Integrierte Mikroplatten- und HPTLC-Strategie zur Bestimmung und Profilierung der Gesamtphenole und Flavonole in Zitrusschalenextrakten

Zusammenfassung

Diese Studie präsentiert einen kombinierten AlCl₃/Folin–Ciocalteu-Ansatz zur HPTLC-Profilierung und Quantifizierung von Flavonolen/5-Hydroxyflavonen und phenolischen Verbindungen in Zitrusschalen, ergänzt durch Mikroplattenanalyse.

Zusammenfassung

Phenolische Verbindungen und Flavonoide tragen maßgeblich zur antioxidativen Aktivität und zum Funktionswert von Zitrusnebenprodukten bei. Konventionelle kolorimetrische Tests sind zwar weit verbreitet, haben jedoch keine chromatographische Trennung und können von chemischen Störungen beeinflusst werden. Dieses Protokoll bietet einen integrierten analytischen Workflow, der mikroplattenspektrophotometrische Tests mit Hochleistungs-Dünnschichtchromatographie (HPTLC) kombiniert, um den Gesamtphenolanteil (TPC) und die Gesamtflavonole plus 5-Hydroxyflavon-Gehalt (TFHC) in Zitrusschalenextrakten zu bestimmen und zu profilieren. Ethanolische Extrakte von Kalk (Citrus aurantifolia) und Mandarinen (Citrus reticulata) Schalen wurden mit Folin–Ciocalteu (FC) und Aluminiumchlorid (AlCl₃) Tests in einem 96-Well-Mikroplattenformat untersucht, gefolgt von einer HPTLC-Analyse mit zwei sequentiellen mobilen Phasen und einer doppelten postchromatographischen Derivatisierung. Mikroplattenmessungen ergaben TPC-Werte von 74,2 mmol/g für Kalk und 72,8 mmol/g für Mandarin, während TFHC-Werte jeweils 15,5 mmol/g bzw. 6,0 mmol/g betrugen. Die HPTLC-Trennung löste vier phenolische Bänder in Kalk und sechs in Mandarin auf. Nach der AlCl₃-Derivatisierung wurden zwei Kalkbänder selektiv visualisiert, was mit Flavonolen oder 5-Hydroxyflavonen übereinstimmt. Die Summe der phenolischen Schädlinge, die von HPTLC geschätzt wurden, betrug 22,0 bzw. 20,8 mmol/g Trockensubstanz für Kalk bzw. Mandarin, während TFHC bei Kalk 13,4 mmol/g erreichte und in Mandarin nicht nachgewiesen wurde. Diese Ergebnisse zeigen, dass Mikroplatten-Assays eine schnelle und sensible Schätzung des Gesamtgehalts ermöglichen, während HPTLC die Selektivität durch Verbindungstrennung und funktionell-gruppenspezifische Derivatisierung erhöht. Die kombinierte Strategie ermöglicht Hochdurchsatz-Screening gefolgt von chromatographischer Bestätigung und bietet eine praktische und reproduzierbare Plattform für die phytochemische Charakterisierung komplexer Pflanzenmatrizen.

Einleitung

Zitrusschalen sind ein Nebenprodukt der Saftindustrie und haben das Vorhandensein funktioneller Verbindungen wie Antioxidantien^nachgewiesen. Sie wurden als neuroprotektive Lebensmittel², entzündungshemmende, aknehemmende Kosmetika³ und als Lebensmittelzusatzstoffe⁴ verwendet. Mehrere dieser Bioaktivitäten werden den Flavonoiden⁵ und den phenolischen Verbindungen⁶ zugeschrieben. Allgemeine Methoden zur Abschätzung der Gesamtmenge an Flavonoiden und Phenolen wurden in der Literatur⁷ etabliert, wobei die gebräuchlichsten das Folin-Ciocalteu für den Gesamtphenolgehalt (TPC)⁸ und das Aluminiumchlorid für Gesamtflavonoidverbindungen (TFC)⁹ mittels Spektrophotometrie sind. Die Folin-Ciocalteau-Methode wurde 1927 erstmals¹⁰ veröffentlicht, basierend auf einer Modifikation der Folin-Denis-Reaktion¹¹, beide basierend auf einer Redoxreaktion von phosphotungstisch-phosphomolibdischen Verbindungen. Die Folin-Ciocalteau-Methode misst die Reduktionskapazität phenolischer Verbindungen¹². Der Aluminiumchlorid- und Flavonoidtest wurde erstmals 1960 vorgeschlagen, basierend auf Komplexen zwischen dem Metall und den Flavonoid-Liganden¹³.

Beide spektrophotometrischen Tests sind nützliche Werkzeuge zur Schätzung und zum Vergleich des Gesamtgehalts an Phytoverbindungen, die häufig in Pflanzenmaterialien vorkommen. Sie unterliegen jedoch verschiedenen Einschränkungen. Beispielsweise ergeben sich einige Einschränkungen durch die Verwendung externer^{Standards 14}, bei denen allgemein angenommen wird, dass die chemische Natur des Standards die Signalantwort nicht wesentlich beeinflusst. In der Praxis ist diese Annahme schwer zu validieren, da die molare Absorptivität von Faktoren wie Konjugation und anderen strukturellen Merkmalen abhängt, die in natürlichen Produkten schwer zu standardisieren sind. So bewerteten Appel et al.¹⁵ TPC von elf Eichenarten und entwickelten den sogenannten "Selbststandard"-Ansatz, der Unterschiede von mehr als 50 % in den Steigungen der Kalibrierungskurven meldete. Selbststandardisierung ist eine Strategie, die darauf ausgelegt ist, dieselbe Zusammensetzungsmischung von Verbindungen wie in der Probe darzustellen und so eine genauere Übereinstimmung mit dem tatsächlichen Gesamtphenolgehalt (TPC) in der^{Probe 16} zu gewährleisten. Selbststandards liefern auch einige Informationen über das Verhältnis zwischen reaktiven Gruppen und dem durchschnittlichen Molekulargewicht; es ist jedoch mühsam und schwer zu standardisieren.

