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Methodenartikel
Wir präsentieren ein Protokoll zur quantitativen Analyse von Molekülen oder Ionen in subzellulären Kompartimenten lebender Zellen unter Verwendung von Förster-Resonanz-Energieübertragungs-(FRET)-basierten Biosensoren. Sie umfasst standardisierte Bildgebung, binäre Maskenverarbeitung und ratiometrische Analyse mit linearer Regression auf Phosphat bei Arabidopsis thaliana (A. thaliana), ist jedoch breit auf andere Biosensoren und Organismen anwendbar.
Fluoreszierende Biosensoren bieten einen nicht-invasiven und vielseitigen Ansatz zur Überwachung dynamischer Veränderungen der Metaboliten- oder Ionenkonzentrationen in lebenden Zellen. Konkret ermöglichen FRET-basierte Biosensoren ratiometrische Messungen, die subzelluläre Analytenwerte angeben, während sie unabhängig vom Biosensor-Ausdrucksniveau sind. Wir beschreiben ein umfassendes und standardisiertes Protokoll für die quantitative ratiometrische Analyse von FRET-basierten Biosensoren in Pflanzen. Das Protokoll begleitet die Nutzer durch die Vorbereitung von Live-Proben, die konfokale Bildaufnahme von Spendern, FRET- und Akzeptorkanälen, binäre Maskengenerierung für subzelluläre Interessenbereiche sowie gefolgt von regressionsbasierter ratiometrischer Datenanalyse. Das Hauptergebnis ist eine regressionsbasierte ratiometrische Auslesung, die quantitative Vergleiche zwischen Genotypen, Geweben, Entwicklungsstadien und Behandlungsbedingungen ermöglicht. Anhand des cpFLIPPi-5.3m-Biosensors für anorganisches Phosphat als Beispiel demonstrieren wir die Messung der anorganischen Phosphatwerte im Chloroplaststroma von A. thaliana. Dieser analytische Rahmen ist breit auf andere FRET-basierte Biosensoren und Modellsysteme anwendbar und ermöglicht eine präzise raumzeitliche Quantifizierung von Metaboliten und Ionen in vivo. Diese Strategie liefert messbare Einblicke in die subzelluläre Dynamik von Metaboliten und Ionen und unterstützt Vergleiche unter unterschiedlichen experimentellen Kontexten.
Die Überwachung der Metabolit- und Ionendynamik in lebenden Pflanzenzellen ist unerlässlich, um zu verstehen, wie metabolische Signalwege und Signalnetzwerke im Raum und in der Zeit koordiniert sind, um Wachstum und Entwicklung zu unterstützen 1,2. Die Konzentrationen zellulärer Metaboliten schwanken schnell als Reaktion auf Umweltsignale wie Nährstoffverfügbarkeit, Lichtintensität und Stress3. Unter diesen ist der Anteil an anorganischem Phosphat (Pi) besonders wichtig, da er eine Schlüsselrolle beim Energietransfer, der Signalübertragung und der Stoff....
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HINWEIS: Arabidopsis-transgene Linien, die cpFLIPPi-5.3m und cpFLIPPi-null (zytosolische und plastid-gezielte Varianten) exprimieren, wurden zuvor17,18 und pht2 erzeugt; 1-1 (CS19883) wurde aus dem Arabidopsis Biological Resource Center, MS-Medium, Abdeckgläsern, Perfluorodecalin, Konfokalmikroskop und einem 40-fachen Öl-Immersionsobjektiv (numerische Apertur 1,3), Anregungslasern (CFP/445 nm und cpVenus/515 nm oder instrumentgerechte Emissionswellenlängen), Emissionsfiltern für CFP, cpVenus/FRET und cpVenus-Akzeptor, Kamera oder Detektoren, Bildanalyse-Workstation, FIJI
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Konfokale Bildgebung
Mit Konfokalmikroskopie und Metamorph-Software wurden separate Kanäle aufgenommen, um die FRET-Donor- und Akzeptorsignale in A. thaliana-Blattgeweben des Wildtyps (WT) und des pht2 sichtbar zu machen; 1 Chloroplast Pi-Transporter-Mutant (Abbildung 2). Repräsentative Bilder zeigen eine klare subzelluläre Lokalisierung des Pi-Biosensors, wobei Chloroplasten nicht nur innerhalb .......
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Dieses Protokoll bietet einen standardisierten Ansatz zur Quantifizierung lebender Zellen von Metaboliten oder Ionen mittels FRET-basierter Biosensoren. Wichtige Vorteile sind die nicht-invasive ratiometrische Messung und die Anwendbarkeit auf mehrere subzelluläre Kompartimente 17,20,21,22. Der Einsatz von binären Masken und linearer Regression verbessert die P.......
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Die Autoren geben keine Interessenkonflikte im Zusammenhang mit diesem Werk an.
Wir würdigen die Beiträge ehemaliger Mitglieder des W.K.V.-Labors, deren Bemühungen die Entwicklung dieses Protokolls unterstützt haben. Finanzielle Unterstützung erfolgte durch das US-Energieministerium, das Office of Science, das Bioimaging Technology Program (DE-SC0014037) und Basic Energy Sciences (DE-FG02-04ER15559). A.S.R. wurde teilweise durch Mittel des Hagler Institute for Advanced Study der Texas A&M University unterstützt.
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| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 40-faches Öl-Untertauchungsobjektiv | Olympus | https://www.edmundoptics.in/p/olympus-uplxapo-40x-oil-immersion-objective/55558/?srsltid=AfmBOoo0cqmgz7SoQ3ZCUvlJn_LeA37O42aX5BbFqF76k40CwQLNVn4P | Objektivlinse für Bildgebung |
| Abdeckungsbrille / Deckfolien | VWR | 48393-081 | Deckmantel für die Platzierung der Probe |
| FIJI (ImageJ) | Open Source | 2.9.0 | Bildanalyse-Software |
| Invertiertes Olympus IX81-Mikroskop | Olympus | http://www.olympusconfocal.com/brochures/pdfs/ix81.pdf | Konfokales Bildgebungssystem |
| iXon3 897 EMCCD Kamera | Andor-Technologie | https://andor.oxinst.com/products/ixon-emccd-camera-series/ixon-life-897 | Teil des konfokalen Bildgebungssystems |
| MetaMorph-Software V7 | Molekulare Geräte. LLC | Version 7 | Bildanalyse-Arbeitsstation |
| Microsoft Excel | Microsoft Suite | v16.68 | Datenanalyse-Software |
| Murashige & Skoog (MS) mittel | Caisson | MSP11-10LT | Pflanzenwachstumsmedium |
| Perfluordecalin (Acros Organic) | Acros Organics | P9900-25G | Bildgebendes Medium |
| Phosphinothricin | Sigma | 77182-82-2 | Antibiotikum |
| Pflanzenwachstumskammer | Viron | Gepflogenheit | Wachstumskammer |
| Yokogawa CSU-X1 rotierende Scheibenkonfokaleinheit | Yokogawa | https://www.yokogawa.com/solutions/products-and-services/life-science/spinning-disk-confocal/csu-x1-confocal-scanner-unit/ | Teil des konfokalen Bildgebungssystems |
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