Phänotypisches Profilieren von MPTP-induzierten, Parkinson-ähnlichen Verhaltensphänotypen bei Zebrafischlarven basierend auf Verhaltensexperimenten

Zusammenfassung

Dieses Protokoll etabliert ein verhaltensbezogenes Phänotypisierungsparadigma bei mit MPTP behandelten Zebrafischlarven, um Parkinson-ähnliche motorische und nicht-motorische Defizite zu bewerten.

Zusammenfassung

Dieser Artikel stellt ein einzigartiges, multiparametrisches verhaltensbezogenes Phänotypisierungsprotokoll für MPTP-induzierte Parkinson-Krankheit (PD) bei Larvenzebrafischen vor. Die chemische Induktion PD-ähnlicher Pathologie bei Zebrafischen bietet ein hochdurchsatzfähiges, genetisch handhabbares System, doch die meisten Studien konzentrieren sich eng auf grundlegende Lokomotor-Assays oder einfache Licht-Dunkel-Übergänge. Solche begrenzten Ansätze erfassen nicht das breitere Spektrum von PD-bedingten Dysfunktionen, die von Bradykinesie und sensorimotorischen Defiziten bis hin zu angstähnlichen Verhaltensweisen und Schlafstörungen reichen. Um diese Lücke zu schließen, entwickelte diese Studie eine integrierte Batterie von 6 komplementären Assays: Lokomotortest zur Bewertung des allgemeinen Lokomotor- und Explorationsantriebs; Thigmotaxis-Bewertung zur Erkennung angstbezogener Edge-Präferenz-Verhaltensweisen; Startle-Response-Test zur Aufzeichnung von Bradykinesie und beeinträchtigter motorischer Reaktivität; Hell-Dunkel-Herausforderungstests zur Bewertung von Risikobereitschaft und Stressreaktion; photomotorische Antwortparadigmen (einschließlich Stroboskopstimulation) zur Quantifizierung sensorimotorischer und reflexiver Bewegungen; und Überwachung der Schlaf-Wach-Regulierung zur Messung des Schlaf-Wach-Verhaltens. Larvenzebrafische sind subletalen Konzentrationen von MPTP von 1 Tag nach der Befruchtung (DPF) bis 5 DPF ausgesetzt, wobei Verhaltensanalysen ab 4 bis 6 DPF beginnen. Hochauflösende automatisierte Nachverfolgung erzeugt pro Assay mehrere Verhaltensendpunkte. Dieser Ansatz deckt bisher unentdeckte, PD-ähnliche Veränderungen auf, wie eine ungeordnete Schlafarchitektur, beeinträchtigte Gewöhnungslernbewegungen, sensorimotorische und reflexive Bewegungen, die frühe nichtmotorische Symptome widerspiegeln. Durch die Kombination dieser Tests erhalten Forscher ein umfassendes Verhaltenssymptom, das der Komplexität der menschlichen PD besser entspricht. Dieses Protokoll erweitert das Paradigma zur Untersuchung der PD-Pathogenese, zur Auswahl von Kandidatentherapien und zur Erforschung von Umweltmodulatoren. Sie veranschaulicht das Ziel der Sammlung, innovative Tiermodelle zu präsentieren, die durch robuste, facettenreiche Phänotypisierung die translationale Relevanz erhöhen.

Einleitung

Die Parkinson-Krankheit (PD) ist nach Alzheimer die zweithäufigste neurodegenerative Erkrankung¹. Seine Prävalenz und die Zahl der betroffenen Personen sind in den letzten Jahren stetig gestiegen und^{stellen weltweit eine} erhebliche Herausforderung für die öffentliche Gesundheit dar. Die Inzidenzrate von PD steigt mit^{dem Alter von 3,4} Jahren deutlich an. Klinisch äußert sich PD sowohl durch motorische Symptome – wie Dyskinesie, Bradykinesie, Ruhetremor und Haltungsinstabilität – als auch durch eine Vielzahl nicht-motorischer Symptome, darunter kognitive Beeinträchtigung, Angst und Schlafstörungen⁵. Derzeit hängt die Diagnose von PD hauptsächlich vom Vorhandensein motorischer Symptome⁶ ab; Bis diese Symptome jedoch sichtbar werden, sind bereits über 60 % der Dopaminneuronen in der Substantia nigra verloren^gegangen. Obwohl nichtmotorische Symptome häufig früher auftreten, erschwert das Fehlen spezifischer und objektiver Bewertungskriterien die frühe Diagnose und Intervention⁸. Derzeit besteht die Hauptbehandlung von PD in der Verabreichung von Levodopa⁹, das im Gehirn in Dopamin umgewandelt wird und so die Dopaminspiegel im Striatum wieder auffüllt. Obwohl diese Behandlung die Symptome vorübergehend lindern kann, stoppt sie das Fortschreiten der Krankheit^nicht. Daher ist weitere Forschung zur Pathogenese von PD und zum Drogenscreening unerlässlich.

