Dieses Protokoll beschreibt eine zweiphasige Säure-Lösungsmittel-Extraktionsmethode zur Isolierung kurzkettiger Fettsäuren aus niedrig einbringenden Mauskotproben ohne Derivatisierung.
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Methodenartikel
Extraktion von kurzkettigen Fettsäuren aus Mäusekot mittels einer zweiphasigen Säure-Lösungsmittel-Methode
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll zur Gewinnung von kurzkettigen Fettsäuren (SCFAs) aus niedrig-Eingabe-Maus-Kotproben mittels einer Zweiphasen-Säure-Lösungsmittel-Extraktionsstrategie. Die Methode ist für einzelne Fäkalieingänge von etwa 20–50 mg konzipiert und verwendet verdünnte Salzsäure und Ethylacetat, um eine Phasentrennung ohne Derivatisierung zu ermöglichen. Das Protokoll besteht aus Fäkalhomogenisierung, Säuerung, Partitionierung organischer Lösungsmittel und Zentrifugation bei niedriger Temperatur und kann mit Standardlaborgeräten durchgeführt werden, die in Forschungslaboren üblicherweise verfügbar sind. Nach der Extraktion eignen sich SCFAs für die nachgelagerte Analyse durch routinemäßige, auf Gaschromatographie basierende Plattformen. Die erfolgreiche Ausführung des Protokolls zeigt sich durch die Erkennung klar aufgelöster SCFA-Spitzen bei charakteristischen Retentionszeiten über dem Hintergrundrauschen, wie bei wichtigen fäkalen SCFAs wie Acetat, Propionat und Butyrat aus einzelnen Mausproben demonstriert wird. Dieses Protokoll adressiert eine häufige Verfahrensherausforderung in Kleintierstudien, indem es einen standardisierten Workflow für die Extraktion von fäkalen SCFA aus begrenztem Probenmaterial bietet und gleichzeitig die Kompatibilität mit routinemäßigen analytischen Arbeitsabläufen aufrechterhält.
Einleitung
Dieses Protokoll wurde entwickelt, um die Extraktion von kurzkettigen Fettsäuren (SCFAs) aus Müs-Kotproben mit geringem Input in einem Format zu ermöglichen, das mit routinemäßiger Gaschromatographie (GC)-basierter Analyse kompatibel ist. SCFAs sind flüchtige organische Fettsäuren mit weniger als sechs Kohlenstoffatomen, hauptsächlich darunter Essigsäure, Propionsäure und Buttersäure, die von der Darmmikrobiota durch die Fermentation unverdaulicher Ballaststoffe produziertwerden. Die Quantifizierung dieser Metaboliten aus einzelnen Mäusen ist häufig in Kleintierstudien erforderlich, bei denen das Fäkalienmaterial begrenzt ist und die Proben mit verhaltensbezogenen, metabolischen oder physiologischen Phänotypen 2,3,4,5,6 verknüpft sind. Ein praktischer, leistungsarmer Extraktionsworkflow ist daher notwendig, um experimentelle Designs zu unterstützen, die auf SCFA-Messungen pro Tier basieren.
Bestehende Ansätze zur fekalen SCFA-Analyse stellen mehrere methodische Einschränkungen dar. Die Quantifizierung von SCFAs in Fäkalproben bleibt aufgrund ihrer Volatilität, geringen Häufigkeit und der Komplexität biologischer Matrizen7 analytisch schwierig. Standard-Arbeitsabläufe erfordern oft Derivatisierungsschritte, große Probenvolumina und spezielle Geräte wie automatisierte Flüssigkeitshandhabung, spezialisierte Homogenisierungsplattformen oder Festphasen-Extraktionssäulen 8,9,10,11. Diese Anforderungen können die Zugänglichkeit und Skalierbarkeit einschränken, insbesondere in Mausstudien, bei denen der Stuhlabtrag pro Tier minimal ist und longitudinale oder genotypspezifische Probenahmen üblichsind. Daher bleibt eine methodische Lücke bei Protokollen, die eine SCFA-Extraktion aus kleinen Fäkaleingängen ohne Derivatisation erlauben und dennoch mit Standard-Gaschromatographie-Workflows kompatibel bleiben.
