Protokoll zur Untersuchung der Honokiol-Regulation der transformierenden Wachstumsfaktor-Beta-1/SMAD-Signalgebung in ultraviolett A-induzierten Haut-Photoaging-Modellen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll untersucht, ob Honokiol die UVA-induzierte Fotoalterung in menschlichen dermalen Fibroblasten und Maushaut verbessert, indem es den TGF-β1/Smad-Weg aktiviert und die MMP-Expression reduziert.

Zusammenfassung

Honokiol (HNK), ein Schlüsselbestandteil aus Magnolia officinalis, hat das Potenzial, Hauterkrankungen zu behandeln. Derzeit sind die Auswirkungen und der Wirkmechanismus von HNK auf ultraviolette A (UVA)-induzierte Photoschäden in der Haut unklar. Ein photoalterndes Schadensmodell von HDF-Zellen und haarloser Maushaut wurde mittels UVA-Induktion konstruiert. Der Einfluss von HNK auf die Lebensfähigkeit normaler HDF-Zellen und UVA-induzierter HDF-Zellen wurde durch den Zellviabilitätstest untersucht. Die SOD-, GSH-, CAT- und MDA-Werte in HDF-Zellen wurden mit verschiedenen Sets gemessen, und die ROS-Werte wurden mit DCFH-DA und Dihydroethidium gemessen. SA-β-Galaktosidase- und TUNEL-Färbungen erkannten Seneszenz und Apoptose in HDF-Zellen, und die Flowzytometrie bewertete den Zellzyklusverlauf. Histopathologische Hautschäden wurden mittels pathologischer Färbung untersucht. Zusätzlich wurden Immunfluoreszenz und Western Blot verwendet, um Ki67, Kollagen, Matrix-Metalloproteinase- (MMP) und TGF-β1/Smad-pathway-assoziierte Proteinwerte zu bewerten. Die HNK-Behandlung (2,5–10 μM) hatte keine negativen Auswirkungen auf die normale Lebensfähigkeit der HDF-Zellen, schwächte jedoch UVA-induzierte HDF-Zellschäden ab und reduzierte oxidativen Stress sowie Apoptose. UVA induzierte die Seneszenz von HDF-Zellen, induzierte einen S-Phasen-Stillstand, senkte Ki67, verringerte den Kollagengehalt und erhöhte die MMP-Expression, während HNK diese UVA-induzierten Anomalien effektiv abschwächte. Darüber hinaus verursachte UVA tiefere Falten, einen geringeren Wasser- und Kollagengehalt sowie eine erhöhte Epithheldicke in der Maushaut, während subkutane Injektion von HNK pathologische Schäden am Hautgewebe sowie einen erhöhten Wasser- und Kollagengehalt abschwächte. Darüber hinaus aktivierte HNK den TGF-β1/Smad-Signalweg, und der TGF-β1-Inhibitor SB431542 die schützende Wirkung von HNK gegen Fotoalterungsschäden in HDF-Zellen beeinträchtigt. Zusammenfassend hat HNK das Potenzial, ein Medikament zur Linderung von Photo-Aging-Schäden zu sein, indem es die MMP-Expression durch Aktivierung des TGF-β1/Smad-Wegs reduziert und so die UVA-induzierte Photo-Aging in HDF-Zellen und Maushaut hemmt.

Einleitung

Der Prozess der Hautalterung ist komplex und in zwei Hauptformen unterteilt: natürliche Alterung und Fotoalterung¹. Studien zeigen, dass bis zu 80 % bis 90 % der Hautalterung durch exogene Umweltfaktoren (z. B. UV-Strahlen, Luftverschmutzung) verursacht werden, von denen die langfristige durch ultraviolette Strahlung induzierte Fotoalterung die schwerwiegendsten Auswirkungen hat ^2,3. Ultraviolette Strahlung wird in UVC, UVB und UVA unterteilt. Da UVC die Ozonschicht nicht durchdringen kann, konzentriert sich die aktuelle Forschung zur Fotoalterung auf UVA (320–400 nm) und UVB (280–320 nm)^4,5,6. Im Vergleich zu UVB hat UVA weniger Energie, ist aber durchdringender, dringt durch die Epidermis und dringt tief in die Dermis, was eine wichtige Ursache für schwere Hautalter von⁷ Jahren ist. Frühere Studien haben gezeigt, dass der durch 57 mJ/cm² UVB und 20 J/^{cm 2} UVA-Bestrahlung verursachte Schaden an HaCaT-Zellen vergleichbar⁸ ist. Haut-Photo-Aging verursacht Veränderungen in der Funktion und Struktur der Haut, die sich insbesondere in Hautoberflächengewebe, vertiefender Falten, Kollagenverlust und dem Erscheinen einer mit bloßem Auge sichtbaren grauen Hautfarbe äußern; In schweren Fällen können verschiedene gutartige, krebsartige Läsionen und Tumore^auftreten. Mit dem Anstieg der Forschung zu Alterung und Anti-Aging sind die Gesundheitsrisiken des Photoaging zu einem der wichtigsten Gesundheitsprobleme weltweit geworden. Daher ist es entscheidend, die pathophysiologischen Prozesse, die UVA-induzierten Fotoalterungsschäden zugrunde liegen, zu untersuchen, um neue therapeutische Optionen für die Behandlung zu entwickeln.