Der Aufbau geeigneter Tiermodelle ist entscheidend für die Forschung zur Pathogenese von PD- und Anti-PD-Medikamentenscreening. Heute gibt es drei Hauptmodelle für PD-Studien: das chemische Induktionsmodell¹¹, das Gen-Editierungsmodell¹² und das humane Xenotransplantationsmodell¹³. Häufig verwendete Modelltiere sind Nagetiere wie Mäuse¹⁴ und nicht-menschliche Primaten wie Affen¹⁵. In letzter Zeit haben Zebrafische (Danio rerio) in PD-Studien zunehmend Aufmerksamkeit erlangt wegen ihrer Vorteile wie geringe Größe, schnelles Wachstum, hohe genetische Homologie mit Menschen und transparenten Embryonen¹⁶. Die Verwendung von Neurotoxin MPTP (1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin) zur Induzierung von Dopamin-Neuronenschäden^17,18 ist eine klassische Methode zur Erstellung eines PD-Modells. Zebrafische, die subletalen MPTP-Konzentrationen ausgesetzt sind, zeigen verschiedene PD-ähnliche Verhaltensphänotypen¹⁹.

Heutzutage konzentrieren sich jedoch die meisten Zebrafisch-PD-Studien hauptsächlich auf grundlegendes Lokomotorikverhalten oder einfache Licht-Dunkel-Übergänge^16,20, und eindimensionale Verhaltenstests sind schwierig, die komplexen Verhaltensmerkmale der PD, insbesondere die Verhaltensänderungen der nichtmotorischen Funktion, vollständig widerzuspiegeln. Da PD eine Krankheit ^{ist, die} mehrere neurobehaviorale Systeme über die motorische^Kontrolle hinaus betrifft, ist dringend eine multiparametrische Methode zur Bewertung des verhaltensbezogenen Phänotyps erforderlich, um die multisystemischen Phänotypen²⁴ zu erfassen.

Dementsprechend entwickelt diese Studie ein mehrfaches, parametrisches und schnelles Verhaltensphänotypisierungs-Assay-Protokoll, um die PD-ähnlichen Verhaltensphänotypen bei mit MPTP behandelten Zebrafischlarven umfassender zu beschreiben. Eine subletale Dosis MPTP (50 μM)²⁵ wurde den Larven 1 bis 5 Tage nach der Befruchtung (dpf)16,20,26 gegeben. Von 4 bis 6 DPF^{16, 20, 24} führten wir 6 Verhaltenstests durch: Überwachung der Schlaf-Wach-Regulation, photomotorische Reaktionsparadigmen, Thigotakaxis-Bewertung, Lokomotorik-Bewertung, Startle-Response-Test und Licht-Dunkel-Herausforderungstests. Diese Verhaltensbewertungen decken sowohl motorische als auch nicht-motorische Aspekte ab, wie Bewegungsdefizite, sensorimotorische, gewöhnungsorientiertes Lernen, Risikobereitschaft, Stressreaktion und Schlaf-Wach-Rhythmus.

Mit Hilfe des Zebrabox-Hochdurchsatz-Videotracking-Systems und der quantitativen Analysemethode extrahierten und quantifizierten wir verschiedene Verhaltensparameter und verglichen die Verhaltensunterschiede zwischen der MPTP-behandelten Gruppe und der Wildtyp-(WT-)Gruppe statistisch. Im Vergleich zu bestehenden Zebrafisch-PD-Tests erfasst diese multiparametrische Verhaltensbatterie motorische und nicht-motorische Phänotypen innerhalb eines standardisierten Rahmens. Das automatisierte Tracking-System gewährleistet objektive Verhaltensdatenerfassung und hohe Reproduzierbarkeit. Darüber hinaus ermöglicht die geringe Körpergröße der Larven, einzelne Tiere in Mehrfach-Brunnenplatten zu platzieren, was eine Hochdurchsatzbewertung ermöglicht. Die oben genannten Vorteile sind vorteilhaft, um den pathologischen Mechanismus von PD gründlich zu analysieren, die Kandidaten für Medikamente oder Verbindungen zu screenen und den Einfluss von Umweltfaktoren auf das Auftreten oder die Entwicklung von PD zu untersuchen.

