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Methodenartikel

Quantitative ratiometrische Analyse von FRET-basierten Biosensoren in Arabidopsis thaliana ermöglicht Live-Messung von Analyten in subzellulären Kompartimenten

361 Ansichten

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DOI:

10.3791/70028

⸱

24. Februar 2026

 , 
1Department of Biology, Texas A&M University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir präsentieren ein Protokoll zur quantitativen Analyse von Molekülen oder Ionen in subzellulären Kompartimenten lebender Zellen unter Verwendung von Förster-Resonanz-Energieübertragungs-(FRET)-basierten Biosensoren. Sie umfasst standardisierte Bildgebung, binäre Maskenverarbeitung und ratiometrische Analyse mit linearer Regression auf Phosphat bei Arabidopsis thaliana (A. thaliana), ist jedoch breit auf andere Biosensoren und Organismen anwendbar.

Zusammenfassung

Fluoreszierende Biosensoren bieten einen nicht-invasiven und vielseitigen Ansatz zur Überwachung dynamischer Veränderungen der Metaboliten- oder Ionenkonzentrationen in lebenden Zellen. Konkret ermöglichen FRET-basierte Biosensoren ratiometrische Messungen, die subzelluläre Analytenwerte angeben, während sie unabhängig vom Biosensor-Ausdrucksniveau sind. Wir beschreiben ein umfassendes und standardisiertes Protokoll für die quantitative ratiometrische Analyse von FRET-basierten Biosensoren in Pflanzen. Das Protokoll begleitet die Nutzer durch die Vorbereitung von Live-Proben, die konfokale Bildaufnahme von Spendern, FRET- und Akzeptorkanälen, binäre Maskengenerierung für subzelluläre Interessenbereiche sowie gefolgt von regressionsbasierter ratiometrischer Datenanalyse. Das Hauptergebnis ist eine regressionsbasierte ratiometrische Auslesung, die quantitative Vergleiche zwischen Genotypen, Geweben, Entwicklungsstadien und Behandlungsbedingungen ermöglicht. Anhand des cpFLIPPi-5.3m-Biosensors für anorganisches Phosphat als Beispiel demonstrieren wir die Messung der anorganischen Phosphatwerte im Chloroplaststroma von A. thaliana. Dieser analytische Rahmen ist breit auf andere FRET-basierte Biosensoren und Modellsysteme anwendbar und ermöglicht eine präzise raumzeitliche Quantifizierung von Metaboliten und Ionen in vivo. Diese Strategie liefert messbare Einblicke in die subzelluläre Dynamik von Metaboliten und Ionen und unterstützt Vergleiche unter unterschiedlichen experimentellen Kontexten.

Einleitung

Die Überwachung der Metabolit- und Ionendynamik in lebenden Pflanzenzellen ist unerlässlich, um zu verstehen, wie metabolische Signalwege und Signalnetzwerke im Raum und in der Zeit koordiniert sind, um Wachstum und Entwicklung zu unterstützen 1,2. Die Konzentrationen zellulärer Metaboliten schwanken schnell als Reaktion auf Umweltsignale wie Nährstoffverfügbarkeit, Lichtintensität und Stress3. Unter diesen ist der Anteil an anorganischem Phosphat (Pi) besonders wichtig, da er eine Schlüsselrolle beim Energietransfer, der Signalübertragung und der Stoffwechselregulation spielt, doch seine subzelluläre Dynamik bleibt schwer zu messen4.

Standard-kolorimetrische Tests und die Phosphor-31 Kernresonanz (³¹P)-NMR können totale oder kompartimentale Pi schätzen, aber sie haben keine Einzelzellauflösung und eine begrenzte zeitlicheGenauigkeit 5,6. Während die Synchrotron-Röntgenspektrometrie und die Radiotracer-Bildgebung subzelluläre oder Fluxinformationen liefern, können sie Pi nicht zuverlässig von phosphorylierten Metaboliten unterscheiden und sind oft invasiv. Nicht-wässrige Fraktionierung und enzymbasierte kinetische Assays bieten indirekte Schätzungen für stromale und zytosolische Pi, sind jedoch arbeitsintensiv und anfällig für Kontaminationen 7,8. Zusammen unterstreichen diese Einschränkungen die Notwendigkeit zerstörungsfreier Methoden mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung zur Überwachung von Metaboliten wie Pi, wie etwa Live-Bildgebung von FRET-basierten Biosensoren.

