Tanshinon-IIA-vermittelte Abschwächung der postinfarkten Myokardialfibrose durch IL-33/ST-2-Signalveränderungen im epikardialen Fettgewebe der Ratten

Zusammenfassung

Diese Studie zeigt, dass Tanshinon IIA (Tan IIA) eine postmyokardiale Infarktfibrose mildert, wahrscheinlich durch IL-33/ST2-Modulation, wie in Tiermodellen und molekularem Andocken gezeigt und durch ELISA und Western Blot validiert wurde.

Zusammenfassung

Myokardinfarkt (MI), eine schwere Form der koronaren Herzkrankheit, führt häufig zu Myokardfibrose, einem Hauptverursacher für Herzfunktionsstörungen und Herzinsuffizienz. Epikardiales Fettgewebe (EAT) wird zunehmend durch zytokinvermittelte Modulation der Herzfunktion in die kardiovaskuläre Pathologie einbezogen. Tanshinon IIA (TanIIA), eine lipophile Verbindung aus Salvia miltiorrhiza, weist entzündungshemmende, antioxidative und antifibrotische Eigenschaften auf. Diese Studie zielte darauf ab, das therapeutische Potenzial von TanIIA bei der Abschwächung der myokardialen Fibrose nach dem MI zu evaluieren und die zugrunde liegenden Mechanismen mit einem integrativen Ansatz zu erforschen, der in vivo-Experimente und in silico-Analysen kombiniert. Ein Maus-MI-Modell wurde etabliert, und molekulare Andockung wurde eingesetzt, um die Bindung von TanIIA an Schlüsselkomponenten des interleukin-33/wachstumsstimulierenden Gen-2-Signalwegs (IL-33/ST2) zu untersuchen. Unsere Ergebnisse zeigten, dass die Behandlung mit TanIIA die Herzfunktion signifikant verbesserte, histologische Schäden reduzierte und Myokardialfibrose milderte, ebenso wie die Serumspiegel des N-terminalen pro-Gehirn-natriuretischen Peptids (NT-proBNP) und des hochsensitiven kardialen Troponins I (hs-cTnI). TanIIA dämpfte außerdem entzündliche Reaktionen und oxidativen Stress im Serum, Myokard und EAT. Mechanistisch senkte TanIIA die Expression von IL-33 und ST2, unterdrückte den myeloideschen Differenzierungsfaktor 88 (MyD88)/Nuklearfaktor kappa-B (NF-κB)-Weg und reduzierte die Spiegel des transformierenden Wachstumsfaktor-β1 (TGF-β1). In-silico-Analysen zeigten weiter, dass TanIIA starke Bindungsaffinitäten für IL-33, ST2, MyD88 und NF-κB p65 aufwies, wobei die stabilste Interaktion für ST2 vorhergesagt wurde. Zusammen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass TanIIA MI-induzierte Myokardfibrose lindert, indem es EAT-assoziierte Entzündungen und oxidativen Stress moduliert, möglicherweise durch Multi-Target-Hemmung der IL-33/ST2-Achse. Diese Ergebnisse unterstützen TanIIA als vielversprechenden therapeutischen Kandidaten für die Behandlung der myokardialen Fibrose nach dem Infarkt.

Einleitung

Myokardinfarkt, pathologisch definiert als Tod eines Kardiomyozyten infolge einer langanhaltenden Ischämie, bleibt ein lebensbedrohliches kardiovaskuläres Ereignis¹. Trotz bedeutender Fortschritte bei Reperfusionsstrategien und Pharmakotherapie bleibt MI weltweit eine führende Ursache für Morbidität und Mortalität 2,3,4,5,6. Eine zentrale pathophysiologische Folge von MI ist Myokardialfibrose, die übermäßige Ablagerung extrazellulärer Matrixproteine, die ein wesentlicher Faktor für nachfolgende unerwünschte klinische Ergebnisse^ist. Diese fibrotische Narbenbildung ist zwar für die Verhinderung eines Ventrikelwandrisses unerlässlich, wird aber oft zu einem maladaptiven Reparaturprozess, der durch komplexe entzündliche und interzelluläre Signalwege 5,7,8,9,10 eingeleitet wird. Durch den Ersatz des funktionellen Myokards durch nicht-kontraktiles Narbengewebe führt maladaptive Fibrose zu erhöhter Ventrikelsteifheit, fortschreitender Herzfunktionsstörung und letztlich Herzinsuffizienz ^9,11. Daher ist die Untersuchung neuartiger pharmakologischer Behandlungen, die gezielt auf Postinfarkt-Fibrose abzielen und diese abschwächen, ein entscheidendes therapeutisches Ziel zur Verbesserung der langfristigen Morbidität und Mortalität von Patienten.

