mit einem dünnen Band aus Parafilm. Legen Sie den Objektträger flach in einen lichtdichten Behälter auf ein feuchtes, empfindliches Gewebe, damit die Kulturen nicht austrocknen.
2. Antikörperfärbung
   1. Bringen Sie zuvor gelagerte Objektträger auf Zimmertemperatur, entfernen Sie PBS und waschen Sie die Brunnen mit 500 μL frischem PBS für 15 Minuten mit sanftem Rühren. Überspringe diesen Schritt, wenn du direkt von Schritt 2.1.4 fortgehst.
   2. Permeabilizierte Zellen mit 500 μL Permeabilisierungspuffer für 15 Minuten bei Raumtemperatur ohne Bewegung.
   3. Wasche die Brunnen mit 500 μL PBS und 15 Minuten sanftem Rühren. Wiederhole das zweimal für insgesamt 3 Waschen.
   4. Fügen Sie jedem Brunnen 500 μL Blockpuffer hinzu und inkubieren Sie 1 Stunde bei Zimmertemperatur mit sanfter Bewegung.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Quellart des Serums im Blockpuffer mit der Wirtsart des sekundären Antikörpers übereinstimmt. In diesem Protokoll verwenden wir Eselserum und sekundäre Antikörper.
   5. Verdünne die primären Antikörper von Interesse im IF-Puffer gemäß den Empfehlungen des Herstellers. Entferne den Blockierungspuffer und gib 300 μL verdünnte Antikörperlösung zu jedem Bohrloch.
   6. Versiegeln Sie den Deckel des Kammerverschlusses mit Parafilm und legen Sie den Verschluss in einen lichtdichten Behälter. Über Nacht bei 4 °C mit sanftem Umrühren inkubieren.
   7. Wasche die Brunnen mit 500 μL IF-Puffer und 15 Minuten sanfter Bewegung. Wiederhole das zweimal für insgesamt 3 Waschen.
   8. Verdünne geeignete, fluoreszierend markierte sekundäre Antikörper im IF-Puffer, gemäß den Herstellerempfehlungen. Fügen Sie jedem Brunnen 300 μL sekundäre Antikörperverdünnung hinzu und inkubieren Sie 1 Stunde bei Raumtemperatur mit sanfter Bewegung.
      HINWEIS: Vermeiden Sie nach diesem Schritt eine längere Lichteinwirkung, um das Photobleaching zu begrenzen.
   9. Wiederhole Schritt 2.2.7.
   10. Verdünnen Sie eine 300 μM große Serienlösung von 4',6-Diamidino-2-Phenylindol (DAPI) 1:800 in PBS. Fügen Sie jedem Brunnen 300 μL hinzu und inkubieren Sie 20 Minuten bei Zimmertemperatur mit sanfter Umrührung.
   11. Wasche die Zellen mit 500 μL PBS für 5 Minuten mit sanfter Bewegung. Einmal wiederholen.
3. Verschlussmontage
   1. Entfernen Sie so viel Rest-PBS wie möglich, ohne die Kulturen zu stören. Setzen Sie den Deckel wieder auf und trennen Sie die Kammer mit dem vom Hersteller bereitgestellten Werkzeug vom Glasverschluss.
   2. Wischen Sie mit einem empfindlichen Arbeitsgewebe die Ränder des Objektträgers ab, um Rückstände von PBS zu entfernen, ohne das ECM-Gel zu stören.
   3. Spritze langsam Silikondichtmittel um die Ränder des Schlittens mit einer Spritze und einer 18G-Nadel. Lass das Silikon 3 Minuten fest werden.
   4. Während das Silikon aushärtet, gib 1-2 Tropfen Antifade-Montagemedium in jede Öffnung. Vermeide Blasen. Wenn sich Blasen bilden, verwenden Sie eine Pipette, um sie vorsichtig zu entfernen, ohne die Kultur zu beschädigen.
   5. Nachdem das Silikon ausgehärtet ist, lassen Sie einen Glasdeckel vorsichtig in einem flachen Winkel absenken. Verwenden Sie eine Pinzette oder eine Pipettenspitze, um Luftblasen auszustoßen, während der Deckdeckel abgesenkt wird. Benutze sanften Druck, um das Zerbrechen des Deckdeckels zu vermeiden.
   6. Stellen Sie den Folie in einen lichtdichten Behälter bei Zimmertemperatur und lassen Sie ihn über Nacht einhärten. Der Objektträger kann dann bei 4 °C gelagert werden, und das Protokoll kann bis zu einer Woche pausiert werden.
      HINWEIS (Optional): Um die Folien besser zu versiegeln, tragen Sie 1 Stunde nach dem Abdichten klaren Nagellack auf die Ränder des Deckdeckels auf.
   7. Bildfolien mit einem konfokalen Fluoreszenzmikroskop bei 10-20-facher Vergrößerung. Erfassen Sie fünf zufällige Sichtfelder, um Operator-Bias zu minimieren.

