Zweifarbige Multifiber-Photometrie-Aufzeichnungen des Social Behavior Network bei Mäusen

Zusammenfassung

Die Faserphotometrie ist eine der gebräuchlichsten Techniken zur Aufzeichnung der Kalziumaktivität in tiefen neuronalen Populationen des Gehirns. Hier beschreiben wir ein Protokoll für anpassbare, multisite-Zweifarb-Bildgebung der Kalziumaktivität und anderer dynamischer fluoreszierender Signale aus tiefen Hirn-Neuralpopulationen bei Mäusen.

Zusammenfassung

Die Faserphotometrie, die Massenaufzeichnung von Signalen über ein Glasfaserkabel, ist eine nützliche Methode zur Erfassung der Kalziumaktivität von Neuronengruppen im frei bewegenden Nagetier. Insbesondere macht diese Methode das Angreifen kleiner Populationen genetisch spezifizierter Neuronen in ventraleren und weniger zugänglichen Bereichen des Gehirns zu einem handhabbaren Problem, da es weiterhin schwierig ist, die zelluläre Auflösung zu erfassen. Diese Technik kann skaliert werden, um von mehreren Standorten gleichzeitig mit einem gebündelten Multifiber-Ansatz aufzuzeichnen, und kann mehrere Zelltypen mit genetischen Strategien an jedem aufgezeichneten Ort anvisieren. Hier stellen wir ein Protokoll bereit, wie man maßgeschneiderte Multifiber-Arrays zum Zielen auf das Maus-Sozialverhaltensnetzwerk (bis zu 12 Standorte) erstellt und einfügt. Dieses Protokoll beschreibt die chirurgischen Operationsverfahren, die für eine erfolgreiche Zielsetzung mehrerer Standorte mit unseren individuell angepassten Multifaserarrays erforderlich sind, sowie den viralen Ansatz zur Abgabe von grün- und rotverschobenen fluoreszierenden Indikatoren der Kalziumaktivität zur gleichzeitigen Bildgebung zweier genetisch identifizierter neuronaler Populationen an jedem Ort. Wir demonstrieren, wie man aus diesen Regionen mit einem kommerziell erhältlichen komplementären Metall-Oxid-Halbleiter-(CMOS)-Kamerasystem während sozialem Verhalten aufzeichnet. Darüber hinaus demonstriert dieses Protokoll Methoden zur Qualitätskontrolle und beschreibt eine Vorverarbeitungspipeline für Rauschkorrektur und Standardisierung. Abschließend diskutieren wir einige potenzielle Anwendungen des Werkzeugs, um neuartige Erkenntnisse über großflächige Gehirnnetzwerke zu entdecken.

Einleitung

Die Faserphotometrie, die umfangreiche Aufzeichnung fluoreszierender Signale über Glasfaserkabel, hat sich als leistungsstarke Technik zur Messung der neuronalen Populationsaktivität in Tiefhirnregionen etabliert. Oft sind diese Bereiche mit Mikroendoskopie oder traditionellen elektrophysiologischen Ansätzen ^1,2,3 nicht leicht zugänglich. Ein Hauptziel in der modernen Systemneurowissenschaft ist es, die Berechnungen zu identifizieren und zu entschlüsseln, die von groß angelegten, zelltypenspezifischen Gehirnnetzwerken verwendet werden, die an der Verhaltenserzeugung beteiligt sind. Neuropixel-Sonden und kommerziell erhältliche Multifiber-Ferrulen sind hervorragend darin, von linear ausgerichteten neuronalen Populationen 4,5,6,7 aufzuzeichnen, während die weitfeldige kortikale Bildgebung eine ausgezeichnete Abdeckung der oberflächlichen kortikalen Dynamiken ^{bietet 8,9}. Die gleichzeitige Aufzeichnung räumlich verteilter, aber funktional verbundener subkortikaler neuronaler Populationen ist jedoch technisch herausfordernd^geblieben. Darüber hinaus ist es zwar möglich, mehrere Tiefenhirnstrukturen mit mehreren Einzelfaser-Ferrulen für die Photometrie gezielt anzuvisieren, aber dieser Ansatz ist auf neuronale Populationen beschränkt, die ausreichend voneinander entfernt sind, damit mehrere Ferrulen^{implantiert werden} können. Maßgeschneiderte Multifaser-Photometrie-Arrays schließen diese Lücke, indem sie gleichzeitige Aufzeichnungen aus vielen subkortikalen Regionen bei frei handelnden Tieren mit minimalen Einschränkungen ermöglichen und so ein einzigartiges Fenster zur Netzwerkkoordination bei komplexen Verhaltensweisen bieten.

Das soziale Verhaltensnetzwerk (SBN) stellt ein ideales System zur Untersuchung groß angelegter Gehirnnetzwerkdynamiken dar. Das SBN ist eine dicht miteinander verbundene und evolutionär konservierte Menge subkortikaler Strukturen, die an der Erzeugung sozialer Verhaltensweisen beteiligt sind und über alle Wirbeltierklassen^hinweg identifiziert ^wurden. Diese Strukturen umfassen traditionell, sind aber nicht beschränkt auf, das laterale Septum, den präoptischen Bereich, den Bettkern der Stria terminalis, die vorderen und ventromedialen hypothalamischen Kerne, die mediale Amygdala, den Nucleus accumbens sowie periaquäduktale Graue 13,14,15. Innerhalb des SBN spielen spezifische neuronale Populationen, definiert durch molekulare Marker, eine entscheidende Rolle bei der Regulation des sozialen Verhaltens. SBN-ɣ-aminobuttersäure-erge (GABAerge) Neuronen (gekennzeichnet durch die Expression des vesikulären GABA-Transporters (VGAT) und glutamaterge Neuronen (gekennzeichnet durch die Expression des vesikulären Glutamattransporters (VGlut) stellen die wichtigsten exzitatorischen und inhibitorischen Zelltypen im Netzwerk dar und spielen wahrscheinlich dissoziable Rollen bei der Modulation sozialer Handlungen 16,17,18,19. Über diese klassischen Neurotransmittersysteme hinaus spielt die Signalübertragung von Sexualhormonen eine entscheidende Rolle für die Funktion des Netzwerks. Zum Beispiel erfordern viele männliche und weibliche soziale Verhaltensweisen die Expression des Östrogenrezeptor-Alphas, und die Aktivität in SBN-Neuronen, die diese Rezeptoren exprimieren, steuert diese Verhaltensweisen kausal^an.. Darüber hinaus sind SBN-neuronale Populationen mit Liganden und Rezeptoren vieler neuromodulatorischer Systeme angereichert, darunter Dopamin, Arginin-Vasopressin, Oxytocin, Opioide, Tachykinin, Neuropeptid Y, Prolaktin, Orexin, Agouti-bezogenes Peptid, Melanocortine, Kisspeptin und das Gonadotropin-freisetzende^Hormon 17,18,19,27,28,29,30.³¹, und neuere Fortschritte bei genetisch codierten Sensoren ermöglichen nun die Verfolgung vieler dieser vielfältigen Signalmoleküle 32,33,34,35,36,37,38. Da SBN-neuronale Populationen räumlich über subkortikale Strukturen verteilt sind, sind traditionelle experimentelle Präparate (z. B. extrazelluläre Elektrophysiologie, kortikale Oberflächenbildgebung und frühere Ansätze der Multifiberphotometrie) nicht in der Lage, die moment-zu-moment-Aktivitätsdynamik in diesem großflächigen Gehirnnetzwerk zu erfassen. Dennoch können maßgeschneiderte Multisite-Faserphotometrieplattformen durch die Überwachung der Kalziumdynamik in genetisch definierten neuronalen Populationen zusammen mit neuromodulatorischen Freisetzungsmustern aufzeigen, welche spezifischen Zelltypen und Signalmoleküle bestimmte Merkmale des sozialen Verhaltens codieren und so neuartige mechanistische Erkenntnisse liefern.

Hier entwickelten wir eine anpassbare Plattform für Multisite-Zweifarb-Faserphotometrie, die die gleichzeitige Aufzeichnung von bis zu 12 Gehirnregionen in frei handelnden Mäusen ermöglicht. Mit diesem Ansatz führten wir zweifarbige Photometrie-Aufzeichnungen der Kalziumaktivität von 22 identifizierten neuronalen Populationen durch, verteilt auf 11 SBN-Hirnregionen, zusammen mit Messungen der Dopaminschwankungen im Nucleus accumbens mit einem GPCR-aktivierungsbasierten DA-Sensor (GRAB-DA1m)³³ (Tabelle 1). Dieses Protokoll (Abbildung 1) beschreibt den Aufbau maßgeschneiderter Multifaser-Arrays, chirurgische Verfahren zur Zielerfassung mehrerer Deep-Brain-Standorte, virale Abgabestrategien zur Expression dualer Kalziumindikatoren (GCaMP³⁹ und RCaMP⁴⁰), Datenerfassung mit einem kommerziell erhältlichen CMOS-Kamera-basierten Faserphotometriesystem, Qualitätskontrollmethoden und eine Vorverarbeitungspipeline zur Rauschkorrektur und Signalstandardisierung. Entscheidend ist, dass unsere Vorverarbeitungspipeline isosbestische Steuerungswellenlängenaufzeichnungen enthält, die es uns ermöglichen, Bewegungsartefakte zu korrigieren. Wir verfolgen einen regressionsbasierten Ansatz⁴¹, um Bewegungsartefakte zu korrigieren und Signaltreue bei intensiven sozialen Verhaltensweisen wie Reiten oder Kämpfen sicherzustellen. Da unsere maßgeschneiderte Multifiber-Photometriemethode gleichzeitig die Aktivitäten überwachen kann, die sowohl über proximale als auch distale Tiefenhirnstrukturen verteilt sind, während die Zelltyp-Spezifität der Aufzeichnungen durch genetische Zielsetzung^42,43 erhalten bleibt, bietet sie erhebliche Vorteile gegenüber alternativen Ansätzen zur Erfassung neuronaler Aktivitätsdynamik in tiefen, groß angelegten Gehirnnetzwerken.