Salvia miltiorrhiza (Danshen), eine traditionelle chinesische Medizin, und ihre verschiedenen Präparate werden häufig zur Behandlung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen eingesetzt. Tanshinon IIA, sein Hauptbestandteil der lipophilen Substanz, wird mit mehreren kardioprotektiven Eigenschaften versehen, darunter anti-atherosklerotische, antikardiale ischämische und antioxidative Effekte 12,13,14,15. Mechanistisch übt TanIIA seine entzündungshemmenden und fibrotischen Effekte aus, indem es verschiedene Signalwege moduliert: 13,14,15,16,17. Bemerkenswert ist, dass TanIIA direkt Adipozyten anvisiert, deren Entzündungsreaktionen unterdrückt und so die zelluläre Dysfunktion¹⁸ lindert. Ob diese schützenden Effekte von TanIIA sich jedoch auf das epikardiale Fettgewebe auswirken, bleibt jedoch noch zu klären.

Das epikardiale Fettgewebe, ein einzigartiges viszerales Fettdepot, ist stark an der Pathogenese der koronaren Herzkrankheit (CAD), Vorhofflimmern (AF) und Herzinsuffizienz beteiligt. Anatomisch zwischen dem Myokard und der viszeralen Schicht des Epikards gelegen, ohne eine dazwischenliegende Faszienschicht, erleichtert EAT die direkte parakrine Kommunikation mit den benachbarten Herzstrukturen ^19,20,21,22. In seinem physiologischen Zustand ist EAT kardioptektiv, unterstützt den Stoffwechsel und setzt entzündungshemmende sowie antioxidative Adipokine^frei. Umgekehrt wird EAT während pathologischer Erkrankungen zu einer Quelle pro-inflammatoris, pro-oxidativer und pro-fibrotischer Mediatoren, die die unerwünschte Herzremodellierung 27,28,29,30 antreiben. Folglich wurde die Hypothese formuliert, dass TanIIA Myokardialfibrose hemmen kann, indem es Entzündungsreaktionen und oxidativen Stress im Epikardfett abschwächt, möglicherweise über einen neuartigen Signalweg.

Interleukin-33, ein Mitglied der IL-1-Familie der Zytokine³¹, ist für seine starken antihypertrophen und antifibrotischen Eigenschaften im Herz-Kreislauf-System^{bekannt 25}. Seine biologischen Effekte werden durch einen eigenständigen Rezeptorkomplex, ST2, vermittelt, der in zwei Isoformen existiert: einem Transmembranrezeptor (ST2L), der die Signalübertragung initiiert, und einem löslichen Täuschungsrezeptor (sST2), der IL-33³² bindet. Klinisch sind die Serum-sST2-Spiegel nach einem Myokardinfarkt (MI) akut erhöht und dienen als robuster prognostischer Marker für Nebenwirkungen bei Herzinsuffizienz und Myokarditis 33,34,35,36. Die kanonische IL-33/ST2L-Signalkaskade beinhaltet die Rekrutierung des Adaptorproteins MyD88 und die anschließende Aktivierung von TRAF6, was zur Phosphorylierung und Abbau des NF-κB-Inhibitors (IκB) und zur daraus resultierenden Kerntranslokation von NF-κB^37,38 führt. Dieser Weg ist eng mit anderen wichtigen entzündlichen Zytokinen verknüpft; beispielsweise kann IL-33/MyD88-Signalübertragung die Sekretion des entzündungshemmenden Zytokins IL-10³⁹ fördern, während das proinflammatoriske Zytokin TNF-α wiederum die Entzündungsreaktion durch Aktivierung von NF-κB verstärken kann, um die IL-33-Expression ^40,41 zu induzieren. Wichtig ist, dass sowohl IL-33 als auch ST2 im Fettgewebe exprimiert werden, wo angenommen wird, dass sie lokale entzündungshemmende Effekte haben 31,42,43. Ob die kardioprotektiven Effekte von TanIIA die Modulation der IL-33/ST2-Achse beinhalten, bleibt jedoch unerforscht.

