Methodenartikel

Isolierung und Identifikation primärer fibroblastähnlicher Synovialzellen bei Patienten mit rheumatoider Arthritis

DOI:

10.3791/70116

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24. Februar 2026

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1Graduate School, Beijing University of Chinese Medicine, 2Department of TCM Rheumatology, China-Japan Friendship Hospital, 3Beijing Key Lab for Immune-Mediated Inflammatory Diseases, China-Japan Friendship Hospital

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieses Protokoll beschreibt die Methode zur Isolierung und Identifizierung hochreiner primärer fibroblastähnlicher Synovizyten (FLS) aus Synovialgewebe von Patienten mit rheumatoider Arthritis zur zuverlässigen Krankheitsmodellierung und Arzneimittelscreening.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rheumatoide Arthritis (RA) ist eine chronische autoimmune entzündliche Erkrankung, die durch Synovialhyperplasie und fortschreitende Gelenkzerstörung als primäres pathologisches Merkmal gekennzeichnet ist. Fibroblast-ähnliche Synoviozyten (FLS) gelten als zentrale zelluläre Komponenten der RA-Pathogenese und zeichnen sich durch ihr aggressives, tumorartiges Verhalten aus, das Knorpel- und Knochenabbau vermittelt. Die Isolierung und Reinigung von rheumatoiden Arthritis-Fibroblast-ähnlichen Synovizyten (RA-FLS) ist ein entscheidendes Instrument zur Untersuchung von Krankheitsmechanismen und zur Bewertung potenzieller therapeutischer Medikamente. Hier präsentieren wir ein umfassendes Protokoll zur Isolierung, Kultivierung und funktionellen Validierung des primären menschlichen RA-FLS aus entfernten Synovialgewebeproben, die während einer Kniegelenkersatzoperation bei RA-Patienten entnommen wurden. Diese Methode nutzt frisches Synovialgewebe und verwendet einen sequentiellen enzymatischen Verdauungsprozess mit Trypsin und Kollagenase Typ II, um die Isolierung von RA-FLS aus der Gewebematrix zu maximieren. Schließlich wird die Zellbestimmung durch Vimentin-Immunfluoreszenz und Durchflusszytometrie erreicht, ergänzt durch die funktionelle Bewertung der TNF-α-induzierten Proliferation. Dieses Protokoll ermöglicht die Aufnahme hochreiner RA-FLS-Kulturen mit spezifischen phänotypischen Eigenschaften und entzündlicher Reaktionsfähigkeit und bietet Forschern eine zuverlässige Methode, um kurzfristig kultivierte, patientenabgeleitete RA-FLS zu erhalten, die für Arzneimittelscreening, mechanistische Studien und Tissue Engineering geeignet sind.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rheumatoide Arthritis (RA) ist eine chronische autoimmune entzündliche Erkrankung, die durch symmetrische Polyarthritis der peripheren Gelenke gekennzeichnet ist, mit einer geschätzten globalen Prävalenz von 0,5 % bis 1 % und dem Potenzial, verschiedene systemische und extraartikuläre Komplikationen auszulösen 1,2,3,4,5. Das zentrale pathologische Merkmal der RA ist eine chronische Synovitis, die durch Autoimmunreaktionen vermittelt wird und zudem zur Bildung invasiven Pannusgewebes führt, das den Gelenkknorpel und den subchondralen Knochen 6,7 erodiert. Unter diesen stellt die Synovitis das früheste und zentralste pathologische Merkmal der RA dar. Fibroblast-ähnliche Synoviozyten (FLS), die als vorherrschende residente Zellen des Synoviums leben, sind entscheidend für die Orchestrierung sowohl der Synovialentzündung als auch der Knochenzerstörung 8,9. Während der synovialen Entzündungsreaktion bei RA verlieren rheumatoide Arthritis-Fibroblast-ähnliche Synovizyten (RA-FLS) ihren normalen "regulatorischen" Phänotyp und zeigen stattdessen ein "pro-inflammatoriskes" Profil10. Diese Verschiebung führt zur massiven Produktion entzündlicher Zytokine, die verwandte Energiestoffwechselwege aktivieren können, was zu einer erhöhten Zellproliferation führt und die synovialen Entzündungskaskade 11,12,13 weiter verstärkt. Gleichzeitig interagieren RA-FLS mit anderen Immuncellen (wie Makrophagen, T-Zellen und B-Zellen), um einen anhaltenden chronischen Entzündungszustand 14,15 aufrechtzuerhalten. Darüber hinaus zeigen RA-FLS krebsähnliche Merkmale, darunter eine erhöhte Migrationskapazität, Invasivität, unkontrollierte Proliferation und Resistenz gegen Apoptose, und sind aktiv an den Prozessen von Knorpel- und Knochenerosionbeteiligt.