Dieses Protokoll eignet sich optimal für Experimente, die gleichzeitige Aufzeichnungen aus räumlich verteilten subkortikalen Hirnregionen (≥4 Stellen) bei frei handelnden Tieren erfordern, insbesondere bei der Untersuchung von Netzwerkdynamiken über genetisch definierte Zelltypen oder der Verfolgung der Neuromodulatorfreisetzung zusammen mit neuronaler Aktivität. Der Ansatz ist besonders wertvoll, um naturalistische Verhaltensweisen mit kräftiger Bewegung (z. B. soziale Interaktionen) zu untersuchen, wobei unsere Pipeline zur Korrektur von Bewegungsartefakten die Signaltreue sicherstellt. Forscher suchen jedoch nach Einzelzellauflösung, Unterscheidung zwischen somatischen und axonalen Signalen oder Aufzeichnungen aus oberflächlichen kortikalen Regionen, könnten alternative Ansätze (z. B. Miniaturmikroskopie, Neuropixel oder Breitfeldbildgebung) als angemessener empfinden. Wichtige praktische Überlegungen sind die chirurgische Komplexität, die Notwendigkeit einer individuellen Herstellung von Multifaserarrays und der Aufbau der erforderlichen Materialinfrastruktur (3D-Druckfähigkeiten, Glasfaserwerkzeuge).

Protokoll

HINWEIS: Dieses Protokoll wurde an erwachsenen Mäusen im Alter von 8–25 Wochen getestet und validiert. Die Mäuse wurden bei 21–26 °C und 30%–70% Luftfeuchtigkeit in einem 12-Stunden-Umkehr-Dunkellicht-Zyklus untergebracht (AUS: 10:00 Uhr; AM: 22:00 Uhr). Die Experimente fanden ausschließlich während der subjektiven aktiven (dunklen) Phase statt. Nahrung und Wasser wurden ad libitum bereitgestellt. Alle Tierverfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Princeton University genehmigt und entsprachen den Standards des National Institutes of Health.

1. Herstellung von Multifaserarrays und Patchcords (Abbildung 1A)

1. Patchcord fertigen (Abbildung 2A).
   1. Besorgen Sie ein 12-faser-verzweigtes Patchkabel und drucken Sie den mitgelieferten Patchcord-Anschluss sowie das stereotaktische Bohrzubehör (Supplemental File 1, Supplemental File 2, Supplemental File 3) mit Harz (Zugfestigkeit: 8,7 Kilopfund/Quadratzoll [ksi], E-Modul: 377 ksi, Wärmeablenkung: 138 °F, Verlängerung: 8%).
   2. Baue den bereitgestellten Polierpuck (Supplemental File 4) aus einer 2 Zoll großen Edelstahlstange und füge in der Mitte des Pucks einen Ausschnitt in der Größe des Multifaser-Arrays ein.
   3. Entfernen Sie das überschüssige Harz manuell aus den Durchbohrlöchern des Dübelstifts im Multifiber-Array mit einem 1,22 mm x 11 mm Bohrer. Selbst beim Präzisions-3D-Druck sind die Dübelstiftlöcher etwas zu klein, als dass der Dübel hindurchgehen könnte.
   4. Bohren Sie durchgehende Faserlöcher.
      1. Stecken Sie Legierungsstahl-Dübelstifte (1,19 mm x 12,7 mm) in alle 4 Pin-Löcher des stereotaktischen Bohrzubehörs und setzen Sie den Patchcord-Stecker bodengekehrt in das stereotaktische Bohrzubehör, wobei die Dübel durch die Durch-Löcher der Dübelstifte des Multifiber-Arrays gehen.
      2. Ziehe die M4-Stellschrauben in den Gewindelöchern fest, um den Patchcord-Anschluss zu sichern, und befestigen Sie das stereotaktische Bohrzubehör im stereotaktischen Rahmen.
      3. Setzen Sie einen 0,25 mm x 5,5 mm Bohrer in den stereotaktischen Bohrer ein und montieren Sie den Bohrer am stereotaktischen Rahmen. Mit diesem Bohrer nivelliert man die Gier, Steigung und Roll des Multifiber-Arrays mit einer maximalen Abweichungstoleranz von ±0,03 mm.
         HINWEIS: Gier und Tonhöhe an den vordersten und hinteren Positionen des 3D-Drucks, Horizontalroll an den vier Ecken des Multifiber-Arrays.
      4. Bohren Sie in der Mitte über einem der 3D-gedruckten Faserlöcher und stellen Sie die stereotaktischen X/Y-Koordinaten des Frames auf die ML (X) und AP (Y) Koordinaten der zugehörigen Gehirnregion ein (Tabelle 1). Bewegen Sie den Bohrer auf die neuen (0, 0)-Koordinaten am stereotaktischen Rahmen, um den Bohrer über dem vorderen Dübel-Durchbohrloch zu zentrieren.
      5. Verwenden Sie den 0,25 mm x 5,5 mm Bohrer, um jedes Faserdurchbohrloch bis zu einer Tiefe von 5,5 mm an den stereotaktisch definierten Koordinaten auszubohren (Tabelle 1).
         HINWEIS: Verwenden Sie ein langes Stück überschüssige Glasfaser, um zu überprüfen, ob alle Löcher vollständig frei sind, bevor Sie das Multifiber-Array aus dem stereotaktischen Rahmen entfernen. Dies begrenzt die Anzahl der Male, in denen das Multifiber-Array nivelliert und gebohrt werden muss, um die Durchgangslöcher zu befreien.
   5. Anschließen Sie den Patchcord-Stecker und das verzweigte Patchcord
      1. Legen Sie >10 cm der Patchcord-Fasern frei. Schneiden Sie die Fasern mit einem Faserscribe ab, um sicherzustellen, dass sie gleich lang sind. Dann lege jeweils ein Stück 3/16" und 5/16" Schrumpfschlauch um die 12 Fasern am Patchcord.
         HINWEIS: Das Rohr schützt alle freiliegenden Fasern, nachdem sie in den Anschluss eingeklebt wurden.
      2. Stecken Sie jede Faser in eines der Durchgangslöcher des Patchcord-Steckers ein, sodass an der Unterseite etwa 0,3 mm Faser freiliegen. Nachdem alle Fasern eingefügt wurden, verwenden Sie eine 21–27 G Nadelspitze, um Sekundenkleber auf die Oberseite des Patchcord-Steckers aufzutragen, um die Fasern zu fixieren.
      3. Epoxidharz wird in einer 0,5–1 cm hohen Pyramidenform auf die Oberseite des Patchcord-Steckers aufgetragen. Stellen Sie sicher, dass kein Epoxidharz irgendeinen Bereich außer der Oberseite, an der die Fasern eingesetzt wurden, bedeckt. Lassen Sie Epoxidharz über Nacht bei Zimmertemperatur aushärten.
      4. Verwenden Sie eine Heißluftpistole auf der niedrigsten Stufe, um das Schrumpfrohr über dem Epoxidharz und der darüberliegenden Faser (<3–5 cm) zu schrumpfen.
         HINWEIS: Vermeiden Sie es, dabei den Schrumpfschlauch zu berühren, um Verbrennungen zu vermeiden.
      5. Schneiden Sie ein Stück weiches Kunststoffrohr mit einem Innendurchmesser von 3 mm auf die Länge der verbleibenden freiliegenden Fasern, schneiden Sie entlang des Schlauchrandes einen Schnitt und schließen Sie die verbleibende freiliegende Faser in das Rohr ein.
