Die Überwachung der Metabolit- und Ionendynamik in lebenden Pflanzenzellen ist unerlässlich, um zu verstehen, wie metabolische Signalwege und Signalnetzwerke im Raum und in der Zeit koordiniert sind, um Wachstum und Entwicklung zu unterstützen 1,2. Die Konzentrationen zellulärer Metaboliten schwanken schnell als Reaktion auf Umweltsignale wie Nährstoffverfügbarkeit, Lichtintensität und Stress3. Unter diesen ist der Anteil an anorganischem Phosphat (Pi) besonders wichtig, da er eine Schlüsselrolle beim Energietransfer, der Signalübertragung und der Stoffwechselregulation spielt, doch seine subzelluläre Dynamik bleibt schwer zu messen4.
Standard-kolorimetrische Tests und die Phosphor-31 Kernresonanz (³¹P)-NMR können totale oder kompartimentale Pi schätzen, aber sie haben keine Einzelzellauflösung und eine begrenzte zeitlicheGenauigkeit 5,6. Während die Synchrotron-Röntgenspektrometrie und die Radiotracer-Bildgebung subzelluläre oder Fluxinformationen liefern, können sie Pi nicht zuverlässig von phosphorylierten Metaboliten unterscheiden und sind oft invasiv. Nicht-wässrige Fraktionierung und enzymbasierte kinetische Assays bieten indirekte Schätzungen für stromale und zytosolische Pi, sind jedoch arbeitsintensiv und anfällig für Kontaminationen 7,8. Zusammen unterstreichen diese Einschränkungen die Notwendigkeit zerstörungsfreier Methoden mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung zur Überwachung von Metaboliten wie Pi, wie etwa Live-Bildgebung von FRET-basierten Biosensoren.
Genetisch codierte FRET-basierte Biosensoren sind leistungsstarke Werkzeuge für in-vivo-Analysen intrazellulärer Ionen- und Metabolitendynamik. Frühe Studien zeigten den Nutzen solcher Biosensoren zur Überwachung von Glukose-, Saccharose- und ATP-Konzentrationen in Zellen 9,10,11. Neuere Fortschritte haben diesen Ansatz erweitert, um Kalzium, Nitrat, Phosphat, Auxin, Abscisinsäure und Gibberellin zu überwachen, was wertvolle Einblicke in die Regulation von Nährstoffen und Hormonen liefert 12,13,14,15,16.
cpFLIPPi-5.3m ist ein FRET-basierter Pi-Biosensor, der zur Überwachung subzellulärer Pi-Spiegel in Pflanzenzellen17 optimiert ist. Dieser Biosensor besteht aus einem cyanobakteriellen Pi-Bindungsprotein, flankiert von einem FRET-Spender (eCFP, verstärktes cyan-fluoreszierendes Protein) und einem FRET-Akzeptor (cpVenus, eine modifizierte Variante des Venus-gelben fluoreszierenden Proteins), und er durchläuft bei der Pi-Bindung eine Konformationsänderung. Diese Änderung verändert das Pi-abhängige FRET-abgeleitete Fluoreszenzsignal, das durch konfokale Bildgebung erfasst wird, sodass eine Erhöhung der Pi-Konzentration zu einem verringerten FRET/Spender-Verhältnis führt. Die Pi-abhängige ratiometrische Analyse wird während der Nachbearbeitung von Bildern durchgeführt, indem die Intensitäten der Akzeptor- und Donoremissionen18 verglichen werden.
Die quantitative ratiometrische FET-Analyse in lebenden Pflanzengeweben erfordert eine Korrektur für spektrale Durchblutung und Kreuzerregung der Donor- (CFP) bzw. Akzeptor-(cpVenus)-Fluorophoren18. Durchblutung tritt auf, wenn CFP-Emission im FRET-Kanal detektiert wird, während Kreuzerregung durch die Anregung von cpVenus während der CFP-Anregung erfolgt. Diese spektralen Artefakte können sich zwischen Zellen und subzellulären Kompartimenten, insbesondere in pigmentierten Pflanzengeweben, unterscheiden und daher die ratiometrischen Messungen beeinträchtigen. Um eine korrigierte oder sensibilisierte FRET-Emission zu erhalten, werden Durchlauf- und Kreuzanregungsbeiträge wie folgt vom rohen FRET-Signal subtrahiert:
Sensibilisierte FRET-Emission = Rohe FRET-Emission – Durchlauf – Kreuzanregung
Korrekturfaktoren für Durchblutung und Kreuzerregung werden durch die Bildgebung von Pflanzen bestimmt, die CFP oder cpVenus einzeln an denselben zellulären und subzellulären Orten wie der Biosensor18 exprimieren. Die sensibilisierte FRET-Emission wird dann wie folgt berechnet:
Sensibilisierte FRET-Emission = Roh-FRET-Emission – (CFP-Emission × Durchlauf-Korrekturfaktor) – (cpVenus-Emission × Kreuzerregungs-Korrektionsfaktor)
Das Verhältnis der sensibilisierten FRET-Emission zur Donoremission (FRET-Verhältnis) berichtet über relative Veränderungen der Ligandenkonzentration und ist unabhängig vom Biosensor-Expressionsniveau19.