Honokiol (HNK) wird aus Magnolia officinalis, einem traditionellen chinesischen Heilkraut, gewonnen und ist eine bedeutende bioaktive Verbindung mit der chemischen Formel C₁₈H₁₈O₂¹¹. HNK zeigt verschiedene pharmakologische Aktivitäten, und seine phenolische Hydroxylgruppe ist sehr anfällig für Oxidation und weist starke antioxidative und freie Radikal-Zerstörungseffekte^auf. Darüber hinaus weist HNK antibakterielle, entzündungshemmende, antivirale, antitumorale, antidepressiva, neuroprotektive und anti-vorzeitige Eierstockversagen pharmakologische Effekte^auf. Orale HNK wurde in Tier- und klinischen Studien als im Wesentlichen sicher eingestuft, und es wurden keine signifikanten Nebenwirkungen identifiziert 17,18,19. Jüngste Studien haben gezeigt, dass HNK UVB-induzierten Hautkrebs²⁰ verhindert und die UVB-induzierte Hautentzündungsreaktion sowie DNA-Hypermethylierung²¹ hemmt, was auf seine mögliche Anwendung bei der Behandlung von Hauterkrankungen hindeutet. Im Vergleich zu weit verbreiteten Anti-Photo-Aging-Mitteln, darunter Vitamin C und Resveratrol, besitzt HNK ausgeprägte und überlegene Eigenschaften: Seine lipophile Struktur verleiht eine bessere transdermale Durchlässigkeit als hydrophiles Vitamin^C22; und es zeigt eine höhere Photostabilität und in vivo Bioverfügbarkeit als Resveratrol²³. Diese präklinischen Erkenntnisse stützen die Annahme, dass HNK vielversprechendes translationales Potenzial als sicherer und wirksamer Kandidat für Hautpflegeprodukte und klinische Interventionen gegen ultraviolettbedingte Hautphotoschäden hat. Die Auswirkungen der HNK-Behandlung auf Hautfoto-Alterungsschäden durch UVA sind jedoch bisher nicht berichtet.

Der transformierende Wachstumsfaktor-β1 (TGF-β1) ist ein multifunktionales Zytokin, das für Zellwachstum und -entwicklung, Gewebereparatur und -regeneration sowie für das Wachstum und die Entwicklung von Zellen, Geweben und Organen entscheidend ist^24,25. Es wurde gezeigt, dass TGF-β1 hauptsächlich über Mitglieder der Smad-Proteinfamilie an die Zelle signalisiert, was zur spezifischen Regulation der Transkription nachgelagerter Zielgene führt. Wenn die TGF-β1-Signalübertragung aktiviert wird, führt dies zur Phosphorylierung von Smad2 und Smad3^26,27. Jüngste Studien haben einen starken Zusammenhang zwischen dem TGF-β1/Smad-Weg und Hautfibrose sowie Fotoalterung^28,29 gezeigt. Es wurde berichtet, dass das Säugetierziel Rapamycin den TGF-β1/Smad-Weg im Hautgewebe der Ratten aktiviert, was wiederum die Synthese von Ceramiden fördert, die wichtig sind, um die Hautfeuchtigkeit zu halten und die Hautbarriere³⁰ aufrechtzuerhalten. Bemerkenswert ist, dass HNK den TGF-β1/Smad-Weg in hepatischen stellaten Zellen modulierte, was wiederum die Leberfibrose³¹ verbesserte. Daher wurden zelluläre und Mausmodelle von UVA-induzierten Photo-Aging-Verletzungen entwickelt, mit 2,5–10 μM HNK-Behandlung in HDF-Zellen und 5 mg/kg bzw. 10 mg/kg HNK-Intervention bei haarlosen Mäusen, um die Auswirkungen von HNK auf Photo-Aging-Schäden und seine potenzielle Rolle bei der Modulation des TGF-β1/Smad-Pfads zu untersuchen. Diese Studie hatte zum Ziel, neue therapeutische Strategien für UVA-induzierte Hautphotoschäden zu entwickeln.

Protokoll

Alle Zellkulturexperimente wurden gemäß institutionellen Biosicherheitsrichtlinien durchgeführt und unter Laborbedingungen der Biosicherheitsstufe 2 (BSL-2) durchgeführt. Tierversuche wurden nach Genehmigung des Tierethikausschusses des 988. Krankenhauses der Gemeinsamen Logistikunterstützungskraft der chinesischen Volksbefreiungsarmee (Genehmigungsnummer: 2023-089) durchgeführt.