      6. Färben Sie das klare Rohr mit einem undurchsichtigen schwarzen Marker, um sicherzustellen, dass die Fasern nicht mehr sichtbar sind, und minimieren Sie so die Beleuchtung durch belichtete Fasern während der Bildversuche.
   6. Poliert das Patchcord.
      1. Sichern Sie den Patchcord-Anschluss auf der Unterseite im individuellen Polierpuck. Polieren Sie den Patchcord-Stecker auf 6 μm, 3 μm, 1 μm und dann 0,01 μm Körnung Polierblätter mit 10–20 Bewegungen in Form des Unendlichkeitssymbols/-blatts. Für die 1-μm- und 0,01-μm-Körnungsplatten geben Sie vor dem Polieren 5 Tropfen destilliertes Wasser.
      2. Wischen Sie die Oberfläche des Steckers ab, um überschüssiges destilliertes Wasser zu entfernen. Überprüfen Sie mit einem Brightfield-Mikroskop auf Faserflecken oder Risse auf der polierten Oberfläche des Patchcord-Steckers und polieren Sie gegebenenfalls wiederholt.
   7. Überprüfe den Patchcord-Ausgang.
      1. Verbinden Sie das Subminiatur-Version A (SMA)-Steckerende des Patchkabels mit einem CMOS-Kamera-basierten Glasfaserphotometrie-Bildgebungssystem. Mit visueller Codierungssoftware folgen Sie dem Handbuch des Fotometrie-Bildgebungssystems und fokussieren Sie die CMOS-Kamera auf das SMA-Ende des Patchcords.
         HINWEIS: Das Handbuch wird regelmäßig aktualisiert, um mit Software-Updates in Einklang zu kommen. Da sich der visuelle Code des Photometriesystems oft mit neuen Softwareveröffentlichungen ändert, enthält dieses Handbuch die aktuellsten Informationen zu aktuellen Softwareveröffentlichungen.
      2. Messen Sie 470 nm Patchcord-Ausgang bei 20 % Leistung mit einem optischen Leistungsmessgerät. Wiederhole Schritt 1.1.7, wenn der Patchcord-Ausgang < 2,5 mW ist.
2. Multifaser-Array herstellen.
   1. Drucken Sie das bereitgestellte Multifiber-Array (Supplemental File 5, Supplemental File 6) mit Harz und den technischen Spezifikationen aus Schritt 1.1.1.
   2. Bereite ein Multifiber-Array vor.
      1. Setzen Sie M0,6-Messing-Sechskantmuttern in jede der vier Schlitze in den Seitenecken des Multifiber-Arrays ein und richten Sie das Loch der Sechskantmutter in die Mitte der Öffnung aus.
      2. Tragen Sie einen einzelnen Tropfen Sekundenkleber an der Seite jedes Sechskantnussschlitzs mit einer 21–27-G-Nadelspitze auf und fügen Sie bei Bedarf zusätzliche Tropfen zur Verstärkung hinzu. Lass den Kleber 5 Minuten bei Zimmertemperatur trocknen, bevor du zum nächsten Schritt übergehst.
      3. Entfernen Sie jeglichen Kleber an den Seiten des Multifaser-Arrays mit einer Rasierklinge, damit er in den Polierpuck passt.
      4. Wenn überschüssiger Sekundenkleber auf der Oberfläche des Multifiber-Arrays getrocknet ist, polieren Sie die Oberfläche des Multifiber-Arrays mit dem maßgefertigten Polierpuck und 30-μm-Körnung-Polierblättern, bis der Kleber entfernt ist und die Multifiber-Array-Oberfläche flach ist.
      5. Entfernen Sie das überschüssige Harz manuell aus den Dübelpin-Durchlöchern im Multifiber-Array mit einem 1,22-mm-Bohrer.
   3. Bohren Sie durchgehende Faserlöcher (Abbildung 2B-C).
      1. Führe Legierungsstahl-Dübelstifte (1,19 mm x 12,7 mm) in alle 4 Pin-Löcher des stereotaktischen Bohrzubehörs ein und setze das Multifiber-Array auf der Oberfläche (flache Seite) nach oben in das stereotaktische Bohrzubehör, wobei die Dübelstifte durch die Dübelstift-Durchlöcher des Multifiber-Arrays gehen.
      2. Wiederholen Sie Schritt 1.4.2 – Schritt 1.4.5.
   4. Bereite die Fasern für das Multifiber-Array vor.
      1. Entfernen Sie das Kunststoffgehäuse von einem Abschnitt von 200 μm, 0,39 NA Glasfaser mit einem Glasfaserableiter. Reinige die Ballaststoffe mit Ethanol.
      2. Spalten Sie die Fasern mit einem Faserbeil in ~3–5 cm lange Abschnitte. Spalten Sie diese Schnitte anschließend mit einem Faserschreiber in zwei Hälften. Verwenden Sie ein Hellfeldmikroskop, um sicherzustellen, dass mindestens ein Ende der abgespaltenen Abschnitte frei von Absplittern oder Makeln ist. Verwende nur Fasern mit mindestens einem makellosen Ende.
      3. Tape ein präzises Lineal von mindestens 15 mm Länge unter dem Hellfeldmikroskop. Setzen Sie die unversehrte Seite der Faser an der 0 mm Position auf dem Lineal (Abbildung 2D). Schneiden Sie die Fasern auf die gewünschte Länge für jede Zielregion ab (Tabelle 1).
         HINWEIS: Die Faserlänge wird berechnet, indem 6 mm zur stereotaktischen D/V-Koordinate für die tiefste Faser hinzugefügt und dieser Wert für alle Fasern angepasst wird, um die Differenz zwischen ihrer D/V-Koordinate und der D/V-Koordinate der tiefsten Faser anzupassen.
   5. Führe Fasern in das Multifiber-Array ein.
      1. Legen Sie das Multifaser-Array mit der Oberseite nach unten in den Fertigungshalter. Richten Sie das Stück aus und sichern Sie es mit Dübelstiften.
      2. Die Faserlänge an die Stelle anpassen (Tabelle 1) und die gespaltenen Fasern in die entsprechenden Durchgangslöcher des Multifiber-Arrays einführen, wobei die unbefleckte Seite nach oben zeigt. Stellen Sie sicher, dass alle Fasern vor dem nächsten Schritt ganz hineingeschoben werden.
      3. Tragen Sie Sekundenkleber mit einer 21–27-G-Nadelspitze auf, um alle Fasern festzukleben. Lass den Kleber mindestens 30 Minuten bei Zimmertemperatur einwirken, bevor du weitermachst.
   6. Polieren Sie das Multifiber-Array, indem Sie Schritt 1.1.6 mit Multifiber-Array oberflächenseitig nach unten wiederholen (Abbildung 2E).
   7. Überprüfe die Effizienz des Multifiber-Arrays.
      1. Reinigen Sie die polierte Oberfläche des Multifiber-Arrays mit Ethanol und tragen Sie anschließend Index-Matching-Gel auf. Stecken Sie 4 Dübelstifte in den Patchcord-Anschluss und befestigen Sie das Multifiber-Array mit G5-Antriebsschrauben und dem dazugehörigen Schraubendreher (Abbildung 2F).
      2. Verwenden Sie ein Leistungsmessgerät, um die 470 nm und 560 nm LED-Emission des Multifiber-Arrays zu messen. Berechnen Sie die Effizienz mit diesen Werten:
         