Der Gesamt-Flavonoid-Verbindungstest auf Basis der Aluminiumchloridkomplexation wurde in aktuellen Studien^17,18 kritisch bewertet, die zu dem Schluss kamen, dass AlCl₃ speziell Komplexe mit zwei Untergruppen von Flavonoiden bildet: Flavonole und 5-Hydroxyflavonen. Typischerweise zeigen Flavonole eine maximale Absorption von etwa 440 nm, während 5-Hydroxyflavone etwa 415 nm absorbieren. Darüber hinaus können bestimmte Flavonoide eine intrinsische Absorption im Bereich von 415–440 nm zeigen, selbst ohne Derivatisierung, und die Zunahme der Absorptivität bei Komplexbildung variiert je nach Verbindung. Außerdem fehlen beiden kolorimetrischen Tests die Trennung und können daher nicht zwischen verschiedenen phenolischen Bestandteilen unterscheiden; Obwohl dieses Merkmal bei der Schätzung des Gesamtinhalts vorteilhaft sein kann, führt es zu einer begrenzten Spezifität. Diese Überlegungen unterstreichen die Notwendigkeit einer analytischen Strategie, die einzelne Komponenten vor der kolorimetrischen Detektion auflöst und so echte Assay-Reaktionen von spektralen oder chemischen Störungen unterscheidet.

Trotz dieser Einschränkungen bleiben solche Assays wertvolle Werkzeuge für das allgemeine Screening bioaktiver phenolischer Verbindungen in Pflanzen- und Obstextrakten¹⁹. Zur Bewertung potenzieller Interferenzen stellt der Einsatz einer Hochleistungs-Dünnschichtchromatographie (HPTLC)-Methode, die sowohl mit Folin–Ciocalteu- als auch AlCl₃-Reagenzien gezeigt wurde, ein effektiver Ansatz dar. Die chromatographische Trennung ermöglicht den Nachweis interferierender Substanzen mit bereits vorhandenen Absorptionsbändern vor der Komplexbildung, während die fotografische Dokumentation eine gleichzeitige Analyse mehrerer Absorptionsmaxima ermöglicht. Darüber hinaus bietet die HPTLC-Analyse mehrere Vorteile gegenüber umfassenderen chromatographischen Techniken wie HPLC–MS/MS, darunter einen geringeren Lösungsmittelverbrauch, kürzere Analysezeit aufgrund der gleichzeitigen Verarbeitung mehrerer Proben (bis zu 18 pro ^Platte) und erleichterte Interpretation komplexer Mischungen aufgrund der Selektivität der postchromatographischen Derivatisierung²¹.

In dieser Arbeit präsentieren wir ein integriertes Protokoll zur Bestimmung der spezifischen Verbindungen aus dem Gesamtpolyphenolgehalt (TPC) und Gesamtflavonolen plus 5-Hydroxyflavonen (TFHC) in Zitrusschalenextrakten mittels Hochleistungs-Dünnschichtchromatographie (HPTLC) Trennung, zusammen mit einer allgemeinen Gehaltsschätzung auf Basis eines kolorimetrischen Mikroplatten-Assays. Die planare chromatographische Quantifizierung phenolischer Verbindungen erfolgt mit dem Folin–Ciocalteu-Reagenz, während die Derivatisierung von Aluminiumchlorid ausschließlich zur chromatografischen Identifikation von Bändern angewendet wird, die Flavonolen und 5-Hydroxyflavonen entsprechen. Bei diesem Ansatz basiert die Bestimmung der TFHC auf der Folin–Ciocalteu-Antwort chromatografisch aufgelöster und chemisch identifizierter Verbindungen und nicht auf der Aluminiumchlorid-Komplexation zur Quantifizierung. Die HPTLC-Analyse ermöglicht eine verbindungsspezifische Trennung und Visualisierung, wodurch einzelne phenolische Bestandteile identifiziert und potenzielle spektrale Interferenzen erkannt werden können. Zusätzlich wird eine mikroplattenbasierte spektrophotometrische Methode zur schnellen Schätzung des Gesamt-TPC und TFHC vorgestellt, die ein ergänzendes Hochdurchsatz-Screening-Tool für komplexe Pflanzenmatrizen bietet.

Protokoll

1. Zubereitung von Fruchtschalen

1. Entfernen Sie etwa 50 g Schalen von jeder Frucht und trennen Sie sie vom essbaren Teil. Für unsere repräsentativen Ergebnisse wurden Mandarinen in einem örtlichen Geschäft gekauft (importiert aus Chile, Isabellinen-Varietät), und Linden wurden von einem Baum in der Nähe von San José, Costa Rica, gesammelt (Gutscheinexemplar JVR-16434).
2. Legen Sie die Schalen in einen Plastikbeutel mit Zip-Locks und frieren Sie sie mindestens 2 Stunden bei -20 °C ein.
3. Die gefrorenen Schalen in einen vorgekühlten Gefriertrockner umleiten, die Beutel offen halten und über Nacht Vakuum (0,1 mbar) auftragen, bis sie vollständig trocken sind.
4. Mahlen Sie jedes getrocknete Material mit einer Klingenmühle auf etwa 0,1 mm.