Genetisch codierte FRET-basierte Biosensoren sind leistungsstarke Werkzeuge für in-vivo-Analysen intrazellulärer Ionen- und Metabolitendynamik. Frühe Studien zeigten den Nutzen solcher Biosensoren zur Überwachung von Glukose-, Saccharose- und ATP-Konzentrationen in Zellen 9,10,11. Neuere Fortschritte haben diesen Ansatz erweitert, um Kalzium, Nitrat, Phosphat, Auxin, Abscisinsäure und Gibberellin zu überwachen, was wertvolle Einblicke in die Regulation von Nährstoffen und Hormonen liefert 12,13,14,15,16.

cpFLIPPi-5.3m ist ein FRET-basierter Pi-Biosensor, der zur Überwachung subzellulärer Pi-Spiegel in Pflanzenzellen17 optimiert ist. Dieser Biosensor besteht aus einem cyanobakteriellen Pi-Bindungsprotein, flankiert von einem FRET-Spender (eCFP, verstärktes cyan-fluoreszierendes Protein) und einem FRET-Akzeptor (cpVenus, eine modifizierte Variante des Venus-gelben fluoreszierenden Proteins), und er durchläuft bei der Pi-Bindung eine Konformationsänderung. Diese Änderung verändert das Pi-abhängige FRET-abgeleitete Fluoreszenzsignal, das durch konfokale Bildgebung erfasst wird, sodass eine Erhöhung der Pi-Konzentration zu einem verringerten FRET/Spender-Verhältnis führt. Die Pi-abhängige ratiometrische Analyse wird während der Nachbearbeitung von Bildern durchgeführt, indem die Intensitäten der Akzeptor- und Donoremissionen18 verglichen werden.

Die quantitative ratiometrische FET-Analyse in lebenden Pflanzengeweben erfordert eine Korrektur für spektrale Durchblutung und Kreuzerregung der Donor- (CFP) bzw. Akzeptor-(cpVenus)-Fluorophoren18. Durchblutung tritt auf, wenn CFP-Emission im FRET-Kanal detektiert wird, während Kreuzerregung durch die Anregung von cpVenus während der CFP-Anregung erfolgt. Diese spektralen Artefakte können sich zwischen Zellen und subzellulären Kompartimenten, insbesondere in pigmentierten Pflanzengeweben, unterscheiden und daher die ratiometrischen Messungen beeinträchtigen. Um eine korrigierte oder sensibilisierte FRET-Emission zu erhalten, werden Durchlauf- und Kreuzanregungsbeiträge wie folgt vom rohen FRET-Signal subtrahiert:

Sensibilisierte FRET-Emission = Rohe FRET-Emission – Durchlauf – Kreuzanregung

Korrekturfaktoren für Durchblutung und Kreuzerregung werden durch die Bildgebung von Pflanzen bestimmt, die CFP oder cpVenus einzeln an denselben zellulären und subzellulären Orten wie der Biosensor18 exprimieren. Die sensibilisierte FRET-Emission wird dann wie folgt berechnet:

Sensibilisierte FRET-Emission = Roh-FRET-Emission – (CFP-Emission × Durchlauf-Korrekturfaktor) – (cpVenus-Emission × Kreuzerregungs-Korrektionsfaktor)

Das Verhältnis der sensibilisierten FRET-Emission zur Donoremission (FRET-Verhältnis) berichtet über relative Veränderungen der Ligandenkonzentration und ist unabhängig vom Biosensor-Expressionsniveau19.

Der cpFLIPPi-5.3m-Biosensor wurde erfolgreich auf verschiedene subzelluläre Kompartimente von A. thaliana und anderen Arten gezielt, wodurch die Visualisierung der Pi-Dynamik 18,20,21,22 möglich ist. Dieser Biosensor zeigte Heterogenität in der Verteilung und dem Transport von zytosolischen Pi zwischen Geweben und hat Chloroplastenstromale Pi-Schwankungen mit Transporteraktivität und photosynthetischer Leistung in Verbindung gebracht20,21. Da der Biosensor Veränderungen innerhalb eines definierten Dynamikbereichs meldet, erfordert die Interpretation, dass der Bereich in vivo Pi-Niveaus unter stabilen Bildgebungsbedingungen umfasst. Ungleichmäßige Beleuchtung oder sehr geringe Biosensor-Häufigkeit können die ratiometrischen Messungen beeinflussen, was die Bedeutung standardisierter Erfassungseinstellungen und geeigneter negativer Kontrollen wie des Pi-unempfindlichen Steuersensors20 unterstreicht. Wenn die Variation des FET-Verhältnisses zwischen den Interessensregionen (ROIs) minimal ist, ist eine Regressionsanalyse möglicherweise nicht angebracht, und es wird empfohlen, die ROI-Mittel zu bündeln.