Das hier beschriebene Protokoll schließt diese Lücke durch die Anwendung einer zweiphasigen Säure-Lösungsmittel-Extraktionsstrategie mit verdünnter Salzsäure und Ethylacetat. Der Arbeitsablauf besteht aus Fäkalhomogenisierung, Säuerung, Partitionierung organischer Lösungsmittel und Zentrifugation bei niedriger Temperatur und ist für den Betrieb mit kleinen fäkalen Eingangsmassen konzipiert. Im Gegensatz zu derivatisierungsbasierten Arbeitsabläufen, die zusätzliche chemische Modifikationsschritte oder spezialisierte Probenvorbereitungsplattformen erfordern, ermöglicht dieses Protokoll die direkte Extraktion von SCFAs in einem Format, das mit routinemäßiger GC-basierter Analyse mit Standardlaborausrüstungkompatibel ist.
Diese Methode ist für Studien gedacht, bei denen SCFA-Extraktion aus begrenzten Mengen Maus-Kotmaterials erforderlich ist, insbesondere wenn individuelle Messungen erforderlich sind oder wenn die Probenverfügbarkeit das experimentelle Design einschränkt. Es eignet sich für GC-basierte Analysen gängiger SCFAs (C2–C6) in Fäkalproben, ist jedoch nicht für Anwendungen konzipiert, die derivatisierungsabhängige Detektion, Ultra-Spurenquantifizierung über die GC-Sensitivität hinaus oder die Bewertung systemischer SCFA-Konzentrationen erfordern.
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Protokoll
Der Ständige Ausschuss für Tiere in Mass General Brigham (MGB), Boston, MA, USA, genehmigte das vorherige Tierprotokoll, das darauf abzielte, die Anzahl der verwendeten Tiere zu minimieren. Dieses Protokoll entspricht den Richtlinien und Vorschriften der National Institutes of Health. Dieses Manuskript wurde gemäß den ARRIVE-Richtlinien erstellt. Das Protokolldiagramm ist in Abbildung 1 dargestellt, und die benötigten Materialien sind in der Materialtabelle aufgeführt.
Abbildung 1: Diagramm des Protokolls. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
1. Kotprobenentnahme und -vorbereitung
- Sammeln Sie frische Fäkalproben (~30 mg) in separaten 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhren. Erfassen Sie die exakte Fäkal-Eingangsmasse jeder Probe, um eine genaue Normalisierung der SCFA-Konzentrationen zu ermöglichen.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Entnahme saubere Ampullen, Handschuhe und Pinzetten für jede Probe enthält. Alle Glaswaren und Instrumente müssen vor der Nutzung autoklaviert werden. Dieses Protokoll wurde für fäkale Eingangsmassen von etwa 20–50 mg pro Probe validiert, wobei ~30 mg als repräsentativer Eingang verwendet werden. Die Extraktionsvolumina bleiben innerhalb dieses Bereichs konstant. - Platzieren und beschriften Sie die erforderliche Anzahl der Zentrifugenfläschchen, die den Proben entsprechen.
- Bereiten Sie verdünnte Salzsäure (0,5 m; pH 1–2) vor, indem Sie langsam konzentriertes HCl (12 M, ACS-Reagenzqualität) zu ultrareinem Wasser hinzufügen.
VORSICHT: HCl ist korrosiv; Sie kann schwere Verbrennungen an Haut, Augen und Atemwegen verursachen. Gefährlich einzuatmen. - Taue die Proben bei Zimmertemperatur 30–45 Minuten auf oder bis sie vollständig aufgetaut sind.
2. Probenhomogenisierung und Versauerung
- Geben Sie 255 μL der 0,5 M HCl-Lösung zu jedem Zentrifugenfläschchen.
- Nimm ein neues Fläschchen und fülle es mit 70 % Ethanol, um es zur Reinigung von Pinzetten zu verwenden. Reinigen Sie die Pinzette, indem Sie sie in das Ethanol tauchen und dann auf einem sauberen Papiertuch trocknen.
VORSICHT: Ethanol ist brennbar und kann Haut und Augen reizen; Das Einatmen von Dämpfen kann Schwindel verursachen. - Richten Sie ein Ethanolbad für die Stößel ein, indem Sie die Stößel in einen Behälter legen und diesen mit 70 % Ethanol füllen, bis alle Stößel vollständig untergetaucht sind.
- Holen Sie die richtige Probe aus der Probenbox. Nimm den Deckel vom Fläschchen und entferne eine Probe (~30 mg) Kot.
- Geben Sie die Fäkalienproben in die entsprechenden Zentrifugenphiolen.
- Sobald alle Proben in die richtigen Zentrifugenfläschchen gelegt sind, entferne einen Stößel aus dem Ethanolbad. Trockne den Stößel mit einem sauberen Papiertuch.