2. Extraktion

1. Wäge etwa 100 mg trockene, gemahlene Zitrusschale (Limette oder Mandarin) ab und lege sie in ein 15-mL-Glasrohr.
2. Gib 3 ml 60%-Ethanol in das Rohr.
3. Sonikieren Sie die Mischung in einem Ultraschallbad für 10 Minuten bei 40 °C, um Pflanzenzellen zu stören und die Freisetzung von phytochemischen Stoffen zu erleichtern.
4. Zentrifugiere die Probe bei 850 × g für 10 Minuten.
5. Übertragen Sie vorsichtig den ethanolischen Supernatant mit einer Pasteur-Pipette in eine 10-mL Volumenkolben und vermeiden Sie so eine Störung des Sediments.
6. Fügen Sie zusätzlich 3 ml 60 % Ethanol in das Rohr mit dem feuchten Feststoffrest hinzu.
7. Wiederholen Sie die oben beschriebenen Schall- und Zentrifugationsschritte in den Schritten 2.3 und 2.4.
8. Übertragen Sie das Überlagermittel in denselben Volumenkolben und kombinieren Sie es mit dem vorherigen Extrakt.
9. Führen Sie eine dritte Extraktion durch, indem Sie die vorherigen Schritte (2.6–2.8) wiederholen.
10. Säuere den kombinierten Extrakt (≈9 mL) mit zwei Tropfen 0,1 mol/L HCl (um die Stabilität von Anthocyaninen und anderen phenolischen Verbindungen zu erhöhen) und erhöhe das Volumen mit Methanol auf 10 mL.
11. Führen Sie dieses Verfahren für jede Probe in dreifacher Ausführung durch.

3. Gesamtgehalt an Flavonolen und 5-Hydroxyflavonen (TFHC) mittels Mikroplattenspektrophotometrie

1. Bereiten Sie eine Quercetin-Stocklösung (100 μg/mL) oder einen äquivalenten Flavonoidstandard vor.
   1. Wiege 10 mg Quercetin mit einer Balance mit 0,1 mg Präzision.
   2. Lösen Sie das Quercetin in etwa 5 mL 95%igen Ethanols auf und übertragen Sie die Lösung in eine 10 mL Volumenkolbe, die als Standardlösung bezeichnet ist.
   3. Spülen Sie das Becherglas zweimal mit 2 ml 95% Ethanol ab und geben Sie die Spülungen in die Flasche.
   4. Bring das Volumen mit 60 % Ethanol auf die Grenze.
   5. Bereiten Sie Standardlösungen (10–100 μg/mL) und einen Blank in 1,5-mL Mikrozentrifugenröhren gemäß Tabelle 1 vor.
   6. Stellen Sie sicher, dass alle Proben und Standards im Absorptionsbereich von 0,2–0,8 liegen und gegebenenfalls die Konzentrationen anpassen.
   7. Bereiten Sie das Mikroplattenlayout vor, indem Sie gemäß Abbildung 1 60 μL Blank, Probe oder Standard in jedes Bohrloch dosieren. Führe drei Replikationen pro Probe oder Standard durch.
   8. Geben Sie wässrige Lösungen aus 2 % Aluminiumchlorid, 5 % Natriumacetat und 80 % Methanol in separate Reagenzienreservoirs ab.
      HINWEIS: Führen Sie Aluminiumchlorid und Methanollösungen mit Vorsicht. Aluminiumchloridlösungen sind reizend, und Methanol ist durch Aufnahme, Einatmen und Hautaufnahme giftig. Vermeiden Sie Haut- und Augenkontakt und tragen Sie geeignete PSA
   9. Mit einer 8-Kanal-Mehrkanalpipette geben Sie 10 μL AlCl₃-Lösung, 10 μL Natriumacetatlösung und 200 μL 80 % Methanol zu jedem Bohrloch.
   10. Schüttle den Teller bei mittlerer Intensität 10 Sekunden und brüte ihn 30 Minuten im Dunkeln aus.
   11. Messen Sie die Absorption bei 415 nm. Wenn das Schütteln nicht möglich ist, mischen Sie vor der Inkubation manuell mit einer Mikropipette (Abbildung 2).
   12. Interpolieren Sie die Absorptionswerte der Proben aus der Kalibrierungskurve und wenden Sie bei Bedarf Verdünnungs-, Volumen- und Massenkorrekturfaktoren an.

Tabelle 1: Mengen der Quercetin-Standards für die Kalibrierungskurve der Gesamtflavonole und des 5-Hydroxyflavon-Gehalts (TFHC). Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Abbildung 1: Mikroplatten-Layout für die Gesamt-Flavonole- und 5-Hydroxyflavon-Gehalt (TFHC) Mikroplatten-Analyse. (A) Schema der Mikroplatten. (B) Software-Gen5-Layoutprogramm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 2: Mikroplatten-Software-Einrichtung für die Analyse des Gesamtgehalts von Flavonolen und 5-Hydroxyflavonen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

