Funktionelle Beurteilung der Maus-Gingival-Epithelbarriere mit fluoreszierenden Traceren

Summary

Ziel dieses Protokolls ist es, einen standardisierten Ansatz zur quantitativen Bewertung der Integrität der murinen gingivalen Epithelbarriere zu bieten, indem fluoreszenzmarkierte Dextrans unterschiedlicher Molekülgröße in vivo auf die Gingivaloberfläche topisch aufgetragen werden, gefolgt von einer ex-vivo-Bildgebung mit einem Einzelphotonenmikroskopiesystem.

Abstract

Die gingivale Epithelbarriere dient als entscheidende Frontabwehr für die orale Immunität und Homöostase. Eine intakte Epithelbarriere verhindert effektiv das Eindringen schädlicher Stoffe aus der oralen Umgebung, während ihre Störung eng mit der Pathogenese von Erkrankungen wie Parodontitis und oralem Lichen planus verbunden ist. Hier haben wir eine topische, anwendungsbasierte Methode entwickelt, um die Integrität der gingivalen Epithelbarriere bei Mäusen zu bewerten. Zunächst wurde eine Mischung aus fluoreszierend markierten Dextrans mit unterschiedlichen Molekulargewichten (40 oder 70 kDa) in einem 2%igen Natriumcarboxymethylcellulose topisch auf die labiale Zahnfleischoberfläche des Molarbereichs aufgetragen. Nach einer 30-minütigen Inkubationszeit wurde der Oberkiefer dissektioniert und in einem maßgeschneiderten Halter für die sofortige Bildgebung mit einem Einzelphotonenmikroskopiesystem fixiert. Dieser Ansatz ermöglicht die Visualisierung und Quantifizierung von Traceren unterschiedlicher Größe über die Epithelschichten hinweg und liefert eine funktionale Anzeige der integrität der gingivalen Epithelbarriere, die für Studien zu oraler Entzündung, Wundheilung und Krankheitsmodellierung anwendbar ist.

Introduction

Die gingivale Epithelbarriere bildet eine kritische Abwehrgrenze in der Mundhöhle, die die Gewebeintegrität bewahrt, indem sie den Stofftransport selektiv reguliert und gleichzeitig eine mikrobielle Invasion^{verhindert 1}. Diese dynamische Struktur besteht aus geschichtetem Plattenepithel, das durch enge Übergangskomplexe miteinander verbunden ist, und steuert präzise die parazelluläre Permeabilität, um das nicht-selektive Durchdringen von Mikroorganismen, Makromolekülen und gelösten Stoffen^{einzuschränken 2}. Mehrere Faktoren können die Integrität der Zahnfleischbarriere beeinträchtigen. Die Mundhöhle beherbergt die zweitvielfältigste mikrobielle Gemeinschaft im menschlichen Körper, mit über 700 Bakterienarten, die Zahnoberflächen, Zahnfleischspalten und Mundschleimhaut^besiedeln. Die Epithelzellen, die das Zahnfleischgewebe auskleiden, sind dieser dichten mikrobiellen^Umgebung dauerhaft ausgesetzt.

Virulenzfaktoren, die von parodontalen Krankheitserregern (z. B. Porphyromonas gingivalis), einschließlich Lipopolysaccharide, ausgeschieden werden, haben gezeigt, dass sie die Funktion der Epithelbarriere stören, wodurch entzündliche Reaktionen im Zahnfleischgewebe ausgelöst und das pathologische Fortschreiten ^6,7 vorangetrieben^werden. Entzündungsmediatoren und mechanische Stressoren verschlimmern die Barrieredysfunktion weiter und erhöhen die Anfälligkeit für orale Erkrankungen⁸. Orale Probiotika können helfen, Parodontalerkrankungen vorzubeugen, indem sie die Stabilität der gingivalen Epithelbarriere fördern. Dennoch bleiben die biologischen Wechselwirkungen zwischen Mikroorganismen und gingivalen Epithelzellen bei der Modulation der Barrierefunktion weitgehend^{unaufgeklärt}. Daher ist die Entwicklung zuverlässiger Methoden zur Bewertung der Funktion der epithelialen Barriere von größter Bedeutung.