Alle experimentellen Verfahren wurden in strikter Übereinstimmung mit institutionellen und nationalen Richtlinien für die Pflege und Nutzung von Labortieren durchgeführt. Am Ende des Experiments wurden die Mäuse durch eine Überdosis Natriumpentobarbital (100 mg/kg, intraperitoneale Injektion) eingeschläfert. Alle Anstrengungen wurden unternommen, um das Tierleiden während der Unterbringung, Behandlung und Probenahmen zu minimieren. Die im Protokoll verwendeten Reagenzien, Chemikalien, Geräte und Software sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Zellkultur und -verarbeitung

1. Humane dermale Fibroblasten (HDF) im Fibroblast-Kulturmedium kultivieren. Kulturen werden bei 37 °C in einer gesättigten Luftfeuchtigkeit mit 5 %_CO2 gehalten.
2. Ersetze das Kulturmedium alle 3 Tage und gib HDF im Verhältnis 1:3 durch, wenn es konfluent ist.
3. Bestrahlen Sie HDF mit UVA-Lampen (Emissionsspektrum: 320–400 nm) bei einer Dosis von 5 J/cm².
4. Sofort nach 30 Minuten UVA-Bestrahlung mit frischem Medium auffüllen. Wiederholen Sie die UVA-Bestrahlung einmal täglich für 8 aufeinanderfolgende^{Tage und 32} Jahre.
5. Behandle HDF mit 2,5, 5, 10, 20 oder 40 μM HNK für 24 oder 48 Stunden in den Dosis-Screening-Experimenten³³. HDF wird 24 Stunden lang mit 2,5, 5 oder 10 μM HNK behandelt, gefolgt von UVA-Bestrahlung (5 J/cm²) in den folgenden Experimenten.
6. HDF wird 4 Stunden lang 10 μM HNK ausgesetzt, dann 24 Stunden mit 10 μM TGF-β1-Inhibitor SB431542 inkubiert und schließlich mit UVA (5 J/cm²) in der HNK+SB431542-Gruppe bestrahlt.

2. Bewertung der Zellviabilität

1. Inokulieren Sie HDF in 96-Well-Zellkulturplatten mit einer Dichte von 1×10⁴ Zellen pro Bohrloch.
2. Nach verschiedenen Behandlungen wird 10 μL 10 μL 10 % wasserlösliches Tetrazoliumsalzreagenz zu jedem Bohrloch zu einem Endvolumen von 100 μL pro Bohrloch hinzugefügt und die Zellen bei 37°C für 1,5 Stunden im Dunkeln inkubiert.
3. Missen Sie die OD450-Werte der Zellen mit einem Mikroplattenleser.

3. Bestimmung der Superoxiddismutase (SOD), Malondialdehyd (MDA), Katalase (CAT) und Glutathion (GSH)-Spiegel

1. Waschen Sie HDF mit 1 ml vorgekühltem PBS (0,01 M, pH 7,4), fügen Sie 200 μL SOD-Proben-Vorbereitungslösung (aus dem SOD-Assay Kit) hinzu, um die Zellen 15 Minuten lang auf Eis zu lysieren.
2. Zentrifugieren Sie das Lysat bei 8000 × g für 5 Minuten bei 4 °C und sammeln Sie das Supernatant als Prüfprobe.
3. Verwenden Sie ein BCA-(Bicinchina-Säure-)Protein-Testset, um die Proteinkonzentration des Supernatanten zu bestimmen, und passen Sie die Probe auf 50 μg Gesamtprotein in einem 50-μL-Volumen an.
4. Mische die 50 μg Proteinprobe mit dem SOD-Puffer zu einem Endreaktionsvolumen von 200 μL und inkubiere die Mischung bei 37 °C 30 Minuten im Dunkeln und messe dann den OD450-Wert.
5. Nehmen Sie denselben Zelllysat-Supernat, der für den SOD-Test verwendet wird, und messen Sie die CAT-, GSH- und MDA-Werte mit den jeweiligen Assay-Kits.

4. Messung zellulärer ROS-Spiegel

1. Behandle HDF-Zellen unter verschiedenen Bedingungen, spüle zweimal mit 500 μL PBS und mische gut mit einer 500 μL fluoreszierenden Sonde aus 10 μM reaktiven Sauerstoffspezies und inkubiere bei 37 °C 20 Minuten fernab von Licht.
2. Zentrifugiere bei 1000 × g für 5 Minuten bei Raumtemperatur, um die Zellen zu sammeln, und spüle dann zweimal mit 500 μL PBS.
3. Die Zellen in einem 500-μL-Zellkulturmedium wieder suspendieren und anschließend die Färbung mittels Durchflusszytometrie analysieren.
4. Erfassen Sie die Fluoreszenzintensität mit einer Durchflusszytometrie-Analysesoftware und berechnen Sie dann ROS-Werte basierend auf der Fluoreszenzintensität – ein höherer ROS entspricht stärkerer grüner Fluoreszenz).

5. Seneszenzassoziierte β-Galactosidase (SA-β-Galactosidase) Färbung

1. Säen Sie HDF in 6-Well-Zellkulturplatten mit einer Dichte von 1×10^{6 Zellen pro} Bohrloch und kultivieren Sie die Wirkung. Nach verschiedenen Behandlungen Waschen Sie HDF einmal mit 2 ml PBS.
2. Gib jedem Bohrloch 1 ml β-Galactosidase-Färbungsfixativ hinzu und brüte die Zellen bei Raumtemperatur mit Fixativ 15 Minuten lang aus.
3. Wasche die Zellen dreimal mit 2 mL PBS, gib jedem Brunnen 1 ml Färbelösung hinzu und inkubiere dann über Nacht bei 37°C im Dunkeln.
4. Beobachte und fotografiere die Zellen mit einem Lichtmikroskop (seneszente Zellen erscheinen blau).