HINWEIS: Verwenden Sie für jede Probe einen neuen Stößel. - Verwenden Sie die Stößel, um die Fäkalienproben richtig zu zerkleinern und aufzulösen, siehe Abbildung 2. Mahlen Sie die Fäkalprobe, bis eine visuell homogene Suspension erhalten ist, ohne sichtbare feste Fragmente.
Abbildung 2: Mahlen von Kotproben mit einem Stößel. Frisch gesammelte Fäkalien werden gemahlen, um eine einheitliche Konsistenz für die SCFA-Analyse zu erreichen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.
- Leg die gebrauchten Stößel in eine leere Schachtel, um sie später zu waschen.
- Wirbeln die Proben mit einem Impuls-Wirbelmixer mit maximaler Geschwindigkeit für 10 Sekunden, wobei die Röhren fest verschlossen sind.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Zentrifugenphiolen fest abgedeckt sind, um ein Verlaufen der Mischung zu verhindern.
3. SCFA-Extraktion und Phasentrennung
- Zentrifugiere die Proben bei 16.000 × g für 10 Minuten bei 4 °C, um eine ordnungsgemäße Ausbalancierung der Zentrifuge sicherzustellen.
- Nach dem Starten der Zentrifuge werden die neuen Zentrifugenphiolen mit den Proben beschriftet. Entfernen Sie die Proben aus der Zentrifuge, sobald die Zentrifugation abgeschlossen ist.
- Stellen Sie die 200-μL-Pipette auf 120 μL ein. Sammelt nach der Zentrifugation vorsichtig 120 μL des wässrigen Überstandsmittels, um eine Störung des Pellets zu vermeiden. Geben Sie das Supernatant in die neu beschrifteten Zentrifugenfläschchen und entsorgen Sie das Pellet.
- Geben Sie eine gleiche Menge (120 μL) Ethylacetat zu den neu gekennzeichneten Fläschchen wie die überlagerte Flüssigkeit. Wiederhole das für alle Proben.
VORSICHT: Ethylacetat ist entflammbar und kann Haut, Augen und Atemwege reizen. Vermeiden Sie das Einatmen von Dämpfen und längerem Kontakt. - Bringen Sie die Proben erneut zur Zentrifuge. Stellen Sie sicher, dass die Zentrifuge richtig ausbalanciert ist und der Rotordeckel sicher ist. Drehen Sie mit 2.374 × g für 20 Minuten bei 4 °C.
- Nach der Zentrifugation werden vorsichtig 120 μL der oberen organischen Phase aufgenommen, ohne die untere wässrige Phase zu stören. Übertragen Sie das extrahierte, SCFA-haltige Supernatant in neue, beschriftete Zentrifugenfläschchen.
HINWEIS: Das gesammelte Volumen kann weniger als 120 μL betragen. Wenn an der Grenzfläche eine Emulsion vorhanden ist, verlängern Sie die Zentrifugation oder kühlen Sie die Proben auf Eis, bis eine klare Phasentrennung erreicht ist. Prozedurale Leerproben, die parallel ohne Fäkalien verarbeitet werden, können als optionaler Qualitätskontrollschritt zur Bewertung der Hintergrundwerte von SCFAs durch Reagenzien oder Handhabung eingebaut werden. - Untersuchen Sie frühere Fläschchen, um sicherzustellen, dass die untere Schicht nicht versehentlich aufgezogen wurde.
HINWEIS: Schritte zur Säurezugabe und zur Behandlung organischer Lösungsmittel sollten schnell durchgeführt werden, wobei die Röhren wann immer möglich verschlossen bleiben, um Verdampfungs- oder Verdampfungsverluste zu minimieren.
4. Handhabung und Lagerung von Extrakten
- Finde und beschrifte eine Extraktionsbox richtig und lege die extrahierten Proben hinein.
HINWEIS: Proben können nach der Entnahme der organischen Phase sicher pausiert werden, indem die Extrakte bei bis zu 24 Stunden bei −20 °C in eng verschlossenen Röhren gelagert und dann auf −80 °C für längere Lagerung übertragen werden. - Stellen Sie die Box in einen -80 °C Gefrierfach, um auf die SCFA-Analyse zu warten.
HINWEIS: Da sowohl Ethylacetat als auch SCFA hochflüchtig sind, sollten extrahierte Proben nach der Lagerung bei −80 °C umgehend analysiert werden. Eine verlängerte Langzeitspeicherung kann die Integrität der Proben beeinträchtigen.
