Methodenartikel

Metagenomische Next-Generation-Sequenzierung von Rückenmarksflüssigkeit zum Nachweis von Krankheitserregern des zentralen Nervensystems

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DOI:

10.3791/70075

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17. April 2026

 ,  ,  , 
1University of California, San Francisco Weill Institute for Neurosciences, Department of Neurology, University of California, San Francisco

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Forschungsprotokoll beschreibt einen optimierten Arbeitsablauf für metagenomische Next-Generation-Sequenzierung (mNGS) von Gehirnspinalflüssigkeit. Durch die Bewältigung von Herausforderungen, die einzigartig für Proben mit niedriger Biomasse sind, ermöglicht die Methode eine robuste Erkennung von Krankheitserregern in unterschiedlichen Ressourcenumgebungen und bietet eine vielseitige Grundlage für die Forschung zu neuroinfektionsbiologischen Erkrankungen.

Zusammenfassung

Metagenomische Next-Generation-Sequenzierung (mNGS) hat sich als leistungsstarkes Werkzeug für unvoreingenommene Pathogenerkennung und Wirtstranskriptionsprofilierung in klinischen und Forschungsumgebungen etabliert. Obwohl ihre Nützlichkeit bei der Diagnose von Infektionen des zentralen Nervensystems (ZNS) zunehmend anerkannt wird, stellen Proben der Großhirnflüssigkeit (CSF) aufgrund der geringen Nukleinsäurehäufigkeit und der Anfälligkeit für Abbau besondere Herausforderungen dar. Diese Studie präsentiert ein optimiertes, forschungsbasiertes Protokoll für Illumina-Sequenzierungsplattformen, das auf CSF-MNGS zugeschnitten ist und dabei Probenhandhabung, Nukleinsäureextraktion, Bibliotheksvorbereitung, Sequenzierung und bioinformatische Analyse umfasst. Qualitätskontrollansätze, die sowohl an hohe als auch ressourcenarme Umgebungen angepasst werden können, werden ebenfalls angeboten, einschließlich Alternativen zur Kapillarelektrophorese. Diese Studie zeigt die Robustheit des Protokolls durch zwei repräsentative Kohorten: einen hochintensiven, auf NovaSeq basierenden Workflow und einen kostenbewussten NextSeq-basierten Workflow. In diesen Kohorten wurden Krankheitserreger in über 50 % der Fälle nachgewiesen, was das diagnostische Potenzial der Methode auch bei ressourcenbegrenzten Anpassungen unterstreicht. Dieses Protokoll ermöglicht reproduzierbare Liquor-MNGS und bildet eine Grundlage für vielfältige Anwendungen in der Forschung und Diagnostik neuroinfektionsbiologischer Erkrankungen.

Einleitung

Metagenomische Next-Generation-Sequencing (mNGS) ist eine zunehmend genutzte molekulare Technik, die den Nachweis eines breiten Spektrums von Nukleinsäuren in einer gegebenen Umwelt- oder Wirtsprobeermöglicht. Durch die Amplifizierung und Sequenzierung des überwiegenden Großteils des genetischen Materials innerhalb einer Probe erfordert mNGS keine vorgefasste Hypothese über die spezifischen Mikroorganismen, die vorhanden sein könnten. mNGS hat sich als diagnostisches Werkzeug in verschiedenen klinischen Kontexten als nützlich erwiesen, etwa zur Erkennung ungewöhnlicher Krankheitserreger oder atypischer Erscheinungen von Infektionskrankheiten 1,2,3. Darüber hinaus wird das Wirtstranskriptionsprofil auch durch die durch den mNGS-Test erzeugten RNA-Sequenzierungsdaten erfasst, was es Forschern ermöglicht, die Immunantwort des Wirts auf verschiedene Krankheitszustände besser zu verstehen4. Die Anwendbarkeit von mNGS in einer Vielzahl klinischer und forschungsbezogener Kontexte sowie die dramatische Kostensenkung der Generika-Sequenzierung in den letzten Jahrzehnten haben zu einem enormen Wachstum der Nutzungdieser Technologie geführt.