In diesem Artikel stellen wir ein detailliertes Protokoll für die quantitative ratiometrische Analyse von cpFLIPPi-5,3m in A. thaliana vor, einschließlich konfokaler Bildgebung, Bildsegmentierung mit binären Masken und Berechnungen des Fret-Verhältnisses zur dynamischen Überwachung von Pi in lebenden Zellen. Diese Methode bietet einen reproduzierbaren Arbeitsablauf zur Analyse von FRET-basierten Biosensorsignalen, wobei ratiometrische Daten mittels linearer Regression und statistischer Vergleiche über experimentelle Bedingungen analysiert werden. Repräsentative Daten werden unter Verwendung der Anhäufung von verändertem Chloroplaststroma Pi in pht2 gezeigt; 1, ein Chloroplast-Pi-Transporter-Mutant, der den cpFLIPPi-5,3m-Sensor 21,23 ausdrückt. Dieses Protokoll wird Forschern helfen, FRET-basierte ratiometrische Bildgeberstellung auf andere experimentelle Systeme anzuwenden, indem es biosensorische spektrale Korrekturen, Bildeinstellungen und quantitative Analyseschritte detailliert darstellt. Durch die Standardisierung der Bildaufnahme und regressionsbasierten Analysen innerhalb definierter experimenteller Kontexte unterstützt der Workflow einen konsistenten Vergleich von FRET-Antworten über Proben hinweg, die unter abgestimmten Bedingungen analysiert wurden. Es ist geeignet für diejenigen, die schnelle und kompartmentspezifische Veränderungen der Analytenspiegel in lebenden Pflanzengeweben messen möchten, einschließlich Mutanten oder transgenen Linien mit verändertem Metabolitentransport oder -metabolismus. Dieser standardisierte Ansatz wird die Reproduzierbarkeit quantitativer Lebendzellbildgebungsstudien in der Pflanzenbiologie erleichtern. Zusätzlich zur hier beschriebenen chloroplast-lokalisierten Pi-Biosensing kann die analytische Strategie an andere FRET-basierte Biosensoren und organismusspezifische Gewebe angepasst werden, sofern biosensorspezifische Kalibrierungs- und Kontrollmessungen etabliert werden.

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Protokoll

HINWEIS: Arabidopsis-transgene Linien, die cpFLIPPi-5.3m und cpFLIPPi-null (zytosolische und plastid-gezielte Varianten) exprimieren, wurden zuvor17,18 und pht2 erzeugt; 1-1 (CS19883) wurde aus dem Arabidopsis Biological Resource Center, MS-Medium, Abdeckgläsern, Perfluorodecalin, Konfokalmikroskop und einem 40-fachen Öl-Immersionsobjektiv (numerische Apertur 1,3), Anregungslasern (CFP/445 nm und cpVenus/515 nm oder instrumentgerechte Emissionswellenlängen), Emissionsfiltern für CFP, cpVenus/FRET und cpVenus-Akzeptor, Kamera oder Detektoren, Bildanalyse-Workstation, FIJI24 und Excel gewonnen.

