Dreidimensionale Kokulturmethode zur Untersuchung indirekter Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Zelltypen auf einer rekonstituierten Basenmembran

Zusammenfassung

Dieser Artikel beschreibt eine einfache Methode zur dreidimensionalen Kokultur zweier Zelltypen, die durch eine rekonstituierte Basalmembran getrennt sind, die wenig spezialisierte Ausrüstung erfordert und leicht mit verschiedenen experimentellen Techniken analysiert werden kann.

Zusammenfassung

Die dreidimensionale (3D) Kokultur ist eine sich schnell entwickelnde Technik für Forscher, die Zell-Cell-Interaktionen mithilfe von In-vitro-Experimenten genau untersuchen möchten. Die Einschränkungen der Monoschicht-Zellkultur, einschließlich begrenzter Wechselwirkungen zwischen zellulärer und extrazellulärer Umgebung sowie gestörter Zellmorphologie, werden durch die Simulation der zellulären Umgebung in vivo angegangen. Mit einem Gerüst zur strukturellen Unterstützung und der Einbeziehung biologisch aktiver extrazellulärer Matrixkomponenten zeigen 3D-Kulturen Verhaltensweisen und Morphologien, die stärker mit dem Gewebe übereinstimmen. Die Integration mehrerer Zelltypen in diese Art von 3D-Umgebung ermöglicht die Untersuchung von Zell-Zell-Interaktionen innerhalb eines biomimetischen Modellsystems. Eine Vielzahl von 3D-Kokultur-Technologien ist entstanden, jede mit ihren eigenen Vor- und Nachteilen. Oft erfordern diese Technologien spezielle Ausrüstung, ein komplexes Setup oder spezielles technisches Wissen. Außerdem existieren einige standardisierte Methoden zur Untersuchung indirekter Zell-Cell-Interaktionen zwischen zwei Zelltypen, die durch eine rekonstituierte Basalmembran getrennt sind. Hier beschreiben wir eine 3D-Kokulturmethode, die nur grundlegende technische Fähigkeiten erfordert und weiter verbreitete Materialien verwendet, um indirekte Zell-Zell-Interaktionen über eine Basalmembran erfolgreich nachzubilden. Eine Monoschicht von Zellen wird mit einer Schicht extrazellulärer Matrix in Form von Matrigel bedeckt, und ein zweiter Zelltyp wird oben angesiedelt. Die resultierende Kokultur wird fünf Tage lang aufrechterhalten, woraufhin die Zellen auf morphologische Veränderungen durch Immunfluoreszenz analysiert oder aus der Kokultur für detailliertere genomische, transkriptomische oder proteomische Analysen extrahiert werden. Dieses Protokoll ist ideal, um die Auswirkungen der Zell-zu-Zell-Kommunikation auf das Zellverhalten zu untersuchen, wenn physischer Kontakt durch eine Basalmembran unterbrochen ist. Da Forscher weiterhin auf in-vivo-relevante Zellkulturmethoden setzen, ist ein vereinfachter Ansatz notwendig, um hohe Markteintrittsbarrieren zu vermeiden.

Einleitung

Die In-vitro-Zellkultur ist eine robuste, schnelle und weit verbreitete Forschungstechnik. Obwohl traditionelle Zellkulturmethoden wirkungsvoll sind, unterscheiden sie sich stark von einer in vivo Umgebung. Die räumlich eingeschränkte Natur der Monolayer-Zellkultur führt zu Veränderungen in der Genexpression, Morphologie und Biochemie ^1,2,3. Dreidimensionale (3D) Kulturtechniken beheben diese Ungleichheit, da Zellen in einem Gerüst gezüchtet werden, das die extrazelluläre Matrix (ECM) in Organen und Geweben simuliert. In der....

Protokoll

Dieses Protokoll (Abbildung 1A) beschreibt ein 3D-Kokultursystem, das darauf ausgelegt ist, Zell-Cell-Interaktionen über eine Basalmembranmatrix nachzubilden. Eine nachgelagerte Analyse ist mit Konfokalmikroskopie (Abbildung 1B) oder durch Zellentnahme aus der Kokultur möglich (Abbildung 1C). Durch die Verwendung einer "Sandwich"-Konstruktion, bei der eine Schicht ECM-Gel zwischen zwei Zellpopulationen eingebettet wird, benötigt das Protokoll keine spezialisierte Ausrüstung und kann mit grundlegendem Wissen moderner Zellkulturtechniken durchgefüh....