Insbesondere hat mNGS vielversprechende Ergebnisse bei der Erkennung von Infektionen des zentralen Nervensystems (ZNS) gezeigt, die weiterhin schwer zu diagnostizierensind 2,6,7. Vor der Einführung der klinischen mNGS-Tests untersuchte das California Encephalitis Project die Ursachen der Enzelphalitis im ganzen Bundesstaat und stellte fest, dass trotz erweiterter molekularer Tests und detaillierter klinischerUntersuchung über die Hälfte der Fälle undiagnostiziert blieb. Nun, über zwei Jahrzehnte später, entdeckte ein klinisch validierter cerebrospinaler (CSF) mNGS-Test über einen Zeitraum von sieben Jahren das Vorhandensein pathogener Organismen im CSF von fast 15 % der Patienten mit Verdacht auf CNS-Infektionen7. Darüber hinaus wurde bei Patienten mit bestätigten Infektionsdiagnosen einer von fünf nur durch diesen klinischen CSF-MNGS-Test diagnostiziert, was den Nutzen dieses Testansatzes7 unterstreicht. Darüber hinaus haben Studien auch das Potenzial gezeigt, die Wahrscheinlichkeit verschiedener ZNS-Infektionen anhand des durch den mNGS-Assay 9,10,11 erzeugten Wirtstranskriptoms vorherzusagen.

Die Zugänglichkeit dieser vielversprechenden Technik ist jedoch durch Herausforderungen begrenzt, die einzigartig für die Behandlung und Verarbeitung von Liquorproben sind. Insbesondere ist die Menge an Liquor-DNA und -RNA oft geringer als die von den Library PreparationKits 12,13 angegebene Mindestmenge. Auch die Nukleinsäurequalität kann suboptimal sein, da CSF-Proben, die für klinische Zwecke gesammelt werden, oft bei Temperaturen gelagert werden, bei denen DNAses und RNAses aktivbleiben können. Dieses Papier beschreibt ein forschungsbasiertes CSF-mNGS-Protokoll für Illumina-Sequenzierungsplattformen, das optimiert wurde, um die Wahrscheinlichkeit zu maximieren, nutzbare Daten für den Pathogennachweis zu erzeugen (Abbildung 1).

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Protokoll

Dieses Protokoll wurde mit Proben entwickelt, die im Rahmen der vom UCSF Institutional Review Board genehmigten Studien gesammelt wurden.

figure-protocol-1
Abbildung 1: Cerebrospinalflüssigkeit (CSF) metagenomische Next-Generation-Sequencing (mNGS) Probenverarbeitung und analytischer Workflow zur Pathogenerkennung. Dieses Diagramm zeigt die Hauptschritte in den CSF-mNGS-Wet-Lab- und bioinformatischen Signalwegen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

1. Überlegungen zur Behandlung von Liquorproben

HINWEIS: Die mNGS-Ergebnisse sind optimal, wenn die CSF-Bibliothek zur Entnahme vorbereitet wird oder wenn CSF-Proben durch Schnelleinfrieren in flüssigem Stickstoff konserviert werden, gefolgt von einer Langzeitlagerung bei -80 °C 15. Alternativ kann der Einsatz von Konservierungslösungen wie dem DNA/RNA-Schild bei der Probenentnahme eine längere Lagerung bei Raumtemperatur ermöglichen.16,17. Dies kann in Situationen vorzuziehen sein, in denen Bedenken hinsichtlich der Zuverlässigkeit der Kühlkette bestehen. Darüber hinaus kann das Vermeiden unnötiger Frost-Tau-Zyklen ebenfalls dazu beitragen, die Nukleinsäureintegrität zu bewahren, und es kann ratsam sein, Proben zum Zeitpunkt der Entnahme vorab zu aliquotieren, wenn für dieCSF-Proben 18,19 mehrere analytische Workflows erwartet werden.

