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Kolorimetrische Bewertung der Deiodinase-1-Aktivität in menschlichen Lebermikrosomen mittels der Sandell-Kolthoff-Reaktion

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DOI:

10.3791/70104

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10. April 2026

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1Experimental Toxicology and Ecology, BASF SE, 2Pharmacy, Pharmacology and Toxicology, Free University of Berlin, 3German Federal Institute for Risk Assessment (BfR), German Centre for the Protection of Laboratory Animals (Bf3R)

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine kolorimetrische Methode, um den Einfluss von Chemikalien auf die Deiodinase-1 (DIO1)-Aktivität in menschlichen Lebermikrosomen mithilfe der Sandell-Kolthoff-Reaktion zuverlässig zu bewerten. Sie enthält vordefinierte Akzeptanzkriterien und statistische Leistungskennzahlen und unterstützt laufende Bemühungen zur Einbeziehung von OECD-Testrichtlinien.

Zusammenfassung

Diese Methode ermöglicht die Identifizierung von Teststoffen, die die DIO1-Aktivität hemmen und somit die Schilddrüsenhormon-Homöostase beeinträchtigen können. Das vorgestellte Protokoll beschreibt eine nicht-radioaktive, kolorimetrische Methode zur Bewertung der Auswirkungen von Teststoffen auf die enzymatische Aktivität von Deiodinase 1 (DIO1) in menschlichen Lebermikrosomen. Der Test basiert auf der Sandell-Kolthoff-(SK)-Reaktion, die das während der Dejodinierung von reversem Triiodothyronin (rT3) zu Diiodothyronin (T2) freigesetztes Iodid quantifiziert. Das gelbe Cerium (IV) wird in Anwesenheit von Iodid zu farblosem Cerium (III) reduziert, was eine photometrische Detektion bei 415 nm ermöglicht. In diesem standardisierten System wird die Ceriumkonzentration (IV) auf 40 mM eingestellt, um die Signalstabilität und -robustheit unter den beschriebenen Bedingungen zu verbessern. Um die Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit des Tests zu gewährleisten, ist ein umfassendes Kontrollsystem enthalten: 6-Propyl-2-Thiouracil (Referenzpunkt), Aurothioglukose (positive Kontrolle), 1-Thio-β-D-Glukosenatriumsalz (Negativkontrolle) und 1 % Dimethylsulfoxid (Lösungsmittelkontrolle). Das Protokoll beinhaltet einen Entfernungsmesstest zur Bestimmung geeigneter Testkonzentrationen, Standardisierung der mikrosomenspezifischen Jodidfreisetzungsaktivität und strukturierte chemische Interferenztests bei Abwesenheit von Mikrosomen, mit einer optionalen Nachuntersuchung ohne Dithiothreitol (DTT) zur Identifizierung von DTT-abhängigen Artefakten. Der DIO1-SK-Assay eignet sich für mittel- bis hochdurchsatz-Screenings und mechanistische toxikologische Studien. Seine Robustheit, Skalierbarkeit und Anwendbarkeit auf menschliche Mikrosomen machen es zu einem wertvollen Werkzeug zur Untersuchung endokriner Störungen. Dieses Protokoll unterstützt regulatorische Validierungsbemühungen.

Einleitung

Endokrine Disruptoren (EDs) sind Chemikalien, die die hormonelle Regulation stören und folglich beim Menschen Nebenwirkungen verursachen 1,2. Deiodinasen (DIO) sind membranassoziierte Enzyme, wobei Selenocystein ein Schlüsselreststoff in ihren aktiven Stellen ist. Diese Enzymfamilie besteht aus drei unterschiedlichen Isoformen (DIO1, DIO2 und DIO3), die zusammen die zirkulierenden Schilddrüsenhormonkonzentrationen (TH) modulieren und deren gewebespezifische Verfügbarkeit innerhalb von Zellen3 steuern. Thyroxin (T4), das als Prohormon dient, und Triiodothyronin (T3), die aktive Form, spielen eine entscheidende Rolle bei der Regulierung des Energieverbrauchs, Wachstums, Entwicklungsprozessen und der Thermoregulationim Körper 4. Die DIO-Isoformen unterscheiden sich in ihren Eigenschaften ihrer Dejodinations-Spezifität, kinetischen Eigenschaften und Substratpräferenzen3. DIO1 ist das Hauptdeiodinase-Isoform in der adulten Leber und zeigt eine starke Substrataffinität für umgekehrtes Triiodothyronin (rT3) und sulfatierte Iodothyronine, während DIO2 bevorzugt T4 und rT3 nutzt und DIO3 hauptsächlich auf T4 und T3 wirkt. Die Verwendung menschlicher Lebermikrosomen und rT3 als Substrat ermöglicht eine selektive Detektion der DIO1-Aktivität und minimiert die Interferenz durch andere Isoformen. Während die genauen Folgen der substanzinduzierten DIO1-Hemmung noch vollständig geklärt sind, zeigen Hinweise aus menschlichen Genmutationen, die DIO1 betreffen, eindeutig, dass DIO1 das Schilddrüsenhormonsystemstören kann. Daher besteht ein dringender Bedarf an robusten und reproduzierbaren Methoden zur Untersuchung der DIO1-Hemmung.

Ziel der vorgestellten Methode ist es, die DIO1-Aktivität in vitro mit einem nicht-radioaktiven, kolorimetrischen Ansatz auf Basis der Sandell-Kolthoff (SK)-Reaktion zu quantifizieren. DIO1 katalysiert die Umwandlung von umgekehrtem rT3 in T2, ein Prozess, der zur Freisetzung von Iodidionen führt. Die SK-Reaktion ermöglicht eine empfindliche Detektion des freigesetzten Jodids und ermöglicht die Bestimmung der Iodidfreisetzungsaktivität (IRA) als direkte Messgröße der DIO1-Aktivität. Dieser Test ermöglicht den Nachweis inhibitorischer Effekte von Teststoffen auf DIO1 und unterstützt mechanistische Toxikologie, Screening oder regulatorische Entscheidungsfindung. Sie ist besonders relevant für die Untersuchung der DIO1-Hemmung als molekulares auslösendes Ereignis unerwünschter Ergebniswege, die zu Schilddrüsenstörungen führen, wie es durch internationale Validierungsinitiativen wie die von EURL ECVAM 6,7 koordinierten Verfahren dargelegt wird. Die Methode wurde ursprünglich 2012 8,9 entwickelt und 6,7weiter optimiert, um dem wachsenden Bedarf an robusten, reproduzierbaren und skalierbaren In-vitro-Assays gerecht zu werden, die in Testbatterien für endokrine Screenings integriert werden können, insbesondere im Zusammenhang mit dem Schilddrüsenhormonstoffwechsel. Kürzlich wurde die Anwendung analoger SK-basierter Setups für Medium-10 bis High-Throughput Screening11 veröffentlicht, was die breite Anwendbarkeit des SK-basierten Ansatzes demonstriert.

Obwohl der DIO1-SK-Test indirekt die DIO1-Aktivität misst, indem er IRA statt TH-Produkte quantifiziert, bietet er mehrere Vorteile gegenüber alternativen Techniken. Im Gegensatz zu Methoden, die auf radiomarkierten Substraten12 oder massenspektrometriebasierter Quantifizierung von abgeschwächten oder gebildeten Schilddrüsenhormonen13 basieren, liefert die SK-Reaktion eine einfache, skalierbare und kosteneffiziente Anzeige, indem sie die Iodidfreisetzung bei 415 nm14 misst. Obwohl LC-MS/MS-Methoden mit Festphasenextraktion (SPE-LC-MS/MS) eine hohe Spezifität und Empfindlichkeit bei der Quantifizierung von rT3 und T2 bieten, erfordern sie teure Instrumentierung und sind weniger geeignet für Screening mit höherer Durchsatzleistung. Im Gegensatz dazu kann der DIO1-SK-Test in Standardlaborumgebungen durchgeführt werden und wurde für den Einsatz mit menschlichen Lebermikrosomen vorvalidiert, wobei er eine hohe Reproduzierbarkeit und Prädiktivität 6,7 zeigt. In einer vergleichenden Studie wurden die Ergebnisse der SK-Reaktion, insbesondere der Jodidfreisetzung, direkt mit der Quantifizierung von Schilddrüsenhormonmetaboliten (rT3 und T2) mittels SPE-LC-MS/MS 15 verglichen worden. Die Ergebnisse zeigten eine starke Übereinstimmung zwischen den beiden Ansätzen in einer Reihe von Teststoffen und Hemmungspotenzen. Für alle getesteten Substanzen spiegelten Veränderungen der durch die SK-Reaktion gemessenen Veränderungen der Iodidfreisetzungsaktivität (IRA) stark Veränderungen der rT3- und T2-Werte wider, die durch Massenspektrometrie bestimmt wurden. Dies unterstützte zudem die Gültigkeit der SK-Anzeige als Ersatz für DIO1-Aktivitäten. Diese vergleichenden Analysen bestätigen, dass der SK-Assay eine robuste und zuverlässige Alternative zu komplexeren analytischen Techniken bietet und dass die Iodidfreisetzung mit Sicherheit gemessen werden kann, um die DIO1-Hemmung in vitro zu beurteilen.

Die SK-Methode hat jedoch bestimmte Einschränkungen, die berücksichtigt werden müssen: Sie ist anfällig für Interferenzen durch Substanzen, die entweder freies Jodid als Verunreinigung enthalten, Iodid nicht-enzymatisch freisetzen oder mit Assay-Komponenten wie Dithiothreitol (DTT) reagieren. DTT wird als reduzierender Kofaktor einbezogen, um die katalytische Fähigkeit der Deiodinase aufrechtzuerhalten, indem die Regeneration des aktiven Setselenocysteins im reduzierten Zustand während des Umsatzes unterstützt wird. Da DTT ein starkes Reduktant ist, können bestimmte Teststoffe (oder Verunreinigungen) Redoxreaktionen durchlaufen, die die kolorimetrische Anzeige beeinflussen und in manchen Fällen zu DTT-abhängigen Assay-Artefakten führen, die nicht mit der freigesetzten enzymatischen Iodid in Verbindung stehen. Solche Interferenzen können zu falsch-negativen Ergebnissen bei der DIO1-Hemmung führen, da das gemessene Jodid möglicherweise nicht aus der enzymatischen Umwandlung von rT3 stammt. Daher eignet sich der SK-Test zwar für routinemäßige Screenings und die meisten Teststoffe, während LC-MS/MS zur Bestätigung verwendet werden kann, wenn eine Interferenz im Assay oder bei Substanzen komplexer chemischer Eigenschaften vermutet wird.