6. Zellzyklus-Assay

1. Säe HDF in 6-Well-Platten bei 1×10⁶ Zellen pro Well; Nach verschiedenen Behandlungen die Zellen zweimal mit 2 ml PBS ausspülen.
2. Zentrifugiere bei 1000 × g für 5 Minuten bei Raumtemperatur, um Zellen zu sammeln, gib 1 ml 70 % Ethanol (Zellfixativ) hinzu und vermische vorsichtig durch Pipetieren. Stellen Sie die festen Zellen für 12 Stunden in einen 4°C-Kühlschrank.
3. Bereiten Sie 500 μL pro Probe der Zellfärbungslösung vor, indem Sie Propidiumiodid (PI, Endkonzentration 50 μg/mL) und RNaseA (Endkonzentration 200 μg/mL) in PBS mischen. Zellen 500 μL Färbungslösung aussetzen, im Dunkeln bei 37 °C für 30 Minuten inkubieren.
4. Bewerten Sie die Fluoreszenzintensität mittels Durchflusszytometrie. Führen Sie eine Zellzyklusanalyse mit einem Durchflusszytometer durch.

7. TUNEL-Verfärbung

1. HDF-Zellen verschiedener Behandlungsgruppen werden 1 ml 4%-Paraformaldehyd ausgesetzt und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
2. Gib 1 ml PBS mit 0,3 % Triton X-100 zu den Zellen und inkubiere 5 Minuten bei Raumtemperatur.
3. Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS und fügen Sie dann 500 μL TUNEL-Assay-Lösung tropfweise hinzu, um die Zellen gleichmäßig zu bedecken. Inkubiere bei 37°C im Dunkeln 1,5 Stunden lang.
4. Fügen Sie 200 μL DAPI-Färbelösung hinzu, um die Zellen zu bedecken, und inkubieren Sie 10 Minuten lang abseits des Lichts bei 25 °C.
5. Versiegeln Sie die Zellen mit einem Fluoreszenzsignal-Erhaltungsmedium und beobachten und fotografieren Sie sie dann mit einem Fluoreszenzmikroskop (TUNEL-positive Zellen zeigen grüne Fluoreszenz).

8. Immunfluoreszenzfärbung

1. Säen Sie HDF-Zellen aus verschiedenen Behandlungsgruppen in 12-Well-Platten. Sobald die Zelldichte 50 % bis 60 % erreicht hat, setzen Sie die Zellen 1 ml 4 % Paraformaldehyd aus und inkubieren Sie 25 Minuten bei Raumtemperatur.
2. Fügen Sie 1 ml 5 % Rinderserumalbumin (BSA) tropfweise hinzu, um die Zelloberfläche zu blockieren, und inkubieren Sie 30 Minuten bei Raumtemperatur.
3. Fügen Sie 500 μL primäre Antikörper Ki67 (1:300), Kollagen I (1:100), Matrix-Metalloproteinase (MMP)-1 (1:50) oder MMP-3 (1:100) tropfweise hinzu und inkubieren Sie über Nacht bei 4°C.
4. Am folgenden Tag inkubieren Sie die Zellen mit 500 μL Fluorescein-Isothiocyanat (FITC)-markiertem sekundären Antikörper (1:100) bei 37°C fernab von Licht für 1 Stunde.
5. Fügen Sie 200 μL DAPI-Färbelösung hinzu, um die Zellen zu bedecken, inkubieren Sie 10 Minuten fern von Licht, beobachten Sie mit einem Fluoreszenzmikroskop und analysieren Sie mit Bildanalysesoftware (Kollagen-I- und MMP-1-positive Zellen zeigen rote Fluoreszenz, Ki67- und MMP-3-positive Zellen zeigen grüne Fluoreszenz).

9. ELISA

1. Fügen Sie 100 μL HDF-Zellkultur-Supernatant in Bohrlöcher mit MMP-1- oder MMP-3-ELISA-Kitplatten hinzu und inkubieren Sie bei 37°C für 2 Stunden.
2. Waschen Sie die Bohrungen dreimal mit 200 μL PBS, geben Sie dann 100 μL des entsprechenden Antikörpers zu jedem Brunnen und inkubieren Sie 1 Stunde lang bei 37 °C im Dunkeln.
3. Spülen Sie die Brunnen dreimal mit 200 μL Waschpuffer (im Kit enthalten), schütteln Sie überschüssige Lösung ab und inkubieren Sie die Proben mit 100 μL Streptavidin-HRP für 30 Minuten bei 37 °C im Dunkeln.
4. Nach dem Abspülen mit PBS gib 100 μL Substrate A und B gemäß der Kit-Anleitung dazu und brüte 10 Minuten bei 37°C im Dunkeln inkubieren.
5. Fügen Sie 50 μL Abschlusslösung hinzu, mischen Sie gut, bewerten Sie den OD_450-Wert mit einem Mikroplattenleser und berechnen Sie die Konzentration.