2. Gewinnung von Liquor-Nukleinsäure

VORSICHT: Führen Sie in einem geeigneten Biosicherheitsschrank mit Handschuhen und einem Laborkittel, um das Übertragungsrisiko infektiöser Organismen zu verringern. Reagenzien sind schädlich, wenn sie geschluckt, eingeatmet oder mit der Haut in Kontakt kommen. Entsorgen gebrauchte Materialien als gefährliche chemische Abfälle gemäß den örtlichen Vorschriften.

  1. Das Quick-DNA/RNA-Kit eignet sich im Allgemeinen gut für Proben mit geringer Nukleinsäuremenge.
  2. Die Liquorstoffproben auf Eis auftauen, dann 100 μL–1 mL jeder Probe in ein 1,5 mL Rohr übertragen und 10 Minuten lang mit 16.000 x g bei 4 °C zentrifugieren.
  3. Man pipettiert vorsichtig das Überstandsmittel ab, wobei das Pellet (das oft mit bloßem Auge unsichtbar ist) und 100 μL Überlagerungsmittel zurückbleiben.
  4. Fügen Sie 100 μL DNA/RNA Shield zu den verbleibenden 100 μL Supernatant und Pellet hinzu und mischen Sie gründlich mit einer Pipetten.
  5. Anschließend fügen Sie 600 μL DNA/RNA-Lysepuffer und Pipettenmischung hinzu, bis die Lösung homogen ist.
  6. Befolgen Sie den Rest des DNA/RNA-Extraktionsprotokolls, wie vom Hersteller in ergänzenden Anhängen A beschrieben, mit den folgenden wichtigen Änderungen, die spezifisch für CSF sind:
    1. Alle Zentrifugationsschritte führen Sie 1 Minute bei maximaler Geschwindigkeit (~21.000 x g) durch, außer dem letzten DNA/RNA-Waschschritt, der 3 Minuten bei maximaler Geschwindigkeit laufen sollte.
    2. Elutieren Sie die Probe, indem Sie 22 μL (statt 25 μL) nukleasefreies Wasser direkt auf die Säulenmatrix geben, und dann 3 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Das höhere Volumen führt in der Regel zu einer größeren Gesamtmenge an aus der Säule elutierten Nukleinsäure.
    3. Nach der Eluation pipettieren Sie den Durchfluss zurück auf die Säulenmatrix und zentrifugieren Sie erneut für eine Minute mit maximaler Geschwindigkeit. Übertragen Sie die Probe in ein neues 1,5-ml-Speicherrohr und beginnen Sie entweder sofort mit der Bibliotheksvorbereitung oder lagern Sie bei -80 °C.

3. Vorbereitung der CSF-RNA-Bibliothek

VORSICHT: Führen Sie in einem geeigneten Biosicherheitsschrank, tragen Sie Handschuhe und einen Laborkittel. Reagenzien sind schädlich, wenn sie geschluckt, eingeatmet oder mit der Haut in Kontakt kommen. Entsorgen gebrauchte Materialien als gefährliche chemische Abfälle gemäß den örtlichen Vorschriften.

HINWEIS: Wichtige Überlegungen vor dem Beginn: Die rRNA-Entlastung wird der Polyadenylierungsanreicherung zur Isolierung von mRNA vorgezogen, da die rRNA-Depletion keine zusätzlichen Perlenreinigungsschritte erfordert (was die Ausbeute nutzbarer mRNA verringern kann), und einige neuroinvasive RNA-Virus-Transkripte keine Polyadenylierung besitzen. ERCC (External RNA Controls Consortium) RNA Spike-In kann als Qualitätskontrollmaßnahme hinzugefügt werden, ist jedoch nicht zwingend erforderlich. Wenn die RNA nach der Extraktion bei -80 °C gelagert wurde, taut man vor Beginn auf Eis auf.