1 . Probenvorbereitung

  1. Entstehung transgener A. thaliana-Linien
    1. Klonen Sie den cpFLIPPi-5.3m-Biosensor sowie die Pi-insensitive Control (cpFLIPPi-Null), Donor-only (CFP) und Acceptor-only (cpVenus)-Kontrollen in Pflanzenexpressionsvektoren17.
    2. Für eine stabile Expression transformieren Sie A. thaliana-Pflanzen im sgs3-13-mutanten Hintergrund mittels Agrobacterium tumefaciens-Floraldip , ernten T1-Samen und wählen Transformanten auf 0,5x Murashige & Skoog (MS) Agarplatten mit dem entsprechenden Selektionsmittel aus, z. B. Phosphinothricin (10 μg/mL).
    3. Sterilisiere A. thaliana-Samen , die die Biosensoren ausdrücken, indem du sie 1 Minute lang in 70 % Ethanol tauchst, 1 Minute auf 50 % Bleichmittel umleiten und dann 6-10 Mal mit sterilem Wasser abspülen.
      VORSICHT: Ethanol und Bleichmittel sind Reizstoffe und sollten mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (PSA) behandelt werden. Führen Sie die Samensterilisation in einer chemischen Abzugshaube oder einem gut belüfteten Bereich durch, um das Einatmen von Dämpfen zu vermeiden, und mischen Sie Bleichmittel und Ethanol niemals direkt. Entsorgen von Abfalllösungen gemäß den institutionellen Richtlinien zur chemischen Sicherheitsvorgaben.
    4. Samen bei 4°C im Dunkeln für 2–3 Tage stratifizieren, um die Keimung zu synchronisieren, und dann die Samen in Agar-verfestigte oder flüssige 0,5x MS Medium mit 0,25 % Saccharose und der gewünschten Pi-Konzentration (250 μM) für das experimentelle Design übertragen. Beziehen Sie den Auswahlagenten ein, wenn Sie Transformanten auswählen.
    5. Platten werden in eine kontrollierte Wachstumskammer mit 21°C übertragen, 16 Stunden Licht: 8 Stunden Dunkellichtzyklus, 120 μmol·m⁻²·s⁻¹ Lichtintensität und ~60 % relative Luftfeuchtigkeit. Setzlinge 4–7 Tage lang züchten, um Wurzeln zu bilden, oder Setzlinge 21 Tage lang in den Boden zu legen, um die Blätter zu bezeichnen.
    6. Bei Tests von Pi-Behandlungen wird die Setzlinge auf das gewünschte Pi-Medium übertragen (z. B. 250 μM Pi für Pi vollständig; 10 μM Pi für Pi-Defiziente) und die Behandlung für den definierten Zeitraum aufrechterhalten (z. B. 48 Stunden bei akuter Pi-Deprivation).
    7. If possible, screen plants for adequate sensor expression by imaging for donor or acceptor fluorescence (low-intensity excitation) using a fluorescence stereo microscope (7-‬10x magnification).
    8. Untersuchen Sie Linien im gleichen genetischen Hintergrund, die cpFLIPPi-null wie liganden-unempfindliche Kontrollgruppen exprimieren.

2 . Konfokale Bildgebung

  1. Für die Wurzeln sollte man Setzlinge in ihrem Wachstumsmedium/sterilem Wasser auf einer Glasrutsche montieren. Vorsichtig mit einem kleinen Deckdeckel überlagern, um die Wurzeln ohne Kompression abzuflachen. Bild sofort.
  2. Bei den Blättern entfernen Sie das Zielblatt (z. B. das dritte oder vierte Blatt bei 21 Tage alten Pflanzen) und legen Sie die adaxiale Oberfläche in einem Objektträger nach unten.