3. Ernten von Kokulturen für die nachgelagerte Analyse

HINWEIS: Die Entnahme von Zellen oder Biomolekülen ist mit Immunfluoreszenz nicht vereinbar. Es wird empfohlen, Kokulturen für andere nachgelagerte Analysen in Standard-24-Well-Kulturschüsseln mit denselben Zellkonzentrationen und -volumen wie in den Abschnitten 1 und 2 beschrieben zu züchten.

1. Zellextraktion
   1. Entferne das verbrauchte Medium und wasche vorsichtig mit eiskaltem PBS. Wiederhole das einmal für insgesamt zwei Waschen.
   2. Mit einer breiten Pipettenspitze wird 1 ml Eiskalte-Zell-Rückgewinnungslösung hinzugefügt, die hier als Rückgewinnungslösung bezeichnet wird. Pipette vorsichtig auf und ab, um die ECM-Gelschicht zu stören. Flüssigkeit in ein 1,5-mL-Mikrozentrifugenrohr übertragen.
      HINWEIS: Die Zellwiederherstellungslösung ist eine kommerziell erhältliche nicht-enzymatische Lösung, die dazu dient, Zellen, die in ECM-Gel eingebettet sind, sanft zu befreien. Es handelt sich um eine proprietäre Zusammensetzung und kann mit bestimmten Zelltypen inkompatibel sein. Alternativ kann die enzymatische Depolymerisation des ECM-Gels mit sanften Proteinasen wie Dispase oder Accutase in Betracht gezogen werden. Dies erfordert 37 °C Inkubationen sowie eine Optimierung der Inkubationszeit.
   3. Fügen Sie jedem Brunnen 250 μL Eiskalte Rückgewinnungslösung hinzu, um verbleibende Zellen zu sammeln. Übertragen in das entsprechende Mikrozentrifugenrohr.
   4. Röhrchen 4-5 Mal invertieren, um zu mischen.
   5. Tube auf Eis umlegen und 60 Minuten lang mit sanftem Umrühren inkubieren. Alle 10 Minuten werden die Röhren 2-3 Mal umgekehrt, um ein Absinken des Röhreninhalts zu verhindern.
   6. Zentrifugenröhren mit 300 x g für 5 Minuten bei 4 °C
   7. Überprüfen Sie das Vorhandensein eines sichtbaren Zellpellets. Entferne vorsichtig das Supernatant und gib 1 ml eiskaltes 1x PBS hinzu. Zentrifugiere mit 300 x g für 5 Minuten bei 4 °C. Wiederhole das einmal für insgesamt zwei Waschen. Erwarten Sie, dass das Pellet 80–90 % der ursprünglich ausgesäten Zellen enthält, wobei die Anteile jedes Zelltyps konstant bleiben.
      HINWEIS: An diesem Punkt kann das Zellpellet lysiert werden, um Protein oder Nukleinsäuren zu sammeln. Lysierte Pellets können bei -80 °C gelagert werden, und das Protokoll kann für 3 Monate pausiert werden. Lysis ist mit 3.2 nicht kompatibel.
2. Single-Cell-Suspensionsvorbereitung
   1. Pellet in 200 μL mit 0,25 % Trypsin-EDTA resuspendieren. Dann bei 37 °C 3–4 Minuten inkubieren.
   2. Fügen Sie 600 μL vollständiges Wachstumsmedium hinzu, um die Verdauung von Trypsin zu dämpfen.
   3. Zentrifugiere mit 300 x g für 5 Minuten bei Raumtemperatur. Entferne Supernatant und gib 500 μL Raumtemperatur-PBS hinzu.
   4. Zentrifugiere mit 300 x g für 5 Minuten bei Raumtemperatur. Wiederhole das einmal für insgesamt zwei Waschen.
   5. Pellet in 80 μL PBS mit 0,04 % BSA neu suspendieren und mit einem 40 μm Zellsieb filtern.
   6. Verdünne 5 μL Suspension in 5 μL Trypanblau. Zählen Sie die Zellen und bewerten Sie die Lebensfähigkeit mit einem Hämatocytometer. Die Zellen sind nun für die Downstream-Analyse bereit.