  1. RNA-Fragmentierung und Priming: Pipettenmischung mischt Folgendes in einem Polymerase-Kettenreaktionsröhrchen (PCR): 3,5 μL RNA-Probe, 0,5 μL 1:2500 verdünnte ERCC-Spike-in, 4 μL Erststrang-Reaktionspuffer (5x), 1 μL Zufallsprimer und 1 μL 1:100 verdünnte rRNA (Materialtabelle). In einem Thermozyklus wird der erhitzte Deckel auf 105 °C eingestellt und die Proben bei 75 °C für 2 Minuten, 70 °C für 2 Minuten, 65 °C für 2 Minuten, 60 °C für 2 Minuten, 55 °C für 2 Minuten, 37 °C für 5 Minuten und 25 °C für 5 Minuten inkubiert.
  2. Erststrang-cDNA-Synthese: Pipette mischt die fragmentierte und primierte RNA (10 μL) mit 8 μL nukleasefreiem Wasser und 2 μL Erststrang-Syntheseenzymmischung. In einem Thermocycler stellen Sie den erhitzten Deckel auf 105 °C ein und inkubieren Sie die Proben bei 25 °C für 10 Minuten, 42 °C für 15 Minuten und 70 °C für 15 Minuten.
  3. Synthese der cDNA des zweiten Strangs: Pipette mischt die vom ersten Strang synthetisierte DNA (20 μL) mit 8 μL Puffer der Zweitstrangsynthese der Reaktion, 4 μL Enzymmischung der Zweitstrangsynthese und 48 μL nukleasefreiem Wasser. In einem Thermocycler werden die Proben 1 Stunde lang bei 16 °C inkubiert, wobei der beheizte Deckel geschlossen ist.
  4. Führen Sie eine magnetische Perlenreinigung durch (ergänzende Anhänge B) mit einem 1,8-fachen Verhältnis von SPRI-Magnetperlen (144 μL). Elutieren Sie in 53 μL nukleasefreies Wasser und übertragen Sie 50 μL des finalen Supernatanten (das gereinigte doppelsträngige cDNA enthält) in ein sauberes, nukleasefreies PCR-Rohr. Zu diesem Zeitpunkt können die Proben bei Bedarf bei -20 °C über Nacht sicher eingefroren werden.
  5. cDNA-Bibliothek Ende der Vorbereitung: Wenn die Probe über Nacht bei -20 °C gelagert wurde, taut sie vor dem Neustart auf Eis auf. Pipette mischt die gereinigte ds-cDNA (50 μL) mit 7 μL End-Prep-Reaktionspuffer und 3 μL Endprep-Enzymmischung.
  6. In einem Thermocycler werden die Proben bei 20 °C für 30 Minuten und bei 65 °C für 30 Minuten inkubiert, wobei der beheizte Deckel geschlossen ist.
  7. Adapterligation (diesen Schritt auf Eis durchführen): Erzeugen Sie eine 1:100-Verdünnung des Adapters in nukleasefreiem Wasser. Pipettieren Sie das Endvorbereitungs-Reaktionsgemisch (60 μL) in ein Rohr mit 30 μL Ligations-Mastermischung, 1 μL Ligationsverstärker und einem 2,5 μL 1:100 verdünnten Adapter. Stellen Sie sicher, dass der Adapter separat hinzugefügt wird (z. B. nicht vorgemischt mit dem Ligationsmaster-Mix oder Ligationsverstärker), um die Bildung von Adapter-Dimeren zu vermeiden.
  8. In einem Thermocycler werden die Proben bei 20 °C für 15 Minuten inkubiert, wobei der beheizte Deckel geschlossen ist.
  9. Beginnen Sie sofort mit der magnetischen Perlenreinigung (Ergänzender Anhang 2) mit einem 0,9-fachen Verhältnis von SPRI-Magnetperlen (87 μL).
  10. Elutieren Sie in 17 μL nukleasefreies Wasser und übertragen Sie 15 μL des finalen Supernatanten in ein sauberes, nukleasefreies PCR-Rohr
  11. Barcoding PCR: Pipettieren Sie die gereinigte, adapter-ligierte cDNA (15 μL) in ein Rohr mit 3 μL USER-Enzym, 25 μL Q5 Master Mix und 10 μL einzigartigen barcodedierten Primern. In einem Thermocycler stellt man den erhitzten Deckel auf 105 °C, inkubiert die Proben bei 37 °C für 15 Minuten, dann bei 98 °C für 30 Sekunden, und führt anschließend 19 Zyklen mit 98 °C für 10 Sekunden und 65 °C für 75 Sekunden durch. Beenden Sie die PCR, indem Sie 5 Minuten bei 65 °C brüten.
  12. Führen Sie eine abschließende magnetische Perlenreinigung mit einem 0,8-fachen Verhältnis magnetischer Perlen (43 μL) durch. Elutieren Sie in 23 μL nukleasefreies Wasser und übertragen Sie nach dem letzten Trennschritt der Perle 20 μL in ein sauberes, nukleasefreies PCR-Rohr. Zu diesem Zeitpunkt können die Proben bei Bedarf bei -20 °C über Nacht sicher eingefroren werden.