4. Gesamtpolyphenolgehalt (TPC) mittels Mikroplattenspektrophotometrie

1. Erstellen Sie eine Standardkurve für Gallsäure (0,000–0,120 mg/mL).
   1. Wägen Sie etwa 0,0123 g Gallensäure (98 % Reinheit) mit einer Analysewaage und lösen Sie sie in destilliertem Wasser.
   2. Die Lösung in eine 10 ml Volumenkolben übergeben, zweimal abspülen und bis zur Markierung mit destilliertem Wasser füllen, um die Bodenlösung zu erhalten.
   3. Bereiten Sie eine Arbeitslösung vor, indem Sie 1 ml der Brühlösung mit destilliertem Wasser auf 10 ml verdünnen.
   4. Erstellen Sie Kalibrierungsstandards, indem die Arbeitslösung gemäß Tabelle 2 weiter verdünnt wird.
   5. Konzentrationen werden angepasst, wenn die Absorptionswerte außerhalb des 0,2–0,8-Bereichs liegen.
   6. Bereiten Sie das Folin–Ciocalteu-Arbeitsreagenz vor, indem Sie das kommerzielle Reagenz 1:14 mit destilliertem Wasser verdünnen.
      HINWEIS: Folin–Ciocalteu-Reagenz und Salzsäurelösungen sind korrosiv. Vermeiden Sie Spritzer und direkten Kontakt. Führen Sie die Handhabung des Reagens in einer Abzugshaube durch.
   7. Pipettieren Sie 30 μL jeder Probe, Standard oder Blank, in eine 96-Well-Mikroplatte gemäß Abbildung 3A und verwenden Sie drei Replikate pro Probe.
   8. Fügen Sie jedem Bohrloch mit einer Mehrkanalpipette 215 μL Folin–Ciocalteu-Arbeitsreagenz hinzu.
   9. Geben Sie 50 μL 20%ige Natriumcarbonatlösung zu jedem Brunnen und mischen Sie gründlich mit einer Mikropipette.
   10. Inkubieren Sie die Platte 20 Minuten bei 40 °C mit Rührung (Abbildung 3B).
   11. Misse die Absorption bei 755 nm.

Tabelle 2: Mengen an Galliensäurestandards für die Kalibrierungskurve des Gesamtphenolgehalts (TPC). Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Abbildung 3: Mikroplatten-Layout und Software-Einrichtung für die Analyse des Gesamtphenolgehalts (TPC). (A) Layout. (B) Softwareprogramm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

5. Allgemeine Bedingungen für die Hochleistungsanalyse der Dünnschichtchromatographie

1. Standardkurven
   1. Bereiten Sie Standardlösungen aus Quercetin und Gallensäure (jeweils 100 μg/mL) vor, wie oben in Abschnitt 3 und Abschnitt 4 beschrieben.
   2. Trage Gallensäure auf sechs Bahnen mit Volumina von 2, 4, 6, 8, 10 und 12 μL auf.
   3. Tragen Sie 5 μL Gallensäure und Quercetin einzeln auf getrennte Spuren zur Identifikation auf.
2. Kennzeichenaufteilung:
   1. Verwenden Sie eine 10 × 20 cm große Silikagel-Platte mit 60 F₂₅₄ Aluminiumrückseite als stationäre Phase.
   2. Stellen Sie die Anwendungsparameter wie folgt ein: Y-Position 7,0 mm, Bandlänge 6,0 mm, erste X-Position 14,0 mm, Abstand zwischen den Spuren 9,4 mm.
   3. Geben Sie pro Band 10 μL von jedem Extrakt und verwenden Sie Stickstoff als Sprühgas.
   4. Stellen Sie den Lösungsmittel-Frontabstand auf 70 mm ein.
3. Plattenentwicklung:
   1. Entwickle Platten in einer manuellen Kammer mit 40 ml mobiler Phase und erlaube 10 Minuten für die Kammersättigung mit Filterpapier, das mit der mobilen Phase und der Kammerwand in Kontakt steht, um die Dämpfe der mobilen Phase zu unterstützen, die Kammeratmosphäre zu sättigen.
   2. Entwickle Platten entweder mit MP1 oder MP2 und führe bei entsprechender Bedarf doppelte Entwicklung durch. Mobile Phase 1 (MP1), die aus Ethylacetat: Ameisensäure:Essigsäure:Wasser (100:11:11:26) besteht; und MP2 aus Toluol: Ethylacetat: Ameisensäure (5:4:1).
      HINWEIS: Entwickeln Sie HPTLC-Platten in einer Abzugshaube. Bewegliche Phasenkomponenten (Ethylacetat, Toluol, Ameisensäure und Essigsäure) sind flüchtig, und Toluol sowie Ethylacetat sind hochentflammbar. Vermeiden Sie das Einatmen von Dampf und vermeiden Sie Zündquellen.
   3. Lass die Teller bei Zimmertemperatur trocknen.
4. Derivatisierung
   1. Sprühplatten mit Folin–Ciocalteu-Reagenz (300 μL Reagenz + 600 μL 50 % Ethanol), trocknen kurz mit einer Heißluftpistole und sprühen mit 1 ml 10 % Natriumcarbonat in 50 % Ethanol.
   2. Sprühe andere Platten separat mit 1 % Aluminiumchlorid in 50 % Ethanol.
5. Heizplatten gleichmäßig mit einer Heißluftpistole verwenden, bis sich die Farbentwicklung stabilisiert und die Platten vollständig trocken sind.

6. Entwicklung für die Analyse des Gesamtflavonols und 5-Hydroxyflavones (TFHC) sowie des Gesamtphenolgehalts (TPC) mittels Hochleistungs-Dünnschichtchromatographie

1. Proben werden in dreifachen Spuren zusammen mit Gallsäure- und Quercetin-Referenzspuren angewendet (zur Identifikation, wie in Schritt 5.1.4 beschrieben).
2. Entwickle eine Platte mit MP1.
3. Entwickeln Sie die Platte erneut mit MP2.
4. Derivatieren Sie die Platte mit FC-Reagenz, wie zuvor beschrieben.
5. Fotodokumentieren Sie die Platte mit weißer Beleuchtung sowie 254 nm und 366 nm UV-Beleuchtung.
6. Wiederholen Sie das Verfahren und ersetzen Sie den letzten Schritt für die AlCl-3-Derivatisierung, wie in Abbildung 4 dargestellt.