      3. Wenn die Effizienz <75 % beträgt, wiederhole die Schritte 1.2.7.1–1.2.7.2.
         HINWEIS: Wenn das Nachpolieren die Effizienz nicht verbessert und keine Makel an den Fasern vorhanden sind, ist es möglich, dass die Fasern auf dem Multifiber-Array nicht zur Patchcord-Steckdose ausgerichtet sind.
   8. Bereite ein Multifiber-Array für die Verwendung vor (Abbildung 2G).
      1. Setzen Sie 4 Dübelstifte in die Durchgangslöcher des Multifiber-Arrays ein. Stellen Sie sicher, dass die Dübelstifte nicht mehr als 1 mm von der Gehirnseite des Multifaser-Arrays herausragen.
      2. Setze Superkleber auf der Gehirnseite auf die Dübelstifte. Lass den Kleber mindestens 10 Minuten bei Zimmertemperatur trocknen, bevor du das Multifiber-Array benutzt.

2. Operation (Abbildung 1B)

1. Bereite den Operationsraum und die Werkzeuge vor.
   1. Sauberer stereotaktischer Rahmen, um einen aseptischen Arbeitsbereich zu gewährleisten.
   2. Nehmen Sie sterile, resorbierbare Nähte.
   3. Ein Autoklav, eine feine Pinzette, eine feine Schere und zwei Bulldoggenklemmen.
   4. Stellen Sie sicher, dass der Verdampfer mit Isofluran gefüllt ist. Stellen Sie sicher, dass die Schläuche für Isofluranz-, Vakuum- und Sauerstoffleitungen sicher mit dem Verdampfer, der Induktionskammer und dem Nasenkegel des stereotaktischen Rahmens verbunden sind.
2. Beschaffen Sie sich adenosoziierte Viren von jRCaMP1b, GCaMP6f und GRAB-DA1m.
   VORSICHT: Tragen Sie beim Umgang mit Viren immer persönliche Schutzausrüstung.
   1. Verdünne Viren bei Bedarf auf eine Arbeitskonzentration zwischen 1x10¹³ und 4x10¹³ Teile/Milliliter.
   2. Bereiten Sie eine 1:1-Mischung aus adenoassoziierten Viren von jRCaMP1b und GCaMP6f vor.
   3. Legen Sie einen Aliquot der 1:1 jRCaMP1b:GcaMP6f-Virusmischung und einen Aliquot des GRAB-DA1m-Virus auf Eis, um die Temperatur bei 4 °C zu halten.
3. Anästhesie einleiten.
   1. Setze die Maus in die Induktionskammer und schließe die Kammertür. Starten Sie den Sauerstofffluss in den Verdampfer mit 1 L/min.
   2. Lenken Sie den Gasstrom in die Induktionskammer und schalten Sie die Vakuumleitung ein, um überschüssiges Gas aus der Kammer zu entfernen. Stellen Sie den Verdampfer auf eine Isoflurankonzentration zwischen 3 % und 5 % ein.
4. Übertragen Sie die Maus auf den stereotaktischen Frame.
   1. Sobald die Atmung der Maus auf 1 Atemzug pro Sekunde verlangsamt ist, bewege die Maus auf den stereotaktischen Rahmen. Stecken Sie die vorderen Schneidezähne der Maus in den Schlitz im Mundstück des Nasenkegels und ziehen Sie den Nasenkegel über die Nase der Maus fest.
   2. Stellen Sie den Gasstrom auf den stereotaktischen Rahmen um, wobei die Isoflurankonzentration auf 1 %–2 % eingestellt ist, um die Anästhesie aufrechtzuerhalten. Schalte die Vakuumleitung um, um Gas aus dem Nasenkegel zu entfernen.
      HINWEIS: Überwachen Sie die Atmung der Maus während der gesamten Operation und passen Sie die Isoflurankonzentration bei Bedarf an, um eine tiefe Anästhesie mit einer Atemfrequenz von 1 Atemzug pro Sekunde aufrechtzuerhalten. Eine tiefe Anästhesie sollte während der gesamten Operation regelmäßig bestätigt werden, indem sichergestellt wird, dass die Maus nicht auf einen Zehenkniff reagiert.
   3. Stellen Sie das Heizsystem so ein, dass es eine Körpertemperatur von 35 °C hält, und tragen Sie die Augen der Maus mit optischer Salbe auf, damit sie nicht austrocknen.
   4. Setze stereotaktische Ohrenstangen ein, sodass sie auf beiden Seiten des Schädels drücken, leicht dorsal und vorne zu den Gehörgängen. Ziehen Sie die Ohrstangen fest und sorgen Sie dafür, dass der Schädel der Maus fixiert ist, indem Sie sanften Druck auf den Kopf der Maus ausüben.
5. Bereite die Kopfhaut auf den Schnitt vor.
   1. Schneide oder rasiere die Haare auf dem Kopf der Maus, bis sie kurz sind. Tragen Sie Haarentfernungsgel auf den Kopf der Maus auf und lassen Sie es etwa eine Minute einwirken. Entfernen Sie das restliche Gel mit einem sauberen Wattestäbchen.
   2. Wiederhole 2.5.1 bei Bedarf, bis alle Haare auf dem Kopf entfernt sind.
   3. Desinfizieren Sie die Haut auf dem Kopf mit Wattestäbchen, um Betadin (10 % Povidon-Jod-Lösung) aufzutragen, gefolgt von einer 70 % Ethanollösung.
6. Den Schädel freilegen.
   1. Schneiden Sie einen Schnitt entlang der Schädelmitte, der sich von etwas hinter dem Lambda bis leicht vor der Rostral-Nasenvene erstreckt.
      HINWEIS: Die rhostrale Rhinalvene ist das Blutgefäß, das sich auf der dorsalen Oberfläche des Gehirns zwischen dem Riechbulb und dem präfrontalen Kortex befindet.
   2. Schneide und entferne die rasierte Haut an den Seiten dieses Schnitts, um einen tropfenförmigen Schnitt zu bilden, der die Parietalknochen, die vordere Spitze des intraparietalen Knochens und den Teil der Nasenknochen, der vor der rostralen Rhinalvene liegt, freilegt (Abbildung 2H).
   3. Reinigen Sie die Schädeloberfläche vorsichtig mit 0,9 % Kochsalzlösung und einem sauberen Wattestäbchen.
7. Nivelliert den Schädel.
   1. Lokalisieren Sie die Stelle, an der die rostrale Rhinalvene auf die sagittale Naht trifft. Markiere diesen Punkt mit einer sterilen Skalpellklinge.
   2. Setzen Sie einen #92 Karbidbohrer in den stereotaktischen Bohrer ein und montieren Sie den Bohrer am stereotaktischen Rahmen. Verwenden Sie den stereotaktischen Manipulator, um die Spitze des Bohrers auf der Schädeloberfläche an der markierten Stelle zu positionieren und die X-, Y- und Z-Koordinaten des Bohrers zu nullstellen.
   3. Ebener Tonfall des Schädels durch Messung der Z-Tiefe an der markierten Stelle und -8,25 mm hinten davon. Gier des Schädels durch Messung des seitlichen Abstands zwischen dem markierten Punkt und der Position -8,25 m hinten. Horizontaler Roll, indem Z-Tiefe an den Positionen ±2,0–2,5 mm von der Mittellinie an den Positionen -2,0, -4,5 und -7,0 mm relativ zum markierten Punkt gemessen wird.
8. Führe Kraniotomien und Duratomien durch.
   1. Ersetze den Bohrer durch einen #76 oder #78 Hartmetallbohrer. Stillen Sie den Bohrer an der markierten Stelle an der Verbindung von sagittaler Naht, rostraler Nasenvene und Schädeloberfläche ein.
   2. Verschieben Sie den Bohrer auf die A/P- und M/L-Koordinaten jeder Gehirnregion (Tabelle 1). An jeder Stelle wird eine Kraniotomie durchgeführt und die Dura Mater bei jeder Kraniotomie vorsichtig mit einer leeren Spritzenspitze von 27G oder kleiner entfernt.
9. Injiziere das Virus.
   1. Glas-Mikropipetten werden so gezogen, dass ihre Spitze um mindestens 7 mm verjüngt und eine Spitzenöffnung von 10–30 μm hat.
      HINWEIS: Die Schritte 2.9.2–2.9.12 werden neu gestartet, wenn die Mikropipette nach einem der folgenden Schritte Luftblasen enthält.
   2. Füllen Sie eine leere Glas-Mikropipettenspitze mit Mineralöl nach. Stecken Sie die Mikropipettenspitze in den Nanoliter-Injektor. Verwenden Sie die Nanoliter-Injektor-Schnittstelle, um so viel Mineralöl wie möglich aus der Mikropipette auszustoßen.
   3. Montiere den Nanoliter-Injektor auf den stereotaktischen Rahmen. Schneiden Sie ein kleines Stück Paraffinwachs ab und legen Sie es auf den Kopf der Maus.
   4. Pipette 1 μL der jRCaMP1b:GCaMP6f-Virusmischung auf das Paraffinwachs. Senken Sie die Spitze des Nanoliter-Injektors so, dass die Glasspitze der Mikropipette in der Virusmischung ist, und füllen Sie die Mikropipette mit dem Virus über die Schnittstelle des Injektors auf.
   5. Wiederholen Sie 2.9.4, bis alle verwendeten Viren auf den Nanoplitzer-Injektor übertragen wurden (Tabelle 1). Entferne und entsorge das Paraffinwachs in einem Biohazard-Abfallbehälter.
   6. Stellen Sie die Spitze der Injektor-Mikropipette an der markierten Position an der Verbindung der sagittalen Naht, der Rostral-Nasenvene und der Schädeloberfläche auf Null.
   7. Beginnend mit der am vorsten ventralen Injektionsstelle zur dorsalen Injektion (Tabelle 1), bewege die Mikropipettenspitze an jede Stelle, senke sie bis zur Gehirnoberfläche und nullstelle die Z-Position auf dem stereotaktischen Rahmen.
   8. An jeder Stelle senkt man die Mikropipettenspitze ins Gehirn, bis sie 0,1 mm ventral relativ zur Injektionsstelle ist. Dann hebt man die Mikropipettenspitze 0,1 mm bis zur Endinjektionsstelle. Lass das umliegende Gewebe 30 Sekunden lang um die Mikropipettenspitze herum absinken.
   9. Über die Nanoliter-Injektorschnittstelle injizieren Sie 300 nL der 1:1 jRCaMP1b:GcaMP6f-Virusmischung mit einer Rate von 1–2 nL/s, um das Gemisch an der aktuellen Injektionsstelle zu dispersieren.
   10. Lassen Sie die Mikropipettenspitze mindestens 5 Minuten nach Abschluss der Injektion an der Injektionsstelle verbleiben. Heben Sie die Mikropipettenspitze langsam aus dem Gehirn heraus, um das Risiko zu verringern, dass sich das Virus dorsal entlang der Injektionsbahn ausbreitet.
   11. Nach der Injektion des 1:1 jRCaMP1b:GcaMP6f viralen Gemisch an jeder Stelle verwenden Sie die Nanoliter-Injektionsschnittstelle, um den Kolben des Nanoliter-Injektors wieder in seine ursprüngliche Position zurückzubringen. Entferne die Mikropipette und entsorge sie in einem Biohazard-Abfallbehälter für scharfe Gegenstände.
   12. Falls nötig, wiederholen Sie die Schritte 2.9.2–2.9.11 für jede Hirnregion, die für die GRAB-DA1m-Expression anvisiert ist. An jeder Zielstelle werden 150 nL anstelle der 300 nL injiziert, die für die Virusmischung verwendet werden.
10. Multifiber-Array implantieren.
    1. Befestigen Sie das Multifiber-Array am stereotaktischen Rahmen mit einer beliebigen Befestigung, die das Multifiber-Array an den Dowelstiften halten kann, um es während der Implantation stabil zu halten (Abbildung 2I).
    2. Passen Sie die Position des Multifaserarrays so an, dass jede Faser mit dem Zentrum ihrer jeweiligen Kraniotomie ausgerichtet ist und die längste Faser auf der Gehirnoberfläche ruht. An dieser Stelle wird der stereotaktische Manipulator auf null gestellt und das Multifiber-Array langsam abgesenkt, bis es 0,25 mm über der D/V-Position der tiefsten Virusinjektion liegt (Tabelle 1, Abbildung 2J).
    3. Stellen Sie eine kalte Rührschale auf Eis und geben Sie 1 Löffel Zementpulver, 4 Tropfen flüssige Basis und 1 Tropfen Katalysator dazu. Mische 20 Sekunden.
       HINWEIS: Wiederholen Sie diesen Schritt immer dann, wenn Flüssigzement verwendet wird und mehr benötigt wird.
    4. Verwenden Sie eine Spritze und eine 23–31-G-Nadel, um flüssigen Zement in den Raum zwischen dem Multifiber-Array und dem Schädel zu übertragen.
    5. Tragen Sie flüssigen Zement mit einem dünnen Kunststoffapplikator oder einer Spritzennadel auf, um die vier Seiten des Multifaserarrays vollständig zu bedecken und so eine pyramidenförmige Form aus dem Schädel zu bilden (Abbildung 2K). Lass den Zement mindestens 15 Minuten trocknen.
    6. Nähen Sie die Haut entlang des Schnitts zusammen, um sicherzustellen, dass kein Schädel freiliegt.
11. Lass die Maus sich erholen.
    1. Reduziere die Isoflurankonzentration auf 0.
    2. Übertrage die Maus vom stereotaktischen Rahmen auf ein Heizkissen und warte, bis die Maus wach und bewegungsfähig ist, bevor sie zurück in ihren Käfig gelegt wird.
    3. Lassen Sie die Maus sich mindestens zwei Wochen erholen, bevor Sie mit den Experimenten beginnen.