4. CSF-DNA-Bibliotheksvorbereitung

VORSICHT: Führen Sie in einem geeigneten Biosicherheitsschrank mit Handschuhen und Laborkittel. Reagenzien sind schädlich, wenn sie geschluckt, eingeatmet oder mit der Haut in Kontakt kommen. Entsorgen gebrauchte Materialien als gefährliche chemische Abfälle gemäß den örtlichen Vorschriften.

  1. Wenn die extrahierte DNA über Nacht bei -20 °C gelagert wurde, tauen Sie sie vor dem Neustart auf Eis auf.
  2. DNA-Fragmentierung und Endpräparation: Mischen Sie den Erststrang-Reaktionspuffer gründlich durch Vortexen und Pipette-Mischen der Lösung, um eventuelle Niederschlagsstoffe wieder aufzuhängen. Pipettenmischung enthält 3,5 μL der extrahierten DNA, 22,5 μL nukleasefreies Wasser, 7 μL Erststrang-Reaktionspuffer und 2 μL Erststrang-Enzymmischung.
  3. In einem Thermocycler stellt man den erhitzten Deckel auf 105 °C ein und inkubiert die Proben bei 37 °C für 5 Minuten, dann bei 65 °C für 30 Minuten.
  4. Der Adapterligierungs- und Barcoding-PCR-Prozess ist identisch für die DNA- und RNA-Bibliotheken. Wiederholen Sie die Abschnitte 7–10 der "CSF RNA Library Preparation" mit der fragmentierten und am Ende vorbereiteten DNA, um die DNA-Bibliotheksvorbereitung abzuschließen.