10. Photo-Aging Schadens-Mausmodell-Bau

1. SPF-fähige weibliche SKH1-Haarlose Mäuse (15-20 g, 4-5 Wochen alt) bei 22 °C, 55%-60% Luftfeuchtigkeit und ermöglichen autonomen Zugang zu Nahrung und Wasser. Desinfizieren Sie regelmäßig Einrichtungen, darunter Lebensmittelbehälter, Wasserflaschen und Trinkauslaufe.
2. Mäuse werden zufällig der Kontrollgruppe (n=6) und der Modellgruppe (n=18) zugeteilt. Bestrahlen Sie Modellgruppenmäuse mit UVA bei 0,35 J/^{cm 2} für 8 Wochen³⁴; Haus-Kontrollgruppenmäuse in derselben Umgebung ohne UVA-Bestrahlung.
3. Teile die Modellgruppe der Mäuse gleichmäßig in 3 Untergruppen (jeweils n=6) auf.
4. Verabreichen Sie subkutane Injektionen von HNK mit 5 mg/kg oder 10 mg/kg in 100 μL Volumen zweimal pro Woche an zwei Untergruppen während der UVA-Bestrahlung (Aufzeichnung als 5 mg/kg HNK-Gruppe bzw. 10 mg/kg HNK-Gruppe). Geben Sie der dritten Untergruppe während der UVA-Bestrahlung zweimal wöchentlich subkutane Injektionen von 100 μL Kochsalzlösung (Aufzeichnung als UVA-Gruppe).
5. Bewerten Sie die Hautfaltenbildung und den Wassergehalt nach erfolgreicher Modellierung³⁵.
6. Euthanasiere Mäuse mit Natriumpentobarbital (100 mg/kg) intraperitoneal und sammle dann dorsale Hautgewebe für weitere Experimente.

11. Messung des Hautkollagen-I-Gehalts

1. Sammeln Sie 50 mg Rückenhautgewebe der Maus, mahlen Sie sie gründlich in flüssigem Stickstoff und lysieren Sie sie mit 500 μL vorgekühltem RIPA-Lysepuffer für 30 Minuten auf Eis.
2. Zentrifugieren Sie das Lysat bei 8000 × g für 5 Minuten bei 4 °C, sammeln Sie das Supernatant auf und messen Sie den Kollagengehalt mit einem Pro-Kollagen-IC-Peptid-Assay-Set gemäß den Anweisungen des Herstellers.

12. Färbung von Hämatoxylin und Eosin (HE)

1. Maushautgewebe in 10 ml 4 % Paraformaldehyd bei Raumtemperatur für 24 Stunden fixieren, in Gradientenethanol dehydrieren (50 %, 75 %, 95 %, 100 % jeweils für 5 Minuten), Paraffin einbetten und in 4 μm große Scheiben schneiden.
2. Backen Sie die Scheiben bei 65°C für 8 Stunden, deparaffinisieren Sie zweimal für jeweils 10 Minuten in Xylol und rehydrieren Sie sie bei Raumtemperatur in Gradientenethanol.
3. Die Scheiben 8 Minuten mit Hämatoxylinlösung färben, 1 Minute mit laufendem Leitungswasser abspülen, 30 Sekunden mit Differenzierungslösung differenzieren und 1 Minute bei Zimmertemperatur mit Eosin färben.
4. Die gefärbten Scheiben in Gradientenethanol dehydrieren, mit Xylol klarmachen, mit Montagemedium versiegeln und unter dem Mikroskop betrachten (der Zellkern erscheint blau-violett, während das Zytoplasma, die Kollagenfasern und die Erythrozyten in unterschiedlichem Maße rosa erscheinen).

13. Masson-Färbung

1. Färben Sie Paraffinabschnitte von Mäusehautgewebe mit dem Masson Trichrome Staining^{Kit 36}. Paraffinisiere Paraffinteile zweimal für jeweils 10 Minuten in Xylol, gib eine Weigert-Eisenhämatoxylin-Färbelösung hinzu und färbe sie 10 Minuten lang.
2. Differenzieren Sie mit einer säurehaltigen Ethanol-Differenzierungslösung für 30 Sekunden, spülen Sie 5 Minuten mit laufendem Leitungswasser ab und färben Sie dann tropfweise 10 Minuten bei Zimmertemperatur mit einer Ponceau-Fuchsin-Färbungslösung. Führe das Reverse-Bläuen mit Massons blauer Lösung durch und spüle dann 1 Minute mit destilliertem Wasser.
3. Bereite eine schwache säurehaltige Arbeitslösung mit einem Verhältnis von destilliertem Wasser vor: schwache säurehaltige Lösung (im Kit enthalten) = 2:1; 1 ml schwachsäurehaltige Arbeitslösung tropfweise hinzufügen und 30 Sekunden bei Zimmertemperatur waschen.
4. Gib überschüssige Flüssigkeit ab, gib tropfweise 1 ml Phosphomolybdische Säurelösung hinzu und behandle 2 Minuten bei Zimmertemperatur. Geben Sie 1 ml der schwachen Säurearbeitslösung tropfweise hinzu und waschen Sie dann 30 Sekunden.
5. Gieße überschüssige Flüssigkeit ab, gib tropfweise 1 ml Anilinblaue Farblösung hinzu und beize sie 1 Minute lang. Gib 1 ml schwache Säure-Arbeitslösung tropfweise hinzu und wasche sie 30 Sekunden.
6. Schnell in 95 % Ethanol für 2 Sekunden dehydrieren. Dehydriere sie zweimal in absolutem Ethanol, jeweils 10 Sekunden.
7. Nach dem Trocknen reinigen Sie die Abschnitte mit Xylol und befestigen Sie sie mit neutralem Kaugummi. Beobachten Sie die Verteilung der Kollagenfasern in jeder Gruppe unter dem Mikroskop (Kollagenfasern erscheinen blau, während Muskelfasern, Zytoplasma und Erythrozyten leuchtend rot sind und die Zellkerne deutlich blau-schwarz erscheinen).