Der DIO1-SK-Test wird derzeit als OECD-Testrichtlinie in ein internationales PEPPER-Projekt (Public-Private Platform for the validation of Endocrine Disruptors Characterization Methods) vorbereitet, was seine wachsende Bedeutung für regulatorische Anwendungen und die internationale Harmonisierung von Strategien für endokrine Disruptor-Teststrategien hervorhebt. Der Assay kann in umfassende In-vitro-Testbatterien integriert werden, die sowohl chemische Sicherheitsbewertungen als auch mechanistische Untersuchungen zur endokrinen Störung16 unterstützen. In Kombination mit Assays, die zusätzliche Schlüsselereignisse entlang des Schilddrüsen-Nebenwirkungspfads behandeln, trägt es zu einem umfassenderen Verständnis der Mechanismen der Schilddrüsenhormonstörung bei.

Darüber hinaus machen die Skalierbarkeit und hohe Reproduzierbarkeit des Protokolls es gut geeignet für das Screening mit mittlerer bis hoher Durchsatzleistung. Dies ist unerlässlich, um große Mengen von Substanzen während der Arzneimittelentwicklung und in akademischen Kontexten zu bewerten, wie kürzlich gezeigtwurde. Forscher, die an der DIO1-Hemmung interessiert sind – sei es für Screening, mechanistische Toxikologie oder regulatorische Entscheidungsfindung – profitieren von einem robusten, zugänglichen und vielseitigen Test. Die Validierung dieser Methode macht sie zu einem Standardinstrument für die Forschung zur Störung des Schilddrüsenhormonsystems und zur Bewertung der chemischen Sicherheitskontrolle.

Protokoll

HINWEIS: Vor der Durchführung des Haupttests sind eine Reihe von Vorbereitungsschritten unerlässlich, um die Genauigkeit, Reproduzierbarkeit und Gültigkeit des DIO1-SK-Tests sicherzustellen. Diese Preassay-Aktivitäten umfassen das Gießen von Ionenaustausch- und harzgefüllten Filterplatten, die für eine effektive Trennung und die Minimierung von Hintergrundinterferenz in der SK-Reaktion entscheidend sind. Die Sandell-Kolthoff-Reaktion wird regelmäßig standardisiert, wobei iodid-Standardkurven verwendet werden, um systematische Veränderungen zu überwachen und die Assay-Qualität zu erhalten. Die Aktivität menschlicher Lebermikrosomen wird gemessen, um die batchspezifische Jodidfreisetzungskapazität zu bestimmen und so eine konsistente enzymatische Leistung über die Experimente hinweg zu gewährleisten. Zusammen bilden diese Schritte eine solide Grundlage für die anschließende Hauptanalyse und Datenauswertung und unterstützen die Erzeugung reproduzierbarer und interpretierbarer Ergebnisse.