5. Qualitätskontrolle und Pooling der Bibliothek

  1. Quantifizieren Sie die Konzentration der Probenbibliotheken mittels des DNA-Quantifikationskits und des entsprechenden Fluorometers. Wasserkontrollen sollten deutlich geringere (oder nicht quantifizierbare) Konzentrationen aufweisen als die übrigen Proben.
  2. Bewerten Sie die Größen der Probenbibliotheken, indem Sie die Proben auf einer automatisierten Kapillarelektrophorese-Maschine durchführen.
  3. Alternativ, falls keine automatisierte Kapillarelektrophoresemaschine verfügbar ist, verstärkt man 1–2 μL der Probe weiter durch eine PCR-Reaktion mit Illumina-Universalprimern und führt anschließend eine Elektrophorese von 10 μL des Endprodukts auf einem 2%igen Agarosegel durch. Entsorgen gebrauchte Materialien als gefährliche chemische Abfälle gemäß den örtlichen Vorschriften.
    HINWEIS: Die optimale Bibliothekslänge beträgt etwa 400–500 Basenpaare, daher sollten zukünftige Fragmentierungsinkubationen entsprechend angepasst werden, wenn die Bibliotheksgrößen größer oder kürzer als gewünscht sind. Darüber hinaus ist es entscheidend, das Vorhandensein von Adapterdimeren zu prüfen, die etwa 150 Basenpaare lang sind und auftreten, wenn zwei Adaptermoleküle versehentlich ohne Insert-Sequenz zusammengebunden werden. Selbst wenn sie in geringen Mengen vorhanden sind, neigen Adapterdimere dazu, effizient auf der Durchflusszelle zu clustern und zu sequenzieren, wodurch der Anteil der nutzbaren Reads während eines Sequenzierungslaufs reduziert wird. Daher führen Sie, falls Adapterdimere vorhanden sind, eine zusätzliche magnetische Perlenreinigung mit einem 0,8-fachen Verhältnis von SPRI-Magnetperlen durch. (Beachtend: Wenn >10 % der Probe Adapterdimere sind, kann es 2–3 Runden magnetische Perlenreinigung erfordern, um die meisten Adapterdimere zu entfernen).
  4. Um eine ähnliche Sequenzierungstiefe über Proben innerhalb desselben Sequenzierungslaufs zu gewährleisten, ist es notwendig, die äquimolaren Mengen jeder Probe zusammenzuführen. Wenn die Bibliotheksgrößen über alle Proben vergleichbar sind, poolen Sie einfach die äquivalenten Massen jeder RNA-Bibliothek und wiederholen Sie dies separat für jede DNA-Bibliothek.

6. Sequenzierungsüberlegungen

  1. Die gesammelten Proben sind nun bereit zur Sequenzierung auf Illumina-Sequenzierungsgeräten. Wenn die Sequenzierung intern erfolgt (statt über eine spezialisierte Sequenzierungskernanlage), denaturieren und verdünnen Sie die gesammelten Bibliotheken sorgfältig gemäß den Anweisungen des Sequenzierungsgeräts, bevor der Pool auf die Reagenzienkassette geladen wird (typische Konzentration beträgt 4 nM für die meisten Illumina-Sequenzierungsplattformen).
  2. Berechnen Sie die geschätzte Sequenztiefe, indem Sie die erwartete Datenausbeute für die Illumina-Flusszelle durch die Anzahl der multiplexierten Proben im Durchlauf teilen.
    HINWEIS: Die Bestimmung der gewünschten Sequenztiefe hängt von mehreren Faktoren ab, darunter Kosten, verwendetes Sequenzierungsgerät und die Ziele des Experiments. Zwei Beispiele für verschiedene Sequenztiefen werden unten im Abschnitt Repräsentative Ergebnisse vorgestellt.