14. Messung der ROS-Werte im Hautgewebe

1. Nehmen Sie gefrorene Stücke des Maushautgewebes (hergestellt innerhalb von 1 Stunde nach der Exzision), verteilen Sie 1 ml Reinigungslösung tropfwärts über die gesamte Schnittfläche und lassen Sie sie 10 Minuten bei Zimmertemperatur stehen.
2. Schütteln Sie die Waschlösung ab und fügen Sie dann 1 ml 10 μM Reaktiv-Sauerstoff-Spezies-Sonde tropfweise hinzu, um die Abschnitte gleichmäßig zu bedecken; Inkubieren Sie bei 37 °C fernab des Lichts für 30 Minuten.
3. Spülen Sie die Schnitte zweimal mit PBS, fügen Sie Deckfolien hinzu und beobachten Sie sie mit einem Fluoreszenzmikroskop (ROS-positive Bereiche zeigen rote Fluoreszenz; je niedriger der ROS-Wert, desto schwächer das rote Fluoreszenzsignal).

15. Biochemische Indikatorentests

1. Sammeln Sie Mäuseserum und bereiten Sie Detektionsreagenzien gemäß den Anweisungen der entsprechenden Prüfkits vor.
2. Missen Sie die Aktivitäten von Aspartattransaminase (AST) und Alanintransaminase (ALT) im Mausserum mit den jeweiligen Kits.
3. Bestimmen Sie die Werte von Blutharnstoffstoff (BUN) und Kreatinin (CRE) im Mäuseserum mit Hilfe der jeweiligen Kits.

16. Westlicher Fleck

1. Sammeln Sie 50 mg Gewebe oder 1×10^{6 Zellen} , lysieren Sie die Proben 30 Minuten lang auf Eis mit einem 200 μL RIPA-Lysepuffer, um Proteine zu erhalten.
2. Zentrifugiere bei 8000 × g für 5 Minuten bei 4 °C und sammle das Überstandsmittel. Bewerten Sie den Proteingehalt in Zellen und Geweben mit dem BCA-Proteinkonzentrations-Assay-Kit.
3. Elektrophorese von Probenproteinen auf 12 % SDS-PAGE-Gel durchführen und getrennte Proteine bei 4 °C auf PVDF-Membranen übertragen.
4. Blockiere PVDF-Membranen mit 5 % BSA für 3 Stunden bei Raumtemperatur. Spülen Sie die Membranen mit TBST (enthält 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl und 0,1 % Tween-20) dreimal und inkubieren Sie dann über Nacht bei 4°C mit primären Antikörpern: P53 (1:1000), P21 (1:1000), P16 (1:100), Kollagen I (1:1000), Cyclin A2 (1:500), Cyclin-abhängige Kinase 2 (CDK2, 1:1000), MMP-1 (1:500), MMP-3 (1:1000), TGF-β1 (1:1000), Smad2 (1:100), Smad3 (1:1000), p-Smad2 (1:1000) oder p-Smad3 (1:1000).
5. Am zweiten Tag die Membranen dreimal mit TBST waschen und dann mit 1 ml Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (1:10000) bei Zimmertemperatur 2 Stunden inkubieren. Tragen Sie 500 μL des verstärkten Chemilumineszenz-(ECL)-Reagens gleichmäßig auf die Membranen auf und scannen Sie sie dann mit einem Gelbildgebungssystem.
6. Führen Sie eine Grauwertanalyse mit Bildanalysesoftware durch. Geben Sie das relative Ausdrucksniveau als Verhältnis seines Grauwerts zu dem von GAPDH aus.

17. Statistische Analyse

1. Bei in-vitro-zellbasierten Assays werden alle Experimente unabhängig dreimal unabhängig wiederholt (n=3, biologische Replikationen).
2. Für In-vivo-Tierversuche werden pro Gruppe 6 Mäuse (n=6) einbezogen, was den 3R-Prinzipien für das Wohlergehen und die Ethik von Labortieren entspricht.
3. Alle Ergebnisse werden als Mittelwert ± Standardabweichung angegeben. Führen Sie statistische Analysen mit Statistiksoftware durch. Die Normalität der Daten wurde mit dem Shapiro-Wilk-Test getestet.
4. Für normal verteilte Daten verwenden Sie einseitig ANOVA für den Vergleich mehrerer Gruppen, gefolgt von Tukeys Post-hoc-Test für paarweise Vergleiche zwischen Gruppen. Für nicht-normalverteilte Daten wenden Sie den nichtparametrischen Kruskal-Wallis-Test an. P< 0,05 zeigt einen signifikanten Unterschied.
5. Erstellen Sie Diagramme mit Grafiksoftware.