Protokoll

Diese Studie mit Zebrafischen wurde in Übereinstimmung mit institutionellen Richtlinien für Tierpflege und -anwendung durchgeführt und vom Ethischen Ausschuss der School of Pharmaceutical Sciences der Universität Shandong (Nr.YXDW2025-0056) genehmigt. Die Reagenzien und die verwendeten Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. MPTP-Vorbereitung

1. Bereiten Sie 1× E3-Medium vor, indem Sie 100× E3-Brühlösung 1:100 mit ultrareinem Wasser verdünnen (z. B. 5 ml 100× E3 mit 495 mL ultrareinem Wasser mischen, um 500 mL 1× E3-Medium zu erhalten).
   HINWEIS: Bereiten Sie E3 Medium am Tag der Anwendung frisch vor.
2. Bereite eine 1 mM MPTP-Lagerlösung vor, indem du 5,0 mg MPTP-Pulver in ein 50 mL Zentrifugenrohr gibst und E3-Medium zu einem Endvolumen von 25 mL hinzufügst (verwende das Zentrifugenrohr als Mischbehälter, aber eine Zentrifugation ist nicht erforderlich). Beschrifte die Lösung als 1 mM MPTP-Stocklösung. Die Brühlösung im Dunkeln aufbewahren.
3. Herstellung einer 50 μM MPTP-Lösung: 2,5 mL der 1 mM MPTP-Lagerlösung in einen sauberen Behälter umgeben und mit 47,5 mL E3-Medium verdünnen, um ein Endvolumen von 50 mL bei einer Endkonzentration von 50 μM MPTP zu erhalten. Der verbleibende Teil der Lagerlösung wurde weiterhin im Dunkeln gelagert.
   VORSICHT: MPTP ist ein starkes Neurotoxin und muss mit äußerster Vorsicht behandelt werden. Tragen Sie stets geeignete persönliche Schutzausrüstung (PSA), einschließlich Handschuhe, Laborkittel und Schutzbrillen. Entsorgung von MPTP-Abfällen gemäß institutionellen Biosicherheitsrichtlinien.

2. Zebrafischembryonen präparieren und gruppieren

1. Wählen Sie geschlechtsreife männliche und weibliche erwachsene Zebrafische aus und führen kontrollierte Zucht mit Zuchtbecken mit abnehmbaren Trennwänden durch. Um 20:00 Uhr werden männliche und weibliche Zebrafische getrennt in die Brutbecken im Verhältnis 2:3 gesetzt und mit Trennwänden getrennt.
2. Am folgenden Tag werden Trennwände um 8:00 Uhr entfernt, um die Paarung zu ermöglichen, und so das Laichen eingeleitet. Sammeln Sie die Embryonen nach 1 Stunde und waschen Sie sie dreimal mit sauberem Wasser.
3. Die Embryonen werden in 100 mm Petrischalen mit frischem E3-Medium untergebracht und bei 28 °C unter einem 14-Stunden-Licht-/10-Stunden-Dunkelzyklus (Lichter von 08:00 bis 22:00 Uhr an) ausgebrütet.
   HINWEIS: Überschreiten Sie nicht mehr als 50 Embryonen pro Schüssel mit 20 mL Medium, um eine normale Entwicklung zu gewährleisten.
4. Bei 1 DPF werden die unbefruchteten, missgestalteten und abnormalen Embryonen vorsichtig mit einer Pasteur-Pipette entfernt und die Lösung mit Zebrafisch-Embryonen ersetzt. Für die WT-Gruppe ersetzen Sie das bestehende Medium durch frisches E3-Embryomedium. Für die MPTP-behandelte Gruppe ersetzen Sie das Medium durch eine 50 μM MPTP-Lösung (Abbildung 1A) und geben Sie dann beide Gruppen zurück in den Inkubator.
5. Für beide Gruppen ersetzen Sie die Lösung und entfernen Sie alle 24 Stunden alle toten oder ungesunden Embryonen. Für die MPTP-behandelte Gruppe wird die MPTP-Lösung täglich vom Morgen 1 dpf bis zum Morgen um 4 DPF ersetzt (Abbildung 1A). Dann wird die MPTP-behandelte Gruppe ab dem Morgen um 5 dpf auf E3-Medium umgestellt bis zum Ende des Experiments.
   HINWEIS: Ersetzen Sie die Lösung vorsichtig mit einer Pasteur-Pipette. Saugen Sie das Medium langsam vom Rand der Petrischale ab und fügen Sie frische Lösung entlang der Wand der Petrischale hinzu, um die Störung der Embryonen zu minimieren.