In den letzten Jahren wurde FLS häufig als In-vitro-Modelle zur Untersuchung von gelenkentzündlichen Erkrankungen wie RA verwendet, ein Trend, der teilweise durch die Einschränkungen der aktuellen Erstlinien-Pharmakotherapien 17,18,19 verursacht wird. Sie werden in 2D-Kulturen, 3D-Modellen und Organ-on-a-Chip-Systemen eingesetzt, um Krankheitsmechanismen zu untersuchen, therapeutische Ziele zu validieren und Medikamententests durchzuführen 20,21,22,23. Darüber hinaus dienen RAFLS als Grundlage für fortgeschrittene Anwendungen, einschließlich von Patienten abgeleiteter synovialer Organoide zur Vorhersage der DMARD-Reaktion; genetische Editierung mittels CRISPR/Cas9 zur Untersuchung der Genfunktion im RA-Fortschreiten; und als Zellquelle für die Entwicklung funktioneller synovialer Gewebetransplantate 24,25,26.

Die Gewinnung kurzfristig kultivierter RA-FLS aus dem Synovialgewebe von rheumatoiden Arthritis-Patienten dient als erster Schritt für viele Experimente. Im Vergleich zu FLS-Zelllinien behalten kurzfristig kultivierte, patientenabgeleitete RA-FLS die interpatientische Heterogenität und krankheitsspezifische Merkmale, was eine authentischere Darstellung krankheitsbedingter transkriptioneller Faktoren und regulatorischer Unterschiede ermöglicht. Folglich können Zellausbeute, Wachstumsrate und funktionelle Leistung von patientenspezifischen Faktoren wie Alter, Krankheitsdauer, Medikamentengeschichte und Krankheitsaktivität beeinflusst werden, was zu einer gewissen Variabilität zwischen den Chargen führt. Forscher sollten daher vor der Anwendung den klinischen Hintergrund der Gewebequelle bewerten und Experimente in frühen Durchgängen (P3-P7) durchführen, um die phänotypische Stabilität der Zellen zu erhalten.

Diese Studie beschreibt ein vereinfachtes Protokoll zur Extraktion und Identifizierung von RA-FLS aus Knie-Synovialgewebe. Die Methode verwendet sequentielle enzymatische Verdauung (Trypsin gefolgt von Typ-II-Kollagenase) in Kombination mit sanfter mechanischer Dissoziation. Belege deuten darauf hin, dass solche optimierten, mehrstufigen enzymatischen Strategien im Allgemeinen besser abschneiden als Einzelenzym- oder nicht-sequentielle Mischenzymtherapien, die die Zelllebensfähigkeit und den Phänotyp 27,28,29,30 beeinträchtigen können. Im Vergleich dazu ermöglicht das vorgestellte Protokoll eine effizientere und sanftere Isolierung von RA-FLS mit hoher Lebensfähigkeit und hoher Reinheit, wodurch Zellschäden und phänotypischer Verlust minimiert werden, um die Eignung für nachgelagerte funktionelle Tests sicherzustellen.

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Protokoll

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Diese Studie sammelte Synovialgewebe von Patienten mit rheumatoider Arthritis, die sich einer Gelenkersatzoperation im China-Japan Friendship Hospital unterzogen. Alle Patienten gaben vor der Operation eine schriftliche informierte Einwilligung ab. Die gesammelten Informationen und biologischen Proben wurden mit strengen Maßnahmen behandelt, um die Privatsphäre und die Datensicherheit der Patienten zu gewährleisten. Alle verbleibenden Synovialgewebeproben wurden gemäß den Biosicherheitsvorschriften entsorgt. Die Verwendung von Kniesynovialgewebe von Patienten mit rheumatoider Arthritis in dieser Studie wurde vom Ethikausschuss des China-Japan Friendship Hospital genehmigt (Genehmigungsnummer: 2025-KY-223). Die Reagenzien und die verwendeten Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Aufnahme und Vorbereitung von Synovialgewebe

HINWEIS: Geben Sie das während der Operation gewonnene Synovialgewebe in einen sterilen Behälter mit 0,9 % Kochsalzlösung oder PBS, um eine Kontamination beim Transport vom Operationssaal in den Biosicherheitsschrank zu verhindern. Verwenden Sie Ethanol-Immersion, gefolgt von einem Waschen mit einer Penicillin-Streptomycin-Lösung als entscheidende Schritte, um bakterielle oder pilzbedingte Kontaminationen zu verhindern und so den Erfolg der folgenden Experimente sicherzustellen.