Abbildung 4: VisionCats-Schritte zur Analyse von TPC und TFHC durch HPTLC. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Ergebnisse

Extraktionsbedingungen
Das hier beschriebene allgemeine Extraktionsprotokoll verwendet 60 % Ethanol, wie zuvor berichtet²². Auf andere pflanzliche Quellen extrapoliert können die Extraktionsbedingungen hinsichtlich der Polarität des Lösungsmittels und der Anzahl der Zyklen optimiert werden. Eine umfassende Begründung für die Auswahl sowohl des Lösungsmittels als auch der Anzahl der Zyklen wurde an anderer Stelle beschrieben¹⁶. Die Auswahl des Lösungsmittels kann sich an früherer Literatur und Polaritätsindizes orientieren; Im Allgemeinen werden hydroalkoholische Mischungen aus Ethanol oder Methanol sowie Aceton empfohlen. Die optimale Anzahl der Extraktionszyklen (n) kann berechnet werden, indem ein festes Gesamtvolumen von 10 mL in 1–5 Zyklen à 10/n mL geteilt und anschließend die flüssigen Extrakte gesammelt werden. Die Effizienz verschiedener Extraktionszyklenzahlen wird dann statistisch verglichen, um die Bedingung zu identifizieren, die im TPC-Test die maximale Absorption ergibt.

Mikroplatten- und HPTLC-Quantifizierung
Die Standard-Kalibrierungskurven sowohl für den Mikroplatten-Test als auch für die HPTLC-Analyse sind in Abbildung 5 dargestellt. Zur Bestimmung des Gesamtphenolgehalts (TPC) mittels der Folin–Ciocalteu-Mikroplattenmethode und für HPTLC-Platten, die mit demselben Reagenz derivatiert wurden, wurden Kalibrierungskurven unter Verwendung der Gallensäure als Referenzverbindung erstellt. Gallinsäure wurde nicht nur ausgewählt, weil sie einer der am häufigsten verwendeten Standards für die TPC-Quantifizierung ist, sondern auch, weil sie unter denselben mobilen Phasenbedingungen wie bei den Kalk- und Mandarinproben eluiert werden kann. Quercetin wurde außerdem als potenzieller Standard für den HPTLC-Test bewertet; es erwies sich jedoch als ungeeignet für dieses chromatographische System, da es mit der Lösungsmittelfront co-eluierte und nicht zuverlässig quantifiziert werden konnte. Dennoch wurde TFHC unter Verwendung von Quercetin als Referenzstandard bestimmt, da Gallensäure keinen farbigen Komplex mit Aluminiumchlorid bildet, da es weder ein Flavonol noch ein 5-Hydroxyflavonon ist.

Abbildung 5: HPTLC-Platte aus Kalk, Mandarin, Gallsäure und Quercetin, die sequentiell mit MP1 gefolgt von MP2 entwickelt und separat mit Aluminiumchlorid (AlCl₃) und Folin–Ciocalteu (FC) Reagenzien derivatiert wird. Das chromatographische Profil nach der AlCl₃-Derivation wird dargestellt. Abkürzungen: FC, Folin–Ciocalteu-Derivation; AlCl₃, Derivation von Aluminiumchlorid; W, Weißlichtbeleuchtung; 366, UV-Beleuchtung bei 366 nm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Die Ergebnisse für den Gesamtphenolgehalt (TPC) sowie den Gesamtgehalt an Flavonoid- und Hydroxycinnaminsäure (TFHC) sind in Tabelle 3 dargestellt. Wie erwartet, waren TFHC-Werte signifikant niedriger als TPC-Werte, etwa fünfmal so niedrig in Kalkproben und zwölffach niedriger in Mandarinproben.

Tabelle 3: Ergebnisse für Mandarinen- und Kalk-Gesamtphenolgehalt mittels Mikroplatten-Methode. Abkürzungen: Abs: Absorptionsannahme, CV: Variationskoeffizient, DF: Verdünnungsfaktor, GAE: Gallsäureäquivalente, IR: Unabhängige Replikation, QE: Quercetin-Äquivalente, Rep: Wiederholung, SD: Standardabweichung, TFHC: Gesamtflavonole und 5-Hydroxiflavonverbindungen, TPC: Gesamtphenolgehalt und Durchschnitt. *Berechnung basierend auf der Trockensubstanz. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Ebenso werden die Ergebnisse der HPTLC-Analyse in Tabelle 4 zusammengefasst. Die chromatographische Trennung ermöglicht die Visualisierung einzelner Bänder, die verschiedenen Verbindungen entsprechen. Vier phenolische Bestandteile wurden in Kalkproben und sechs in Mandarinenproben nachgewiesen. Keines dieser Bänder entsprach den Retentionsfaktoren der verwendeten Referenzstandards (Gallensäure und Quercetin), was mit den Erwartungen übereinstimmt.

Tabelle 4: Ergebnisse für den Gesamtphenolgehalt und Bänder, die zu AlCl₃ gehören, zeigten Verbindungen durch HPTLC, derivatiert mit AlCl₃. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 4 zeigt außerdem den gesamten phenolischen Gehalt, der aus der HPTLC-Analyse geschätzt wird, berechnet als Summe der einzelnen chromatografisch detektierten Verbindungen (analog zum TPC). Zusätzlich enthält die Tabelle den kumulativen Gehalt der Bänder, die den Flavonolen oder 5-Hydroxyflavanen zugeordnet sind (Rf = 0,46 und 0,62 bei Kalk; keine im Mandarin nachgewiesen). Diese Bänder erschienen nach der Derivatisierung mit AlCl₃ gelb und zeigten unter 366 nm UV-Beleuchtung gelbliche Fluoreszenz. Vor der Derivatisierung wurde jedoch keine sichtbare Färbung beobachtet, wie in Abbildung 5 gezeigt.