1. Präassay-Arbeit

  1. Herstellung von Puffern und Reagenzien
    1. Bereiten Sie alle Puffer und Lagerlösungen im Voraus vor, wie in Tabelle 1 beschrieben. Speichern Sie Aliquots wie angegeben, um Stabilität und Reproduzierbarkeit zu gewährleisten.
    2. Am Tag des Tests bereiten Sie die Substratmischung für jede 96-Well-Platte frisch vor. Für eine 96-Well-Platte kombinieren Sie 5,75 mL HEPES/EDTA-Puffer (50 mM HEPES, 2,16 mM EDTA, pH 7,0), 0,5 mL aufgetautes 1 M DTT und 10 μL 6 mM rT3 (gelöst in DMSO). Mische vorsichtig und lasse die Substratmischung bis zur Verwendung auf Eis.
  2. Vorbereitung der Referenz
    1. Bereiten Sie am Tag der Durchführung des Tests eine 10-1 M große Lagerlösung mit Referenzkontrolle 6-PTU in einem geeigneten Lösungsmittel (z. B. DMSO) vor.
    2. Bereiten Sie eine 1:10-Verdünnung dieses Bestands in diH2O (RI-C8) vor, um eine DMSO-Konzentration von 10 % zu erreichen, und bereiten Sie eine Reihe von Verdünnungen aus diesem Bestand in 10 % DMSO in diH2O vor, wie in Tabelle 2 beschrieben.
  3. Vorbereitung der positiven Kontrolle
    1. Bereiten Sie eine 10–2 M große Lagerlösung der positiven Kontroll-Aurothioglukose in einem geeigneten Lösungsmittel (z. B. DMSO) vor und lagern sie bis zu 6 Monate bei 4 °C.
    2. Am Tag des Tests wird der Bestand auf 10–3 M in diH2O verdünnt, um eine DMSO-Konzentration von 10 % DMSO zu erreichen.
  4. Vorbereitung der negativen Kontrolle
    1. Bereiten Sie am Tag der Durchführung des Tests frisch eine 10-2 M große Lagerlösung des Negativkontroll-1-Thio-β-D-Glukosenatriumsalzes vor.
    2. Am Tag des Tests wird der Bestand auf 10–3 M in diH2O verdünnt, um eine DMSO-Konzentration von 10 % DMSO zu erreichen.
      HINWEIS: Verwenden Sie stets geeignete Sicherheitsvorkehrungen, insbesondere beim Umgang mit gefährlichen Chemikalien wie Natriumarsenit und Schwefelsäure. Alle Reagenzien sollten mit deionisiertem Wasser vorbereitet und gemäß den Empfehlungen des Herstellers gelagert werden. Die Substratmischung, einmal vorbereitet, und das aufgetaute DTT-Aliquot sind für den einmaligen Gebrauch am Tag des Tests vorgesehen und sollten nicht erneut eingefroren werden.
  5. Gießen von Ionenaustauschharz
    1. Verwenden Sie für die Vorbereitung einen geeigneten rechteckigen, transparenten Behälter.
    2. Geben Sie etwa 250 g (oder die gewünschte Menge) Ionenaustauschharz in einen großen Behälter und waschen. Waschen Sie mit 10 % Essigsäure; Lass die Harzfederung 10 Minuten ruhen.
    3. Nachdem die Federung 10 Minuten eingependelt ist, neigt und aspiriert man das Supernatant leicht. Waschen Sie mindestens fünfmal insgesamt oder bis keine Farbe mehr in das Lösungsmittel austritt.
    4. Nach dem letzten Waschschritt fügen Sie 10 % Essigsäure hinzu, sodass sie etwa 50 % des Gesamtvolumens ausmacht.
    5. Kippen Sie den Behälter so, dass das Harz sich zu einer Seite bewegt, und stabilisieren Sie den Behälter in der geneigten Position. Warte ~10 Minuten, bis sich die Phasen getrennt haben.
    6. Setzen Sie eine 96-Bohrloch-Filterplatte auf eine 96-tiefe Bohrlochplatte und geben Sie 100 μL 10 % Essigsäure in jede Mulde der 96-Bohrloch-Filterplatte.
    7. Schneiden Sie die für das Harzgießen verwendeten Spitzen in einer Höhe von ~1 cm, um die Öffnung am Ende zu vergrößern, und gießen Sie 300 μL Ionenaustauschharz in jede Mulde der 96-Well-Filterplatte.
      HINWEIS: Die in unserer Arbeit verwendeten Spitzen haben ein maximales Volumen von 1.200 μL und können an Mehrkanalpipetten befestigt werden.
    8. Elutieren Sie die Essigsäure durch Zentrifugation in eine 96-tiefe Bohrlochplatte mit 100–200 × g in einer Zentrifuge mit ausschwenkbarem Rotor für Mikrotiterplatten für 1 Minute. Überprüfen Sie, ob das Harz gleichmäßig über die Platte verteilt ist.
    9. Versiegeln Sie den Teller mit einer undurchlässigen Kunststofffolie und lagern Sie sie maximal 6 Monate bei 4 °C.
      HINWEIS: Ionenaustauschharzbestandteile sind dafür bekannt, die SK-Reaktion zu beeinflussen, wenn sie nicht richtig ausgewaschen werden. Das entfernte Überdachungsmittel kann direkt in der SK-Reaktion verwendet werden (50 μL Überlagerungsprobe verwenden, 50 μL Cerium hinzufügen und schließlich 50 μL Arsenitlösung) und kann mit einer 10%igen Essigsäureprobe (Blankkontrolle) verglichen werden, um eine vollständige Auswaschung der Komponenten sicherzustellen.
  6. Standardisierung der Sandell-Kolthoff-Reaktion
    1. Bereite Jodidverdünnungen aus einer entsprechenden Iodidquelle (z. B. Iodid-Standardlösung) mit empfohlenen Konzentrationen von 1.500, 1.000, 750, 500, 400, 300, 200, 100, 50, 25, 10, 5 und 1 nM Jodid unter Verwendung eines jeweiligen Jodidstandards in diH2O vor.
    2. Füge 50 μL reines diH2O als Kontrolle und 50 μL der präparierten Iodid-Verdünnungen zu einer 96-Well-Platte in dreifacher Form hinzu, wie im Layout in Abbildung 1 beschrieben.
    3. Fügen Sie allen Bohrlöchern 50 μL 40 mM Ceriumlösung hinzu und starten Sie die Reaktion, indem 50 μL 25 mM Arsenitlösung zu allen Bohrlöchern hinzugefügt werden.
    4. So bald wie möglich nach der Zugabe der Arsenitlösung wird die Absorption mit einem Plattenmesser bei 415 nm (±2 nm) gemessen, indem die optische Dichte (OD) jede Minute für 21 Minuten aufgezeichnet und der anfängliche OD aufgezeichnet wird.
    5. Bewerten Sie die Ergebnisse wie in Abschnitt 4 beschrieben.
      HINWEIS: In der Regel erfordert ein Hintergrund von ΔOD21 Minuten > 0,3 in der reinen diH2O-Kontrolle Aufmerksamkeit und weitere Untersuchung der zugrunde liegenden Ursachen (z. B. Kontamination in der A- oder Ce-Charge, niedrige Wasserqualität).
  7. Bewertung der Mikrosomenaktivität
    1. Bereiten Sie die höchste Konzentration (RI-C8) des Referenzelements (6-PTU) wie in Schritt 1.2 beschrieben vor.
    2. Bereiten Sie die sechs Mikrosomenverdünnungen wie in Tabelle 3 beschrieben und die Substratmischung wie in Tabelle 1 beschrieben vor.
    3. Fügen Sie 10 μL eines 10 % (v/v) Lösungsmittelverdünners in diH2O (z. B. 10 % DMSO in diH2O) und 10 μL 10-2 M 6-PTU (RI-C8) zu einer 96-Well-Platte in dreifachem Zustand hinzu, wie in der Plattenanordnung in Abbildung 2 beschrieben.
    4. Fügen Sie 40 μL Mikrosomen-Verdünnungen in diH2O (was zu 20, 10, 5, 2,5, 1,25, 0,68 und 0 μg mikrosomalem Protein pro Bohrloch führt) zur 96-Well-Platte, wie im Plattenlayout gezeigt.
      HINWEIS: Lieferanten liefern typischerweise die Lagerkonzentration des mikrosomalen Proteins. Falls nicht, können Standardmethoden zur Proteinquantifizierung verwendet werden, obwohl wir sie in dieser Studie nicht angewandt haben.
    5. Gib 50 μL frisch vorbereitetes Substratmischung zu jedem Brunnen und versiegele die Platte mit einer undurchlässigen Kunststofffolie.
    6. Setzen Sie die 96-Well-Platte auf einen Shaker in einen Inkubator (37 °C bei 850 U/min) und inkubieren Sie 2 Stunden.
    7. Nach der Inkubationszeit legen Sie die Platte auf Eis, um die Reaktion zu stoppen.
    8. Führen Sie den Ionenaustausch analog zu Schritt 2.2 durch.
    9. Übertragen Sie geeignete Mengen an Probe aus dem im Ionenaustauschschritt gewonnenen tiefen Bohrloch auf eine frische 96-Well-Platte, um unverdünnte (50 μL Probe), 1:2 (25 μL Probe + 25 μL 10 % Essigsäure) und 1:4 (12,5 μL Probe + 37,5 μL 10 % Essigsäure) Verdünnungen zu messen, wobei die Plattenanordnung unverändert bleibt.
    10. Bewerten Sie die Ergebnisse wie in Abschnitt 4 beschrieben und bestimmen Sie den Verdünnungsfaktor für die Proben in 10 % Essigsäure sowie die mikrosomale Proteinkonzentration, die dennoch zu den höchstmöglichen ΔOD21min -BG-Werten in der Sandell-Kolthoff-Reaktion führt, ohne das Sättigungsplateau zu erreichen.
      HINWEIS: In der Regel ist eine Iodidfreisetzung von ΔOD21 Minuten > 0,5 leicht in den 1:4- oder 1:2-Essigsäureverdünnungen der 20 μg mikrosomalen Proteine pro Bohrlochprobe erreichbar und liegt meist bei etwaeinem ΔOD 21 Minuten von 1. Höhere mikrosomale Proteinkonzentrationen werden nicht empfohlen, da sie während des Tests die Hintergrund- und unspezifische Bindung erhöhen. Es wird empfohlen, die Messung einer 6-PTU-Verdünnungsreihe mit der bestimmten Mikrosomenkonzentration und dem Verdünnungsfaktor zu wiederholen, um das Ergebnis zu bestätigen.
  8. Löslichkeitsbewertung von Testobjekten
    1. Lösen Sie das Testobjekt bei 100 mM oder 200 mg/mL in einem geeigneten Lösungsmittel (z. B. DMSO) bei Raumtemperatur auf. Mischen oder vortoben und die Auflösung visuell prüfen (Mikroskop).
    2. Wenn ungelöst, sonikieren Sie bis zu 5 Minuten und prüfen Sie erneut. Wenn es noch nicht gelöst ist, erhitze bis zu 60 Minuten bei 37 °C und prüfe erneut.
    3. Wenn unlöslich, weiter verdünnen oder eine neue Fond in niedrigerer Konzentration vorbereiten und wiederholen Sie das Verfahren. Wenn DMSO nicht geeignet ist, probiere Wasser oder Ethanol als alternative Lösungsmittel.
    4. Nach der Auflösung bereiten Sie eine 1:10-Verdünnung mit diH2O (10 % Lösungsmittel) vor und wiederholen Sie die Bewertung (Mischung, Sonikation, Erhitzen bei Bedarf).
    5. Um die Testbedingungen zu simulieren, bereiten Sie eine 1%-Testverdünnung im Prüfpuffer vor und wiederholen Sie die Löslichkeitsprüfung.
  9. Vorbereitung von Testgegenständen und Entfernungsmessung
    1. Bereiten Sie die Lösung des Testobjekts bei der höchsten löslichen Konzentration in einem geeigneten Lösungsmittel (vorzugsweise DMSO) vor, wie sie bei der Löslichkeitsbewertung in Schritt 1.8 bestimmt wurde.
    2. Für den Entfernungsbestimmungstest bereiten Sie acht Testverdünnungen durch aufeinanderfolgende 1:10 (v/v) Verdünnungsschritte mit der Standardlösung und 10 % DMSO in diH2O vor.
    3. Führen Sie den Entfernungsbestimmungstest durch, um das Hemmungsprofil des Testobjekts zu schätzen, indem Sie die in Abschnitt 2 beschriebenen Schritte durchführen. Wenn das Testobjekt bei einer Konzentration ≥25 % Hemmung zeigt, passen Sie den Konzentrationsbereich für die abschließenden Testdurchläufe so an, dass mindestens drei Konzentrationen im linearen Hemmungsbereich und zwei Konzentrationen unter 10 % IRA, falls zutreffend, enthalten sind.
    4. Wenn das Testobjekt eine Hemmung von <25 % in allen getesteten Konzentrationen zeigt, verwenden Sie dieselbe Verdünnungsreihe für die abschließenden Testläufe wieder. In diesem Fall kann der Entfernungsbestimmungs-Assay als einer der drei erforderlichen unabhängigen Testdurchläufe zählen.
      HINWEIS: Führen Sie mindestens zwei, idealerweise drei, unabhängige Experimente für jedes Testobjekt durch, um die Reproduzierbarkeit und Zuverlässigkeit der Ergebnisse sicherzustellen. Wenn eine andere Verdünnung gewählt wird, um den Aktivitätsbereich besser abzudecken, ist eine Abweichung vom 1:10-Verdünnungsverhältnis erlaubt. Die 25%-Grenze in dieser Teststrategie (siehe Schritte 1.9.3 und 1.9.4) unterscheidet Testergebnisse von negativen Kontrollen, berücksichtigt die Variabilität der Basisaktivität und bietet gleichzeitig eine zusätzliche Sicherheitsmarge. Dieser Schwellenwert gewährleistet eine zuverlässige Klassifikation inhibitorischer Profile.

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Abbildung 1: Plattenanordnung für die Jodid-Standardkurve. Diese Abbildung zeigt das 96-Well-Plattenlayout, das zur Erzeugung der Iodid-Standardkurve verwendet wurde. Brunnen enthalten serielle Verdünnungen von Iodid im Bereich von 1 nM bis 1.500 nM sowie diH2O-Only-Steuerungen.  Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 2: Plattenlayout für die Titration mikrosomaler Proteine und Referenztest. Diese Abbildung zeigt das 96-Well-Plattenlayout für mikrosomale Proteintitration und Referenzinhibitor-(6-PTU)-Tests. Die Reihen enthalten zunehmende Mengen an mikrosomalem Protein pro Brunnen, mit und ohne 6-PTU.  Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