  1. Frisches Synovialgewebe in ein 50-mL-Zentrifugenrohr mit PBS eintauchen und in einen Biosicherheitsschrank übergeben.
  2. Das Synovialgewebe wird in eine Petrischaal mit 75 % Ethanol übertragen und 30 Sekunden lang zur Desinfektion eingetaucht.
  3. Entfernen Sie Fett und Knochengewebe aus dem Synovialgewebe mit steriler chirurgischer Schere und Pinzette und übertragen Sie das verbleibende Gewebe dann in eine neue Kulturschale.
  4. Waschen Sie das gewonnene Synovialgewebe dreimal mit PBS, das 10 % Penicillin/Streptomycin enthält.

2. Verdauung des Synovialgewebes

HINWEIS: Verwenden Sie Trypsin, um Zellverbindungen und die extrazelluläre Matrix im Synovialgewebe für die anschließende Isolierung zu stören. Typ-II-Kollagenase wird gezielt angewendet, um die extrazelluläre Matrixstruktur selektiv abzubauen und so die Dissoziation der Zelle von der Matrix zu erleichtern. Sterilisieren Sie alle chirurgischen Scheren, Zangen und Zellsiebe, die für die Synovialgewebedissektion benötigt werden, durch Autoklavierung vor der Anwendung. Nach der Verdauung sollten die Gewebefragmente gelockert erscheinen, mit ausgefransten Rändern, und das Medium kann leicht trüb werden. Unverdautes Gewebe bleibt kompakt und undurchsichtig.

  1. Schneiden Sie das Gewebe wiederholt mit der Schere in 1 mm × 1 mm Fragmente.
  2. Gib 0,25 % Trypsin ins Gewebe und verdaut es bei 37 °C in einem Shaker bei konstanter Temperatur (bei 100–150 U/min) oder in einem Zellinkubator für 30 Minuten.
  3. Bereiten Sie eine 10%ige fetale Rinderserumlösung (FBS) mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) vor.
  4. Das Gewebe wird je nach Gewebemenge in 15 mL oder 50 mL Zentrifugenröhren übertragen und es mit PBS neutralisiert und verdauen, das 10 % fetales Rinderserum (FBS) enthält.
  5. Zentrifugieren (4 °C, 500 × g, 5 min), dann den Überstandsstoff entsorgen und das Pellet zurückhalten.
  6. Setzen Sie das Pellet in PBS wieder auf.
  7. Zentrifugiere (4 °C, 500 × g, 5 min), entsorge dann das Überstandsmittel und behalte das Pellet.
  8. Fügen Sie 100 mg Typ-II-Kollagenase zu 50 ml DMEM-Medium hinzu, um eine 2 mg/mL Typ-II-Kollagenase-Lösung herzustellen.
  9. Filtern Sie die vorbereitete Typ-II-Kollagenase-Lösung durch eine 0,22 μm-Membran zur Sterilisation.
  10. Fügen Sie 2 mg/ml Typ-II-Kollagenase hinzu und verauen Sie sie in einem 37 °C Shaker bei konstanter Temperatur (bei 100-150 U/min) oder einem Zellinkubator für 4 Stunden.

3. Isolierung und Kultur von fibroblastähnlichen Synoviozyten

HINWEIS: Führen Sie alle Zellkulturverfahren an einem Biosicherheitsschrank unter sterilen Bedingungen durch und tragen Sie sterile Handschuhe, um eine Kontamination zu verhindern.