Für die HPTLC-Analyse ermöglicht die Folin-Ciocalteu-(FC)-Derivatisierung eine umfassende Detektion phenolischer Verbindungen, obwohl geringfügige Interferenzen auftreten können. Außerdem färbt die Derivatisierung von Aluminiumchlorid (AlCl₃) selektiv eine Teilmenge der Flavonoide. Die kombinierte Anwendung beider Reagenzien verbessert die Methodenstandardisierung und mildert einige der inhärenten Einschränkungen beider Ansätze. Bemerkenswert ist, dass es unwahrscheinlich ist, dass eine nicht-flavonoide Verbindung sowohl die charakteristische blaue Färbung unter FC als auch die gelb-rote Absorption unter AlCl₃ aufweist. Zusätzlich können bereits vorhandene Chromophore als Interferenzen ausgeschlossen werden, wenn sie mit derselben Intensität vor der Derivatisierung sichtbar sind.

Wie in Abbildung 5 gezeigt, zeigte der Kalkextrakt bei Rf 0,62 und 0,46 zwei Bänder, die auf der unentwickelten Platte nicht nachweisbar waren, aber nach der Folin–Ciocalteu- (FC) und AlCl₃-Derivatisierung deutlich sichtbar wurden. Dieses Verhalten unterstützt ihre flavonoide Natur und entspricht möglicherweise Neoeriocitrin und Hesperidin²³. Weitere phenolische Bestandteile wurden bei Rf 0,21 und 0,37 in Kalk sowie bei Rf 0,36, 0,39, 0,42, 0,46, 0,54 und 0,89 in Mandarin beobachtet. Diese Bänder waren nach der FC-Derivatisierung nachweisbar, aber nicht nach der AlCl₃-Behandlung, was darauf hindeutet, dass sie mit nicht-flavonoiden phenolischen Verbindungen korrelieren könnten. Laut der Literatur gehören zu den wichtigsten nicht-flavonoiden Phenolen, die in Mandarin berichtet werden, Chlorogensäure und Transferulinsäure^24,25. In Kalk sind zuvor beschriebene Verbindungen Kumarsäure und Dihydroxyferulsäure²³. Die Bestätigung dieser Zuweisungen erfordert jedoch eine Analyse mit zusätzlichen Referenzstandards.

Vergleich der HPTLC-Mobilphasen
Beide mobilen Phasen wurden als Modifikation der zuvor gemeldeten Systeme 26,27,28 entwickelt. Die polarere mobile Phase (MP1, Abbildung 6A) bot eine bessere Trennung der phenolischen Bestandteile im Vergleich zu MP2. Im Gegensatz dazu ermöglichte die weniger polare mobile Phase (MP2) (Abbildung 6B) die gleichzeitige Aufbewahrung sowohl der Probenkomponenten als auch der Referenzstandards innerhalb desselben chromatografischen Durchlaufs. Unter MP2-Bedingungen waren die Rf-Werte der Stichprobenbestandteile jedoch relativ niedrig, wobei einige Verbindungen nahe am Ursprung blieben, wie in Abbildung 6 dargestellt. Um diese Einschränkung zu beheben, wurde ein doppeltes Entwicklungsverfahren mit MP1 gefolgt von MP2 implementiert. Diese Strategie gewährleistete eine verbesserte Migration und Auflösung der Probenkomponenten und ermöglichte gleichzeitig eine Quantifizierung anhand von Gallsäurestandards auf derselben Platte unter identischen chromatographischen Bedingungen. Quercetin zeigte vor der AlCl₃-Behandlung eine schwache gelbe Färbung, die nach der Derivatisierung verstärkt wurde. Sowohl für Kalk- als auch Mandarinenextrakte wurden zwei unterschiedliche Bänder beobachtet, zusätzlich zu einem Band, das am Ursprung verblieb. Außerdem wurde nach der AlCl₃-Derivatisierung ein gelbes Band mit einem Rf-Wert von 0,14 deutlich sichtbar.

Abbildung 6: HPTLC-Platten aus Kalk, Mandarine, Gallensäure und Quercetin, entwickelt mit mobilen Phasen 1 (A) und mobilen Phasen 2 (B). Für jede Platte entsprechen die Spuren von links nach rechts: entwickelten (nicht-derivatisierten), Folin–Ciocalteu-derivatierten und AlCl₃-derivatierten Proben. Die Visualisierung erfolgte unter weißem Licht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Diskussion

Probenentnahme und -lagerung sind entscheidende Schritte, um die Integrität phytochemischer Analysen sicherzustellen. Nach der Entnahme sollten die Proben unter gekühlten Bedingungen transportiert und so schnell wie möglich gefriertrocknet werden, um den Abbau zu minimieren. Während getrocknete biologische Materialien im Allgemeinen stabil sind, sind Extrakte in Lösung deutlich widerstandsfähiger, selbst wenn sie unter Kühlung gelagert werden. Daher werden analytische Beurteilungen vorzugsweise an frisch zubereiteten Extrakten durchgeführt. Eine längere Lagerung, selbst für einige Tage unter kalten und lichtgeschützten Bedingungen oder für einige Stunden bei Raumtemperatur, kann zu beobachtbaren Veränderungen chromatografischer Profile führen, einschließlich Veränderungen der Bandintensität und der Bildung von Niederschlägen. Diese Veränderungen sind typischerweise mit chemischen Transformationen wie Oxidation, Hydrolyse oder Komplexationsreaktionen verbunden. Daher sollten alle Reagenzien und Extrakte unter kalten und dunklen Bedingungen gelagert und behandelt werden, um ihre chemische Stabilität zu erhalten.