Die Einzelphotonen-Laser-Rastermikroskopie, bekannt für ihre hohe Auflösung und ihr etabliertes Detektionssystem, hat sich besonders wertvoll für die Untersuchung ex vivo Gewebeproben^{erwiesen 10}. Fortschrittliche bildgebende Methoden verbessern die Bewertung der Eigenschaften der Zahnfleischbarriere erheblich. Die oberflächliche Natur des Zahnfleischgewebes, mit Epithelzellen etwa 100 μm von der Oberfläche entfernt, macht es ideal für solche Bildgebungsmethoden. Unsere Forschung hat eine ex-vivo-Bewertungstechnik etabliert, bei der fluoreszenzmarkierte Dextrans unterschiedlicher Molekulargewichte als parazelluläre Permeabilitätstracer verwendet werden. In Kombination mit einer Einzelphotonen-Lasermikroskopie ermöglicht diese Methode eine genaue Quantifizierung der Funktion der gingivalen Epithelbarriere und liefert Einblicke in die Mechanismen der Parodontalerkrankungen und mögliche therapeutische Interventionen.

Das in dieser Studie etablierte Protokoll, das lokalisierte gelbasierte Tracer-Abgabe mit dreidimensionaler ex-vivo-Bildgebung kombiniert, ist speziell darauf optimiert, die besonderen Herausforderungen bei der Bewertung der gingivalen Epithelbarriere zu adressieren. Erstens sind bestehende intravenöse Tracer-Injektionsansätze (Tabelle 1) nicht in der Lage, die Permeabilität lokalisierter winziger Epithelstellen für externe Substanzen¹¹ präzise zu bewerten. Zweitens erfordern traditionelle histologische Ansätze Entkalkung und Schnitte, was die Gewebearchitektur stört und arbeitsintensiv sowie zeitaufwendig ist 12,13,14. Im Gegensatz dazu verwendet unser Protokoll ein hochadhäsives Gel, um eine effektive Tracer-Retention auf der komplexen lokalen Oberfläche zu erreichen. Darüber hinaus wird durch ein 3D-Bild eine präzise, nicht-destruktive Quantifizierung der Tiefe und Verteilung der Tracer-Penetration im Zahnfleischepithel gewährleistet und so die räumliche Architektur des Gewebes vollständig erhalten. Daher eignet sich diese Methode besonders gut für die hochauflösende raumzeitliche Beurteilung der Funktion der gingivalen epithelialen Barrieren innerhalb der komplexen und geschlossenen oralen Umgebung.

Protocol

Alle experimentellen Verfahren wurden vom Ethikausschuss für Tierforschung des Gesundheitswissenschaftszentrums der Peking-Universität genehmigt und entsprachen dem Leitfaden zur Pflege und Nutzung von Labortieren (NIH Publication Nr. 85-23, überarbeitet 1996). Während des Prozesses wurden die Versuchstiere sorgfältig behandelt, um ihre Schmerzen und Unbehagen zu minimieren.

Die Details jedes Arbeitsschritts zur in-vivo-Permeabilitätsbewertung im Maus-Gingivalepithel sind unten beschrieben (Abbildung 1A). Hier haben wir ein Beispiel für den Nachweis der epithelialen Barrierfunktion sowohl in Ligations- als auch in Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis)-induzierten Mausparodontitis-Modellen gegeben. Alle Mitarbeiter erhielten umfassende Schulungen im Labortierschutz und aseptischer Technik.