3. Multisite, zweifarbige Kalziumbildgebung (Abbildung 1C)

1. Konfigurieren Sie das Datenerfassungsgerät (DAQ).
   1. Verbinden Sie den GND mit dem AGND-Port oberhalb des Ch7-Anschlusses über dem Stromkabel.
   2. Verbinde den DIO0 mit dem Ch0-Port über ein elektrisches Kabel.
2. Verbinde das Photometriesystem mit dem DAQ.
   1. Schließen Sie das Baby Neill Constant (BNC)-Steckerende eines geteilten BNC-Kabels (BNC-Anschluss an einem Ende, rote und schwarze elektrische Drähte am anderen Ende) an den Eingangsanschluss des Photometriesystems an. Schließen Sie das BNC-Steckverbinder-Ende eines anderen geteilten BNC-Kabels an den Ausgangsanschluss des Fotometriesystems an.
   2. Nimm das geteilte BNC-Kabel, das am Eingang des Photometriesystems angeschlossen ist, und verbinde dessen rotes Drahtende mit dem DIO1-Port am DAQ. Nimm das geteilte BNC-Kabel, das an den Ausgangsport des Photometriesystems angeschlossen ist, und verbinde sein rotes Drahtende mit dem Ch1-Port des DAQ.
   3. Verbinde die schwarzen Erdungskabel beider Split-BNC-Kabel mit dem DAQ-GND-Port.
3. Synchronisieren Sie das Verhalten und Photometriekameras.
   1. Setze mehrere Verhaltenskameras in eine Reihe auf, um das Verhalten aus mehreren Blickwinkeln gleichzeitig aufzuzeichnen.
      1. Verbinden Sie den optoisolierten Ausgang (Pin 4, weißes Kabel) der primären Verhaltenskamera mit dem nicht isolierten Eingang der Sekundärkamera (Pin 1, grünes Kabel) über einen 3,3 KΩ-Widerstand. Verbinden Sie den 3,3-V-Ausgang der Hauptkamera (Pin 3, rotes Kabel) mit demselben 3,3 KΩ-Widerstand und an Ch2 am DAQ.
      2. Schließen Sie den optoisolierten Ausgang jeder Sekundärkamera mit ihrem 3,3-V-Ausgang über einen 3,3-kω-Widerstand an.
      3. Verbinden Sie die Erdung der Hauptkamera (Pin 6, braunes Kabel) mit der Masse jeder zweiten Kamera. Verbinden Sie alle Kamera-Erdungskabel mit dem DAQ-AGND-Port oberhalb des Ch2-Anschlusses und an die Ausgangs-Masse des Photometriesystems.
4. Konfigurieren Sie die Verhaltenskameraeinstellungen mit der zugehörigen Bildverarbeitungssoftware.
   1. Stellen Sie die "Aufnahme-Bildrate" auf 45 Hz und die Verstärkung auf 1 ein.
   2. Stellen Sie die Belichtungszeit auf 2998 μs, die untere Belichtungsgrenze auf 100 μs und die obere Belichtungsgrenze auf 150.000 μs.
      HINWEIS: "Aufnahme-Bildrate" ist möglicherweise nicht die tatsächliche Bildrate, die erfasst wird. Je nach Belichtungszeit und angeforderter Datenbandbreite muss dieser Wert möglicherweise höher als die endgültige Bildfrequenz eingestellt werden. Falls nötig, passen Sie die "Aufnahme-Bildrate" so an, dass die angezeigte "resultierende Bildrate" 40 Hz beträgt.
5. Konfigurieren Sie DAQ-Software (Supplemental File 7).
   1. In der DAQ-Software fügen Sie das DAQ als 'Gerät' hinzu und wechseln Sie zum 'Konfigurationspanel'.
   2. Im Reiter 'Kanäle', unter 'Analoger Eingang', aktivieren Sie die Kanäle 0–2. Unter 'Digital' aktivieren Sie Kanal 0.
      HINWEIS: Ch0 entspricht dem Transitor-Transitor-Logiksignal (TTL), Ch1 dem Photometriesystem und Ch2 den daisy-chained Kameras.
   3. Unter 'Analog Input' benennen Sie Kanal 0 "TTL", Kanal 1 "Photometry_system" und Kanal 2 "Behavior_cameras", was für "Transitor-Transistor Logic" steht. Unter 'Digital' benennen Sie Kanal 0 "TTL_trigger".
   4. Im Tab 'Triggers' stellst du die Trigger auf manuell ein. Im Reiter 'Abtastraten' stellen Sie die Abtastrate auf 350 Hz ein.
   5. Wechsle zum 'Display Panel' und füge die Fenster 'Strip', 'Scalar' und 'Output' in die grafische Benutzeroberfläche ein.
6. Photometrie-Systemsoftware konfigurieren (Supplemental File 8).
   1. Entwickeln Sie einen Workflow in der visuellen Codierungssoftware, um einen 5-V-TTL-Impuls zu akzeptieren, der die Aufnahmen auslöst, und speichert den Zeitstempel für jedes Bild, die Fluoreszenzemissionen für die roten und grünen Kanäle jeder Faser sowie das Rohvideo, wie im Handbuch des Photometriesystems beschrieben.
   2. Indem Sie den Knoten für das Photometriesystem im Workflow verwenden, stellen Sie sicher, dass das System so eingestellt ist, dass es abwechselnd Frames von 560, 470 und 415 nm LEDs bei 120 Hz aufzeichnet, was eine funktionale Bildrate von 40 Hz ermöglicht.
      HINWEIS: Dieser Zeitteilungsmultiplexing-(TDM)-Ansatz adressiert die spektrale Überlappung zwischen GCaMP und RCaMP, indem er ihre Anregung zeitlich trennt und sicherstellt, dass jeder Indikator unabhängig über aufeinanderfolgende Frames angeregt wird. Das hier verwendete Aufzeichnungssystem verwendet optimierte Bandpass-Emissionsfilter (grüner Kanal: 500–530 nm; roter Kanal: >580 nm Longpass), die das spektrale Übersprechen weiter minimieren, indem sie die detektierten Photonen auf die überwiegend von jedem Indikator ausgesendeten Wellenlängen beschränken. Die isosbestische Wellenlänge von 415 nm regt sowohl GCaMP als auch RCaMP gleichermaßen an, erzeugt jedoch minimale calciumabhängige Fluoreszenzänderungen und liefert so ein Bewegungsartefakt-Steuersignal. Zusammen sorgen TDM-Anregung und spektrale Filterung dafür, dass 470-nm-Bilder überwiegend die GCaMP-Aktivität erfassen (Abbildung 3A), 560-nm-Bilder überwiegend RCaMP-Aktivität (Abbildung 3B) und 415-nm-Bilder calciumunabhängige Referenzsignale zur Bewegungskorrektur liefern.
7. Führen Sie in vivo Photometrie-Aufnahmen durch.
   1. Erhalten Sie eine Maus, die wie in Schritt 2 Virusinjektionen und Multifiber-Array-Implantation erhalten hat.
   2. Reinigen Sie die Verbindungsflächen des Patchcords und des implantierten Multifaser-Arrays mit Ethanol und einem Wattestäbchen. Mit dem Knoten für das Photometriesystem im visuellen Codierungs-Workflow und einem Photometer stellen Sie die 415-, 470- und 560-LED-Leistungsstufen so ein, dass sie etwa 1,2 mW Beleuchtung vom Patchkabel ausgeben.
   3. Tragen Sie Index-Matching-Gel auf die Verbindungsfläche des Patchcords auf. Richten Sie das Patchkabel mit den Dowel-Pins an das implantierte Multifiber-Array der Maus aus und schieben Sie das Patchcord nach unten, bis es bündig mit der Oberfläche des implantierten Multifiber-Arrays ist.
   4. Ziehe die Patchcord-Schrauben fest, um das Multifiber-Array am Patchkabel zu befestigen. Lass die Maus sich gewöhnen, bevor die Experimente beginnen (Abbildung 2L–M).
   5. Setze Dateinamen.
      1. Für jede Verhaltenskamera drücken Sie den roten Kreis 'Aufnehmen'-Button, um das Aufzeichnungsfenster in der Verhaltenskamera-Aufzeichnungssoftware zu öffnen und den Dateinamen anzugeben.
      2. Öffnen Sie das DAQ-Softwareprogramm, klicken Sie auf die Zahnrad-Taste und navigieren Sie zu 'Logging options' und geben Sie den Dateinamen an.
      3. Klicken Sie auf den Knoten 'PhotometryWriter' im visuellen Codierungs-Workflow des photometriesystems, um den Dateinamen anzugeben.
   6. In den Verhaltenskamera-Aufnahmefenstern klicken Sie für jede Kamera auf 'Aufzeichnung beginnen'. Als Nächstes drücken Sie die Play-Taste im visuellen Codierungs-Workflow des Photometriesystems und in der DAQ-Software auf Aufnahme.
   7. Klicken Sie auf den TTL-Schalter, um synchron über alle Kameras hinweg aufzuzeichnen.
   8. Aufnahme beenden.
      1. Klicken Sie auf den TTL-Schalter, um die synchronen Kameraaufnahmen zu beenden
      2. Drücken Sie die Stopptaste im visuellen Codierungs-Workflow für das Photometriesystem, um in den Verhaltenskamera-Aufnahmefenstern "Aufnahme zu stoppen".
   9. Wiederholen Sie die Schritte 3.7.5–3.7.8 bis zum Ende der Experimente und trennen Sie die Maus.
      HINWEIS: Nach den Experimenten können Photometrie- und Kamera-Datenströme mit benutzerdefiniertem Code mittels der Ausgabe der DAQ-Software ausgerichtet werden. Konkret (1) die Änderung der TTL-Spannung zeigt die Zeit des TTL-Ein- und Versetzens an, (2) Änderungen der Verhaltensspannung der Kamera zeigen an, wann der Verschluss der Kamera öffnet und schließt, um jedes Verhaltensvideo aufzunehmen, und (3) die anfängliche Änderung der Photometriesystemspannung, die auf dem DAQ aufgezeichnet wird, kann mit der TTL-Anfangszeit und den von der visuellen Codierungssoftware ausgegebenen Photometrie-Zeitstempeln verglichen werden, um die Photometriekamera-Zeitstempel zu bestimmen.

4. Datenverarbeitung (Abbildung 1D, Ergänzungsakte 9)

1. Calcium-Bilddaten vorverarbeiten.
   1. De-interleave-Frames von Calcium-Bilddaten, um separate Signalströme zu erzeugen, die als Reaktion auf 415-, 470-nm- und 560-nm-LEDs aufgezeichnet werden.
   2. Verwenden Sie den Adaptive Iterativ Gewichtete Penalized Least Squares Algorithmus (airPLS)⁴⁴ , um Baseline Drift zu korrigieren.
   3. Berechnen Sie ΔF/F mit:
      
      HINWEIS: Die Basisphase sollte eine stabile Epoche vor experimenteller Manipulation sein (z. B. vor der Einführung eines sozialen Partners). Ist die Basisphase zu kurz (<2–3 Min) oder weist große Schwankungen auf, die durch Bewegungsartefakte kontaminiert sein könnten, sollten Sie eine Normalisierung mit der mittleren Fluoreszenz über die gesamte Sitzung anstelle einer eingeschränkten Basisperiode in Betracht ziehen.
2. Korrektur für Bewegungsartefakte (Abbildung 4A).
   1. Verwenden Sie einen regressionsbasierten Ansatz, obwohl alternative Methoden geeignet sind (siehe Tabelle 2)
   2. Z-Score-ΔF/F-Signale verwenden den Median zur Normalisierung der Signalstärke über Regionen hinweg:
      
   3. Lasso-Regression mit L1-Regularisierung anwenden. Lasso (Least Absolute Shrinkage and Selection Operator) führt die automatische Merkmalsauswahl durch, indem die Koeffizienten uninformativer Prädiktoren in Richtung Null verkleinert werden.
      1. Führen Sie eine Gittersuche über die Regularisierungsparameter durch (α = 0,0001, 0,001, 0,01, 0,1, 1, 10, 100). Die Gittersuche identifiziert das optimale Gleichgewicht zwischen Modellkomplexität und Overfitting. Dieser Schritt kann vollständig automatisiert werden, indem man Kreuzvalidierungsroutinen verwendet, die in Standard-Machine-Learning-Bibliotheken verfügbar sind (z. B. scikit-learn in Python).
      2. Für die Zweifarb-Photometrie (unser empfohlener Ansatz) verwenden Sie alle verfügbaren 415-nm-isosbestischen Kontrollkanäle in den 12 Aufzeichnungsregionen als Prädiktoren (siehe Abbildung 4B–C und Ergebnisse für die Begründung ). Für Einfarb-Photometrie (nur GCaMP oder nur RCaMP) beschränken Sie die Prädiktormatrix auf das isosbestische Signal derselben Faser wie das zu korrigierende Kalziumsignal.
      3. Wählen Sie das Modell aus, das den mittleren quadratischen Fehler zwischen vorhergesagtem und beobachtetem Signal minimiert.
   4. Subtrahieren Sie die vorhergesagte Bewegungskomponente vom Signal, um eine korrigierte Aktivität zu erhalten.
3. Glätten Sie das Signal mit einem Savitzky-Golay-Filter mit einem 725-ms-Fenster.