Ergebnisse

Um die Wirksamkeit dieses Protokolls bei der Untersuchung der Auswirkungen von Cell-Zell-Interaktionen über eine Basalmembran zu demonstrieren, wurden Abbildung 2 und Abbildung 3 aus einer früheren Veröffentlichung (Pallegar et al.16) als repräsentative Ergebnisse wiederverwendet. Abbildung 4 und Abbildung 5 sind neuartige Daten und wurden erstel.......

Diskussion

Das Fehlen komplexer Zell-Cell-Interaktionen in traditioneller Zellkultur unterstreicht die Notwendigkeit verbesserter Organ- und Gewebemodelle, um Arzneimittelreaktionen und Krankheitsprogression in vivo genauer zu untersuchen. Die Entwicklung von 3D-Kokultursystemen hat dazu beigetragen, diese Lücke zu schließen, indem sie die Untersuchung der Folgen von Zell-Zell-Interaktionen ohne die Notwendigkeit von In-vivo-Studien ^{ermöglichte 9,12}

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
24-Bohrloch-Gewebekulturplatte	Corning	3524
24 x 60 mm Deckglas	Ultident Scientific	170-C2460
4 % Paraformaldehyd in PBS	Invitrogen	J61899. AK	Verdünnt auf 2 % in 1x PBS
4-Kammer-Kultur-Objektträger	Falcon	354114
Alexa Fluor 647 AffiniPure Fab Fragment Donkey Anti-Goat IgG (H+L)	Jackson Immunoresearch Laboratories Inc.	705-607-003
Bright-Line Hämatocytometer	Hausser Scientific	3120
CellTrace CFSE-Proliferations-Kit	Invitrogen	C34570
Zellwiederherstellungslösung	Corning	354253
DAPI	Sigma-Aldrich Canada Co.	D9542
Donkey Anti-Maus IgG (H+L) kreuzadsorbierter sekundärer Antikörper, DyLight 594	Invitrogen	SA5-10168
Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) hoch kreuzadsorbierter sekundärer Antikörper, Alexa Fluor 647	Invitrogen	A31573
DMEM/F-12, kein Phenolrot	Gibco	21041025
Dulbeccos modifiziertes Adlermedium, hoher Glukosespiegel, Pyruvat	Gibco	11995-065
Fetales Rinderserum, kanadischer Ursprung	Gibco	12483-020
Flowmi-Zell-Siebe, 40 & Micro; M	Bel-Art	136800040
GE Advanced Silikonfenster und -tür, klar	Henkel International	2811093
Ziegenpolyklonaler Anti-ZO-1	SantaCruz Biotechnologie	SC8146	Primärer Antikörper, eingestellt
Rattenmonoklonales Anti-ZO-1	SantaCruz Biotechnologie	SC33725	Alternativer primärer Antikörper als Ersatz für den eingestellten SC8416 Anti-ZO-1
Basalmedium der Mammarepithelzelle	Promocell	C-21210
Matrigel, Phenol Rotfrei, Wachstumsfaktor reduziert, LDEV-frei	Corning	356231	Proteinkonzentration: 9–9,6 mg/mL
Mausmonoklonales Anti-Vimentin	Sigma-Aldrich Canada Co.	V2258	Primärer Antikörper
Neugeborenenkalber-Serum, neuseeländischer Ursprung	Gibco	16010159
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung, pH 7,4	Gibco	10010023
ProLong Gold Antifade Mountant	Invitrogen	P36934
Gereinigte Maus Anti-E-Cadherin	BD Biosciences	610181	Primärer Antikörper
Kaninchen Polyklonales Anti-Claudin 7	Abcam	AB27487	Primärer Antikörper
RPMI 1640, Glutamin	Gibco	11875-093
SupplementMix	Promocell	C-39115
Trypan Blue Stain (0,4 %)	Gibco	15250-061
Trypsin 0,25%-EDTA	Gibco	25200056