Ergebnisse

HNK lindert oxidativen Stressschaden in HDF-Zellen, die durch UVA verursacht werden
Die Auswirkungen verschiedener Konzentrationen der HNK-Behandlung für 24 oder 48 Stunden auf die Lebensfähigkeit von HDF-Zellen wurden mittels Zellviabilitätstest untersucht, um auf die angemessene Konzentration und Behandlungsdauer zu screenen. Die Ergebnisse zeigten, dass 2,5, 5 und 10 μM HNK nach 24 oder 48 Stunden Behandlung die Lebensfähigkeit normaler HDF-Zellen nicht signifikant...

Diskussion

Ultraviolettes Licht ist ein Umweltfaktor, der Zellen und Organismen schädigt. Frühere Studien haben berichtet, dass UVA mit seiner hohen Durchschlagskraft die Hauptart des ultravioletten Lichts ist, das die Erdoberfläche³⁸ erreicht. Fibroblasten sind wichtige funktionelle Zellen in der Dermis, und ihr Altern kann direkt oder indirekt dazu führen, dass die Haut³⁹ Jahre altert. UVA-induzierte Photo-Aging-Schäden im HDF-Zellmodell und im Haar...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
ALT-Aktivitätsassay-Kit	Beyotime Biotechnologie, Shanghai, China	P2711M	Alanin-Transaminase-Aktivitätsdetektionskit
Amplex Red CRE-Testkit	Beyotime Biotechnologie, Shanghai, China	S0291S	Kreatinin-Detektionskit
AntiFade-Montagemedium	Beyotime Biotechnologie, Shanghai, China	P0126	Fluoreszenzsignal-Erhaltungsmontagemedium
AST-Aktivitätstestkit	Beyotime Biotechnologie, Shanghai, China	P2715S	Aspartat-Transaminase-Aktivitätsnachweis-Kit
BCA-Protein-Assay-Kit	Beyotime Biotechnologie, Shanghai, China	P0012	Kit zur Bestimmung der Proteinkonzentration
BSA	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	V900933	Blockreagenz für unspezifische Bindungen
BUN-Assay-Kit	Beyotime Biotechnologie, Shanghai, China	S0574S	Blut-Harnstoff-Stickstoff-Detektor-Set
CAT-Assay-Kit	Beyotime Biotechnologie, Shanghai, China	S0051	Katalase-Aktivitätsdetektionskit
CCK-8-Reagenz	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	96992	Zellviabilitäts-Assay-Lösung, die ein wasserlösliches Tetrazoliumsalz ist, ist
CDK2-Antikörper	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	PA5-79024	primärer Antikörper für CDK2-Detektion
Chemilumineszenz-Mittel ECL	MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USA	HY-K1005	Verbessertes chemilumineszenz-Detektionsreagenz
Kollagen-I-Antikörper	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	PA1-26204	Primärer Antikörper zur Collagen-I-Detektion
Cyclin-A2-Antikörper	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	PA5-34682	Primärer Antikörper zur Cyclin-A2-Detektion
DAPI-Färbelösung	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	D9542	Kernfärbungsfarbe
DCFH-DA Fluoreszenzsonde	MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USA	HY-D0940	fluoreszierende Sonde für reaktive Sauerstoffspezies
Differenzierungslösung	Beyotime Biotechnologie, Shanghai, China	C0161s	Reagenz für den Hämatoxylin-Differenzierungsschritt
Dihydroethidium-Sonde	Beyotime Biotechnologie, Shanghai, China	S0063	Sonde für reaktive Sauerstoffspezies
Fibroblastenkulturmedium	Sunncell Biotechnology Co., Ltd., Wuhan, Hubei, China	SNPM-H342	vollständiges Kulturmedium für das Wachstum von Fibroblasten
FITC-gekennzeichnetes Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	F-2765	Fluorescein-Isothiocyanat (FITC)-markierter sekundärer Antikörper
Durchflusszytometrie	BD biosciences, San Jose, CA, USA	BD FACSCaliburTM	Durchflusszytometer
FlowJo-Software	BD biosciences, San Jose, CA, USA	v10.8	Flusszytometrie-Analyse-Software
Fluoreszenzmikroskop	Leica, Heidelberg, Deutschland	DM IL FÜHRTE	Mikroskop zur Fluoreszenzbildgebung
GAPDH-Antikörper	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	PA1-987	Interne Kontrollantikörper für die Proteinnormalisierung
Gel-Bildgebungssystem	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	iBright CL1500	Bildgebungssystem zur Proteindetektion
Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	31460	Sekundäre Antikörper zur Immundetektion
Graphpad Prism 9.0 Software	GraphPad Software, San Diego, CA, USA	Prism 9.0	Grafiksoftware
GSH-Assay-Kit	Beyotime Biotechnologie, Shanghai, China	S0053	Glutathion-Inhaltserkennungs-Kit
HE-Fleckenset	Beyotime Biotechnologie, Shanghai, China	C0105S	Histologisches Färbungsset für die Gewebemorphologieanalyse