Results

Um die Wirksamkeit dieses Protokolls bei der Untersuchung der Auswirkungen von Cell-Zell-Interaktionen über eine Basalmembran zu demonstrieren, wurden Abbildung 2 und Abbildung 3 aus einer früheren Veröffentlichung (Pallegar et al.16) als repräsentative Ergebnisse wiederverwendet. Abbildung 4 und Abbildung 5 sind neuartige Daten und wurden erstel...

Discussion

Das Fehlen komplexer Zell-Cell-Interaktionen in traditioneller Zellkultur unterstreicht die Notwendigkeit verbesserter Organ- und Gewebemodelle, um Arzneimittelreaktionen und Krankheitsprogression in vivo genauer zu untersuchen. Die Entwicklung von 3D-Kokultursystemen hat dazu beigetragen, diese Lücke zu schließen, indem sie die Untersuchung der Folgen von Zell-Zell-Interaktionen ohne die Notwendigkeit von In-vivo-Studien ^{ermöglichte 9,12}

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-Bohrloch-Gewebekulturplatte	Corning	3524
24 x 60 mm Deckglas	Ultident Scientific	170-C2460
4 % Paraformaldehyd in PBS	Invitrogen	J61899. AK	Verdünnt auf 2 % in 1x PBS
4-Kammer-Kultur-Objektträger	Falcon	354114
Alexa Fluor 647 AffiniPure Fab Fragment Donkey Anti-Goat IgG (H+L)	Jackson Immunoresearch Laboratories Inc.	705-607-003
Bright-Line Hämatocytometer	Hausser Scientific	3120
CellTrace CFSE-Proliferations-Kit	Invitrogen	C34570
Zellwiederherstellungslösung	Corning	354253
DAPI	Sigma-Aldrich Canada Co.	D9542
Donkey Anti-Maus IgG (H+L) kreuzadsorbierter sekundärer Antikörper, DyLight 594	Invitrogen	SA5-10168
Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) hoch kreuzadsorbierter sekundärer Antikörper, Alexa Fluor 647	Invitrogen	A31573
DMEM/F-12, kein Phenolrot	Gibco	21041025
Dulbeccos modifiziertes Adlermedium, hoher Glukosespiegel, Pyruvat	Gibco	11995-065
Fetales Rinderserum, kanadischer Ursprung	Gibco	12483-020
Flowmi-Zell-Siebe, 40 & Micro; M	Bel-Art	136800040
GE Advanced Silikonfenster und -tür, klar	Henkel International	2811093
Ziegenpolyklonaler Anti-ZO-1	SantaCruz Biotechnologie	SC8146	Primärer Antikörper, eingestellt
Rattenmonoklonales Anti-ZO-1	SantaCruz Biotechnologie	SC33725	Alternativer primärer Antikörper als Ersatz für den eingestellten SC8416 Anti-ZO-1
Basalmedium der Mammarepithelzelle	Promocell	C-21210
Matrigel, Phenol Rotfrei, Wachstumsfaktor reduziert, LDEV-frei	Corning	356231	Proteinkonzentration: 9–9,6 mg/mL
Mausmonoklonales Anti-Vimentin	Sigma-Aldrich Canada Co.	V2258	Primärer Antikörper
Neugeborenenkalber-Serum, neuseeländischer Ursprung	Gibco	16010159
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung, pH 7,4	Gibco	10010023
ProLong Gold Antifade Mountant	Invitrogen	P36934
Gereinigte Maus Anti-E-Cadherin	BD Biosciences	610181	Primärer Antikörper
Kaninchen Polyklonales Anti-Claudin 7	Abcam	AB27487	Primärer Antikörper
RPMI 1640, Glutamin	Gibco	11875-093
SupplementMix	Promocell	C-39115
Trypan Blue Stain (0,4 %)	Gibco	15250-061
Trypsin 0,25%-EDTA	Gibco	25200056