  1. Bereiten Sie das vollständige DMEM-Medium vor, indem Sie das DMEM-Basalmedium mit 10 % fetalem Rinderserum, 100 U/mL Penicillin und 100 μg/mL Streptomycin ergänzen.
  2. Setzen Sie ein 100-Mesh-Zellsieb auf eine sterile Petrischüssel und gießen Sie das verdaute Synovialgewebe und die Flüssigkeit auf das Sieb.
  3. Übertragen Sie das Zellsieb mit Restgewebe in eine andere sterile Petrischale.
  4. Mahlen Sie das verbleibende Gewebe am Sieb mit dem Ende einer 20-ml-sterilen Spritze, bis nur noch weiße, faserige Reste übrig sind und keine weitere Zellsuspension exprimiert werden kann.
  5. Spülen Sie das Sieb mit einem passenden Volumen vollständigen DMEM-Mediums ab.
  6. Sammeln Sie alle Filtrate, zentrifugieren Sie (4 °C, 500 × g, 5 min) und entsorgen Sie das Übersetzungsmittel.
  7. Das Pellet in PBS wieder suspendieren, zentrifugieren (4 °C, 500 × g, 5 Min) und das Supernatant entsorgen.
  8. Lassen Sie die Zellen in einem vollständigen DMEM-Medium wieder suspendieren.
  9. Führen Sie Zellzählungen durch und übertragen Sie die Zellen in eine Kulturflasche.
  10. Inkubieren Sie die Flasche in einem Zellkulturinkubator (37 °C, 5 % CO₂).
  11. Ersetze das Medium nach 48 Stunden.
  12. Verdauen Sie die Zellen mit Trypsin und Passage im Verhältnis 1:3, wenn sie eine vollständige Konfluenz erreichen.

4. Identifizieren Sie RA-FLS mittels Vimentin-Immunfluoreszenzfärbung

HINWEIS: Vorwärmen Sie die PBS-Lösung, die zur Zellreinigung verwendet wird, in einem Wasserbad, das auf 37 °C eingestellt ist. Alle in diesem Abschnitt angegebenen Reagenzvolumina sind für ein 48-Well-Plattenformat standardisiert. Die Volumina sollten proportional anhand der Wachstumsfläche skaliert werden, wenn Platten eines anderen Formats verwendet werden.

  1. Man verdaue die Zellen mit Trypsin, suspendiere die entnommenen Zellen neu und verdünne sie mit einem vollständigen DMEM-Medium auf 1 × 104 Zellen /L.
  2. Säe RA-FLS in eine 48-Well-Platte mit 200 μL pro Bohrloch.
  3. In einen Zellkulturinkubator (37 °C, 5 % CO₂) gelegt und 24 Stunden inkubieren.
  4. Entsorge das Medium und wasche die Zellen dreimal mit vorgewärmtem PBS.
  5. Fügen Sie 4 % Paraformaldehyd zur Fixierung der Zellen für 10 Minuten hinzu, entsorgen Sie das Fixativ und waschen Sie dreimal mit PBS.
  6. Bereiten Sie pro Bohrloch 150 μL 0,1 % Triton X-100 Lösung in PBS vor. Sorgen Sie für vollständiges Mischen durch Vortex oder sanfte Inversion vor der Benutzung.
  7. Gib 0,1 % Triton X-100-Lösung zu den Bohrlöchern und inkubiere 10 Minuten lang, um die Zellen zu permeabilisieren.
  8. Entsorge die 0,1%ige Triton X-100 Lösung und wasche dreimal mit PBS.
  9. Fügen Sie pro Brunnen 150 μL tierfreie Blocklösung hinzu und inkubieren Sie 1 Stunde bei Raumtemperatur.
  10. Verwerfen Sie die Blockierungslösung. Fügen Sie 150 μL Vimentin primäre Antikörper-Arbeitslösung (verdünnt 1:200 im Antikörperverdünner) zu jedem Brunnen hinzu.
  11. Inkubieren Sie über Nacht mit einem primären Antikörper bei 4 °C.
  12. Entsorgen Sie den primären Antikörper und waschen Sie die Zellen fünfmal mit PBS.
  13. Fügen Sie pro Bohrloch 150 μL Alexa Fluor 488-konjugierten Anti-Kaninchen-IgG-Sekundärantikörper (verdünnt 1:50 im universellen Antikörperverdünner) hinzu und inkubieren Sie bei 37 °C für 1 Stunde Lichtschutz.
  14. Entsorge den sekundären Antikörper und wasche die Zellen dreimal mit PBS.
  15. Gib pro Muld einen Tropfen DAPI-haltiges Antifade-Montagemedium hinzu und trockne 10 Minuten im Dunkeln.
  16. Beobachten und nehmen Sie Bilder mit einem invertierten Fluoreszenzmikroskop auf, das mit einem 20×-Objektiv und geeigneten Filtersätzen für DAPI und FITC/GFP ausgestattet ist.
    HINWEIS: Waschen Sie die Zellen mit PBS, indem Sie die Brunnen vollständig mit PBS füllen, 5 Minuten inkubieren und dann das PBS entfernen. Dieses Verfahren umfasst einen Waschzyklus.