3. Überwachung der Schlaf-Wach-Regulation

1. Bei 4 dpf werden um 18:00 Uhr Zebrafischlarven aus jeder Gruppe ausgewählt und mit einer modifizierten 3-mL Pasteur-Pipette mit abgetrennter Spitze auf eine 96-Well-Platte übertragen (Abbildung 1B). Die ersten vier Reihen stehen für die WT-Gruppen, und die letzten vier Reihen für die MPTP-Gruppen (48 Zebrafische in jeder Gruppe).
   HINWEIS: Um die Stimulation oder Schädigung von Zebrafischen zu vermeiden, modifizieren Sie Pasteur-Pipetten, indem Sie die Spitze (10 mm) abschneiden, sodass sie eine breite Bohrung erhalten, die größer ist als die Größe der 4-dpf-Zebrafischlarven (Körperlänge übersteigt 3,7^mm).
2. Beobachten Sie jeden Brunnen mit einem Stereomikroskop, um sicherzustellen, dass das Aussehen jeder Zebrafischlarve gesund ist, die Flossen offen und regelmäßig geschwungen sind, der Körper aufrecht steht und die Schwimmblase^{um 29 aufgeblasen} ist. Nachdem Sie sichergestellt haben, dass die Zebrafische in jedem Brunnen gesund sind, füllen Sie jeden Brunnen mit E3-Medium.
   HINWEIS: Füllen Sie jedes Bohrloch mit E3-Medium bis fast wölbend und stellen Sie sicher, dass die Oberflächenspannung erhalten bleibt. Gib die Flüssigkeit vorsichtig hinzu, um Blasen und Überlaufen im Querbrunnen zu verhindern.
3. Nachdem der Fisch und die Flüssigkeit in eine 96-Wellen-Platte überführt wurden, werden sie in die Zebrabox-Kammer gelegt, um sich 30 Minuten vor dem Schlaf-Wach-Verhaltenstest einzugewöhnen.
   HINWEIS: Bevor Sie die 96-Well-Platte in die Zebrabox-Kammer legen, reinigen Sie den Boden der Platte sorgfältig, um Schmutz zu vermeiden, die Video-Tracking-Ergebnisse zu beeinträchtigen.
4. Öffnen Sie die Zebralab-Videotracking-Software, wählen Sie den Quantisierungsmodus und stellen Sie sicher, dass die 96-Well-Platte zentral am Boden der Zebrabox-Kammer positioniert ist.
5. Stellen Sie die Lichteinstellung so ein, dass das Licht um 22:00 Uhr ausgeschaltet wird und das Licht um 8:00 Uhr eingeschaltet wird, was mit den Lichtverhältnissen beim Aufziehen des Zebrafischs übereinstimmt. Tagsüber liegt das weiße Licht in der Regel bei etwa 1000 Lux. Setzen Sie die Softwareparameter wie folgt:²⁹: Detektionsschwelle 40; Burst, 25 (Schwelle für On-Bewegung); Freeze (Schwelle für Bewegung), 4; Behältergröße, 60 S; Gesamtüberwachungszeit: 52 Stunden (20:00 Uhr am ersten Tag bis 00:00 Uhr am dritten Tag). Beginnen Sie mit dem Schlaf-Wach-Verfahren um 20:00 Uhr.
   HINWEIS: Sobald das Verfahren begonnen hat, sollten während des gesamten Experiments jegliche Geräusche und Vibrationen von außen verboten werden, um den normalen Schlaf-Wach-Rhythmus der Zebrafische nicht zu beeinträchtigen. Um die Verdunstung von Wasser während der Langzeitüberwachung zu verhindern, wird die 96-Well-Platte mit transparenter Plastikfolie abgedeckt.
6. Nach 52 Stunden stoppen Sie das Schlaf-Wach-Experiment und speichern Sie die Datendatei. Entfernen Sie die 96-Well-Platte aus der ZebraBox.
   HINWEIS: Mit MATLAB und Excel werden notwendige Parameter wie die Anzahl der Schlafphasen (Schlafphase definiert als Phasen der Inaktivität von mindestens 1 Minute) ^{definiert, 29}, durchschnittliche Schlafphasenlänge (durchschnittliche Dauer der Schlafphasen), Gesamtschlafdauer (alle Dauern der Schlafphasen während der Überwachungszeit), Schlaflatenz (Zeit von einem leichten Übergang bis zum Beginn des ersten Schlafanfalls), Die durchschnittliche Aktivität (definiert als lokomotorische Aktivität während der gesamten Überwachungsphase) und die Wachaktivität (definiert als lokomotorische Aktivität nur während der Wachphase, ohne die Schlafphasen) wurden aus der Datendatei extrahiert und analysiert.
   1. Verwenden Sie einen Schüler-t-Test, um die Unterschiede zwischen der WT-Gruppe und der MPTP-behandelten Gruppe zu vergleichen. Anschließend werden die Schlafkurve, die Wachaktivitätskurve und die durchschnittliche Aktivitätskurve der Zebrafische über die 52 Stunden mit MATLAB-Software dargestellt.