Beim Vergleich beider Techniken (Tabelle 3 und Tabelle 4) sind systematische quantitative Unterschiede erkennbar. Sowohl bei Kalk als auch in Mandarin waren die durch den Mikroplatten-Test erhaltenen TPC-Werte etwa dreimal höher als die von HPTLC geschätzten. Bei Kalk betrug TPC 74,2 mmol/g per Mikroplatten gegenüber 22,0 mmol/g DM bei HPTLC, während TFHC-Werte 15,5 mmol/g bzw. 13,4 mmol/g betrugen. Im Mandarin erreichte TPC 72,8 mmol/g per Mikroplatten, verglichen mit 20,8 mmol/g bei HPTLC. Für TFHC ergab die Mikroplattenmethode 6,0 mmol/g, während keine entsprechenden Bänder von HPTLC nachgewiesen wurden.

Diese Abweichungen lassen sich durch die intrinsischen Einschränkungen und Reaktionsmechanismen jeder Methode erklären. Der Folin–Ciocalteu (FC)-Test ist dafür bekannt, nicht nur mit phenolischen Verbindungen zu reagieren, sondern auch mit verschiedenen nicht-phenolischen Reduktionsstoffen, darunter Ascorbinsäure, Tyrosin, Ameisensäure und Essigsäure²⁹ sowie andere niedrigmolekulare Reduktanten. Solche Verbindungen tragen zum gesamten spektrophotometrischen Signal bei, was potenziell zu einer Überschätzung des TPC führen kann. Zusätzlich können kleinere phenolische Bestandteile die Gesamtabsorption im Mikroplatten-Test gemeinsam erhöhen, selbst wenn ihre individuellen Konzentrationen zu niedrig sind, um in HPTLC eindeutige, quantifizierbare Bänder zu erzeugen. Einige kleine oder hochpolare Metabolite können unter den verwendeten chromatographischen Bedingungen ebenfalls nicht gehalten, aufgelöst oder sichtbar werden.

Abbildung 7: Schematische Darstellung von AlCl₃-Komplexen, die mit Flavonolen und 5-Hydroxyflavonen gebildet wurden. (A) Flavonole und (B) 5-Hydroxyflavone. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Methodologische Unterschiede in der Detektionschemie tragen zudem zu den beobachteten Variationen bei. Die FC-Reaktion führt durch die Reduktion des Reagenzens zu einer erheblichen Erhöhung der Absorption, was zu einer hohen analytischen Empfindlichkeit führt. Im Gegensatz dazu ist die AlCl₃-Methode relativ unspezifisch und basiert auf der Komplexbildung mit bestimmten Flavonoiden. Flavonole zeigen typischerweise eine maximale Absorption bei etwa 410 nm, während 5-Hydroxyflavone etwa 440 nm¹⁸ absorbieren, und ihre Komplexe mit Al³⁺ sind in Abbildung 7 dargestellt. Allerdings ist der Anstieg der Absorption nach der Komplexbildung vergleichsweise gering, was den AlCl₃-Test anfälliger für Interferenz durch Farbmatrixkomponenten, einschließlich der Flavonoide selbst, macht.

Trotz dieser Einschränkungen stellt die kombinierte Verwendung von FC- und AlCl₃-Derivatisation in HPTLC eine kraftvolle ergänzende Strategie für die phenolische Analyse dar. Dieser Ansatz verbindet die hohe Empfindlichkeit der FC-Reaktion mit der strukturellen Diskriminierung, die durch AlCl₃-Komplexation und chromatographische Trennung ermöglicht wird. Darüber hinaus zeigen mehrere Flavonole unter UV-Beleuchtung³⁰ charakteristische gelbliche Bänder, was die Klassifikation und Bestätigung der Verbindungen weiter unterstützt.

Mikroplattenverfahren sind besonders vorteilhaft für Hochdurchsatz-Screening. Sie erfordern eine minimale Probenvorbereitung, einen geringen Reagenzienverbrauch und ermöglichen die gleichzeitige Analyse von Dutzenden von Proben. Unter typischen Laborbedingungen kann ein vollständiger Mikroplatten-Test in etwa 4 Stunden mit weit verbreiteter Instrumentierung durchgeführt werden. Diese Eigenschaften machen Mikroplatten-Assays äußerst geeignet für schnelle Vergleichsstudien, routinemäßige Qualitätskontrolle und die vorläufige Bewertung großer Probenmengen. Im Gegensatz dazu ist HPTLC zeit- und arbeitsintensiver, mit einem vollständigen analytischen Workflow, der typischerweise 7–8 Stunden erfordert. Es basiert außerdem auf spezialisierte Instrumentierungen, die nicht in allen Laboren verfügbar sind, und der Einsatz spezieller Platten und Derivatisierungsreagenzien erhöht die Kosten pro Analyse. Eine weitere Einschränkung besteht darin, dass Metabolite, die in sehr niedrigen Konzentrationen vorhanden sind, unter Standardvisualisierungsbedingungen nicht nachweisbar bleiben können. Diese praktischen und empfindlichkeitsbezogenen Einschränkungen werden jedoch durch den entscheidenden Vorteil der chromatografischen Trennung^30,31 ausgeglichen. HPTLC ermöglicht die Auflösung einzelner Bestandteile in komplexen Pflanzenmatrizen, die Bestätigung echter Assay-Reaktionen und die Erkennung potenzieller störender Verbindungen. Darüber hinaus ermöglicht die selektive postchromatographische Derivatisierung eine einfache Klassifikation von Verbindungen in funktionelle Gruppen (z. B. Flavonole und 5-Hydroxyflavone), was die chemische Interpretation über die Gesamtgehaltsschätzung hinaus verbessert.