1. Umgang mit Tieren

1. Während der gesamten Studie werden Haustiere unter standardisierten, spezifischen, pathogenfreien Bedingungen (SPF) mit einem 12-Stunden-Licht-/Dunkelzyklus eingesetzt und liefern Nahrung und Wasser ad libitum.
2. Herstellung und Verabreichung von Anästhetika und Tracern
   1. Sterile Bedingungen während des gesamten Protokolls aufrechterhalten und Werkzeuge verwenden, die mit 75 % Ethanol gereinigt werden.
   2. Verwenden Sie für das Experiment männliche Wildtyp-Mäuse (WT) C57BL/6J in der reifen Erwachsenenaltersgruppe von 8 bis 10 Wochen. Die Mäuse werden in drei Gruppen unterteilt: eine Kontrollgruppe (unbehandelt) und zwei experimentelle Gruppen (Ligations- und P. gingivalis-induzierte Mausparodontitis-Modelle).
      HINWEIS: In der Gruppierung sollten Mäuse mit ähnlichem Körpergewicht und ähnlichem Wochenalter ausgewählt werden, um den Einfluss von Alter und Gewicht auf die Durchlässigkeit des Zahnfleischepithels zu verringern. Ligationsinduzierte und P. gingivalis-induzierte Mausparodontitis-Modelle sind häufig verwendete Mausmodelle der Parodontitis. Für detaillierte Modellierungsprotokolle siehe die Literatur zu ligationsinduzierten¹⁵- und P. gingivalis-induzierten 16-Mausparodontitis-Modellen.
   3. Wählen Sie fluoreszierende Tracer mit nicht überlappenden Spektren, wie zum Beispiel FITC-markierte Dextran (40 kDa; FD40) und Rhodamin B-markierten Dextran (70 kDa; RD70), um eine separate Signalerkennung mit entsprechenden FITC- und Rhodaminfiltern sicherzustellen.
   4. Verdünne die Tracer. Um diesem Protokoll zu folgen, mischen Sie FD40 (1 g/L) und RD70 (1 g/L) in ein 2%iges Carboxymethylcellulose-Gel und lagern Sie bei 4 °C.
   5. Intraperitoneal injizieren Sie 1,25 % Tribromoethanol (200 mg/kg Körpergewicht, 15–17 μL/g Körpergewicht), um die Mäuse zu betäuben.
      HINWEIS: Tribromoethanol-Lösungen sind lichtempfindlich. Tert-Amylalkohol ist ein brennbares, flüchtiges und reizendes organisches Lösungsmittel. Alle Verfahren zur Vorbereitung, Handhabung und Verabreichung müssen in einer chemischen Abzugshaube oder einem äußerst gut belüfteten Bereich durchgeführt werden, der ausschließlich von jeglichen Zündquellen ferngehalten ist. Das Personal muss geeignete persönliche Schutzausrüstung (PSA) tragen, darunter Handschuhe, chemische Spritzschutzbrillen und einen Laborkittel. Abfallentsorgung: Abfall-Tribromoethanol-Lösung, Tert-Amylalkohol und alle kontaminierten Materialien (z. B. Spritzen, Pipettenspitzen, Handschuhe) müssen gesammelt und als gefährlicher chemischer Abfall in strikter Übereinstimmung mit den Umweltschutzvorschriften und Protokollen Ihrer Institution für brennbare und giftige Chemikalien entsorgt werden.
3. Während der Anästhesie halten Sie die Körperkerntemperatur bei 37 ± 0,5 °C mit einem rückkopplungsgesteuerten Heizkissen. Tragen Sie Erythromycin-Augensalbe auf, um das Austrocknen der Hornhaut zu verhindern.
   HINWEIS: Gewährleisten Sie während der gesamten Studie eine angemessene Pflege für alle Tiere.
4. Nach den chirurgischen Eingriffen sollten die Tiere einzeln auf weicher Einstreu in einem warmen, ruhigen Erholungskäfig untergebracht werden, bis sie vollständig gehfähig sind. Überwachen Sie die Tiere zweimal täglich für 48 Stunden und führen Sie sie erst nach vollständiger Genesung wieder in ihren Stammkäfig ein, basierend auf normaler Haltung, Aktivität und Futterverhalten.
5. Halte die Mundhöhle mit einem Mundknebel offen und trage eine 5 μL bis 50 μL Mischung aus zwei oder mehr parazellulären Permeabilitätstracern mit unterschiedlichen Molekülgewichten topisch auf die labiale Zahnfleischoberfläche der Molarregion auf (Abbildung 1B). Lass sie 30 Minuten gehen. Wenn das Tier die Mischung schluckt, tragen Sie sie erneut auf.
6. Isolierung des Oberkiefers
   1. Nach 30 Minuten Anwendung von Permeabilitätstracern werden die Mäuse auf Karton fixiert, in Rückenlage gelegt und ihre Gliedmaßen mit Tape befestigt.
   2. Nach der Fixierung öffnen Sie die Mundhöhle, um das Oberkiefer zu isolieren. Beseitigen Sie vorsichtig das umliegende Gewebe und spülen Sie die Probe gründlich mit PBS.
   3. Setzen Sie das Oberkiefer auf eine Glasfolie, wobei Modellierton auf beiden Seiten angebracht wird, um die sichere Anbringung eines Überdecks über der Probe zu erleichtern.