4. Photomotorische Antwortparadigmen

HINWEIS: Photomotorische Antwortparadigmen (einschließlich Stroboskoplicht) sind hochdurchsetzbare Verhaltenstests bei 5 DPF-Larven, um sensomotorische und reflexive Lokomotorische Veränderungen als Reaktion auf einen plötzlichen Lichtübergang zu quantifizieren. Dieser Test wurde mit einer 96-Well-Platte durchgeführt, die 2 Paradigmen umfasste: (1) einen Lichtübergang von 1 Minute Dunkelheit zu 1 Minute konstantem Licht (1000 lx) und (2) eine Stroboskoplichtantwort mit einem Übergang von 1 Minute Dunkelheit zu 1 Minute Stroboskoplicht bei 10 Hz.

1. Platzieren Sie die 5 DPF-Larven in eine 96-Brunnen-Platte (1 Larve pro Brunnen) (Abbildung 1B) und füllen Sie jede Mulde mit E3-Medium. Teilen Sie insgesamt 96 Larven in die WT-Gruppe und die MPTP-Gruppe im Durchschnitt.
2. Dunkel-konstantes Licht-Paradigma:
   1. Setzen Sie die 96-Well-Platte mit 5 DPF-Larven in die Zebrabox und lassen Sie die Larven sich 5 Minuten im Dunkeln vor dem Assay akquirieren.
   2. Öffnen Sie den Tracking-Online-Analysemodus.
   3. Stellen Sie das Lichtübergangsprogramm wie folgt ein: 0-60 s: Dunkel, 60-120 s: Konstantes Licht (1000 lx).
   4. Starte das Protokoll, sammle alle 6 Sekunden die entsprechenden Bewegungsparameter während des 120-Sekunden-Tests.
   5. Stoppe das Protokoll bei 120^Sekunden und exportiere die Datendatei. Stellen Sie die Larven für 5 Minuten in völliger Dunkelheit, um sich an die Umgebung zu gewöhnen, und bereiten Sie sie auf den folgenden Dunkelstroboskop-Lichttest vor.
3. Dunkelstroboskoplicht-Paradigma:
   1. Stellen Sie das Lichtübergangsprogramm wie folgt ein: 0-60 s: Dunkel, 60-120s: Stroboskoplicht (1000 lx) bei 10 Hz.
      HINWEIS: Ein 10-Hz-Stroboskop entspricht 10 Lichtimpulsen pro Sekunde. In ZebraLab wird dies implementiert, indem man die Lichtintensität alle 100 ms von 0 auf 1000 lx wechselt.
   2. Nach Abschluss der 5-minütigen Dunkel-Adaption starten Sie den Dunkel-zu-Stroboskop-Licht-Test. Sammeln Sie alle 6 Sekunden Bewegungsparameter während des 120-Sekunden-Tests.
4. Datenanalyse: Sobald der Test abgeschlossen ist, exportieren Sie die Datendatei. Verwenden Sie die MATLAB-Software, um alle 6 Sekunden die Schwimmdistanz zu extrahieren. Plotte die gesamte Strecke (Mittelwert pro 6 Sekunden), die in den 2-minütigen Phasen für beide Tests geschwommen wurde. Berechnen Sie den Gefrierindex, indem Sie die insgesamt in 1 Minute im Dunkeln zurückgelegte Strecke von der im Licht^{zurückgelegten 30} abziehen.
   HINWEIS: Freeze Index < 0 zeigt ein Einfrierverhalten an; Freeze-Index > 0 zeigt Flucht an; Freeze Index = 0 bedeutet keine Reaktion. Verwenden Sie einen Student's t-Test und einen zweiseitigen ANOVA, um die Unterschiede zwischen der WT-Gruppe und der MPTP-behandelten Gruppe zu vergleichen. Insgesamt wurden für jede Gruppe 48 Zebrafischlarven (n = 48) verwendet.

5. Bewertung der Thigmotaxis

1. Wählen Sie zwei 6-Well-Platten aus und füllen Sie jede mit 4 mL E3-Medium.
2. Bei 5 dpf wurden Zebrafischlarven aus der WT-Gruppe und der MPTP-behandelten Gruppe gesammelt und in zwei 6-Well-Platten eingesetzt (eine ist die WT-Gruppe, die andere die MPTP-behandelte Gruppe, 1 Larve pro Brunnen) (Abbildung 1C).
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Anfangsposition der Larven im Zentrum der Brunnen liegt.
3. Vor der Thigotacaxis-Bewertung sollten die Bohrlochplatten 15 Minuten im Voraus an der passenden Position der Zebrabox platziert werden, um Platz zu finden.
4. Datenerhebung und -analyse: Mit der Funktion Draw Area zeichnen Sie zwei konzentrische Kreise im Beobachtungsbereich jedes Bohrlochs (der Radius des Mittelkreises entspricht 1/2 des Radius des Lochs) (Abbildung 1C), und die übrigen Parameter werden wie bei der Lokomotor-Bewertung eingestellt. Starte das Protokoll für die 5-minütige Thigotaxis-Bewertung und führe ein paralleles Experiment durch.
   HINWEIS: Nach Abschluss des Programms generiert die Zebralab-Software innerhalb von 5 Minuten die Flugbahn der Zebrafischlarven sowie verschiedene damit verbundene Bewegungsparameter. In der Datendatei repräsentiert an1 die gesamte Fläche jedes Brunnens und an2 die innere Zone jedes Bohrlochs. Somit bezeichnen total dis(an1) und total dur(an1) die gesamte Schwimmdistanz und die gesamte Zeit, die im gesamten Brunnen verbracht wird, während total dis(an2) und total dur(an2) jeweils die Entfernung und Zeit in der inneren Zone darstellen.
   1. Berechnen Sie die Thigmotaxis mit den folgenden Formeln:
      Berechnen Sie den Prozentsatz der geschwommenen Distanz in der Außenzone:
      