2. Durchführung des DIO1–SK-Tests

  1. Mikrosomen-Inkubation mit Testobjekt
    1. Bereiten Sie das Referenzelement wie in Schritt 1.2 beschrieben sowie die positive und negative Kontrolle vor, wie in den Schritten 1.3 und 1.4 beschrieben. Bereiten Sie die Testobjekte mit geeigneten Konzentrationen gemäß dem in den Schritten 1.8 und 1.9 beschriebenen Protokoll vor.
    2. Bereiten Sie die Substratmischung wie in Tabelle 1 beschrieben vor und bereiten Sie eine Mikrosomensuspension in der vordefinierten Proteinkonzentration gemäß Schritt 1.7 vor, indem Sie die sorgfältig aufgetaute, aliquotierte Mikrosomenlösung in diH2O verdünnen. Lassen Sie die Mikrosomensuspension auf Eis, bis sie für die Brutzeit benötigt wird.
    3. Nach den in Abbildung 3 und Abbildung 4 gezeigten Plattenlayouts (wenn gleichzeitig mehr als zwei Testobjekte bewertet werden) werden 10 μL Referenzpunktkonzentrationen, positive und negative Kontrolle, Lösungsmittelkontrolle (10 % (v/v) Lösungsmittel in diH2O) und Testkonzentrationen zu den Bohrungen hinzugefügt.
    4. Fügen Sie allen Wells 40 μL der Mikrosomensuspension hinzu. Fügen Sie den Proben 50 μL der frisch vorbereiteten Substratmischung hinzu.
    5. Versiegeln Sie die Platte mit einer undurchlässigen Kunststoffplatte und legen Sie sie für 2 Stunden auf einen Shaker in einem Inkubator (37 °C bei 850 U/min); Stelle die Platte nach der Inkubation auf Eis, um die Reaktion zu stoppen.
    6. Stellen Sie die Platte nach der Inkubation auf Eis, um die Reaktion zu stoppen.
      HINWEIS: Die Platte kann bis zur Messung auf Eis gelagert werden, um die Probenintegrität zu erhalten. Die erste Testplatte enthält acht Konzentrationen des Referenzelements, während jede zusätzliche Platte am selben Tag nur die höchste Konzentration des Referenzobjekts enthält, sodass bei Bedarf mehr Platz für weitere Testobjekte bleibt.
  2. Trennung durch Ionenaustauscherharz-gefüllte 96-Well-Filterplatten
    1. Setzen Sie eine vorbereitete Ionenaustausch-Harz-gefüllte 96-Well-Filterplatte, wie in Schritt 1.5 vorbereitet, auf eine 96-tiefe Bohrlochplatte und fügen Sie 150 μL 10%ige Essigsäure in jede Mulde der Ionenaustauscher-Harz-gefüllte 96-Well-Filterplatte hinzu, um das Harz in den Säulen zu benetzen.
    2. Elutieren Sie die Essigsäure durch Zentrifugierung in die verwendete 96-tiefe Bohrlochplatte mit 100–200 × g in einer Zentrifuge mit ausschwenkbarem Rotor für Mikrotiterplatten für 1 Minute.
    3. Ersetzen Sie die verwendete 96-tiefe Bohrlochplatte durch eine neue 96-tiefe Bohrlochplatte.
    4. Fügen Sie 133 μL 10%ige Essigsäure zu jedem Brunnen der inkubierten 96-Well-Platte aus Schritt 2.1.6 hinzu und schütteln Sie die Platte kurz, um die Lösungen zu mischen.
    5. Übertragen Sie 175 μL der im vorherigen Schritt vorbereiteten Proben auf die mit Ionenaustauscherharz gefüllte 96-Well-Filterplatte, wobei das anfängliche Plattenlayout erhalten bleibt.
    6. Führen Sie die Proben durch das Harz und in die 96-tiefe Bohrlochplatte durch Zentrifugierung (100–200 × g) in einer Zentrifuge mit einem ausschwenkbaren Rotor für Mikrotiterplatten für 1 Minute. Entfernen Sie die mit Harz gefüllte 96-Well-Filterplatte im Ionenaustausch.
      HINWEIS: Die 96-tiefe Bohrlochplatte mit Proben kann mit einer undurchlässigen Kunststoffplatte versiegelt und mindestens 3 Monate bei 4 °C gelagert werden. Dies ermöglicht zusätzliche Messungen bei manuellen/technischen Fehlern oder Änderungen des Verdünnungsfaktors in der Sandell-Kolthoff-Reaktion oder -Messung an den folgenden Tagen.
  3. Sandell-Kolthoff-Reaktion
    1. Je nach bestimmtem Verdünnungsfaktor der Proben in 10 % Essigsäure für die verwendete Mikrosomencharge (siehe Schritt 1.7) werden 50 μL der unverdünnten oder entsprechend verdünnten Probe zu einer neuartigen 96-Well-Platte hinzugefügt.
    2. Fügen Sie allen Bohrlöchern 50 μL 40 mM Ceriumlösung (wie in Tabelle 1 beschrieben zubereitet) hinzu und starten Sie die Reaktion, indem Sie 50 μL 25 mM Arsenitlösung (wie in Tabelle 1 zubereitet) in alle Bohrlöcher geben.
    3. So bald wie möglich nach der Zugabe der Arsenitlösung misst man die Absorption mit einem Plattenmesser bei 415 nm (±2 nm), indem die optische Dichte (OD) pro Minute für 21 Minuten aufgezeichnet und der anfängliche OD aufgezeichnet wird.

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Abbildung 3: Plattenlayout für parallele Tests von zwei Testobjekten. 96-Well-Plattenlayout für die Prüfung von zwei Testobjekten in dreifacher Ausführung über mehrere Konzentrationen hinweg, zusammen mit Replikaten negativer, positiver Lösungsmittelkontrollen und dem Referenzobjekt. Als erste Testplatte des Tages verwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 4: Plattenlayout für parallele Tests von drei Testobjekten. 96-Bohrloch-Plattenlayout zum Testen von drei Testobjekten in dreifacher Ausführung über mehrere Konzentrationen hinweg, mit Replikaten von negativen, positiven und lösungsmittelhaltigen Kontrollen. Das Referenzobjekt wird nur in seiner höchsten Konzentration aufgenommen, da es vollständig auf der ersten Platte getestet wird (siehe Abbildung 3). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

3. Tests auf Interferenz (± Mikrosomen und ± DTT)

  1. Bereiten Sie die höchste Konzentration (RI C8) des Referenzelements (6 PTU) wie in Schritt 1.2 beschrieben vor und bereiten Sie die Testprodukt-Lagerlösung und Verdünnungen (höchste Testpunktkonzentration eingeschlossen) vor.
  2. Bereiten Sie die Mikrosomensuspension in der definierten Konzentration pro Bohrloch vor (siehe Schritt 1.7), indem Sie sorgfältig aufgetaute, aliquotierte Mikrosomen in diH2O verdünnen. Lassen Sie die Mikrosomensuspension bis zur Verwendung auf Eis.
  3. Bereiten Sie zwei Substratmischungen vor: die Standardsubstratmischung mit DTT wie in Tabelle 1 beschrieben und eine ansonsten identische Substratmischung ohne DTT (DTT nur weglassen).
  4. Dosieren Sie in die vorgesehenen Bohrungen einer 96-Bohrloch-Platte gemäß Abbildung 5: 10 μL RI C8, 10 μL 10 % (v/v) DMSO in diH2O (Lösungsmittelkontrolle) und 10 μL jeder Verdünnung des Testobjekts.
  5. Fügen Sie laut Abbildung 5 40 μL Mikrosomensuspension zu Brunnen hinzu, die als "mit Mikrosomen" bezeichnet sind, und 40 μL diH2O zu Bohrungen, die als "ohne Mikrosomen" bezeichnet sind.
  6. Auf Eis geben Sie 50 μL Substratmischung mit DTT zu den Brunnen mit "mit DTT" und 50 μL der Substratmischung ohne DTT zu den Brunnen ohne DTT (Abbildung 5).
  7. Versiegeln Sie die Platte mit einer undurchlässigen Kunststofffolie und inkubieren Sie sie 2 Stunden lang auf einem Shaker in einem Inkubator (37 °C, 850 U/min).
  8. Nach der Inkubation wird die Platte auf Eis gelegt, um die Reaktion zu stoppen.
  9. Führen Sie Ionenaustauschtrennung und Iodidquantifizierung über die SK-Reaktion wie in den Schritten 2.2 und 2.3 beschrieben durch und bewerten Sie die Ergebnisse gemäß Abschnitt 4.
    HINWEIS: Dieses Ein-Platten-Setup (Abbildung 5) testet die höchste Testkonzentration parallel zu vs. ohne Mikrosomen und mit versus ohne DTT, um enzymatische DIO1-Aktivität von Assay-Artefakten zu unterscheiden. Eine IRA-Erhöhung ≥20 % in Bohrlöchern ohne Mikrosomen weist auf SK-Interferenz hin (IODIDFREISETZUNG/-auslesung unabhängig von DIO1), und die Substanz wird als "nicht anwendbar im DIO1 SK-Test" eingestuft und von der Analyse ausgeschlossen. Unterschiede zwischen den Bedingungen mit DTT und ohne DTT helfen, die DTT-abhängige Jodidfreisetzung als zusätzlichen Interferenzmechanismus zu identifizieren.

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Abbildung 5: Plattenlayout für Interferenztests. Diese Abbildung zeigt das 96-Well-Plattenlayout für die Interferenzprüfung, bei der Testobjekte, Referenzobjekte und Lösungsmittelkontrolle sowohl mit als auch ohne Mikrosome in Anwesenheit von DTT sowie ohne Mikrosome und ohne DTT getestet werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

4. Datenauswertung

  1. Bewertung der DIO1-Aktivität
    1. Bestimmen Sie die ΔOD21-min-Werte durch Subtraktion der 21-minütigen Werte aller Proben von den ursprünglich gemessenen (0 min)-Werten:
      figure-protocol-6
    2. Bestimmen Sie die ΔOD-BG-Werte, indem Sie den Mittelwert der ΔOD-21-min-Werte der gehemmten 10 3 M 6-PTU (RI)-Kontrollen von den ΔOD21-min-Werten aller Proben subtrahieren:
      figure-protocol-7
    3. Normalisieren Sie die Werte des Prüfobjekts auf die jeweiligen Lösungsmittelkontrollwerte durch Division der Werte(n) der Testobjekte (TI) ΔOD21 min-BG TI durch den Mittelwert der ΔOD21 min -BGSC-Werte der jeweiligen Lösungsmittelkontrolle (SC), wodurch Iodidfreisetzungsaktivitätswerte (IRA) in % erzeugt werden.
      figure-protocol-8
    4. Darstelle die IRA-Werte der unterschiedlichen Konzentrationen der Testobjekte in einer Statistiksoftware, wobei die IRA-Werte auf der y-Achse (linear) und die Testpunktkonzentrationen auf der x-Achse (logarithmisch) liegen.
    5. Verwenden Sie einen Curve-Fit-Algorithmus, um eine Konzentration-Antwort-Beziehung zu visualisieren (z. B. "[Inhibitor] versus Response -- Variable Slope (four parameters)") in der bevorzugten Statistiksoftware. "Top" stellt die maximale Antwort dar, "Bottom" die niedrigste Antwort und "HillSlope" beschreibt die Steilheit der Kurve:
      figure-protocol-9
    6. Bestimmen Sie den IC50 des Referenzelements und, falls zutreffend, des Testelements.
    7. Berechnen Sie den Varianzkoeffizienten (CV) der Schätzung von Log IC50 des Referenzelements in %:
      figure-protocol-10
    8. Berechnen Sie die IRA der negativen Kontrolle, die auf die Lösungsmittelregelung normalisiert ist, in %:
      figure-protocol-11
    9. Berechnen Sie die IRA der positiven Kontrolle, die auf die Lösungsmittelkontrolle normalisiert wird, in %:
      figure-protocol-12
    10. Berechnen Sie den z'-Faktor:
      figure-protocol-13
    11. Um die Gültigkeit des Experiments zu überprüfen, vergleichen Sie die berechneten Werte mit den Akzeptanzkriterien in Tabelle 4.
      HINWEIS: Alle Kriterien müssen erfüllt sein, um einen gültigen Testdurchlauf zu erhalten.
    12. Klassifizieren Sie die Testitems als vollwertige, partielle Inhibitoren oder Nicht-Inhibitoren basierend auf ihrer maximalen Hemmung undIC-50-Werten , wie in Tabelle 5 zusammengefasst.