2. Einphotonenmikroskop-Aufbau

1. Positionieren Sie die dissektionierte Mausmaxilla vorsichtig auf den speziell entworfenen Probenhalter, um eine stabile Platzierung für die Bildgebung sicherzustellen.
2. Nehmen Sie Bilder mit einem aufrechten Einzelphotonenmikroskop auf, das mit einem 25×/NA 1.0 Wasserimmersionsobjektiv ausgestattet ist und sich auf den montierten Stützbereich unter dem Oberkiefer konzentriert.
   HINWEIS: Fluoreszenzsignale sollten unmittelbar nach dem Entfernen des Tracer-Gels sichtbar sein.

3. Maxilla-Bildgebung

1. Beginnen Sie sofort mit der Bildnahme, nachdem Sie die Interessenregion an der Mundoberfläche des zweiten Molars im Oberkiefer ausgewählt haben.
2. Nehmen Sie Z-Stack-Bilder mit einer Schrittweite von 1 μm auf, beginnend mit der Zahnfleischfläche im Oberkiefer bis zu einer Tiefe von 100–200 μm, für eine dreidimensionale (3D) Rekonstruktion.
3. Führen Sie Z-Serien-Bildgebung durch, um die Permeabilität der Epithelbarriere im Oberkier zu bewerten. Konfigurieren Sie die Softwareparameter in der referenzierten Software wie folgt:
   1. Im Dateimenü erstellen Sie einen neuen Ordner und weisen Sie dem Datensatz einen beschreibenden Namen zu.
   2. Unter dem Reiter Erwerbung stellen Sie das XY-Format auf 512 × 512 mit einer Auflösung von 0,99 μm/Pixel ein.
   3. Setze den Zoom-Faktor auf 1.
   4. Stellen Sie die Anregungswellenlängen auf 488 nm (FD40) und 561 nm (RD70) ein, mit Emissionsfenstern von 500–550 nm bzw. 570–620 nm.
      HINWEIS: Die Verstärkungswerte wurden auf 50 (488 nm) bzw. 60 (561 nm) gesetzt.
   5. Für Z-Serie und 3D-Bildgebung wählen Sie den ND-Aufnahmemodus. Stelle den Z-Schritt auf 1 μm ein (nach Bedarf anpassen).
4. Sobald die Parameter konfiguriert sind, wählen Sie den Live-Modus , um den gingivalen Bereich sowohl in einzelnen als auch in verschmolzenen Fluoreszenzkanälen innerhalb des Bildgebungsfensters sichtbar zu machen.
5. Klicken Sie auf Jetzt ausführen , um die Erfassung nach der Parameterkonfiguration zu starten.