Daher wurde die vorliegende Studie darauf ausgelegt, die zentrale Hypothese zu testen, dass TanIIA Myokardialfibrose verhindert, indem es Entzündungen und oxidativen Stress aus dem epikardialen Fettgewebe durch Modulation des IL-33/ST2-Wegs mindert. Konkret haben wir die Hypothese aufgestellt, dass diese therapeutische Wirkung durch die direkte, multizielige Bindung von TanIIA an Schlüsselproteine in dieser Signalkaskade angetrieben wird. Um dies zu bestätigen, haben wir einen doppelten Ansatz gewählt. Zunächst wurde ein Rattenmodell des Myokardinfarkts verwendet, um die Wirksamkeit von TanIIA in vivo bei der Abschwächung unerwünschter Herzremodellierung zu bestätigen. Zweitens, um eine direkte molekulare Grundlage für diese Beobachtungen zu liefern, wurde rechnergestütztes Andocken eingesetzt, um die potenzielle Bindung von TanIIA an vier Schlüsselknoten des Weges – IL-33, ST2, MyD88 und NF-κB p65 – zu charakterisieren. Durch die Untersuchung des Mechanismus von der Gewebeebene bis hin zu spezifischen molekularen Bindungsereignissen zielt diese Studie darauf ab, einen neuartigen mechanistischen Rahmen für die kardioprotektiven Effekte von TanIIA zu etablieren.

Protokoll

Alle experimentellen Verfahren und Tierschutzpraktiken wurden strikt gemäß den Ethischen Vorschriften zur Pflege und Verwendung von Labortieren des Ethischen Tierkomitees der Jiangxi-Universität für Chinesische Medizin durchgeführt (Nr. JZLLSC2023-0702), China.

Molekulare Andocksimulationen
Ein in silico molekulares Andocken wurde angewandt, um direkte Wechselwirkungen zwischen TanIIA und IL-33, ST2L, MyD88 und NF-κB p65 zu untersuchen. Die 3D-Koordinaten von TanIIA wurden aus der PubChem-Datenbank bezogen, und die anfängliche SDF-Datei wurde anschließend in ein PDB-Format umgewandelt. Die Kristallstruktur von IL-33 (PDB ID: 4KC3), ST2L (PDB ID: 4KC3), MyD88 (PDB ID: 7L6W) und NF-κB p65 (PDB ID: 1NFI) stammt aus der Proteindatenbank. Die erste Verarbeitung des Rezeptors erfolgte in PyMOL (v2.3.4), wo Wassermoleküle und ursprüngliche Liganden entfernt wurden, gefolgt von einer weiteren Vorbereitung in AutoDockTools für Wasserstoffzusatz und Ladungszuweisung. Beide Moleküle wurden schließlich in das PDBQT-Format umgewandelt. AutoDock Vina (v1.1.2) wurde verwendet, um die Andocksimulation innerhalb einer definierten Rasterbox im aktiven Standort durchzuführen. Die optimale Bindungspose wurde anhand der niedrigsten Bindungsenergie ausgewählt, und detaillierte Interaktionen wurden mit dem PLIP-Webtool identifiziert. Die endgültige angedockte Konformation wurde mit PyMOL (v2.3.4) visualisiert.

Tiere
Männliche Sprague-Dawley (SD) Ratten, SPF-Klasse, 6 Wochen alt und 200 ± 20g schwer (Zertifikatsnummer SCXK(Su)2023-0009). Die Ratten wurden unter standardisierten Bedingungen gehalten, darunter ein 12-Stunden-Hell-/Dunkelzyklus und eine Temperatur von 22 °C ± 2 °C. Den Tieren wurde während des Experiments unbegrenzter Zugang zu Futter und Wasser gewährt.