Ergebnisse

Abbildung 6 gibt einen Überblick über den Workflow des DIO1-SK-Assays und die wichtigsten Standardisierungsschritte, die erforderlich sind, um die Methode erfolgreich im Labor zu etablieren. Der Arbeitsablauf (Abbildung 6A) fasst die aufeinanderfolgenden Phasen des Tests zusammen, einschließlich der Verwendung menschlicher Lebermikrosomen, der Inkubation mit Testobjekten und Kontrollen, der Iodidextraktion mittels Ionenaustauschtrennung sowie der kolorimetrischen Jodidquantifizierung mittels der Sandell–Kolthoff (SK)-Reaktion. Abbildung 6B hebt die Standardisierungsstrategie hervor, die robuste Leistung und valide Ergebnisse untermauert, darunter (i) Standardisierung der SK-Reaktion, (ii) batch-spezifische Mikrosomenaktivitätstests, (iii) Löslichkeitsbewertung und Interferenztests, (iv) einen Bereichsmesstest und (v) Anpassung der Testkonzentrationen basierend auf dem ersten gültigen Testtest.

Ein zentrales Element dieser Strategie ist batch-spezifische mikrosomale Aktivitätstests, da sich menschliche Lebermikrosomenchargen erheblich in ihrer rT3-Dejodinierungsaktivität unterscheiden können, was die Bestimmung einer geeigneten Enzymkonzentration für jede neue Charge vor routinemäßigen Substanztests erforderlich macht.

Diese gestufte Teststrategie ist entscheidend für die Umsetzung: Erst nachdem die Ausgangsleistung des Tests (Kontrollen, SK-Reaktionsverhalten und Mikrosomenaktivität) überprüft und die Testbedingungen standardisiert sind, kann erwartet werden, dass Substanztests valide, interpretierbare Hemmungsprofile liefern.

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Abbildung 6: DIO1 SK Assay Workflow und Standardisierungsschritte. (A) Der Arbeitsablauf zeigt die Verwendung menschlicher Lebermikrosomen, die Einrichtung der 96-Well-Platte, die Inkubation mit Testobjekten und Kontrollen, die Iodidextraktion und die kolorimetrische Quantifizierung mittels der SK-Reaktion. Jeder Schritt wird nacheinander dargestellt, um die Hauptphasen des Tests hervorzuheben. (B) Die Standardisierungsschritte umfassen die Standardisierung der Sandell-Kolthoff-Reaktion, chargenspezifische Mikrosomenaktivitätstests, Löslichkeits- und Interferenztests, Entfernungsbestimmungstest sowie Anpassung der Konzentrationen von Testgegenständen basierend auf dem ersten gültigen Testdurchlauf. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Aufbauend auf dem in Abbildung 6 gezeigten Workflow- und Standardisierungsrahmen zeigt Abbildung 7 , wie Labore eine angemessene mikrosomale Proteinkonzentration (und Post-Ionenaustausch-Verdünnung) bestimmen, um einen ausreichenden Dynamikbereich zu erreichen, während eine sigmoidale Hemmungsantwort für den Referenzinhibitor aufrechterhalten wird. In Abbildung 7A steigt ΔOD21min-BG mit zunehmendem mikrosomalem Protein an und hängt von der Post-Ionenaustausch-Verdünnung ab (unverdünnt, 1:2, 1:4). Die Verdünnung, die den höchsten ΔOD21min-BG liefert und dabei eine sigmoidale Antwort aufrechterhält, wird für nachfolgende Experimente ausgewählt (Beispiel dargestellt: 1:2-Verdünnung). In Abbildung 7B werden 6-PTU-Hemmungskurven über die mikrosomalen Proteinmengen hinweg verglichen, um die niedrigste Proteinkonzentration zu identifizieren, die dennoch eine sigmoidale Kurve ergibt (Beispiel: 5 μg Protein/Brunnen), wodurch die Sensitivität mit dem Hintergrund ausgeglichen wird.

Wichtig ist, dass dieser Optimierungsschritt von jedem Labor bei der Implementierung der Methode durchgeführt werden muss, da die erforderliche Proteinkonzentration von der Aktivität der verwendeten Mikrosomencharge abhängt, was eine batch-spezifische Standardisierung der Enzymkonzentration erforderlich macht.

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Abbildung 7: Mikrosomale Aktivität und Hemmung durch 6-PTU. (A) Das Diagramm zeigt die Zunahme der Aktivität als Hintergrund-(BG)-korrigiertes Sandell-Kolthoff-Signal (ΔOD21 min n-BG) mit zunehmenden Mengen an mikrosomalem Protein pro Bohrloch (log10[μg Protein/Brunnen]), getestet bei unverdünnten, 1:2- und 1:4-Verdünnungen. Die höchste Verdünnung mit dem höchstenΔOD-Wert von 21 Min– BG sowie mit einer sigmoidalen Form wird für zukünftige Experimente verwendet. In diesem Fall ist es die 1:2-Verdünnung. (B) Konzentrations-Antwort-Kurve des Referenzinhibitors 6-Propyl-2-Thiouracil (6-PTU), die die Jodidfreisetzungsaktivität (IRA in %) zeigt, gezeichnet gegen log10[Konzentration (M)] bei verschiedenen mikrosomalen Proteinlasten (5, 7,5 und 10 μg Protein/Well). IRA-Werte werden auf die Lösungsmittelkontrolle normalisiert. Datenpunkte beider Graphen stellen den Mittelwert ± SD von drei technischen Replikaten (Brunnen) pro Bedingung aus einem repräsentativen Mikrosomenaktivitätstest dar. Die Kurven wurden durch nichtlineare Regression mit einem logistischen ("variablen Steigungsmodell") mit vier Parametern angepasst (Inhibitor vs. Antwort). Die kleinste Proteinkonzentration mit einer sigmoidalen Kurve wird für zukünftige Experimente verwendet; in diesem Fall 5 μg/Well. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Sobald der Arbeitsablauf und die Standardisierungsschritte (Abbildung 6) abgeschlossen sind und eine angemessene mikrosomale Proteinkonzentration für die ausgewählte Mikrosomencharge (Abbildung 7) festgelegt wurde, sind die Kernparameter des Tests vorhanden, um mit dem routinemäßigen Stofftest fortzufahren. In diesem Stadium können Testobjekte zusammen mit dem Plattenkontrollsatz (Referenzpunkt, Lösungsmittelkontrolle und positive/negative Kontrollen) im standardisierten Plattenformat ausgewertet werden, was eine robuste Normalisierung und eine konsistente Interpretation der Hemmungsprofile ermöglicht.

Abbildung 8 zeigt eine Assay-Diskriminierung basierend auf Konzentrations-Antwort-Verhalten bei der Jodidfreisetzungsaktivität (IRA). Der Referenzinhibitor 6-PTU (Abbildung 8A) zeigt einen konzentrationsabhängigen Rückgang des IRA und liefert das erwartete sigmoidale Hemmungsprofil, wie es für die Assay-Leistungsverifikation zu erwarten ist. Tanninsäure (Abbildung 8B) zeigt ein inhibitorisches Profil, das mit dem Referenzinhibitor vergleichbar ist (maximale Hemmung > 90 %) unter den dargestellten Bedingungen. Die drei höchsten Konzentrationen der Testsubstanz wiesen negative IRA-Werte auf. IRA-Werte <0 % spiegeln keine biologisch bedeutsame 'negative Jodidfreisetzung' wider, sondern entstehen durch das Berechnungsverfahren (Hintergrundsubtraktion und Normalisierung zur Lösungsmittelkontrolle), das kleine Schwankungen in der Lösungsmittelkontrolle in negative normalisierte Werte ausbreiten kann. Dementsprechend werden IRA-Werte unter 0 % für die Ergebnisinterpretation als gleichwertig mit 0 % (Baseline) betrachtet. Dibutylphthalat (Abbildung 8C) zeigt keine Hemmung (maximal Hemmung unter 25 %) über den getesteten Konzentrationsbereich hinweg, was ein nicht-inhibitorisches Profil darstellt. Zusammen zeigen diese Profile, dass der Test unter standardisierten Bedingungen hemmendes von nicht-inhibitorischem Verhalten unterscheiden kann. Das Testsystem kann auch partielle Inhibitoren identifizieren, die maximale Hemmungswerte zwischen 25 % und 90 % zeigen (Daten nicht angegeben). Weitere Details zur Kategorisierung finden Sie in Tabelle 5.