  3. Infiltrieren Sie mit 10–15 μL Perfluordecalin, um bei Bedarf Lufträume zu reinigen, und überlagern Sie vorsichtig mit einem kleinen Glasgewicht, um die Probe abzuflachen. Bild sofort.
  4. Verwenden Sie ein High-NA-Objektiv, das für lebende Zellen geeignet ist (z. B. 40× / 1,2-1,3 NA). Verwenden Sie dasselbe Ziel für alle Proben, um die Vergleichbarkeit zu erhalten.
  5. Mit der Metamorph-Software stellen Sie die Anregungs- und Emissionskanäle ein und nehmen Sie Bilder auf (Abbildung 1).
    HINWEIS: Zur Erfassung der Spender-(CFP)-Emission kann Anregung bei ~445 nm (oder instrumentengeeigneter CFP-Linie) und Sammlung der Spenderemission (z. B. 470–500 nm Bandpass) verwendet werden. Zum Beispiel wurde die Anregung des 445-nm-Lasers bei 70 % (Abbildung 1A) mit einer Belichtungszeit von 1000 ms (Abbildung 1B) verwendet, um die CFP-Emission zu erfassen. Zur Erfassung des FRET (sensibilisierte Akzeptoremission): Anregung bei Donorwellenlänge (445 nm) und Sammlung des Akzeptoremissionsbandes (z. B. 530–560 nm). Zur Erfassung des direkten Akzeptorkanals: Anregung bei Akzeptoranregung (z. B. 500–515 nm) und Sammlung desselben Akzeptoremissionsbandes wie bei FRET.
  6. Bilder nacheinander aufnehmen: Erfassen Sie die Spenderanregung/Spenderemission, Spenderanregung/FRET-Emission, dann Akzeptor-Anregung/Akzeptor-Emission. Halte die Bildbearbeitungszeit pro Feld kurz, um Photobleaching (500–1000 ms) zu begrenzen.
    HINWEIS: Für jeden zellulären Standort (Wurzelzytosol, Blattmesophyllzytosol, Chloroplaststroma) bestimmen Sie die optimale Laserleistung, die Detektorverstärkung und die Belichtungszeit (Abbildung 1), sodass die mittleren Pixelintensitäten über dem lokalen Hintergrund, aber unter der Detektorsättigung liegen. Halten Sie identische Aufnahme-Einstellungen für von Donor-Anregung abgeleitete Kanäle (Spender und FRET) für einen bestimmten Ort aufrecht. Bildgebende Parameter hängen von der Probe, dem Mikroskop, der Lichtquelle und dem Detektionssystem ab und müssen daher empirisch bestimmt werden, wobei akzeptable Bereiche durch Regressionsanalyse wie in diesem Protokoll beschrieben bewertet und dokumentiert werden. Die hier verwendete Bildaufnahmesoftware ist Metamorph Version 7.
  7. Verwenden Sie dieselbe Detektorempfindlichkeit (zum Beispiel hier wurde eine Verstärkung von 2,4x und null Versatz verwendet) für alle Bilder für eine Zielposition. Wenn mehrere Detektoren verwendet werden, charakterisiere die spektralen Antworten für jeden Detektor und dokumentiere sie.
  8. Erwache Kontrollbilder für jedes interessierte Gewebe/Genotyp.
    1. Bild untransformiertes Wildtypgewebe ab, um die Hintergrund-Autofluoreszenz für jeden Kanal zu bestimmen.
    2. Bildpflanzen, die Spender-only (CFP) und Akzeptor-only (cpVenus) bei denselben Aufnahmeeinstellungen für jeden Ort ausdrücken, um spektrale Korrekturkoeffizienten (Durchblutung und Kreuzerregung) abzuleiten. Aufnahme von Bildern von mehreren Individuen (≥6–8) mit unterschiedlichen Emissionsintensitäten.