Experimentelles Protokoll
Ein Rattenmodell des Myokardinfarkts wurde erstellt, indem die linke vordere absteigende (LAD) Koronararterie gebunden wurde. Schein-operierte Ratten unterzogen sich denselben chirurgischen Eingriffen ohne LAD-Ligation. Kurz gesagt wurden die Ratten mittels intraperitonealer Injektion von 1 % Natriumpentobarbital (50 mg/kg) betäubt, gefolgt von endotrachealer Intubation und Beatmung. Eine linke Thorakotomie wurde durchgeführt, um das Herz freizulegen. Der LAD wurde anschließend mit einer 4-0 nicht absorbierbaren Naht ligiert. Die erfolgreiche MI-Einleitung wurde durch eine ST-Segment-Erhöhung an einem kontinuierlichen Elektrokardiogramm und sichtbares Blanchering der linken ventrikulären Vorderwand bestätigt. Nach der Operation erhielten die Ratten drei Tage lang Cefoxitin-Natrium (200 mg/kg/Tag, I.P.). Vierundzwanzig Stunden nach der Operation wurden die überlebenden Ratten zufällig in sechs Gruppen eingeteilt (n = 10 pro Gruppe):

Scheingruppe: erhielt intraperitoneale Kochsalzinjektionen (1 mL·^kg-1·^Tag-1).

MI-Gruppe: erhielt intraperitoneale Injektionen von Kochsalzlösung (1 mL·^kg-1·^Tag-1).

TanIIA-L-Gruppe (niedrige Dosis): erhielt intraperitoneale Injektionen von TanIIA (7,5 mg·^kg-1·^Tag-1).

TanIIA-M-Gruppe (mittlere Dosis): erhielt intraperitoneale Injektionen von TanIIA (15 mg·^kg-1·^Tag-1).

TanIIA-H Gruppe (hohe Dosis): erhielt intraperitoneale Injektionen von TanIIA (30 mg·^kg-1·^Tag-1).

XST-Gruppe (positive Kontrolle): erhielt orale Gavage von Valsartan (30 mg·^kg-1·^Tag-1·1).

Alle Behandlungen wurden täglich über 28 aufeinanderfolgende Tage durchgeführt. Die Dosen von TanIIA und XST wurden auf Grundlage früherer Studien und unserer vorläufigen, unveröffentlichten Daten^{von 44,45} ausgewählt.

Elektrokardiogramm (EKG) und Echokardiographie
Nach 28 Tagen Behandlung wurde die Herzfunktion mittels transthorakaler Echokardiographie bewertet. Bei 2 % Isofluran-Anästhesie (Bewegungsmodus) wurden M-Mode-Bilder aufgenommen, um die enddiastolischen/systolischen Durchmesser des linken Ventrikulars (LVIDd/s) zu bestimmen. Die linksventrikuläre Auswurffraktion (LVEF) und die fraktionierte Verkürzung (LVFS) wurden anschließend aus einem Durchschnitt von drei aufeinanderfolgenden Herzzyklen berechnet. Zusätzlich wurden vor der Operation, 15 Minuten nach der Ligation und am experimentellen Endpunkt Elektrokardiogramme aufgenommen, um die elektrische Herzaktivität zu überwachen.

Probenahme und 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC)-Färbung
Das Blut aus der Bauchaorta wurde bei 1370 × g für 15 Minuten zentrifugiert, um das Serum zu isolieren, das bei -80 °C gelagert wurde. Herz- und epikardisches Fettgewebe wurden schnell entfernt und gewogen. Für molekulare Analysen wurden EAT- und Infarkt-Grenzzonengewebe in flüssigem Stickstoff gelähmt und bei -80 °C gelagert. Andere Gewebeproben wurden für die histologische Untersuchung in 4 % Paraformaldehyd fixiert. Zusätzlich wurden ausgewählte Herzen bei -20 °C eingefroren, in Schnitte genommen und mit TTC gefärbt, um die Infarktgröße zu beurteilen. Materialien und tierisches Gewebe werden gemäß den Laborsicherheitsvorschriften verwendet und behandelt.