Ergebnisse

Um bis zu 12 SBN-Gehirnregionen gleichzeitig aufzuzeichnen, haben wir ein anpassbares Multifiber-Array nach dem oben genannten Protokoll gebaut. Nach der Genesung von der Operation wurden die Mäuse während der sozialen Interaktion erfasst (Abbildung 5). Bei allen Experimenten durften männliche CD1-Probenmäuse mit männlichen Balb/c-Mäusen in ihrem Heimkäfig interagieren. Wir nutzten Vgat-Cre-Mäuse, um jRCaMP1b⁴⁰ in GABAergen Neuronen cre-abhängig über 11 SBN-Gehirnregionen zu exprimieren, GCaMP6f³⁹ in nicht-GABAergen Zellen in Cre-ausschließender Weise⁴⁵ über dieselben Gehirnregionen und GRAB-DA1m³³ im Nucleus accumbens⁴² (Tabelle 1). Histologische Bestätigung der Fasertargetierung findet sich in unseren früheren Publikationen^42,43. Hier wollten wir die Leistung verschiedener Methoden zur Korrektur von Bewegungsartefakten testen. Konkret verglichen wir die Wirksamkeit der Verwendung von: (1) einem Medianfilter allein; (2) Lasso-Regression mit L1-Regularisierung, die ausschließlich gleichfaserige isosbestische Signale verwendet (Ein-Prädiktor-Ansatz)¹¹ und (3) Lasso-Regression unter Verwendung isosbestischer Signale aller Fasern als Prädiktoren (Multi-Prädiktor-Ansatz)^41,42 (Abbildung 4A). Entscheidend ist, dass die Lasso-basierte Methoden das Rohsignal mit dem aktivitätsunabhängigen fluoreszierenden Signal korrigieren, das als Reaktion auf die isosbestische Frequenz (415 nm) LED erzeugt wird, während die mediane Filterglättung das aktivitätsunabhängige Signal nicht berücksichtigt.

Wir bewerteten die Bewegungskorrektur anhand von zwei verschiedenen Maßen: absolutem Hochfrequenzrauschen und Jitter. Hochfrequentes Rauschen wurde als Standardabweichung der ersten Ableitung des Signals definiert, die die Größe schneller Signalfluktuationen widerspiegelt. Jitter wurde als der Variationskoeffizient der Ableitung des Signals definiert, der die Größe der Frame-zu-Frame-Signalvariabilität relativ zum Mittelwert der Ableitung des Signals widerspiegelt. Wir stellten fest, dass beide Lasso-basierte Ansätze (Einzel-Prädiktor und Multi-Prädiktor) den Medianfilter deutlich übertroffen in Bezug auf die Reduzierung von Hochfrequenzrauschen und Jitter, wobei die Multi-Prädiktor-Korrektur die Korrektion mit einem einzelnen Prädiktor geringfügig übertraf (Abbildung 4C–D; Hochfrequentes Rauschen, n=414 für 23 Signale über 18 Aufzeichnungssitzungen: Kruskal-Wallis-Test, H = 501,9420, S. < 0,001; Post-hoc Mann-Whitney U-Tests mit Bonferroni-Korrektur: Glättete vs. Einzelstandortregression ***p < 0,001, Glättete vs. Multi-Site-Regression ***p < 0,001, Einzelstandort vs. Multi-Site **p = 0,0073; Jitter: Kruskal-Wallis-Test, H = 495,6685, S. < 0,001; Post-hoc Mann-Whitney-U-Tests mit Bonferroni-Korrektur: Glättete vs. Einzelstandortregression ***p < 0,001, Glättete vs. Multi-Site-Regression ***p < 0,001, Einzelstandort vs. Multi-Site-Regression ***p = 0,0006). Konkret zeigte der Multi-Prädiktor-Ansatz (unter Verwendung aller Glasfaserisosbestika) Vorteile für Rotkanal-(RCaMP)-Signale: 5 von 12 roten Signalen wiesen signifikant weniger Restrauschen auf als die Korrektur eines einzelnen Prädiktors (n = 18 Aufnahmen/Region). Für Jitter zeigten BNST (t-Test, t = 5,42, ***p < 0,001), POA (t-Test, t = 2,68, *p = 0,011), AH (t-Test, t = 2,66, *p = 0,012) und PAG (Mann-Whitney U-Test, U = 279, ***p < 0,001) eine Multi-Prädiktor-Überlegenheit. Für hochfrequentes Rauschen zeigten BNST (Mann-Whitney U-Test, U = 285, ***p < 0,001), POA (Mann-Whitney U-Test, U = 292, ***p < 0,001), AH (t-Test, t = 7,10, ***p < 0,001), PAG (t-Test, t = 13,72, ***p < 0,001) und LHb (t-Test, t = 5,47, ***p < 0,001) Multi-Prädiktor-Überlegenheit. Green-Channel-(GCaMP)-Signale zeigten keine signifikanten Unterschiede zwischen den beiden Lasso-Ansätzen in allen 12 Regionen sowohl für Jitter- als auch für Hochfrequenzrauschmetriken (alle p>0,05, für die vollständige Liste statistischer Tests siehe Tabelle 3). Dies deutet darauf hin, dass bei der zweifarbigen Photometrie die Einbeziehung von kanalübergreifenden isosbestischen Informationen die Bewegungskorrektur für rote Signale verbessert, wahrscheinlich weil grüne Kanalisosbestik sauberere Bewegungsinformationen liefern. Diese Daten zeigen, dass die Bewegungsartefaktkorrektur mit isosbestischen Regressionsmethoden einfache Filteransätze deutlich übertrifft, wobei die Mehrkanalregression spezifische Vorteile für Dual-Color-Aufnahmen bietet.