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Abbildung 8: Das Dosis-Wirkungs-Verhalten des DIO1–SK-Tests unterscheidet Inhibitoren von Nicht-Inhibitoren. Dosis-Antwort-Kurven zeigen die Jodidfreisetzungsaktivität (IRA in %) im Vergleich zur log10-Konzentration (M) für (A) den Referenzinhibitor 6-PTU, (B) einen repräsentativen Inhibitor (Tanninsäure) und (C) einen repräsentativen Nichtinhibitor (Dibutylphthalat). IRA-Werte wurden nach Hintergrundsubtraktion berechnet und auf die Lösungsmittelkontrolle normalisiert. Die Symbole stellen den Mittelwert ± SD (n = 3) eines unabhängigen Experiments dar, das jeweils mit drei technischen Replikaten (Brunnen) pro Konzentration durchgeführt wird. Die Kurven wurden durch nichtlineare Regression mit einem logistischen ("variablen Steigungsmodell") mit vier Parametern angepasst (Inhibitor vs. Antwort). IRA-Werte unter 0 % werden für die Ergebnisinterpretation als gleichwertig zu 0 % (Baseline) betrachtet. Diese Daten zeigen, dass der Test ein sigmoidales Hemmungsprofil für den Referenzinhibitor liefert und bestätigen kann, ob eine Konzentration-Antwort-Kurve unter standardisierten Bedingungen hemmend oder nicht-hemmend ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Bei einem gültigen Testlauf zeigen Lösungsmittelkontrollen (SC) eine deutlicheΔOD-Signaltrennung von 21 Minuten vom vollständig gehemmten Referenzzustand (6-PTU, RI-C8). In einem Beispieldatensatz (10 unabhängige Durchläufe) enthielt jede Platte n = 9 technische Replikate für SC und die vollständig inhibiierte Referenz (6-PTU bei 10−3 M). Über die Platten hinweg reichten die Plattenmittelwerte SC ΔOD21 Minuten von 1,383 bis 1,819 (Mittelwert ± SD: 1,565 ± 0,114), während die Plattenmittelwert ΔOD21 Minuten für die gehemmte 6-PTU-Bedingung zwischen 0,258 und 0,771 lagen (Mittelwert ± SD: 0,473 ± 0,087). Die Berechnung des ΔOD in diesem Test basiert auf der Differenz zwischen OD0min und OD21min, und die Gültigkeit des Tests wird üblicherweise durch eine Z′-Faktor-Schwelle von >0,5 unterstützt.

Über 10 unabhängige Testdurchläufe erzeugte 6-PTU eine sigmoidale Konzentrations-Antwortkurve mitIC-50-Werten von 1,20E-06 M bis 5,02E-06 M (Mittelwert ± SD: 2,74E-06 M ± 1,13E-06 M). Die Akzeptanzkriterien für die IC50-Werte im Referenzbereich von 1,00E-06 bis 1,00E-05 basieren auf Daten aus früheren Validierungsstudien. Allerdings werden dieIC-50-Werte erheblich von der verwendeten Mikrosomencharge beeinflusst und können erhebliche Variabilitäten aufweisen. Dennoch wird erwartet, dass diese Variationen innerhalb derselben Größenordnung bleiben.

Die Assay-Qualität lässt sich mit dem z′-Faktor zusammenfassen, der sowohl das Signalfenster als auch die Variabilität der Steuerungen widerspiegelt. Im beschriebenen Datensatz waren sechs Referenzkurven mit z′-Faktoren von 0,544 bis 0,774 verknüpft (Mittelwert ± SD: 0,658 ± 0,062), was mit dem häufig verwendeten Akzeptanzziel von z′ > 0,5 übereinstimmt.

In der Praxis können suboptimale Durchläufe durch Abweichungen im Prüferhintergrund und/oder das Nichterfüllen der vordefinierten Akzeptanzkriterien erkannt werden. Beispielsweise zeigt sich ein hoher Hintergrund in der Sandell-Kolthoff-Reaktion, wenn der reine diH₂O-Blank ΔOD > 0,3 zeigt, was eine Untersuchung rechtfertigt (z. B. Reagenzienverunreinigung oder Wasserqualitätsprobleme). Solche Hintergrunderhöhungen können den Dynamikumfang des Tests verringern und die Kontrollvariabilität erhöhen, was zu nicht geschlagenen Akzeptanzkriterien beiträgt, einschließlich eines Z′-Faktors unter 0,5. Brunnen, die offensichtliche technische Artefakte (z. B. Niederschlag oder abnormale Verfärbungen) aufweisen, sind als Ausreißer von der Bewertung ausgeschlossen. Ausreißer, die durch Boxplot-Ausreißertests bestimmt wurden, sind ebenfalls ausgeschlossen. Wenn die Akzeptanzkriterien nach der Entfernung der Ausreißer nicht erfüllt sind, gilt der Testlauf als ungültig und muss wiederholt werden.

Reagenz/PufferInformationen zur Zubereitung
Saure Ammonium-Ceriumlösung (40 mM (NH4)4Ce(SO4)4*2H2O, 0,5 M H2SO4) (250 mL)Füge 6,32 g (NH4)4Ce(SO4)4*2H2O und 125 ml diH2O zu einer 250 mL volumetrischen Kolben. Fügen Sie 125 mL 1 M H2SO4 hinzu, um ein Endvolumen von 250 ml zu erreichen. Lagern Sie bis zu 6 Monaten bei Raumtemperatur.
DTT (Aliquots von 1 M)Aliquot ist eine hergestellte oder gelieferte 1 M DTT-Lösung in H2O als 0,5 mL Aliquots in 1,5 mL Mikrozentrifugenröhren und lagert bei -20°C bis zu 6 Monate.
HEPES (50 mM) / EDTA (2,16 mM) Puffer (pH 7,0)Mit einer 250 ml Volumenkolben geben Sie 12,5 ml 1 M HEPES-Lösung, 201 mg Ethylendiaminetetraetsäure (EDTA) und füllen bis zu 250 ml mit diH2O. Lagere bis zu 3 Monate bei 4°C.
rT3-Lösung ("Substrat-Mischröhrchen")Lösen Sie rT3 in DMSO auf eine Endkonzentration von 6 mM, aliquotieren Sie sie in 10-μL-Portionen in 15-mL-Zentrifugenröhren und lagern sie bei -20°C bis zu 6 Monate.
Natriumarsenitlösung (25 mM NaAsO2, 0,8 M NaCl, 0,5 M H2SO4) (250 ml)Fügen Sie 0,81 g NaAsO2, 11,7 g NaCl und 125 ml diH2O zu einer 250 ml-Volumenkolben hinzu. Fügen Sie 125 mL 1 M H2SO4 hinzu, um ein Endvolumen von 250 ml zu erreichen. Lagern Sie bis zu 6 Monaten bei Raumtemperatur.

Tabelle 1: Vorbereitung von Puffern und Reagenzien. Diese Tabelle beschreibt die Vorbereitungsschritte und Speicheranweisungen für alle Puffer und Lagerlösungen, die im DIO1 SK-Test verwendet werden, einschließlich HEPES/EDTA-Puffer, DTT, rT3-Lösung, saures Ammoniumcerium-Lösung und Natriumarsenitlösung.

Name der Referenzobjekt-VerdünnungReferenzobjekt-Verdünnungskonzentration [M]10% DMSO [μL]ReferenzobjektEndgültige Konzentration des Referenzelements im Assay [M]
RI-C81.00E-0245050 μL 10-1 M Referenzartikel-Lagerlösung1.00E-03
RI-C71.00E-0345050 μL RI-C81.00E-04
RI-C61.00E-0445050 μL RI-C71.00E-05
RI-C53.16E-05342158 μL RI-C63.16E-06
RI-C41.00E-0545050 μL RI-C61.00E-06
RI-C33.16E-0645050 μL RI-C53.16E-07
RI-C21.00E-0645050 μL RI-C41.00E-07
RI-C11.00E-0745050 μL RI-C21.00E-08

Tabelle 2: Vorbereitung von Referenzitem-Verdünnungen. Diese Tabelle fasst die Vorbereitung der seriellen Verdünnungen für das Referenzelement (6-PTU) zusammen, einschließlich Konzentrationen, DMSO-Volumina und endgültigen Konzentrationen im Assay.

Mikrosom pro Bohrloch [μg]diH2O [μL]Mikrosomenverdünnung [μL]Endgültige Enzymkonzentration im Test [μg/mL]
2078020 μL 20 mg/mL Mikrosomen-Stocklösung200
10400400 μL 20 μg Mikrosom pro Bohrloch-Verdünnung100
5400400 μL 10 μg Mikrosom pro Bohrloch-Verdünnung50
2.5400400 μL 5 μg Mikrosom pro Bohrloch-Verdünnung25
1.25400400 μL 2,5 μg Mikrosom pro Bohrloch-Verdünnung12.5
0.68400400 μL 1,25 μg Mikrosom pro Bohrloch-Verdünnung6.8

Tabelle 3: Herstellung von Mikrosomenverdünnungen. Diese Tabelle zeigt das Verdünnungsschema für mikrosomale Proteine pro Bohrloch, einschließlich der erforderlichen Mengen an diH₂O und Mikrosomen-Stocklösung, um die endgültigen mikrosomalen Proteinkonzentrationen für den Test zu erreichen.

AkzeptanzkriterienVorgeschlagener Cut-off-Wert
Numerisch
IC50 des Referenzpunkts [M]1*10-05 - 1*10-06
CV der Schätzung des Referenzelements von Log IC50 [%]< 3
IRA-Negativkontrolle [%]80 - 120
IRA positive Kontrolle [%]< 20
z'-Faktor> 0,5
Binäre
Form des Referenzobjekts (sigmoidal?)Ja
Die endgültige Konzentrations-Antwort-Kurve des Referenzelements besteht aus mindestens sechs Konzentrationen aus drei ReplikatenJa
Die endgültige Konzentrations-Antwortkurve des Testobjekts besteht aus mindestens sechs Konzentrationen aus drei ReplikatenJa

Tabelle 4: Akzeptanzkriterien für den DIO1 SK Assay. Diese Tabelle listet die Akzeptanzkriterien für die Prüfvalidität auf, wie IC₅₀-Bereich, Variationskoeffizient, IRA-Werte für Kontrollen, z'-Faktor und Anforderungen für Konzentrations-Antwort-Kurven. Die Akzeptanzfenster wurden aus zuvor berichteten DIO1-SK-Validierungsstudien6 abgeleitet, einschließlich einer Reproduzierbarkeitsbewertung basierend auf fünf unabhängigen Durchläufen, die das Referenzfenster IC₅₀ beeinflussten. In einem Beispieldatensatz mit 10 unabhängigen Durchläufen reichte die z′-Faktor-Leistung von 0,544 bis 0,774 (Mittelwert ± SD: 0,658 ± 0,062), was die hier verwendete z′-Akzeptanzschwelle unterstützt.