Der cpFLIPPi-5.3m-Biosensor wurde erfolgreich auf verschiedene subzelluläre Kompartimente von A. thaliana und anderen Arten gezielt, wodurch die Visualisierung der Pi-Dynamik 18,20,21,22 möglich ist. Dieser Biosensor zeigte Heterogenität in der Verteilung und dem Transport von zytosolischen Pi zwischen Geweben und hat Chloroplastenstromale Pi-Schwankungen mit Transporteraktivität und photosynthetischer Leistung in Verbindung gebracht20,21. Da der Biosensor Veränderungen innerhalb eines definierten Dynamikbereichs meldet, erfordert die Interpretation, dass der Bereich in vivo Pi-Niveaus unter stabilen Bildgebungsbedingungen umfasst. Ungleichmäßige Beleuchtung oder sehr geringe Biosensor-Häufigkeit können die ratiometrischen Messungen beeinflussen, was die Bedeutung standardisierter Erfassungseinstellungen und geeigneter negativer Kontrollen wie des Pi-unempfindlichen Steuersensors20 unterstreicht. Wenn die Variation des FET-Verhältnisses zwischen den Interessensregionen (ROIs) minimal ist, ist eine Regressionsanalyse möglicherweise nicht angebracht, und es wird empfohlen, die ROI-Mittel zu bündeln.
In diesem Artikel stellen wir ein detailliertes Protokoll für die quantitative ratiometrische Analyse von cpFLIPPi-5,3m in A. thaliana vor, einschließlich konfokaler Bildgebung, Bildsegmentierung mit binären Masken und Berechnungen des Fret-Verhältnisses zur dynamischen Überwachung von Pi in lebenden Zellen. Diese Methode bietet einen reproduzierbaren Arbeitsablauf zur Analyse von FRET-basierten Biosensorsignalen, wobei ratiometrische Daten mittels linearer Regression und statistischer Vergleiche über experimentelle Bedingungen analysiert werden. Repräsentative Daten werden unter Verwendung der Anhäufung von verändertem Chloroplaststroma Pi in pht2 gezeigt; 1, ein Chloroplast-Pi-Transporter-Mutant, der den cpFLIPPi-5,3m-Sensor 21,23 ausdrückt. Dieses Protokoll wird Forschern helfen, FRET-basierte ratiometrische Bildgeberstellung auf andere experimentelle Systeme anzuwenden, indem es biosensorische spektrale Korrekturen, Bildeinstellungen und quantitative Analyseschritte detailliert darstellt. Durch die Standardisierung der Bildaufnahme und regressionsbasierten Analysen innerhalb definierter experimenteller Kontexte unterstützt der Workflow einen konsistenten Vergleich von FRET-Antworten über Proben hinweg, die unter abgestimmten Bedingungen analysiert wurden. Es ist geeignet für diejenigen, die schnelle und kompartmentspezifische Veränderungen der Analytenspiegel in lebenden Pflanzengeweben messen möchten, einschließlich Mutanten oder transgenen Linien mit verändertem Metabolitentransport oder -metabolismus. Dieser standardisierte Ansatz wird die Reproduzierbarkeit quantitativer Lebendzellbildgebungsstudien in der Pflanzenbiologie erleichtern. Zusätzlich zur hier beschriebenen chloroplast-lokalisierten Pi-Biosensing kann die analytische Strategie an andere FRET-basierte Biosensoren und organismusspezifische Gewebe angepasst werden, sofern biosensorspezifische Kalibrierungs- und Kontrollmessungen etabliert werden.