Abbildung 1. Aufzeichnung aus dem Social Behavior Network mittels Multisite-Zweifarb-Faserphotometrie. (A) Schematische Darstellung, wie man ein Multifiber-Array aufbaut. (B) Schematische Darstellung des Operationsablaufs. (C) Schematische Darstellung von Zweifarb-Kalziumbildungsexperimenten. (D) Beispiel für die Verwendung eines isosbestischen Signals zur Berechnung eines bewegungskorrigierten Signals. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 2. Bilder von wichtigen Verfahren für Herstellung und Operation. (A) Gefertigtes Patchcord, das zur Aufnahme bereit ist. (B) Multifiber-Array, das in einen individuellen stereotaktischen Halter mit dem 0,25 mm x 5,5 mm Bohrer über einem Glasfaserdurchgang platziert wird. (C) Multifiber-Array mit allen Glasfaser-Durchlöchern und eingeklebten Sechskantmuffen. (D) Eine Faser mit einem Faserschreiber spalten. (E) Multifiber-Array, bei dem alle Fasern mit Sekundenkleber befestigt und auf einen individuellen Polierpuck gelegt werden. (F) Vergrößerte Ansicht, wie man den Patchcord-Anschluss am Multifiber-Array ausrichtet und verschraubt. (G) Voll gebautes Multifiber-Array mit Dübelstiften, die an Ort und Stelle geklebt sind. (H) Maus am stereotaktischen Rahmen befestigt, mit einem Kopfhautschnitt, der den Schädel freilegt. (I) Hergestelltes Multifiber-Array, das an einen stereotaktischen Manipulator angeschlossen ist, um das Multifiber-Array während der Operation zu steuern. (J) Vergrößerte Ansicht des Multifiber-Arrays, das ins Gehirn abgesenkt wird. (K) Multifiber-Array vollständig abgesenkt und mit Zahnkleber am Schädel befestigt. (L) Multifiber-Array an einem Tier, das vor der Aufnahme sicher mit dem Patchcord verbunden ist. (M) Herausgezoomte Ansicht des Tieres im Käfig mit Patchcord, das vor und/oder während der Aufnahme angeschlossen ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 3. Spektrale Trennung. Beispielspuren, die minimale spektrale Übersprechen zwischen Kalziumindikatoren zeigen. GCaMP6f (blaue) Signale zeigen eine robuste Aktivierung während der 470-nm-Anregung, aber eine vernachlässigbare Antwort auf die 560-nm-Anregung. jRCaMP1b (rote) Signale zeigen das umgekehrte Muster mit starker Aktivierung ab 560 nm, aber minimaler Antwort auf 470 nm Beleuchtung. (A) Gleichzeitig wurden GCaMP6f- und jRCaMP1b-Signale mit nur 470 nm Beleuchtung aufgenommen. (B) Dasselbe wie (a), aber nur mit 560 nm Beleuchtung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 4. Vergleich verschiedener Methoden für Multifiber-Signalverarbeitung. (A) Schaltplan, der die multistandortbasierte regressionsbasierte Korrektur des photometrischen Signals darstellt. Dieser Ansatz umfasst sequentielle Verarbeitungsschritte, bei denen alle verfügbaren 415-nm-isosbestischen Signale linear auf jedes calciumabhängige Signal abgebildet werden. Vorhergesagte Bewegungskomponenten werden von diesem Signal abgezogen, um die endgültige Auslesung der Aktivität zu erzeugen. z-bewertete ΔF/F-Signale von zwei Signalen mit starker Präsenz von Bewegungsartefakten. (B) Von oben nach unten: isosbestisches Signal vom selben Glasfaser-/Bildkanal, das Bewegungsartefakte darstellt, nur geglättetes RCaMP (links) oder GCaMP (rechts) Signal (mediangefiltert, grün), dasselbe Glasfaser-/Bildkanal-regressionskorrigiertes Signal (Cyan), Multifaser-regressionskorrigiertes Signal (blau). (C) Links: Mittlerer Hochfrequenzrauschwert für jedes aufgezeichnete Signal (n = 21 Sitzungen). Hochfrequentes Rauschen wird als Standardabweichung der ersten Ableitung jedes Signals berechnet. Rauschwerte werden angezeigt für 1) basislinienkorrigiertes, aber unkorrigiertes Signal (grau), 2) basislinienkorrigiertes und mediangefiltertes Signal (pink), 3) basislinien- und einzelfaserregressionskorrigiertes Signal mit Savitsky-Golay-Glättung (cyan) und 4) Basislinien- und Multifaser-regressionskorrigiertes Signal mit Savitsky-Golay-Glättung (blau). Zentrum: Mittlerer Prozentsatz des entfernten Rauschens, der nur durch Glättung, Einzelfaser- oder Mehrfaserregression, aggregiert über alle 23 Signale. Der Prozentsatz des entfernten Rauschens wird als der Anteil des hochfrequenten Rauschens berechnet, der durch Korrektur im Verhältnis zum Gesamtrauschpegel des rohen, baseline-korrigierten Signals entsteht. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM angegeben (Kruskal-Wallis-Test, H = 501,9420, p < 0,001; post-hoc Mann-Whitney-U-Tests mit Bonferroni-Korrektur: Glättete vs. Einzelstandortregression ***p < 0,001, Glättete vs. Multi-Site-Regression ***p < 0,001, Einzelstandort vs. Multisite-Regression **p = 0,0073). Rechts: Prozentsatz der Signale, bei denen hochfrequentes Rauschen statistisch unterschiedlich ist, nach einer Korrektur von Einzelfaser- versus Mehrfaserregression, getrennt nach Signaltyp. Für jedes der 23 Signale wurden die Rauschpegel nach der Single-Site-Korrektur mit den Rauschpegeln nach der Multi-Site-Korrektur verglichen, entweder mit unabhängigen t-Tests (wenn normalverteilt) oder Mann-Whitney-U-Tests (nichtparametrische Alternative). Blaue Segmente zeigen Signale an, bei denen Multi-Site-Korrektur zu deutlich geringerem Rauschen führte als Single-Site-Korrektur (S. < 0,05). Graue Segmente zeigen Signale an, die keinen signifikanten Unterschied zwischen den Korrekturmethoden haben. Cyan-Segmente zeigen Signale an, bei denen die Korrektur eines einzelnen Standorts zu deutlich geringerem Rauschen führte. E: Vgat- GCaMP6f. DA: GRAB-DA. I: Vgat+ jRCaMP1b. (D) Dasselbe wie (C), aber mit Bild-zu-Bild-Variabilität (Jitter), berechnet als Ableitung des Variationskoeffizienten jedes Signals (Kruskal-Wallis-Test, H = 495,6685, p < 0,001; Post-hoc Mann-Whitney-U-Tests mit Bonferroni-Korrektur: Glättet vs. Einzelstandort-Regression ***p < 0,001, Glättete vs. Multi-Site-Regression ***p < 0,001, Einzelstandort vs. Multi-Site ***p = 0,0006). Eine vollständige Liste statistischer Tests und Ergebnisse finden Sie in Tabelle 3. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 5. Multi-Site-Präsentation der zweifarbigen Faserphotometrie. Repräsentative Signale mehrerer Indikatortypen, die während des sozialen Verhaltens gleichzeitig aufgezeichnet werden (Bewohner-Eindringlingstest, Eindringlings-Epoche). Spuren zeigen unnormalisierte und von Baseline subtratraherte, aber nicht bewegungsartefakt-korrigierte GCaMP6f (Cre-negative Neuronen), jRCaMP1b (GABAerge Vgat-Cre+-Neuronen) und GRAB-DA1m (Dopaminsensor im Nucleus accumbens) über soziale Verhaltensnetzwerke desselben Tieres. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Tabelle 1. Viruskoordinaten und Faserlängen für jede gezielte soziale Verhaltensnetzwerk-Hirnregion. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 2. Vergleich von Methoden zur Korrektur von Bewegungsartefakten für Multi-Site-Faserphotometrie. Grundlegende Prinzipien, optimale Anwendungsfälle, Vorteile und Einschränkungen folgender Bewegungsartefaktkorrekturmethoden: einfache lineare Regression, Lasso-Regression mit L1-Regularisierung (unter Verwendung des Multi-Prädiktor-Ansatzes), Bayessche generative Modellierung, frequenzbasierte Skalierung und iterativ umgewichtete kleinste Quadrate. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 3. Details und Ergebnisse der in Abbildung 4 verwendeten statistischen Tests. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Ergänzende Akte 1. 3D-Druckdatei für den Patchcord-Anschluss.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 2. 3D Druckdatei für den Patchcord-Anschluss ohne Durchgangslöcher.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Akte 3. 3D Druckdatei für stereotaktisches Bohrzubehör.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Akte 4. Individueller Polier-Puck-Bauplan.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 5. 3D Druckdatei für Multisite-Photometrie-Arrays, die 12 SBN-Standorte anspricht.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 6. 3D Druckdatei für Multisite-Photometrie-Array ohne Durchbohrungs-Zielstellen.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Akte 7. DAQ-Konfigurationsdatei für DAQ-Software.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzungsakte 8. Visuelle Codierungsdatei für das Photometriesystem.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzungsakte 9. Python-Code, der in Protokoll Schritt 4 verwendet wird und für Bewegungsartefakte-korrigierte Vergleiche verwendet wird. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Die Faserphotometrie ist eine nützliche und kosteneffiziente Technik zur Aufzeichnung der Kalziumaktivität in Populationen aus tiefen Hirnregionen oder bestimmten Zelltypen im frei beweglichen Tier³. Die gleichzeitige Aufzeichnung mehrerer Gehirnregionen ermöglicht es dem Nutzer, die Dynamik zwischen Regionen oder Projektionen während natürlicher Verhaltens- oder kopffixierter Präparaten^{zu vergleichen 5,7,12}. Hier beschreiben wir Methoden, um in zwei Farben bis zu 12 Hirnregionen im subkortikalen "sozialen Verhaltensnetzwerk" des Gehirns mithilfe eines maßgeschneiderten Faserarrays und eines kommerziell erhältlichen Kamerasystems aufzuzeichnen. Im Folgenden erläutern wir wichtige Schritte bei der Umsetzung dieser Methode, mögliche Änderungen und Fehlerbehebungsstrategien sowie deren Bedeutung und Einschränkungen im Vergleich zu bestehenden Ansätzen.

Das Protokoll besteht aus drei Hauptphasen. Erstens erfordert die Herstellung von Multifaser-Arrays und Patchcords, dass maßgeschneiderte 3D-gedruckte Teile an stereotaktischen Koordinaten gebohrt werden, gefolgt von Glasfasereinführung, Polieren und Qualitätskontrolle, um eine Lichtdurchgangseffizienz von ≥75 % sicherzustellen. Präzise Bohrausrichtung (±0,03 mm Toleranz) und gründliches Polieren sind entscheidend. Häufige Ausfälle sind schwache Lichtübertragungseffizienz (<75 %) und verstopfte Glasfaserdurchbohrungen. Eine geringe Effizienz entsteht typischerweise durch Faserfehler beim Spalten oder unsachgemäßem Polieren. Lösungen umfassen die Überprüfung aller Faserenden unter Brightfield-Mikroskopie vor dem Einsetzen (Schritt 1.1.6.2), das Nachpolieren mit der vollständigen Körnung (6 μm → 0,01 μm, Schritt 1.1.6.1) und die Sicherstellung, dass die Faserspalterklinge scharf ist. Um den Durchsatz zu verbessern, können Labore Workflow-Modifikationen wie individuelle Faserschneidevorrichtungen mit Präzisionstranslationsstufen oder laserbasierte Schneidsysteme (Schritt 1.2.4) umsetzen. Kommerzielle 3D-Druckhersteller mit hochpräzisen Systemen können den manuellen Bohrbedarf reduzieren (Schritte 1.1.3–1.1.4, Schritt 1.2.3), wobei die Maßgenauigkeit je nach Charge variieren kann.

Zweitens beinhaltet die chirurgische Implantation eine Schädelausgleichung (±0,03 mm Toleranz), virale Injektionen an 11–12 Stellen sowie Multifiber-Array-Implantation gefolgt von Zementfixation. Die Zielgenauigkeit wird beeinträchtigt, wenn die Schädelnivellierung die Toleranz überschreitet. Dies kann durch Messung des Pitch an mehreren vorder-hinteren Punkten mit 8,25 mm Abstand und Roll in ±2,0–2,5 mm seitlichen Positionen gemildert werden, wobei die Ohrenstangen den Schädel vollständig stabilisieren. Luftblasen bei der Virusinjektion verhindern eine genaue Abgabe und erfordern eine Neuaufnahme der Mikropipetten-Vorbereitung (Schritt 2.9). Während der Multifiber-Array-Implantation vermeiden Sie den Kontakt mit Faserspitzen, indem Sie Zementpyramiden von der Schädeloberfläche nach oben errichten (Schritte 2.10.3–2.10.5) und eine ausreichende Trocknungszeit (≥15 min) einplanen.