3 . Bildverarbeitung

  1. Öffnen Sie die Rohbilder von Donor-Kanälen (CC für Donor-Exzitation/-Emission), FRET (CY für Donor-Exzitation/Akzeptor-Emission) und Akzeptor-Kanälen (YY für Akzeptor-Exzitation/-Emission) in Analysesoftware wie FIJI oder ImageJ. (Abbildung 2).
  2. Ermitteln Sie die mittlere Hintergrundintensität pro Kanal, indem Sie mehrere (5-10) ROIs an gleichwertigen Orten von nicht transformierten Pflanzen mit denselben Einstellungen abbilden. Subtrahieren Sie den mittleren Hintergrundwert von jedem entsprechenden Kanalbild.
  3. Schritte, die in FIJI zu befolgen sind,
    1. Klicken Sie auf den Tab Analysieren> Messungen festlegen > den mittleren Grauwert auswählen. Messen Sie die Hintergrundintensität, indem Sie einen bestimmten ROI oder einen Mittelwert des gesamten Bildes wählen.
    2. Klicken Sie auf den Tab Analysieren> Messen. Speichere die Werte in einer Excel-Tabelle und berechne die mittleren Hintergrundwerte für jeden Kanal. Threshold das Donorbild (CFP), um die räumliche Grenze des Biosensors zu definieren (der Spender hat typischerweise das niedrigste Signal). Konvertiere das Schwellenwerte Spenderbild in eine binäre Maske (Abbildung 3 A).
    3. Klicken Sie auf Tab-Bild> anpassen> Schwellenwert.
    4. Ein Zeitfenster zur Schwellenwertung wird sich öffnen. Wähle die Max-Entropie-Methode für die Schwellenwertung. Legen Sie die räumliche Grenze fest, in diesem Fall das Chloroplaststroma, und wenden Sie die Schwelle an. Dies erzeugt ein schwarz-weißes Binärbild (Abbildung 3 B).
    5. Klicken Sie auf Tab Math> Divide> geben Sie den Wert 255 ein. Das Bild wird ganz weiß. Speichere dieses binäre Maskenbild als .tiff-Datei.
    6. Multiplizieren Sie die Binärmaske mit allen drei vom Hintergrund subtrahierten Bildern, um maskierte Bilder für die Analyse zu erstellen (Abbildung 3C).
    7. Öffnen Sie die binäre Maskendatei in FIJI.
    8. Klicken Sie auf Tab Process> Mathematik>Multiplizieren.
    9. Wählen Sie die Binärmaske als eines der Bilder und das vom Hintergrund subtrahierte CC-Bild als das andere.
    10. Wiederhole die Schritte für CY und YY.
    11. Zeichnen Sie ROIs auf die maskierten Bilder, die der untersuchten Struktur entsprechen (Ganzzell-, Cytosol-, Chloroplast-Stromal). Für jede ROI werden mittlere Pixelintensitäten für Donor-, FRET- und Direktakzeptorkanäle extrahiert. Speichere ROI-Metadaten (Bildname, Koordinaten, experimenteller Zustand, Replikations-ID) für die nachgelagerte statistische Analyse.
    12. Offene CC-, CY- und YY-Bilder.
    13. Klicken Sie auf Tab Math> Subtrahieren> Geben Sie den mittleren Hintergrundwert ein. Alternativ kann dies direkt vor der Berechnung des sensibilisierten FRET in Excel erfolgen.
    14. Öffne die maskierte CC-Datei.
    15. Klicken Sie auf Tab Process > Bildrechner. Multipliziere CC mit der maskierten CC-Bilddatei. Dadurch wird eine neue 32-Bit-Bilddatei geöffnet.
    16. Zeichne ROIs mit den passenden FIJI-Tools in der Haupt-Taskleiste. Zum Beispiel wird hier das Chloroplaststroma mit dem "Oval"-ROI-Tool ausgewählt. Füge die ROIs einem ROI-Manager hinzu (Strg+T). Wähle 5-10 ROIs pro Bild. Haken Sie bei "Alles anzeigen" an. Diese ROIs können als separate Metadatei gespeichert werden (Abbildung 3D). Schließen Sie den ROI-Manager nicht.
    17. Klicken Sie auf Tab Analysieren> Messungen einstellen> Wählen Sie den mittleren Grauwert aus.
    18. Klicken Sie im ROI-Manager auf "Messen".
    19. Die mittleren Pixelwerte der gewählten ROIs erscheinen als Liste in einem separaten Fenster.
    20. Kopieren Sie diese Daten nach Excel. Schließen Sie den ROI-Manager nicht.
    21. Wiederholen Sie die Multiplikation der maskierten CC-Datei mit den CY- und YY-Bildern, um mit dem ROI-Manager in jedem einzelnen Kanal Messungen der gleichen ROIs zu erhalten. Speichere die Werte in Excel.