      Berechnen Sie den Prozentsatz der Zeit, die in der Außenzone verbracht wird:
      
   2. Verwenden Sie einen Student's t-Test, um die Unterschiede in der Thigmolaxe zwischen der WT-Gruppe und der MPTP-behandelten Gruppe zu vergleichen. Insgesamt wurden für jede Gruppe 24 Zebrafischlarven (n = 24) verwendet.

6. Lokomotorische Bewertung

1. Bei 5 dpf werden Zebrafischlarven aus der WT-Gruppe und der MPTP-behandelten Gruppe ausgewählt und jeweils auf zwei 12-Well-Platten übertragen (eine ist die WT-Gruppe, die andere die MPTP-behandelte Gruppe, 1 Larve pro Bohrloch, mit 2 mL E3-Medium) (Abbildung 1D).
   HINWEIS: Achten Sie darauf, dass die Größen der Zebrafischlarven ähnlich sind, und die ausgewählten Larven sollten offene Flossen, eine aufrechte Haltung, eine gute Ausdehnung der Schwimmblase und regelmäßige Bewegung besitzen.
2. Vor der Lokomotorbewertung werden die Bohrlochplatte 15 Minuten im Voraus in die Testposition der Zebrabox gesetzt, um sich anzupassen.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Lichtverhältnisse während der Anpassung mit den Lichtverhältnissen während des Tests übereinstimmen.
3. Nach einer 15-minütigen Akklimatisierungsphase wählen Sie den Online-Tracking-Modus, zeichnen Sie die Bewegungsaktivität jeder Larve für 5 Minuten mit einem automatisierten computergesteuerten Video-Tracking-System auf. Mit Zebralab-Software sammelt man alle 60 Sekunden Bewegungsspuren und verschiedene zugehörige Bewegungsparameter, exportiert die vollständige Datendatei und analysiert mit MATLAB die Gesamtdistanz und Durchschnittsgeschwindigkeit jeder Larve in 5 Minuten.
   1. Verwenden Sie einen Student's t-Test und einen zweiseitigen ANOVA, um die Unterschiede zwischen der WT-Gruppe und der MPTP-behandelten Gruppe zu vergleichen. Insgesamt wurden für jede Gruppe 24 Zebrafischlarven (n = 24) verwendet.

7. Startle-Response-Test

HINWEIS: Dieser Test misst die visuelle Erschreckungsreaktion (VSR), auch bekannt als Dunkelblitz-induzierter Schreck, ausgelöst durch plötzliche Übergänge in die Dunkelheit. Dieser Startle-Response-Test bewertet einen von der Fotografie erzeugten visuellen Erschrecken, der durch abrupte, millisekundenartige Dunkelblitze ausgelöst wird. Im Gegensatz zum Dunkelstroboskoplicht-Paradigma, bei dem wiederholte Lichtimpulse zur Bewertung anhaltender Verhaltensreaktionen verwendet werden, konzentriert sich dieser Test auf schnelle, reflexive motorische Reaktionen auf einen akuten visuellen Reiz.