4. Durchlässigkeitsmessung

1. Teile die Fluoreszenzintensität von FD40 und RD70 in verschiedene Kanäle auf. Hintergrundsubtraktion ist nicht erforderlich; die Z-Achsen-Schnitte zusammenführen. Anschließend verwenden Sie die ImageJ-Software, um die Fluoreszenzintensität zu berechnen, die Permeabilität zu bewerten und die Funktion der Epithelbarriere anzuzeigen.
   1. Klicken Sie auf Datei und wählen Sie Öffnen, um das Oberkieferbild zu öffnen, das unter dem Einzelphotonenmikroskop aufgenommen wurde.
   2. Gehe ins Bildmenü und ändere den Bildtyp auf 8-Bit-Format zur Analyse.
      HINWEIS: Bilder, die von Fluoreszenzmikroskopen und konfokalen Systemen aufgenommen werden, sind in der Regel im RGB-Format und können nicht direkt zur Messung der Fluoreszenzintensität verwendet werden. Sie müssen in einzelne Kanäle aufgeteilt werden oder monochrome Bilder sollten direkt importiert werden.
   3. Öffnen Sie das Menü Analysieren , wählen Sie Messungen setzen und prüfen Sie Fläche, Mittel und IntDen. Bestätigen Sie, indem Sie auf OK klicken.
   4. Wählen Sie den zu analysierenden Kanal aus und passen Sie den Schwellenwert an: Gehen Sie zu Bild | Anpassen | Schwelle. Das System wendet automatisch einen Standardwert und einen Algorithmus an, wobei typischerweise Rot verwendet wird, um ausgewählte Regionen anzuzeigen.
      HINWEIS: Da fluoreszierende Bilder typischerweise schwarze Hintergründe zeigen, wählen Sie auch die Option Dunkler Hintergrund .
   5. Messparameter festlegen: Gehe zu Analysieren und wähle Messungen festlegen. Im Dialogfeld aktivieren Sie den Mittelgrauwert und die Begrenzung des Schwellenwerts. Zum Schluss klicken Sie auf OK.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, das Display-Label zu überprüfen, damit der Bildname in der Ergebnistabelle erscheint, was die Identifizierung der experimentellen Gruppe erleichtert.
   6. Messung ausführen: Wählen Sie das Werkzeug für Freihandauswahl. Verwenden Sie den Cursor, um manuell und präzise die Umrisse des fluoreszierenden Signalbereichs auf der Zahnfleischseite nachzuzeichnen. Klicken Sie auf Analysieren | Messen. Die Ergebnistabelle erscheint, wobei IntDen die Fluoreszenzintensität darstellt.
2. Kopiere die Ergebnisse in eine Tabelle für Berechnungen und importiere sie für die Grafikzeichnung.
3. Berechnung der relativen Fluoreszenzintensität: Zuerst berechnen Sie die mittlere Fluoreszenzintensität der Kontrollgruppe. Dann teilt man den Wert der Fluoreszenzintensität jeder experimentellen Gruppe durch den Mittelwert der Kontrollgruppe, um die relative Fluoreszenzintensität zu erhalten.

Results

Nach dem standardisierten Protokoll wurde die Mausmaxilla, die das Zahnfleischgewebe enthielt, auf einem speziell entworfenen Halter montiert (Abbildung 1C). Die mikroskopische Untersuchung zeigte grüne (FD40) und rote (FD70) Fluoreszenzsignale im Gingiva, was eine Tracer-Durchdringung über die Epithelbarriere zeigte. Nach der Identifizierung des Interessenbereichs unter der Okularlinse wurden mit der Software Bilder aufgenommen. In der Kontrollgruppe waren ...

Discussion

Das Zahnfleischepithel dient als wesentliche physische Barriere gegen bakterielle Invasion, während orale Mikroorganismen eine doppelte Regulierungsfähigkeit aufweisen, indem sie entweder die Barriereintegrität durch Virulenzfaktoren stören oder deren Erhaltung fördern. Diese biologischen Wechselwirkungen bestimmen letztlich die Gewebehomöostase oder den Krankheitsverlauf^17,18. Aufbauend auf dieser Grundlage entwickelten wir eine...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
40 kDa FITC-markiertes Dextran	Sigma Aldrich	78331
70 kDa Rhodamin B-markiertes Dextran	Sigma Aldrich	R9379
Nickel zur stumpfen Gewebetrennung	Bejinghuabo Company	NZW28
Carboxymethylcellulose	MREDA	M049898
Einweg-Sterilspritze	Zhiyu Company		1 mL
ImageJ-Software	National Institutes of Health
Mikrotuben	Axygen	MCT-150-C	1,5 mL
NIS-Elements AR Bildsoftware	Nikon
Phosphat gepufferte Kochsalzlösung 1x	Servicebio	G4207-500
Einzelphotonenmikroskop Nikon A1 MP+	Nikon
Gewebezange	Bejinghuabo Company	M286-05