HNK	MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USA	HY-N0003	Honokiol, bioaktive Verbindung
Humane dermale Fibroblasten	Sunncell Biotechnology Co., Ltd., Wuhan, Hubei, China	SNP-H342	Primäre menschliche Hautfibroblastenzellen
IBM SPSS Statistics 26.0 Software	IBM Corporation, Armonk, NY, USA	IBM SPSS Statistik 26.0	Statistische Analyse-Software
ImageJ-Software	Wayne Rasband, Nationales Institut für Psychische Gesundheit, USA	Version 1.54h	Bildanalyse-Software
Ki67-Antikörper	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	MA5-14520	Primärer Antikörper zur Detektion von Zellproliferationsmarkern
Lichtmikroskop	Leica, Heidelberg, Deutschland	DM3000	optisches Mikroskop für Hellfeldabbildung
Masson-Trichrom-Färbeset	Solarbio, Peking, China	G1340	Kollagen- und Bindegewebsfärbungsset
MDA-Assay-Kit	Beyotime Biotechnologie, Shanghai, China	S0131S	Malondialdehyd-Level-Detektionskit (Lipidperoxidationsmarker)
Mikroplattenleser	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	1410101	Absorptionsmessinstrument für zellbasierte Assays
MMP-1-Antikörper	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	PA5-27210	Primärer Antikörper für die Matrix-Metalloproteinase-1-Detektion
MMP-1 ELISA-Bausatz	Enzymgebundene Biotechnologie, Shanghai, China	ml038199	Quantitative Detektion von MMP-1 in biologischen Proben
MMP-3-Antikörper	Abcam, Cambridge, MA, USA	ab52915	Primärer Antikörper zur Matrix-Metalloproteinase-3-Detektion
MMP-3 ELISA-Bausatz	Enzymgebundene Biotechnologie, Shanghai, China	ml105322	Quantitative Detektion von MMP-3 in biologischen Proben
Neutraler Gummi	Beyotime Biotechnologie, Shanghai, China	C0173	Montagemedium
P16-Antikörper	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	PA5-20379	Primärer Antikörper zur P16-Proteindetektion
P21-Antikörper	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	MA5-14949	Primärer Antikörper zur P21-Proteindetektion
P53-Antikörper	Abcam, Cambridge, MA, USA	ab131442	Primärer Antikörper zur P53-Proteindetektion
Paraformaldehyd	Solarbio, Peking, China	P1110	Zell- und Gewebefixationsreagenz
PI	Beyotime Biotechnologie, Shanghai, China	ST512	Profidiumiodid für DNA-Färbungen in der Zellzyklusanalyse
Pro-Kollagen I C Peptid-Assay-Kit	TAKARA, Tokio, Japan	MK101	Kollagensynthese-Detektions-Kit
p-Smad2-Antikörper	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	44-244G	Primärer Antikörper zur phosphorylierten Smad2-Detektion
p-Smad3-Antikörper	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	44-246G	Primärer Antikörper zur Erkennung phosphorylierter Smad3
PVDF-Membranen	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	88520	Proteintransfermembran für Western-Blotting
RIPA-Lysepuffer	Beyotime Biotechnologie, Shanghai, China	P0013B	Proteinextraktionspuffer für Zell- und Gewebelysate
RNaseA	Beyotime Biotechnologie, Shanghai, China	ST579	Ribonuklease zur RNA-Entfernung während der DNA-Färbung
SA-β-Galactosidase-Färbungsset	Beyotime Biotechnologie, Shanghai, China	C0602	Zelluläres Seneszenz-Detektionsset
SB431542	MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USA	HY-10431	TGF-β 1 Signalweginhibitor
SDS-PAGE-Gels	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	WG1403BX10	Polyacrylamid-Gele für die Proteinelektrophorese
SKH1 haarlose Mäuse	Vitalriver, Peking, China		Tiermodell für Haut-Photo-Alterungsstudien
Smad2-Antikörper	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	51-1300	Primärer Antikörper zur Smad2-Detektion
Smad3-Antikörper	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	51-1500	Primärer Antikörper zur Smad3-Detektion
SOD-Assay-Kit	Beyotime Biotechnologie, Shanghai, China	S0101S	Superoxid-Dismutase-Aktivitätsnachweis-Kit
TGF-β 1 Antikörper	Abcam, Cambridge, MA, USA	ab215715	primärer Antikörper für TGF-Β 1 Detektion
Triton X-100	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	X-100	Nicht-ionisches Reinigungsmittel zur Permeabilisierung der Zellmembran
TUNEL-Assay-Lösung	Beyotime Biotechnologie, Shanghai, China	C1086	Apoptose-Detektionsreagenz für DNA-Fragmentierung
Xylen	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	247642	Organisches Lösungsmittel zur Gewebedeparaffinisation