Kategorie (nach Wirksamkeit)Unterkategorie (nach Potenz)HemmungsaktivitätSchwelle
Kategorie 1: vollständiger InhibitorA: Starker vollständiger InhibitorHemmt die DIO1-Aktivität vollständig bei einer Konzentration, die mit dem Referenzelement 6-PTU vergleichbar ist.Max. Hemmung über 90 % und IC50 im oberen IC50-Bereich von 6-PTU oder unterhalb des oberen IC50-Bereichs von 6-PTU
B: Schwacher VollinhibitorHemmt die DIO1-Aktivität vollständig bei höheren Konzentrationen als das Referenzitem 6-PTUMaximale Hemmung größer um 90 % und IC50 oberhalb des oberen IC50 von 6-PTU
Kategorie 2: partieller Inhibitor-Keine vollständige Hemmung, aber größer als negative und lösungsmittelmäßige KontrolleMaximale Hemmung zwischen 25 % und 90 %
Kategorie 3: kein Inhibitor-Hemmt DIO1 nicht (wie Negativ- und Lösungsmittelkontrolle)Maximale Hemmung unter 25 %

Tabelle 5: Klassifikation der Testobjekte basierend auf der Hemmungspotenz und Wirksamkeit der DIO1. Testobjekte werden in drei Wirksamkeitsgruppen (vollständig, partiell oder nicht-inhibitorisch) eingeteilt, basierend auf ihrer maximalen Hemmung der DIO1-Aktivität. Vollständige Inhibitoren werden weiter nach Potenz unterteilt, abhängig von ihrem IC₅₀ relativ zum Referenzitem 6-PTU.

Diskussion

Der DIO1-SK-Assay bietet eine nicht-radioaktive, kosteneffiziente und skalierbare Alternative zu traditionellen Methoden zur Beurteilung von DIO1-Aktivitäten, wie radioaktiven Assays oder Massenspektrometrie. Die Vorvalidierung für menschliche Lebermikrosomen und die starke Übereinstimmung mit SPE-LC-MS/MS-Messungen der Schilddrüsenhormonspiegel bestätigen ihre Zuverlässigkeit und regulatorische Relevanz, wie sich in der Aufnahme in den OECD-Testleitlinien-Arbeitsplan widerspiegelt. Die Einfachheit der Sandell-Kolthoff (SK)-Reaktion macht den Test für Labore ohne fortschrittliche Instrumentierung zugänglich.

Im vorliegenden Protokoll wurden mehrere praktische Aspekte im Vergleich zu zuvor veröffentlichten DIO1-SK-Verfahren detaillierter festgelegt, um Robustheit und Reproduzierbarkeit in einem routinemäßigen 96-Well-Format weiter zu unterstützen. Diese Klarstellungen konzentrieren sich auf die Begründung für das Steuerungskonzept (Lösungsmittel-, Negativ- und Positivkontrollen), die Entscheidung, frisch präparierte Ionenaustauscher-Harzplatten zu verwenden, anstatt zuvor gegossene Platten wiederzuverwenden, sowie auf SK-Reaktionsbedingungen, die die Handhabungsrobustheit bei Mehrwellplattenmessungen verbessern, während die biologische Interpretation mit früheren Standardisierungsarbeiten 6,7 übereinstimmt.

Trotz seiner Stärken müssen mehrere kritische Schritte angegangen werden, um das während der DIO1-vermittelte Umwandlung von rT3 zu T2 freigesetztes Jodid genau zu quantifizieren. Dies wird durch die Sandell-Kolthoff-Reaktion erreicht, die präzises Timing und eine konstante Handhabung der Reagenzen erfordert, um die Reproduzierbarkeit zu gewährleisten. Die SK-Reaktion ist ein schneller katalytischer Prozess, bei dem Iodid die Reduktion von gelbem Cerium (IV) zu farblosem Cerium (III) durch Arsenit beschleunigt; Die Farbänderungsrate ist direkt proportional zur Jodidkonzentration. Da die Reaktion schnell verläuft, sobald die Arsenlösung hinzugefügt wird, ist es unerlässlich, dass die Messung ohne Verzögerung begonnen wird. In einem Plattenformat mit 96 Wellen kann eine langsame oder inkonsistente Zugabe der Arsenlösung zu erheblichen Variabilitäten zwischen den Bohrlöchern führen. Daher wird der Einsatz einer Mehrkanalpipette oder eines automatisierten Dispensers dringend empfohlen, um eine gleichmäßige und schnelle Zugabe von Reagenzen über alle Bohrungen zu gewährleisten.

Um die Vergleichbarkeit zwischen Bohrungen und zwischen Platten zu maximieren, sollte die Reihenfolge der Reagenzzugabe in der SK-Reaktion mit dem beschriebenen Arbeitsablauf konsistent gehalten werden: Cerium ist als chromogenes Substrat vorhanden, und die Reaktion wird durch Arsenitzusatz initiiert, was die Startzeit definiert und daher eine schnelle, synchronisierte Dosierung erfordert. Alternative Reagenzzusatzbestellungen wurden in diesem Aufbau nicht bewertet; Daher wird eine Änderung der Reihenfolge bei der Reproduktion des Protokolls nicht empfohlen. Darüber hinaus kann die Ceriumkonzentration die praktischen Leistungsmerkmale der SK-Anzeige beeinflussen (z. B. Signalfenster und Robustheit). Während 25 mM Cerium während der früheren Assay-Standardisierung als validierte Standardbedingung definiert wurde, zeigten sich höhere Konzentrationen wie 40 mM, die das Signalfenster und den Z′-Faktor erhöhen, ohne dieIC-50-Werte oder die biologische Interpretation zu beeinflussen, wie bereits in früheren Arbeiten6 beschrieben. In diesem Protokoll wird 40 mM Cerium verwendet, um eine vollständige und schnelle Iodidkomplexation unter den Testbedingungen sicherzustellen und die Robustheit sowie Signalstabilität bei routinemäßigen plattenbasierten Messungen zu verbessern. Die Akzeptanzkriterien (z. B. z′-Faktor,IC-50-Werte des Referenzinhibitors) basieren auf der historischen Leistung, die in früheren Validierungsstudien beobachtet wurde, und dienen als routinemäßige Prüfprüfung der Assay-Leistung.

Die Verwendung menschlicher Lebermikrosomen führt zu biologischer Variabilität, sodass die Standardisierung der mikrosomenspezifischen Jodidfreisetzungsaktivität unerlässlich ist. Eine sorgfältige Vorbereitung von Ionenaustauschharz-gefüllten Filterplatten ist notwendig, um eine ungleichmäßige Harzverteilung über die Filterplatte zu vermeiden und eine vollständige Trennung von Jodid von potenziell störenden Substanzen sicherzustellen. Im Hinblick auf den Harz-Workflow wurde frisch gegossene Ionenaustauscher-Harz-gefüllte Filterplatten gewählt, um das potenzielle Risiko zusätzlicher Variabilität durch Harzsättigung, Iodid- oder Proteinübertragung sowie einen möglichen Verlust der Bindungseffizienz bei Wiederverwendung zu minimieren. Die Wiederverwendung von Harz- und Filterplatten ist technisch machbar, könnte jedoch einige Risiken bergen, die in dieser Studie nicht systematisch bewertet wurden. Sie kann Batch-zu-Batch-Drift verursachen, wenn die Harzbindungskapazität reduziert wird oder wenn Restmatrixkomponenten nach vorherigen Durchläufen im Harzbett verbleiben. Für Labore, die das Recycling in Betracht ziehen, ist eine pragmatische Empfehlung, die Harzleistung nach der Wiederverwendung zu validieren (z. B. durch Überwachung des Hintergrund- und Standardkurvenverhaltens und die Sicherstellung einer konsistenten Jodiderfassung) und die Wiederverwendung einzustellen, wenn erhöhter Hintergrund, verringerter Dynamikumfang oder inkonsistente Trennung festgestellt wird. Es wird empfohlen, harzgefüllte Filterplatten für den einmaligen Gebrauch zu verwenden, da dieses Protokoll speziell auf dieser Methode basiert.

Zusätzlich muss die Löslichkeit jedes Testobjekts in einem geeigneten Vehikel bestimmt werden, da die maximale getestete Konzentration durch die Löslichkeit begrenzt ist (typischerweise bis zu 1 mM mit 1 % DMSO). Da alle Testverbindungen in DMSO als Lösungsmittel angewendet werden, definiert die Lösungsmittelkontrolle die Ausgangsaktivität von DIO1 unter assay-relevanten Bedingungen und dient als die geeignetste Referenzbedingung für Normalisierung und Vergleich. Im Gegensatz dazu wurde 1-Thio-β-D-Glukosenatriumsalz als Negativkontrolle einbezogen, da es strukturell der positiven Kontroll-Aurothioglukose (ATG) ähnelt, aber chemisch inert hinsichtlich der Iodothyronin-Dejodinierung ist und weder die mikrosomalen Redoxsysteme noch die katalytische Aktivität von DIO1 beeinträchtigt. Seine Aufnahme hilft, echte DIO1-spezifische Effekte von unspezifischen Effekten im Zusammenhang mit Verbindungszusätzen, Handhabung oder Wechselwirkungen in der Assay-Matrix zu unterscheiden. Eine No-Treatment/No-Vehicle-Kontrolle wurde nicht als primäre Referenzbedingung verwendet, da sie nicht die tatsächliche Prüfumgebung widerspiegeln würde, in der DMSO in allen mit Verbindungen behandelten Brunnen vorhanden ist; daher ist die Lösungsmittelkontrolle die relevante Grundlage für die Analyse.