4. Ratiometrische Analyse

  1. Öffnen Sie Microsoft Excel, um die folgenden Operationen auszuführen (Abbildung 4).
  2. Berechnung der Korrekturkoeffizienten.
    1. Für jeden zellulären Standort werden FRET-Kanalintensitäten (Y-Achse) von nur Spenderpflanzen gegen Spenderintensitäten (X-Achse) dargestellt. Passe eine lineare Regression an. Die Steigung ist der Spender-Durchblutungskoeffizient (bezeichnet als a).
    2. Wiederholen Sie das, indem Sie die Intensitäten des FRET-Kanals von reinen Akzeptoranlagen (Y-Achse) gegen direkte Akzeptorintensitäten (X-Achse) darstellen. Die Steigung ist der Akzeptor-Kreuzanregungskoeffizient (bezeichnet als b).
    3. Verwenden Sie ≥15–20 ROIs aus mehreren Anlagen, um robuste Koeffizienten zu erhalten. Für das Chloroplaststroma werden 50–60 Chloroplasten ausgewählt.
  3. Berechnen Sie den sensibilisierten FRET für jeden ROI als
    Sensibilisiertes FRET = Rohes FRET – (ein × Spender) – (b × Akzeptor)
    wobei a und b standortspezifische Koeffizienten sind, die oben abgeleitet sind (Abbildung 4).
  4. Plott sensibilisierte FRET (Y-Achse) vs. Donorkanalintensitäten (X-Achse) für gebündelte ROIs. Fit eine lineare Regression und Excel liefert eine Passung im Format y = mx + c, wobei y den sensibilisierten FRET-Intensitäten, x den Donorintensitäten, c dem y-Interzept und m der Steigung der Regression entspricht. Beachten Sie R² für die angepassten Regressionen. Typischerweise reicht R² von 0,8 bis 1 und stellt eine gute Passung dar (Abbildung 4).
  5. Für zytosolische und stromale Messungen berechnen und verwenden Sie die Steigung von FRET/Spender (sensibilisiertes FRET ÷ Spender) als ratiometrische Anzeige, auch als RET-Verhältnis bezeichnet.
    HINWEIS: Der Fehler der Passung für die Regression stellt den Standardfehler der Steigung dar (verwenden Sie die Liness-Funktion in Excel). Verwenden Sie standortspezifische Selektion konsistent über Proben und Genotypen hinweg. Lineare Regression auf Daten mehrerer ROIs und unabhängiger Anlagen bestätigt, dass das FRET-Verhältnis unabhängig von der Sensormenge ist.
  6. Kalibrierung, Steuerung und Unterscheidung unspezifischer Effekte.
    1. Verwenden Sie cpFLIPPi-null (ligandenempfindliche Variante), parallel ausgedrückt und identisch verarbeitet, um potenzielle unspezifische Änderungen des FET-Verhältnisses (pH, Ionenstärke, Photophysik) von Pi-spezifischen Veränderungen zu unterscheiden.
    2. Aggregierte ROI-Daten mit Feldern: Genotyp, Kompartiment, Replikationspflanzen-ID, ROI-ID, Spender, Akzeptor, Roh-FRET, sensibilisiertes FRET, angepasstes Verhältnis (je nach Anwendung). Bewahren Sie rohe Intensitäten.
    3. Für Populationsvergleiche verwenden Sie die regressionsabgeleiteten Steigungen als Primärstatistik; Berichte über Steigungen ± SE und prozentualen relativen Fehler.
    4. Wenden Sie geeignete Inferenzstatistiken (z. B. Student's t-Test oder ANOVA) auf regressionsbasierten Parametern an. Verwenden Sie nichtparametrische Tests, wenn Verteilungen gegen die Normalität verstoßen. Korrigiere mehrere Vergleiche, wenn es angebracht ist.
  7. Qualitätskontroll-Checkliste (vor der Aufnahme von Daten)
    1. Bestätigen Sie, dass alle drei Kanäle jedes Bildes unter der Detektorsättigung liegen und ein ausreichendes Signal-Rausch-Verhältnis (>2–10x Hintergrund) aufweisen.
    2. Bestätigen Sie, dass Spender- und Akzeptor-Einzelfluorophor-Kontrollen unter identischen Einstellungen abgebildet wurden und lineare Beziehungen zur Herleitung der Korrekturkoeffizienten a und b lieferten.
    3. Bestätigen Sie, dass die Bildregistrierung korrekt ist und dass Masken biosensorhaltige Bereiche korrekt definieren.
    4. Bestätigen Sie, dass cpFLIPPi-null-Kontrolle erwartete Mangel an Pi-Empfindlichkeit zeigt.
  8. Repräsentative Qualitätskontrollkennzahlen zur Unterstützung des Ausschlusses von Bildern
    1. Sättigungsrate: Weniger als 1–2 % der Pixel erreichen die maximale Intensität (65.535) für 16-Bit-Bilder.
    2. Hintergrundniveau: Die mittlere Intensität in zellfreien Regionen liegt zwischen ~50 und 200 Einheiten.
    3. Pixelintensitätsbereich: Die mittleren Intensitäten liegen deutlich über dem Hintergrund, bleiben aber unterhalb der Sättigung (~2.000–20.000 Einheiten).
    4. Signal-Rausch-Verhältnis (SNR): Die Werte sollten 2–10 überschreiten.

5. Statistischer Test zur Differenz zwischen zwei Regressionsneigungen

  1. Bestimmen Sie, ob zwei Steigungen (regressionsabgeleitete FRET-Verhältnis-Steigungen aus zwei Genotypen oder Behandlungen) signifikant25 unterscheiden.
  2. Berechnen Sie Teststatistik und Freiheitsgrade wie folgt
    figure-protocol-1
    mit Freiheitsgraden df = n1 + n2 - 4. m1 und m2 entsprechen den Steigungen aus der linearen Regression, sb1 und sb2 beziehen sich auf den Standardfehler jeder Steigung (erhalten aus LINEST oder Regressionsausgabe) und n1 und n2 sind die Stichprobengrößen (Anzahl der ROIs, die für jede Regression verwendet werden).
  3. Erhalten Sie einen zweiseitigen p-Wert für t mit df (z. B. verwenden Sie eine t-Verteilungstabelle oder einen Online-Rechner26). Wenn Sie den Online-Taschenrechner (Abbildung 5C) verwenden, geben Sie die sb1 und sb2 sowie n1 und n2 ein, die im vorherigen Schritt erhalten wurden, um den p-Wert und die Teststatistiken zu berechnen.
  4. Die Interpretation besteht darin, die Nullhypothese (Steigungen sind nicht signifikant unterschiedlich) abzulehnen, wenn p < α (z. B. α = 0,05). Berichte b1, b2, sb1, sb2, t, df und p.