Dementsprechend kann in groß angelegten Studien der analytische Arbeitsablauf mit Mikroplatten-Tests beginnen, um Proben mit erhöhten Konzentrationen der Zielverbindungen schnell zu identifizieren. Ausgewählte Proben können anschließend einer HPTLC-Analyse unterzogen werden, um einzelne Bestandteile zu visualisieren, die Selektivität zu bewerten und mögliche Interferenzen durch duale Derivatisierung zu bewerten. Diese integrierte Strategie (dargestellt in Abbildung 8) verbindet Geschwindigkeit und Durchsatz mit chemischer Spezifität und struktureller Einsicht.

Abbildung 8: Vorgeschlagener Arbeitsablauf für das Musterscreening und die Analyse. (A) Hochdurchsatz Mikroplatten-Screening einer großen Menge Proben. (B) HPTLC-Analyse ausgewählter Proben zur Quantifizierung mit der Folin–Ciocalteu-Methode sowie zur Identifikation von Flavonolen und 5-Hydroxyflavonen mittels AlCl₃-Derivatisierung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Im Vergleich zu HPTLC bietet HPLC in Kombination mit hochauflösender Massenspektrometrie (HPLC–HRMS) – der am häufigsten in der Literatur berichteten Alternative – eine unübertroffene Sensitivität und eindeutige strukturelle Identifikation einzelner Verbindungen³². Dennoch sind HPLC–HRMS-Analysen von Natur aus langsamer, da jeder chromatographische Durchlauf sequentiell durchgeführt werden muss und sie mit deutlich höheren Kosten verbunden sind, die mit Instrumentierung, Lösungsmittelreinheit und Lösungsmittelverbrauch verbunden sind. Darüber hinaus erfordert das funktionale Klassenscreening oft komplexe Datenverarbeitung und verbindungsspezifische Interpretation, während HPTLC eine direkte visuelle Gruppierung von Verbindungen nach der Derivatisierung ermöglicht. Daher stellt HPTLC eine effektive Zwischenplattform zwischen schnellem Mikroplattenscreening und umfassender HPLC–MS-Analyse dar, wobei Durchsatz, Kosten und chemische Selektivität ausgewogen werden.

Flavonoid- und phenolische Analysen finden vielfältige Anwendungen in der Lebensmittelwissenschaft, Nutraceuticals, Pharmazeutik, Landwirtschaft und Materialforschung. In der Lebensmittelwissenschaft wird es verwendet, um die antioxidative Kapazität, Authentizität, Haltbarkeit und Qualitätskontrolle von Produkten wie Säften, Weinen und Tees zu bewerten sowie agronomische Studien zu unterstützen, einschließlich der Bestimmung der optimalen Erntezeit anhand der phenolischen^{Reife 33}. Im Nutraceutical-Bereich ist das phenolische Profiling für die Standardisierung und Qualitätssicherung botanischer Extrakte und kommerzieller Produkte wie grüne Teeextraktkapseln, Traubenkernextrakt-Supplemente, Quercetin-Tabletten und Zitrus-Bioflavonoid-Formulierungen unerlässlich. In der pharmazeutischen und biomedizinischen Forschung unterstützen diese Analysen das Screening bioaktiver Verbindungen mit antioxidativem, entzündungshemmendem und antimikrobiellem Potenzial⁶. In der Landwirtschaft und Pflanzenphysiologie hilft die phenolische Bestimmung dabei, die Stressreaktionen von Pflanzen zu bewerten und Strategien zur Ernteverbesserung zu steuern. Darüber hinaus hilft in der Materialwissenschaft – insbesondere in Studien zu pflanzlichen Korrosionsinhibitoren ^34,35 – die phenolische Charakterisierung dabei, chemische Zusammensetzung mit Adsorptionsverhalten und Schutzwirkung in Verbindung zu bringen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1,5 mL Eppendorf-Röhren	Eppendorf
10-ml-Volumenkolben	Eisco Labs	CH0451B	10/19 Polypropylen-Stopfen, Borosilikatglas, Bernstein – Weißes Abschneidungszeichen, Toleranz & Plusmn; 0,025 ml
100 & Mikro; L und 1000 & Mikro; L-Mikropippettenspitzen	Generisch
100– 1000 & Mikro; L-Mikropipette	Eppendorf	Research Plus
10 & Strich; 100 & Mikro; L-Mikropipette	Eppendorf	Research Plus
15 mL verschlossene Glasröhren	Generisch
50-mL-Becher	Generisch
8-Kanal-Multikanal-Mikropippette	ThermoSciecntific
96-Bohrloch-Mikroplatten	Greiner	655891	Polycicloolefin, Glasboden, schwarz
Analytisches Gleichgewicht			&Plusmn; 0,0001 g
Automatischer TLC-Sampler	CAMAG	ATS4
Zentrifuge	ThermoSciecntific	Sorvall ST8R	≥ 850 & Times; g
Filterpapier	Whatman		Für die Kammersättigung
Gefriertrockner	LABCONCO	Modell 10
Reservoirs für Kunststoffreagenzen	Eppendorf
Spatel mit flachem Ende und Löffelende	Merck Chemicals	HS15906
Synergy HT Multi-Detektions-Mikroplattenleser	BioTek-Instrumente	Synergie HT
TLC Silikagel 60 F254 Aluminium-Rückseiten Platten (10 & Mal; 20 cm)	Merck
TLC-Sprüher	Sigma-Aldrich		20 mL
TLC Visualizer	CAMAG	2
Ultraschallbad/-reiniger	Creworks	ZX-040	mit Temperaturregelung von 40 °C; C
UV Lamb	UPV	UVGL-58
VisionCats-Software	CAMAG
Zip-Lock-Beutel	Generika		1/4 Viertel Gallone