7. Datenanalyse zur Erregererkennung

  1. Nutzen Sie die Open-Source-Webplattform Chan Zuckerberg ID (CZID, https://www.czid.org, Illumina mNGS Pipeline v8.3) zur Durchführung der metagenomischen Analyse zur Pathogenerkennung. CZID bietet außerdem Optionen, Samples über die Kommandozeile hochzuladen und direkt von einem Illumina BaseSpace-Konto zu CZID zu übertragen. Eine detaillierte Übersicht über die Analyse der CZID-mNGS-Daten ist unter https://chanzuckerberg.zendesk.com/hc/en-us/articles/13770737266196-Guide-to-mNGS-Data-Analysis verfügbar
  2. Melden Sie sich bei CZID an, klicken Sie auf "Upload", wählen Sie "Metagenomics" für den Analysetyp aus und wählen Sie die Eingabe-Fastq-Dateien aus dem Sequenzierungslauf aus. Geben Sie die notwendigen Informationen für jede Probe ein, einschließlich Probenname, Probentyp (CSF) und Nukleotid (RNA oder DNA).
    HINWEIS: Die hochgeladenen Dateien werden automatisiert über die CZID-Pipeline verarbeitet, die mehrere Rechenwerkzeuge wie STAR, Bowtie2, Trimmomatic, PriceSeq und GSNAP umfasst, um minderwertige Lese- und menschliche Lesesequenzen zu entfernen. Die Pipeline richtet dann die gefilterten Sequenzen aus und assemblert sie mithilfe der Nukleotid- (NT) und Proteindatenbanken (NR) des National Center for Biotechnology Information (NCBI) über die Softwareprogramme Minimap2 bzw. DIAMOND. Die endgültige CZID-Ausgabe umfasst NT/NR-Taxonzählungen und Contig-Zählungen (zusammenhängende, überlappende Segmente, die während der Montage erzeugt werden) für jede Probe.
  3. Nach der Verarbeitung klicken Sie auf den Projektordner mit den Proben und navigieren Sie zum Zusammenfassungs-Dashboard.
  4. Scrollen Sie nach unten, um die Anzahl der Reads pro Probe zu untersuchen (und vergleichen Sie mit der erwarteten Anzahl von Reads basierend auf der verwendeten Illumina-Flow-Zelle und der Anzahl der im Sequenzierungslauf multiplexierten Proben), den Prozentsatz der Reads, die die Qualitätskontrollfilterung bestehen, und das doppelte Kompressionsverhältnis, um eine verzerrte PCR-Überamplifikation zu beurteilen.
  5. Das Vorhandensein von Kontaminationen durch Umwelt-Nukleinsäurefragmente – entweder während der CSF-Probenentnahme oder während der Extraktion/Bibliotheksvorbereitung – ist ein häufiges Phänomen20. Um festzustellen, ob bakterielle, pilz- und parasitäre Reads wahre Positive sind, können mögliche Methoden mit den normalisierten Read-Counts (reads pro million oder rPM) in Betracht gezogen werden:
    1. Erstellen Sie ein Hintergrundmodell (z. B. mit Wasserproben, die extrahiert, vorbereitet und sequenziert wurden) direkt innerhalb des CZID, um alle Taxonen mit rPMs herauszufiltern, die ähnlich oder weniger häufig im Vergleich zum Hintergrundmodell sind (und daher wahrscheinlich eine Kontamination darstellen). Im Projektordner überprüfen Sie jede der Wasserkontrollproben und klicken Sie dann auf "Hintergrundmodell", um sie zu erstellen. Während Sie jede Probe analysieren, wählen Sie das Hintergrundmodell aus und klicken Sie auf "Schwellenwertfilter", um einen "NTZ-Score" > 1 (oder höher) anzuwenden, um wahrscheinliche Schadstoffe herauszufiltern.
    2. Verwenden Sie vorgegebene rPM-Schwellenwerte, wie die rpM-Probe > 10* (durchschnittliche rPM-Kontrollen) oder log10 (rPM-Stichprobe), mindestens 1 Log größer als log 10 (durchschnittliche rPM-Gesamtkohorte). Laden Sie zunächst das taxonspezifische rPM für jede Probe herunter, indem Sie jede Probe auf der Projektseite prüfen, auf Download klicken und "Combined Sample Taxon Results" auswählen. Die resultierende .csv Datei kann je nach Wunsch mit statistischer Software wie R oder Stata analysiert werden.
      HINWEIS: Angesichts der geringeren relativen Häufigkeit viraler Krankheitserreger sollte jedes Virus mit bekanntem neuroinvasivem Potenzial und mindestens einer Lesung, die mit dem viralen Genom ausgerichtet ist, als positives Ergebnis betrachtet werden (und idealerweise durch wiederholte mNGS oder pathogenspezifische klinische Tests bestätigt werden). Zusätzlich erfordert die analytische Pipeline, dass jede Lektüre in der fastq-Datei rechnerisch auf das wahrscheinlichste Referenzgenom in der NCBI-Datenbank ausgerichtet ist. Daher könnten einige Reads relativ unspezifisch auf einen bestimmten Erreger zugeschnitten sein und theoretisch auf eine breite Palette von Organismen ausgerichtet sein können, anstatt auf das spezifische Taxon, das CZID zugewiesen wurde. Angesichts dieses Risikos sollte eine manuelle Bestätigung positiver Calls erfolgen, indem die Ausrichtung über das webbasierte NCBI BLAST-Tool bestätigt wird (die spezifischen Reads für ein Taxon können direkt von CZID zu NCBI BLAST gesendet werden, indem man auf das Blast-Symbol neben dem entsprechenden Taxon klickt).