Drittens umfasst Aufzeichnung und Datenverarbeitung die Kamerasynchronisation über ein DAQ-System, LED-Leistungskalibrierung (0,1 mW Ausgang/Glasfaser, 1,2 mW Ausgang/12-Faser-Patchkabel) und Signalvorverarbeitung mit isosbestischen Steuerungen. Die hier eingeführte Bewegungskorrektur-Pipeline verwendet Lasso-Regression, die sich gut für Mehrkanal-Prädiktorkonfigurationen eignet, da sie uninformative Prädiktoren automatisch auf Null reduziert und nur diejenigen behält, die sinnvoll zur Artefaktkorrektur beitragen. Diese Eigenschaft macht sie besonders vorteilhaft für die Zweifarb-Photometrie: Indem Lasso isosbestische Signale sowohl von roten als auch von grünen Kanälen als Prädiktoren einbezieht, nutzt es selektiv die Kanäle, die echte Bewegungsinformationen übertragen, was bei Rotkanal- (RCaMP)-Signalen deutlich bessere Rauschreduktion im Vergleich zur Gleichfaserkorrektur allein erzielt (Abbildung 4C–D). Da Lasso die informativsten Prädiktoren automatisch identifiziert, wird dringend empfohlen, alle verfügbaren isosbestischen Kanäle als Eingabe zu verwenden. Dennoch ist Lasso-Regression eine von mehreren gültigen Korrekturmethoden; Alternativen sind Bayessche generative Modellierung⁴⁶, frequenzbasierte Skalierung⁴⁷ und iterativ umgewichtete kleinste Quadrate (IRLS)⁴⁸, die alle wahrscheinlich eine vergleichbare Artefaktreduktion liefern, mit Implementierungsanleitung in Tabelle 2. Anhaltend schlechte Signalqualität trotz optimierter Vorverarbeitung deutet wahrscheinlich auf Hardware- oder chirurgische Probleme hin, und die Schritte 1–2 sollten erneut überprüft werden

Über diese prozeduralen Überlegungen hinaus bringt die zweifarbige Photometrie zusätzliche technische Herausforderungen im Zusammenhang mit der spektralen Trennung mit sich. Ein entscheidender Aspekt in der zweifarbigen Photometrie ist das Management der spektralen Überlappung zwischen grünen und roten Kalziumindikatoren. Obwohl die vollständige Beseitigung des spektralen Crosstalks aufgrund überlappender Emissionsspektren von GCaMP und RCaMP schwierig ist, mildert unser temporaler Multiplexing-Ansatz mit interleaved-LED-Anregung (470 nm für GCaMP, 560 nm für RCaMP, 415 nm isosbestisch) und optimierten Bandpassemissionsfiltern dieses Problem erheblich. In der Praxis beobachten wir minimales Übersprechen: 470-nm-Stimulation erzeugt vernachlässigbare Aktivität im roten Kanal, und umgekehrt bei 560-nm-Stimulation im grünen Kanal (Abbildung 3). Forscher, die sich Sorgen um Restspektralüberlappungen machen, können ihre Systeme weiter optimieren, indem sie Schmalband-Emissionsfilter mit maximaler spektraler Trennung basierend auf ihren spezifischen Indikatorkombinationen auswählen.

Im Vergleich zu anderen Ansätzen für großflächige neuronale Aufzeichnungen bietet maßgeschneiderte zweifarbige Multisite-Faserphotometrie viele bedeutende Vorteile. Erstens, während die Einzelfaserphotometrie ^1,2,3, zeitgenössische extrazelluläre Aufzeichnungen ^4,6 oder kortikale Oberflächenbildgebungsansätze ^8,9 auf eine einzelne oder eine räumlich begrenzte Menge von Gehirnregionen (z. B. an der kortikalen Oberfläche) beschränkt sind, erlaubt das hier geteilte anpassbare 3D-Druckdesign die Zielerfassung von bis zu 12 Hirnregionen überall im Gehirn mit 200 μm großen optischen Fasern. Im Vergleich dazu unterstützen kommerziell erhältliche^{Multifaser-Ferrulen 5,7} nur 100 μm Glasfaseroptik und sind ähnlich auf eine begrenzte Anzahl von Hirnregionen direkt ventral zur linearen Anordnung der Ferrule beschränkt. Was das Zielen und Aufnehmen bestimmter Hirnregionen betrifft, besteht der Hauptkompromiss zwischen dem Faserdurchmesser und dem Sichtfeld des Photometriesystems. Die 3D-gedruckten Multifaserarrays mit 200 μm Fasern zeichnen von einer größeren Fläche an jedem Standort auf im Vergleich zu kommerziell erhältlichen Multifiber-Ferrulen. Im aktuellen Protokoll begrenzt das Kamerafeld des Photometriesystems die Aufzeichnung auf 12 optische Fasern bei 200 μm. Diese Einschränkung kann überwunden werden, indem der Faserdurchmesser auf 100 μm für bis zu 60 Fasern reduziert oder ein individuelles Photometriesystem mit größerem Kameraobjektiv gebaut wird.

Schließlich wurde diese anpassbare, zweifarbige Multisite-Faserphotometrieplattform genutzt, um die neuronale Aktivitätsdynamik zweier genetisch unterschiedlicher neuronaler Populationen über 11 bis 12 Hirnregionen hinweg längs Längs zu verfolgen. Mit einer Cre-in/Cre-ausschließenden Strategie, die Cre-abhängiges RCaMP und Cre-ausschließendes GCaMP über SBN-Populationen in einer Vgat-Cre-Maus hinweg ausdrückt, zeigten sich sowohl aggressive Erfahrungen als auch Beobachtungen, die gemeinsame Muster der SBN-weiten Aktivitätsdynamik bei zukünftigen defensiven sozialen Interaktionen fördern⁴². Mit derselben viralen Strategie in einer Esr1-cre-Maus, um von Östrogenrezeptor-Alpha-exprimierenden und nicht-exprimierenden Neuronen zu erfassen, waren territoriale Muster sozialen Verhaltens mit einer schnellen, hormonsensitiven Reskalierung eines SBN-weiten sozialen Aktionscodes assoziiert, was die verhaltensassoziierte Aktivität im Heimatgebiet⁴³ steigerte. Diese territorienspezifischen Unterschiede im Verhalten und in der Netzwerkcodierung erfordern zirkulierendes Testosteron bei männlichen Mäusen. Während diese Studien einen viralen Ansatz und eine einzige Cre-Linie verwendeten, können zukünftige Studien diese Methoden um intersektionale virale Ansätze, genetisch exprimierte Kalziumindikatoren oder fluoreszierende Reporter der Neuromodulator- und Neuropeptid-Signalgebung erweitern.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
#76 Bohrer	Bohrbohrerstadt	#76
#78 Bohrer	Bohrbohrerstadt	#78
#92 Bohrer	Bohrbohrerstadt	#92
0,01 μ M-Körnung-Polierplatten	ThorLabs	LFCF2
0,25 mm x 5,5 mm Bohrer	Bohrbohrerstadt	Individuelles Produkt	0,25 x 5,5 mm Bohrer, habe die Firma zum Bau kontaktiert
1 & mu; M-Körnung-Polierplatten	ThorLabs	LF1D
12 faserverzweigte Patchord	Dorische Linse	CustomBBP(12)_200/220/3000-0.37 _5m_SMA-12xCL_LAF
200 & mu; m Glasfaser	ThorLabs	FT200UMT
3 & mu; M-Körnung-Polierplatten	ThorLabs	LF3D
30 μ M-Körnung-Polierplatten	ThorLabs	LF30D
6 & mu; M-Körnung-Polierplatten	ThorLabs	LF6D
Absorbierbare Naht	Ethicon	J421H
Adaptive iterativ gewichtete Penalized Least Squares Dokumentation	Google	N/A	https://code.google.com/archive/p/airpls/
Dübelstifte aus legiertem Stahl	McMaster-Carr	98381a983
Verhaltenskameras	Teledyne FLIR	Blackfly S
Bonsai	Bonsai Software Stiftung	Version 2.9.0
Brightfield-Mikroskop	Leica	ES2
Bulldoggenklemmen	FineScienceTools	18038-45
DAQ	Messrechnen	MC USB-200 Serie DAQ
DAQ-Software	Messrechnen	DAQami
Drill	Kopf-Instrumente	Modell 1911 Stereotaxischer Bohrer
Faserspalter	ThorLabs	XL411/CLVB
Faserphotometriesystem	Neurophotometrie	FP3002
Handbuch für das Faserphotometriesystem	Neurophotometrie	N/A	Handbuch für Webseiten-Hosting-Geräte: https://neurophotometrics.com/documentation
Faserschreiber	ThorLabs	S90C
Glasfaserabzieher	ThorLabs	T10S13
Feine Pinzette	FineScienceTools	11252-00
Feine Schere	FineScienceTools	14084-08
G5-Antriebsschrauben	Offener Ephys-Produktionsstandort	OEPS-7105
G5-Schraubenzieher	Offener Ephys-Produktionsstandort	OEPS-7121
GCaMP6f	PNI Viral Neuroengineering Labor	EF1a-Cre übertrifft GCaMP6f-WPRE-hGHpA
GRAB-DA	Addgene	hSyn-GRAB_DA1m-WPRE-hGHpA
Heizpolster	Geschickte medizinische Vorräte	HTP-1500
Heizsystem	Kent Scientific	RT-0515
Isoflurane	Covetrus	29405
jRCaMP1b	Addgene	pAAV.Syn.Flex.NES-jRCaMP1b.WPRE.SV40
M0,6 Messing-Sechskantkörner	MetricScrews.us	21614
Metabond-Zementreagenzien und Werkzeuge	Parkell	S380
MicroFine-ABS-ähnliche 3D-Drucke aus Harz	ProtoLabs	Individuelles Produkt	Siehe Supplemental Code Files 1-3, 5, 6
Nanoliter-Injektor	Drummond Wissenschaftliche Gesellschaft	Nanojekt II	Nanoliter-Injektor
Parrafinwachsplatten	Amcor	ParaFilm M Allzweck-Laborfilm
Pipetter	ThermoFisher Scientific	4641310N
Polieren des Pucks	Maschinenwerkstatt der Physikabteilung der Princeton University	Individuelles Produkt	Siehe Supplemental Code File 4
Leistungsmesser	ThorLabs	PM100D
Puralube optische Salbe	Dechra	P1490-1
Python	Python Software Foundation	N/A
Weiches Kunststoffrohr für das Patchcord	McMaster-Carr	3774N4
SpinView	Teledyne FLIR	Version 1.25.0.52	Bildgebungssoftware, die die Verhaltenskameras steuert
Stereotaktischer Rahmen	Kopf-Instrumente	Modell 1900
TMAC-Dokumentation	N/A	N/A	TMAC-Code: https://github.com/Nondairy-Creamer/tmac
Rohre für stereotaktischen Rahmen	Saint-Gobain	E-3603
Verdampfer	Kent Scientific	VetFlo Vaporizer