Die Fehlersuche konzentriert sich auf die Identifizierung von Störungen in der SK-Reaktion. Jodhaltige, chelatierende oder stark oxidierende Substanzen können die kolorimetrische Anzeige 14,17,18 künstlich beeinflussen. Um dies zu beheben, beinhaltet das Protokoll Interferenztests ohne Mikrosomen. Darüber hinaus kann die Verwendung von Dithiothreitol (DTT) als Cofaktor auch zu einer freisetzenden nicht-enzymatischen Jodid aus bestimmten Testsubstanzen führen. In solchen Fällen werden orthogonale Methoden wie SPE-LC-MS/MS empfohlen, um die DIO1-Hemmung zu bestätigen. Unspezifische Interferenzen durch allgemeine Denaturierungseffekte (z. B. Tenside) können Fehlalarme erzeugen, daher kann eine allgemeine Strategie zur Identifizierung von Häufigen Treffern mit in silico-Werkzeugen oder integrierten Testansätzen wertvoll sein.

Der Test hat mehrere Einschränkungen. Es ist anfällig für Interferenzen durch Teststoffe, die unabhängig von der DIO1-Aktivität mit Testkomponenten reagieren oder Iodid freisetzen. Der Test unterscheidet nicht zwischen spezifischer Hemmung von DIO1 und unspezifischen Eingriffen in die Enzymfunktion oder strukturelle Integrität. Um die Spezifität zu verbessern, kann die Hemmung zusätzlicher mikrosomaler Enzyme parallel analysiert werden, und der Vergleich inhibitorischer Potenzen verschiedener Enzymassays kann weitere Hinweise liefern.

Eine weitere Strategie zur Identifizierung möglicher Artefakte besteht darin, Integritäts- oder Viabilitätstests einzubeziehen, wie sie üblicherweise bei zellbasierten In-vitro-Assays durchgeführt werden, um die maximale Testkonzentration zu bestimmen. Während ein direkter Integritätstest für den DIO1-SK-Test fehlt, ermöglicht seine Verwendung in einer in-vitro-Testbatterie die Integration von Zytotoxizitätsdaten anderer zellbasierter Tests zur Konzentrationsauswahl. Wenn solche Kreuzassay-Informationen nicht verfügbar sind, ist die obere Konzentration im DIO1-SK-Test durch die Löslichkeit begrenzt, die möglicherweise keine relevanten in vivo Expositionen widerspiegelt. Allerdings können toxikokinetische Ansätze verwendet werden, um In-vitro-Testkonzentrationen besser zu definieren und zu interpretieren.

Der DIO1-SK-Assay ist besonders wertvoll für toxikologische Screenings und mechanistische Untersuchungen endokriner Störungen. Es behandelt ein zentrales Ereignis der Schilddrüsenhormon-Homöostase und kann in In-vitro-Testbatterien integriert werden. Seine Robustheit, Reproduzierbarkeit und Anpassungsfähigkeit an unterschiedliche Laborumgebungen und Durchsatzanforderungen machen es zu einem wertvollen Werkzeug für die Bewertung der chemischen Sicherheit und regulatorische Validierung. Der Test liefert eine robuste in-vitro-Messung der DIO1-Hemmung unter standardisierten Bedingungen und unterstützt die Klassifikation von Teststoffen im Vergleich zu einem gut charakterisierten Referenzinhibitor (6-PTU). Allerdings sind in-vivo-Daten zur DIO1-Hemmung rar, und eine direkte Korrelation der in-vitro-DIO1-Hemmungsergebnisse mit in-vivo-Effekten ist daher derzeit nicht anwendbar, um die Prädiktivität in vivo zu schätzen. Dementsprechend sollten Testergebnisse als mechanistische Belege für eine Störung eines Schlüsselereignisses im Schilddrüsenhormonstoffwechsel interpretiert und mit weiteren Beweislinien (z. B. anderen Schilddrüsen-MoA-Tests und orthogonalen Messungen, wo erforderlich) integriert werden. Wichtig ist, dass der DIO1–SK-Assay in mehreren validierungsorientierten Studien (Optimierung/Standardisierung, Prädiktivitätsbewertung und Robustheits-/Genauigkeitsanalyse) evaluiert wurde, und während die Methode sich der OECD-Implementierung nähert, bietet der vorliegende Artikel ein Maß an schrittweiser Verfahrensdetails, das den Transfer und die konsistente Umsetzung über weitere Labore hinweg erleichtern soll.

Offenlegungen

Die Autoren K.S., N.H, D.F.-W. und R.L. sind Mitarbeiter von BASF SE, einem Chemieunternehmen, das den DIO1-Test in Zukunft zur Entwicklung und Registrierung kommerzieller Produkte nutzen könnte.

Danksagungen

Die Autoren möchten Dr. Andreas Weber für seine Arbeit während der ersten Einrichtung des DIO1-SK-Tests danken.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1-Thio-β-D-GlukosenatriumsalzSigma-AldrichT6375-1GCAS 10593-29-0
3,3',5'-Triiodothyronin (rT3) Santa Cruz BiotechnologieSC-209692CAS 5817-39-0
6-Propyl-2-Thiouracil (6PTU)SupelcoP3755-10GCAS 51-52-5
EssigsäureThermo Fisher9526-33CAS 64-19-7
Analytisches GleichgewichtNANAin der Lage, bis zu 30 g mit 0,1 mg Lesbarkeit genau zu wiegen
Arsen-Natriumoxid (NaAsO2)Thermo Fisher041533.APCAS 7784-46-5
Prüfplatten (96-Well-Format)MerckZ707902-108EAz. B. Gewebekulturplatten, 96-Well-Platte, flacher Boden, Polystyrol, 0,34 cm², steril, 108/cs, TPP
Aurothioglukose (ATG)Sigma-AldrichA0606-5MGCAS 12192-57-3
Zentrifugenröhren 15 und 50  mLMerckZ707724-800EA, Z707716-320EAz. B. TPP-Zentrifugenröhren, Volumen 15 und 50 mL, Polypropylen & nbsp;
Zentrifuge mit ausschwenkbarem Rotor für MikrotiterplattenNANASollte hoch genug sein, um eine 96-tiefe Bohrlochplatte mit 96-Tiefen-Filterplatte oben (mindestens etwa 6 cm hoch) zu passen.
Cerium(IV)-Ammoniumsulfat (Ce(NH4)4(SO4)4)Sigma-Aldrich22269-100G-FCAS 10378-47-9
CO2-InkubatorNANAin der Lage, Temperaturen von 37 °C zu halten; C, 5 % CO2 und ≥ 90 % Luftfeuchtigkeit
Tiefenbohrplatten (96-Bohrloch-Format)Supelco575653-Uz. B. SPE 96-Deep Square Well Collection Plate, Bohrlochvolumen 2 mL, Polypropylen
Dimethylsulfoxidid (DMSO)AppliChemA3672.0250CAS 67-68-5
Dithiothreitol (DTT)Sigma-AldrichD9779-1GCAS 3483-12-3
Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) Sigma-AldrichAPO456787707-500GCAS 6381-92-6
Filterplatten (96-Well-Format)MerckWHA77002810z. B. Micro-Plates, 96-Well, klares Polystyrol, 800 & Mikro; L, DNA-Bindung, Whatman
Gasdichte PlattenversieglerThermo Fisher232698z. B. Dichtband, Polyester, steril, Dichtband, Polyester, steril, Nunc
HEPESPan BiotechP05-01100CAS 7365-45-9
Menschliche LebermikrosomenBiovitX008070z. B. INVITROCYP 150-Spender-Pooled Human Liver Liver Microsome
Iodid (IC-Standard)Supelco41271-100MLz. B. Iodid-Standard für IC, 1000 mg/L in Wasser, Sigma-Aldrich
Ionenaustauschharz wie Dowex 50WX2Roth334.4CAS 12612-37-2; Mesh 100-200
Mikrozentrifugenröhren 1,5 & Nbsp; mLMerckEP0030120086-1PAKz. B. Eppendorf® Safe-Lock-Mikrozentrifugenröhren, Volumen 1,5 mL, natürlich
Mehrkanal-Dispenser, der 50 bis 300 Nbsp liefern kann; &Mikro; L pro SchrittNANANA
Mehrkanal-Pipetten, die 10 bis 100 Nbsp liefern können; &Mikro; L pro SchrittNANANA
pH-Messgerät mit Elektrode und KalibrierungspuffernNANAin der Lage, +/- 0,1 pH-Einheiten auszulesen
Photometer zur AbsorptionsmessungTecan Trading AGNAz. B. Sunrise Absorption Reader, INSTSUN-3
Pipeten, die 1 bis 10 Zoll liefern können; &Mikro; LNANANA
Pipeten, die 10 bis 100 Zoll abgeben können; &Mikro; LNANANA
Pipeten, die 100 bis 1000 Zoll abgeben können; &Mikro; L NANANA
Pipeten für höhere VoluminaNANAserologische Pipetten, z. B. 10, 25, 50 mL
PlattenschüttlerThermo FisherNAz. B. Thermo Scientific H+P MONOSHAKE VORTEXER Mikrotiterplatte, direkt gesteuert
Repeater-PipetteNANANA
Natriumchlorid (NaCl)Sigma-AldrichS9888-25GCAS: 7647-14-5, z. B. Natriumchlorid, ACS-Reagenz, ≥ 99.0 %
StatistiksoftwareNANAIn der Lage, Regressionsanalysen durchzuführen, die die Assay-Eigenschaften widerspiegeln, und in der Lage, inhibitorische Konzentrationen zu berechnen, z. B. GraphPad Prims 8, GraphPad
Schwefelsäure (H2SO4) Supelco1007311000CAS 7664-93-9
Volumetrische FlascheNANAzertifiziert mit definiertem Volumen

Referenzen

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