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Ergebnisse

Qualitätskontrolle der Bibliothek
Nach der DNA/RNA-Extraktion beträgt die gemessene Konzentration der extrahierten DNA in der Regel 1–10 ng/μL. Die Konzentration der extrahierten RNA liegt jedoch oft im Bereich von pg/μL, weshalb sie häufig nicht mit Spektrophotometern nachweisbar ist. Nach der Bibliotheksvorbereitung befinden sich die gereinigten und amplifizierten cDNA- und DNA-Bibliotheken in der Regel bei einer Konzentration von 0,5–10 ng/μL bzw. 10–30 ng/μL. Die ...

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Diskussion

Es gibt wichtige Überlegungen, die Änderungen an diesem Protokoll erfordern können, abhängig von der gewünschten Sequenztiefe, der verwendeten Sequenzierungsplattform und der Verfügbarkeit von Ausrüstung für die Qualitätskontrolle. Dennoch zeigen die beiden hier vorgestellten Repräsentativkohorten, dass eine robuste Krankheitserregerdetektion unter einer Vielzahl experimenteller Bedingungen möglich ist. Konkret zeigte Kohorte B, dass trotz mehrerer kostensparender Maßnahmen – flacher Seq...

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Offenlegungen

M.R.W. erhält nicht verwandte Forschungsförderungen von Roche/Genentech, Novartis und Kyverna Therapeutics und ist Gründer und Vorstandsmitglied von Delve Bio Inc. Er hat Beratungsleistungen für Pfizer, Vertex Pharmaceuticals, Ouro Medicines und Indapta Therapeutics angeboten.

Danksagungen

Diese Studie wurde durch Fördermittel des Fogarty International Center der National Institutes of Health im Rahmen von Award Number D43TW009343 unterstützt. Wir möchten den vielen Forschern am Wilson Lab, UCSF und CZI danken, die in den vergangenen Jahren zur Entwicklung und Optimierung von mNGS-Protokollen für vielfältige Forschungsanwendungen beigetragen haben.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,2 mL PCR-RöhrenstreifenEppendorf30124359
1,5 mL DNA-LoBind-RöhrchenEppendorf30108051
1,5 mL Safe Lock-RohreEppendorf30120191
ERCC RNA Spike-In MischungThermo Fisher4456740
Hochempfindliche D1000-ReagenzienAgilent5067-5585
Invitrogen Collibri Bibliothek Verstärkungs-Master-MixThermo FisherA38539050
Mastercycler x50Thermo Fisher6311000010
NEBNext-Multiplex-Oligos für IlluminaNew England Biolabs7335S/L
NEBNext Ultra II DNA-BibliotheksvorbereitungssetNew England BiolabsE7645
NEBNext Ultra II RNA Library Prep Kit für IlluminaNew England BiolabsE7770
NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (150 Zyklen)Illumina20024907
NextSeq 550IlluminaN/a
QIAseq FastSelect -rRNA HMR KitQuiagen334386
Qubit 1X dsDNA Hochsensitivitäts-Assay-KitQubitQ33230
Qubit 4 FluorometerThermo Fishern/a
Quick-DNA/RNA Microprep Plus Kit ZymoD7005
TapeStation 4150AgilentG2992AA

Referenzen

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