1. Präparaten: Bei 5 dpf werden Zebrafischlarven aus der WT-Gruppe und der MPTP-behandelten Gruppe ausgewählt und auf zwei 12-Brunnen-Platten übertragen (eine ist die WT-Gruppe, die andere die MPTP-behandelte Gruppe, 1 Larve pro Bohrloch, mit 2 mL E3-Medium) (Abbildung 1D).
2. Vor dem Startle-Response-Test werden die Bohrlochplatte 5 Minuten im Voraus in die Testposition der Zebrabox gesetzt, um sich anzupassen.
3. Stellen Sie die Stimulationsparameter ein: Zebralab-Software öffnen, den Tracking-Online-Analysemodus ausführen, die Licht-Trigger-Schnittstelle öffnen, eine der drei untenstehenden Auslösermethoden verwenden, Verbesserte Reize aktivieren, auf Wenn die Sitzung beginnt, setzen; im Übergangsplan ist der Dunkelblitzrhythmus wie folgt definiert (das Programm beginnt nach 21 Sekunden auszulösen): Übergang 1: 5 ms, 100 % Lichtintensität; Übergang 2: 2890 ms, 100 % Lichtintensität; Übergang 3: 5 ms, 0 % Lichtintensität; Übergang 4: 100 ms, 0 % Lichtintensität; Kreuze die Liste der Übergänge an , um regelmäßiges Flashen zu gewährleisten.
4. Startprotokoll: Stellen Sie sicher, dass die Numeriscope-Videoaufnahmefunktion aktiviert ist, das automatisierte Hochdurchsatz-Tracking erzeugt einen mehrdimensionalen Datensatz mit 30 Verhaltensendpunkten in diesem 90er-Jahre-Test.
5. Datenanalyse: Nach Abschluss des Startle-Response-Tests exportieren Sie die Rohdatendateien und importieren Sie sie zur Analyse in die MATLAB-Software. Berechnen Sie die Schwimmstrecke jeder Larve in 3-Sekunden-Intervallen sowie die durchschnittliche Schwimmgeschwindigkeit.
   1. Identifizieren Sie die maximale Bewegungsdistanz, die Spitzengeschwindigkeit oder die Antwortlatenz nach dem Flash-Reiz für jede Gruppe. Verwenden Sie einen Student's t-Test und einen zweiseitigen ANOVA, um die Unterschiede zwischen der WT-Gruppe und der MPTP-behandelten Gruppe zu vergleichen. Insgesamt wurden für jede Gruppe 24 Zebrafischlarven (n = 24) verwendet.

8. Hell-Dunkel-Herausforderungstest

1. Bei 5 dpf werden Zebrafischlarven einzeln in zwei 24-Loch-Platten übertragen (Abbildung 1E), mit einer Larve pro Bohrung und 1 ml E3-Medium pro Bohrloch. Jede Platte enthielt 24 Larven, und die beiden 24-Well-Platten waren gleichmäßig in die WT-Gruppe und die MPTP-behandelte Gruppe (n = 24 pro Gruppe) unterteilt.
2. Vor dem Test wird die 24-Bohrloch-Platte für eine 5-minütige Lichtakklimatisierungsphase in den vorgesehenen Testbereich innerhalb der Zebrabox platziert, um die Testumgebung anzupassen. Aktiviere den Tracking-Online-Analysemodus. Konfigurieren Sie das Lichtprogramm wie folgt: 6 Minuten konstantes Licht, gefolgt von 4 Minuten vollständiger Dunkelheit (Abbildung 1E). Die gesamte Testzeit beträgt 10 Minuten, und die Intervallzeit zur Datenerfassung beträgt 60 Sekunden.
   HINWEIS: Die globale 6 Minuten Hell dienen der Akklimatisierung und Habituierung, um stabile Ausgangsbewegungen und spezielle Hell-Dunkel-Reaktionen^{zu gewährleisten 31,32}.
3. In der zehnten^Minute stoppt die Verhaltensaufzeichnung und speichert die Daten. Nimm die Platte vorsichtig aus der Zebrabox.
4. Für jede Larve entnehmen Sie die Schwimmdistanz im Abstand von 60 Sekunden. Berechnen Sie die zurückgelegte Strecke während der Lichtphase (0-6.^Minute), der Dunkelphase (7^.-10^{. Minute}) und die gesamte 10-minütige Periode. Quantifizieren Sie das thigmotaxis Verhalten und die Lernleistung der Habituation in der Dunkelphase.
   HINWEIS: Habituation Learning wird definiert als die Reduktion einer Verhaltensreaktion, wenn ein Tier einem kontinuierlichen Reiz/Umwelt^{ausgesetzt ist 33,34}, und wurde statistisch bewertet, indem die durchschnittliche Gesamtdistanz (mm) während der 1^{. Minute} und der 4^{. Minute nach} dem Übergang von Hell zu Dunkel verglichen wurde. Verwenden Sie einen Student's t-Test und einen zweiseitigen ANOVA, um die Unterschiede zwischen der WT-Gruppe und der MPTP-behandelten Gruppe zu vergleichen. Insgesamt wurden für jede Gruppe 24 Zebrafischlarven (n = 24) verwendet.

9. Entsorgung von MPTP-Abfällen

HINWEIS: Nach jedem Verhaltensexperiment sprühen und wischen Sie MPTP-kontaktierte Oberflächen (z. B. Laborbänke und ZebraBox) mit frisch vorbereitetem Natriumhypochlorit (Bleichmittel; ≥10 % V/V).