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Ergebnisse

Konfokale Bildgebung

Mit Konfokalmikroskopie und Metamorph-Software wurden separate Kanäle aufgenommen, um die FRET-Donor- und Akzeptorsignale in A. thaliana-Blattgeweben des Wildtyps (WT) und des pht2 sichtbar zu machen; 1 Chloroplast Pi-Transporter-Mutant (Abbildung 2). Repräsentative Bilder zeigen eine klare subzelluläre Lokalisierung des Pi-Biosensors, wobei Chloroplasten nicht nur innerhalb ...

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Diskussion

Dieses Protokoll bietet einen standardisierten Ansatz zur Quantifizierung lebender Zellen von Metaboliten oder Ionen mittels FRET-basierter Biosensoren. Wichtige Vorteile sind die nicht-invasive ratiometrische Messung und die Anwendbarkeit auf mehrere subzelluläre Kompartimente 17,20,21,22. Der Einsatz von binären Masken und linearer Regression verbessert die P...

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Offenlegungen

Die Autoren geben keine Interessenkonflikte im Zusammenhang mit diesem Werk an.

Danksagungen

Wir würdigen die Beiträge ehemaliger Mitglieder des W.K.V.-Labors, deren Bemühungen die Entwicklung dieses Protokolls unterstützt haben. Finanzielle Unterstützung erfolgte durch das US-Energieministerium, das Office of Science, das Bioimaging Technology Program (DE-SC0014037) und Basic Energy Sciences (DE-FG02-04ER15559). A.S.R. wurde teilweise durch Mittel des Hagler Institute for Advanced Study der Texas A&M University unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
40-faches Öl-Untertauchungsobjektiv Olympushttps://www.edmundoptics.in/p/olympus-uplxapo-40x-oil-immersion-objective/55558/?srsltid=AfmBOoo0cqmgz7SoQ3ZCUvlJn_LeA37O42aX5BbFqF76k40CwQLNVn4PObjektivlinse für Bildgebung 
Abdeckungsbrille / DeckfolienVWR48393-081Deckmantel für die Platzierung der Probe
FIJI (ImageJ)Open Source2.9.0Bildanalyse-Software
Invertiertes Olympus IX81-MikroskopOlympushttp://www.olympusconfocal.com/brochures/pdfs/ix81.pdfKonfokales Bildgebungssystem
iXon3 897 EMCCD Kamera Andor-Technologiehttps://andor.oxinst.com/products/ixon-emccd-camera-series/ixon-life-897Teil des konfokalen Bildgebungssystems
MetaMorph-Software V7Molekulare Geräte. LLCVersion 7Bildanalyse-Arbeitsstation
Microsoft Excel Microsoft Suitev16.68Datenanalyse-Software
Murashige & Skoog (MS) mittel CaissonMSP11-10LTPflanzenwachstumsmedium
Perfluordecalin (Acros Organic)Acros OrganicsP9900-25GBildgebendes Medium
PhosphinothricinSigma77182-82-2Antibiotikum
PflanzenwachstumskammerVironGepflogenheitWachstumskammer
Yokogawa CSU-X1 rotierende ScheibenkonfokaleinheitYokogawahttps://www.yokogawa.com/solutions/products-and-services/life-science/spinning-disk-confocal/csu-x1-confocal-scanner-unit/Teil des konfokalen Bildgebungssystems

Referenzen

  1. Frommer, W. B., Davidson, M. W., Campbell, R. E. Genetically encoded biosensors based on engineered fluorescent proteins. Chem Soc Rev. 38 (10), 2833-2841 (2009).
  2. Okumoto, S., Jones, A., Frommer, W. B. Quantitative imaging with fluorescent biosensors. Annu Rev Plant Biol. 63, 663-706 (2012).
  3. Sweetlove, L. J., Fernie, A. R. The role of dynamic enzyme assemblies and substrate channelling in metabolic regulation. Nat Communications. 9 (1), 2136(2018).
  4. Plaxton, W. C., Tran, H. T. Metabolic adaptations of phosphate-starved plants. Plant Physiol. 156 (3), 1006-1015 (2011).
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