5. Gaschromatographie-Analyse
- Analysieren Sie die extrahierten SCFAs mittels GC mit einer Kapillarsäule aus Silikondioxid und einer stationären Phase mit freien Fettsäuren bei Durchflussraten von 30, 300 und 20 mL/min für Wasserstoff, Luft und Stickstoff. Injizieren Sie einen 1 μL Aliquot des organischen Extrakts zur Analyse.
- Für quantitative Anwendungen integrieren Sie interne Standards und Kalibrierungsverfahren (z. B. 2-Ethylbuttersäure), wie zuvor beschrieben2.
HINWEIS: Detaillierte instrumentenspezifische Einstellungen sind in den referenzierten Methoden14 bereitgestellt.
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Ergebnisse
Das obige Protokoll hat extrahierte SCFA-Aliquoten von 120 μL ergeben, die der Anzahl der Fäkalproben entsprechen, aus denen sie gewonnen wurden. Die erfolgreiche Ausführung des Extraktionsprotokolls wird durch das Vorhandensein klar aufgelöster SCFA-Spitzen zu charakteristischen Retentionszeiten mit Signalintensität über dem Hintergrundrauschen angezeigt. Wenn das Protokoll wie beschrieben durchgeführt wird, liefert es fäkale SCFA-Profile, die für den quantitativen Vergleich über Proben...
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Diskussion
Dieses Protokoll enthält mehrere kritische Schritte, die eine effiziente und reproduzierbare Extraktion von SCFAs aus kleinvolumigen Mauskotproben gewährleisten. Das Protokoll verwendet ein zweiphasiges Säure-Lösungsmittel-Extraktionssystem mit definierten Volumina verdünnter Salzsäure und Ethylacetat, das auf die physikochemischen Eigenschaften von SCFAs als niedrigmolekulare, schwache organische Säuren zugeschnitten ist. Die Versauerung verlagert SCFAs in ihre protonierte Form, reduzie...
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Offenlegungen
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.
Danksagungen
Wir danken Ihnen dankbar für die finanzielle Unterstützung dieser Studie, die von den National Institutes of Health durch R21AG065606 und R21AG08176 an Yiying Zhang vergeben wurde, sowie durch die Unterstützung der Borten Family Foundation und der Tang-Familienspende an Yiying Zhang.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Zentrifuge | ThermoFisher | 75003424 | "Sorvall Legend Micro 21R Mikrozentrifuge" |
| Zentrifugengefäße | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Mikrotuben-Rack | Millipore Sigma | HS29025F-5EA | |
| Ethylacetat | ThermoFisher | 022912.K2 | HPLC-Qualität, ≥99,5% |
| Grüne Stößel | Fisher Scientific | 50-189-9195 | |
| HCl | Fisher Scientific | SA49 | ACS-zertifiziert (10 N, Stammlösung); auf 0,5 M für die Verwendung verdünnt |
| 1000 μL Pipette | USA Scientific | 7110-1000 | |
| 1000 μL Pipettenspitzen | USA Scientific | 1111-2821 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP82011 | Molekularbiologie-Qualität, 70% Lösung |
| 200 μL Pipette | USA Scientific | 7100-2200 | |
| 200 μL Pipettenspitzen | USA Scientific | 1110-1800 | |
| Pinzette | ThermoFisher | 046638.KT | |
| Vortex | Fisher scientific | 50-136-7909 | "Research Products International Corp VORNADO Miniature Vortex Mixer, Purple Cup" |
Referenzen
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- Sun, Y., et al. PYY-mediated appetite control and obesity alleviation through short-chain fatty acid-driven gut-brain axis modulation by Lacticaseibacillus rhamnosus HF01 isolated from Qula. J Dairy Sci. 108 (8), 7960-7978 (2025).
- He, J., et al. Short-chain fatty acids and their association with signalling pathways in inflammation, glucose and lipid metabolism. Int J Mol Sci. 21 (17), 6356(2020).
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- Kim, K. S., Lee, Y., Chae, W., Cho, J. Y. An improved method to quantify short-chain fatty acids in biological samples using gas chromatography-mass spectrometry. Metabolites. 12 (6), 525(2022).
- Ueyama, J., et al. Freeze-drying enables homogeneous and stable sample preparation for determination of fecal short-chain fatty acids. Anal Biochem. 589, 113508(2020).
- Papanicolas, L. E., et al. Bacterial viability in faecal transplants: which bacteria survive. EBioMedicine. 41, 509-516 (2019).
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- Zhao, G., Nyman, M., Jönsson, J. A. Rapid determination of short-chain fatty acids in colonic contents and faeces of humans and rats by acidified water-extraction and direct-injection gas chromatography. Biomed Chromatogr. 20 (8), 674-682 (2006).
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