Histologische Untersuchung
Zur histopathologischen Untersuchung wurden Paraffinschnitte einer Hämatoxylin- und Eosin-(H&E)-Färbung unterzogen, um die Myokardmorphologie zu beobachten. Die Masson-Trichromfärbung wurde verwendet, um das Ausmaß der Myokardifibrose und die Größe der Epikardinozyten zu bewerten, wobei der Kollagenvolumenanteil (CVF) quantifiziert wurde. Zusätzlich wurde das Verhältnis von Typ-I- zu Typ-III-Kollagen im nicht infarktierten Bereich durch Picrosirius-Rot-(PSR)-Färbung bestimmt. Alle Abschnitte wurden digital für quantitative Analysen eingescannt.

Immunhistochemie
Paraffin-eingebettete Myokardschnitte wurden deparaffinisiert und rehydriert. Die Antigengewinnung erfolgte mit einem Citratpuffer (pH 6,0). Die Schnitte wurden mit 3 % BSA blockiert und dann über Nacht bei 4 °C mit primären Antikörpern gegen Kollagen I, Kollagen III, IL-33, ST2, MyD88, NF-κB p65 und TGF-β1 inkubiert. Anschließend wurden die Schnitte mit einem HRP-markierten Sekundärantikörper für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Färbung wurde mit DAB visualisiert, und die Kerne wurden mit Hämatoxylin gegenfärbt. Die Bilder wurden mit einem digitalen Scanner aufgenommen und mit Bildanalysesoftware analysiert, um die integrierte optische Dichte (IOD) der positiven Färbung zu quantifizieren.

Enzymgekoppelter Immunsorbent-Test
Die Konzentrationen von hs-cTnI, NT-proBNP, IL-33 und ST2 wurden in Serumproben quantifiziert. Zusätzlich wurden IL-10- und TNF-α-Spiegel in Serum-, Myokardhomogenaten und epikardialen Fettgewebelysaten gemessen. Alle Assays wurden mit kommerziell erhältlichen enzymgebundenen Immunsorbent-Assay-Kits (ELISA) gemäß den Protokollen des Herstellers durchgeführt.

Westliche Blotting
Das Gesamtprotein wurde aus Gewebehomogenaten extrahiert, und die Konzentrationen wurden durch einen Bicinchoninsäure-(BCA)-Test bestimmt. Gleiche Mengen Protein wurden durch Natriumdodecylsulfat–Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) getrennt und auf Polyvinylidenfluorid-(PVDF)-Membranen übertragen. Nach der Blockierung mit 5 % fettarmer Milch wurden die Membranen über Nacht bei 4 °C mit primären Antikörpern gegen IL-10, Tumornekrosefaktor-α (TNF-α), IL-33, ST2, NF-κB p65, TGF-β1 und GAPDH (1:1000) inkubiert. Anschließend wurden die Membranen mit einem HRP-konjugierten sekundären Antikörper (1:5000) inkubiert und mit einem ECL-Reagenz visualisiert. Die Bandintensitäten wurden mit Software quantifiziert, und die Proteinwerte wurden als interne Kontrolle auf GAPDH normalisiert.

Statistische Analyse
Alle statistischen Analysen wurden mit medizinischer Statistiksoftware durchgeführt. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts präsentiert. Für Vergleiche zwischen zwei unabhängigen Gruppen wurde ein t-Test verwendet. Im Fall mehrerer Gruppen wurde entweder eine Einweg- oder eine zweiseitige ANOVA gefolgt von einem Tukey-Post-hoc-Test angewendet. In allen Analysen wurde ein P < 0,05 als statistisch signifikant angesehen.

Ergebnisse

Auswirkungen von TanIIA auf die Herzfunktion bei Ratten mit Myokardinfarkt (Abbildung 1)
Gesundheitszustand und Körpergewichtsveränderungen: Ratten in der MI-Gruppe zeigten einen schlechten allgemeinen Zustand mit Bauchdehnung, während Ratten in den TanIIA-Gruppen einen verbesserten Gesundheitszustand, eine erhöhte Nahrungs- und Wasserzufuhr sowie erhöhte Aktivität zeigten. Nach 4 Wochen wurde bei den Rat...