1. Sammeln Sie den flüssigen Abfall (einschließlich verbleibender Expositionslösungen und Spülmittel) und festen Abfälle (z. B. Pasteur-Pipetten, Handschuhe, Petrischalen und Mehrfachbrunnenplatten) des MPTP. Kennzeichnen Sie sie eindeutig als gefährlichen neurotoxischen Abfall.
2. Behandeln Sie kontaminierte flüssige Abfälle und feste Materialien mindestens 24 Stunden lang mit frisch vorbereitetem Natriumhypochlorit (Bleichmittel; ≥10 % v/v) zur Sicherstellung der Dekontamination, gefolgt von der Entsorgung gemäß den institutionellen Vorschriften.
3. Euthanasieren Sie MPTP-behandelte Zebrafischlarven, indem Sie sie in eine verdünnte Natriumhypochloritlösung (z. B. 1:5 Verhältnis von 6 % Bleichmittel zu Wasser) für 5 Minuten^{und 35} Minuten eintauchen. Bestätigter Tod durch Bewegungslosigkeit und Herzschlaglosigkeit. Behandeln Sie die dekontaminierten Larven und Medien als gefährliche biologische Abfälle für die institutionelle Entsorgung (nach institutionell genehmigten Protokollen).

Ergebnisse

Überwachung der Schlaf-Wach-Regulierung
Die 52-Stunden-Schlaf-Wach-Regulierung begann bei 4 DPF und wurde mit einer 96-Well-Platte durchgeführt. Zebrafische in MPTP-behandelten Gruppen zeigten signifikante Störungen der Schlafstruktur im Vergleich zur WT-Gruppe. Repräsentative Schlafkurven, Wachaktivitätsdiagramme und durchschnittliche Aktivitätsspuren sind in Abbildung 2 dargestellt. Die Parameter der Schlaf-Wach-Regulierungsanalyse bei ...

Diskussion

Diese Studie entwickelte und verifizierte ein umfassendes Protokoll zur Bewertung und Analyse des MPTP-induzierten PD-ähnlichen Verhaltensphänotyps. Dieses Protokoll integrierte 6 verschiedene Tests: Lokomotorische Bewertung, Thigotacis-Assay, Startle-Response-Test, photomotorische Antwortparadigmen (einschließlich Stroboskopstimulation), Licht-Dunkel-Herausforderungstest und Überwachung der Schlaf-Wach-Regulation, um motorische und nicht-motorische Defekte der PD zu bewerten und darzust...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
100 & Mal; E3-Serienlösung	Shanghai Feixi Biotechnologie	N/A	mit 34,8 g NaCl, 1,6 g KCl, 5,8 g CaCl2· 2H2O und 9,78 g MgCl2· 6H20 pro Liter
12-Well-Zellkulturplatte	NEST Biotechnologie	712011	Unbehandelt, nicht pyrogen, steril, Polysmød. Verwendet für Verhaltensanalysen von Zebrafischlarven.
24-Well-Zellkulturplatte	NEST Biotechnologie	702011	Unbehandelt, nicht pyrogen, steril, Polysmød. Verwendet für Verhaltensanalysen von Zebrafischlarven.
3 mL Pasteur-Pipette	Biologix	30-0238A1
6-Well-Zellkulturplatte	NEST Biotechnologie	703011	Unbehandelt, nicht pyrogen, steril, Polysmød. Verwendet für Verhaltensanalysen von Zebrafischlarven.
96-Well-Zellkulturplatte	NEST Biotechnologie	701011	Unbehandelt, nicht pyrogen, steril, Polysmød. Verwendet für Verhaltensanalysen von Zebrafischlarven.
MATLAB R2020a	MathWorks, USA	N/A	MATLAB R2020a, campusweite Lizenz, erworben vom Softwareportal der Universität Shandong (softms.sdu.edu.cn). Verwendet zur statistischen Analyse von Verhaltensdaten der Zebrafischlarven.
Microsoft Excel	Microsoft	N/A	Microsoft Excel (Teil von Microsoft Office), Version installiert über das von der Universität Shandong lizenzierte Softwareportal (softms.sdu.edu.cn).
MPTP(1-Methyl-4-Phenyl-1,2,3,6-Tetrahydropyridin)	Beyotime	41125281	5 mg
Petrischale	NEST Biotechnologie	704202	100 mm, steril, leicht griffiger Griff, TC-behandelt
Natriumhypochlorit-Lösung	Macklin	S817439	Standardlösung für Haushaltsbleichmittel (6–14 % aktive Chlorbasis), verdünnt zu ≥ 10 % V/V für Oberflächen- und Abfalldekontamination; außerdem mit 1:5 (6 % Bleichmittel: Wasser) für die Euthanasie von mit MPTP behandelten Zebrafischlarven verdünnt.
Stereomikroskop	Olympus	SZX2-Serie
Zebrabox High-Resolution Video Tracking System	Standpunkt, Frankreich	N/A
Zebralab Software	Standpunkt, Frankreich	N/A	Version (3,52,3,87)