Diskussion

Die vorliegende Studie untersucht die Auswirkungen von TanIIA auf Myokardifibrose nach einem Myokardinfarkt sowie die zugrunde liegenden Mechanismen. Die Hauptbefunde sind wie folgt: (1) TanIIA schwächt die unerwünschte kardiale Remodellierung ab und verbessert die Herzfunktion durch Hemmung der kardialen Fibrose. (2) Es wurde festgestellt, dass TanIIA Myokardifibrose hemmt, indem es entzündliche Reaktionen und oxidativen Stress im Epikardfett abschwächt. (3) TanIIA vermittelt antifibrot...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
BCA-Proteinquantifizierungs-Kit	Thermo Fisher Corporation	PICPI23223
Katzenset	Shanghai Enzyme Link Biotechnologie	202211202
Kollagen-I-Antikörper	Wuhan Servicebio Biotechnology Co., Ltd	GB114197
Kollagen-III-Antikörper	Shenyang Wanleibio Biotechnology Co., Ltd	WL03186
GAPDH-Antikörper	Cell Signaling Technology Corporation	#5174
GraphPad-Prisma	GraphPad Software Corporation	Version 9.0
GSH-Kit	Shanghai Enzyme Link Biotechnologie	202211131
H& E-Färbungslösung	Beijing Solarbio Technology Co., Ltd	H8070; G1100
HRP-gekennzeichnete Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG-Antikörper	Beijing Solarbio Technology Co., Ltd	SE134
Hs-cTnI  Trikot	Shanghai Yuanjie Biotechnology Co., Ltd	20220808
IL-10-Antikörper	Shenyang Wanleibio Biotechnology Co., Ltd	WL03088
IL-10  Trikot	Shanghai Yuanjie Biotechnology Co., Ltd	202211172
IL-33  Trikot	Shanghai Yuanjie Biotechnology Co., Ltd	202211192
IL-33-Antikörper	Shenyang Wanleibio Biotechnology Co., Ltd	WL04438
ImageJ-Software	Nationale Gesundheitsinstitute	Version Fidschi
Image-Pro	Medienkybernetik, USA	Version 6.0
Männliche Sprague-Dawley (SD) Ratten	Jiangsu Jicui Yaokang Biotechnology Co., Ltd	SCXK(Su)2023-0009
Masson-Färbungsset	Wuhan Bolf Biotechnology Co., Ltd	20221218
MDA-Kit	Shanghai Enzyme Link Biotechnologie	202211171
MyD88-Antikörper	Shenyang Wanleibio Biotechnology Co., Ltd	WL02494
NT-proBNP  Trikot	Shanghai Yuanjie Biotechnology Co., Ltd	20220805
Nuklearfaktor kappa-B (NF-κ B)(p65) Antikörper	Abmart Corporation	TP56372
Öffne Babel	Open-Source-Cheminformatics-Toolkit-Projekt	Version 2.3.2
Polyvinylidenfluorid-(PVDF)-Membranen	Merck Millipore	R9M2784
PSR-Lösung	Beijing Solarbio Technology Co., Ltd	G1472
SOD-Kit	Shanghai Enzyme Link Biotechnologie	202211201
ST2-Antikörper	Proteintech Group Corporation	11920-1-AP
ST2-Bausatz	Shanghai Yuanjie Biotechnology Co., Ltd	202211183
Statistische Produkt- und Dienstleistungslösungen (SPSS)	IBM Corporation	Version 26.0
Sulfotanshinon-Natriuminjektion	Shanghai Pharmaceutical First Biochemical Pharmaceutical Co., Ltd	2012303
Superempfindliches ECL-Lumineszenzreagenz	Dalian Meilun Biotechnology Co., Ltd	MA0186
TGF-β 1 Antikörper	ABclonal Corporation	A2124
Titanvin Valsartan Kapsel	Hunan Qianjin Xiangjiang Pharmaceutical Co., Ltd	211120
TNF-α   Trikot	Shanghai Yuanjie Biotechnology Co., Ltd	202211202
TNF-α Antikörper	Shenyang Wanleibio Biotechnology Co., Ltd	WL01581
TTC-Lösung	Fuzhou Phygene Biotechnology Co., Ltd	20210620
Ultrahochauflösendes Ultraschallbildsystem für kleine Tiere	VEVOcompany	Vevo 2100