5. Quantifizierung von RA-FLS und Beurteilung der Reinheit mittels Durchflusszytometrie

HINWEIS: Verwenden Sie Vimentin und CD90 als positive Marker zur Identifizierung von RA-FLS, während CD68, CD14 und CD11b als negative Kontrollfaktoren angewendet werden, um eine Immunzellkontamination auszuschließen. Vimentin dient als intrazelluläres, intermediäres Filamentprotein, das überwiegend im Zytoplasma von RA-FLS lokalisiert ist. CD90 fungiert als kritischer Oberflächenmarker, der auf RA-FLS hoch exprimiert wird und seine Unterscheidung von Immunzellen ermöglicht. Während CD68, CD14 und CD11b speziell in Makrophagen, Monozyten und myeloischen Zellen exprimiert werden, werden sie als negative Marker eingesetzt, um eine Immunzellkontamination auszuschließen. Fluorochrome werden Zelloberflächenmarkern basierend auf ihrer Bindungsspezifität zugewiesen und keine Überschneidungen in den Fluoreszenzkanälen sichergestellt. Zum Beispiel teilen sich in diesem Experiment CD90 und CD68 dasselbe Fluorochrom; daher sollten sie nicht in dasselbe Zentrifugenrohr gegeben werden. Vor der Inkubation mit Vimentin-Antikörpern sollten Fixations- und Permeabilisierungsmittel hinzugefügt werden, um die Zellmembran zu stören. Wenn das Durchflusszytometer genügend fluoreszierende Kanäle hat, können Marker wie CD90 und CD68 verschiedenen Kanälen für eine mehrfarbige Simultananalyse zugewiesen werden, um die Detektionseffizienz und den Informationsinhalt weiter zu verbessern.

  1. Verdauen Sie RA-FLS der dritten Generation mit EDTA-freiem Trypsin.
  2. Beenden Sie die Verdauung mit einem vollständigen DMEM-Medium, zentrifugieren (4 °C, 500 × g, 5 min) und entsorgen Sie den Überwasserstoff.
  3. Das Pellet in PBS wieder suspendieren, Zellzählungen durchführen und die Zellkonzentration mit PBS auf 1 × 10⁶ Zellen/mL anpassen.
  4. Verteilt die Zellen auf drei Zentrifugenröhren und fügt jedem Röhrchen 200 μL Zellsuspension hinzu.
  5. Fügen Sie CD11b-Antikörper (verdünnt 1:100 im universellen Antikörperverdünner) mit einem Endvolumen von 100 μL in Röhre 1 hinzu. Vortex zum Mixen.
    1. Nach 15 Minuten Inkubation 1 ml Fixierungs-/Permeabilisierungsmittel in Röhre 1 geben, Vortex zum Mischen geben und 30 Minuten vor Licht geschützt inkubieren.
    2. Fügen Sie 1 mL Fixations-/Permeabilisierungspuffer in Röhre 1 hinzu, um die Permeabilisierung zu beenden, den Wirbel zum Mischen, zentrifugieren (4 °C, 500 × g, 5 min) und entsorgen Sie den Supernatanten.
    3. Bereite 100 μL Vimentin und CD68-Antikörpercocktail vor (jeweils verdünnt um 1:100 in universellem Antikörper-Verdünner), gib es in Tube 1, wirbe den Vortex zum Mischen und inkubiere 30 Minuten lang geschützt vor Licht.
    4. Fügen Sie 1 mL Fixations-/Permeabilisierungspuffer in Röhre 1 hinzu, Vortex zum Mischen, zentrifugieren (4 °C, 500 × g, 5 min) und entsorgen Sie den Überstandsstoff.
    5. Fügen Sie 1 Tube 1 100 μL Alexa Fluor 488-konjugierten Anti-Kaninchen-IgG-Sekundärantikörper (verdünnt 1:50 im universellen Antikörperverdünner) hinzu. Vortex mischt und brütet 30 Minuten lang geschützt vor Licht.
    6. 1 ml Puffer in Röhre 1 geben, Vortex zum Mischen verwenden, zentrifugieren (4 °C, 500 × g, 5 Min) und das Supernatant entsorgen.
    7. Fügen Sie 300 μL Puffer in Röhre 1 hinzu und Vortex zum Mischen für die Ladeprobe.
  6. Fügen Sie CD90- und CD14-Antikörper (jeweils 1:100 im universellen Antikörperverdünner verdünnt) zu Röhre 2 zu einem Endvolumen von 100 μL hinzu. Lassen Sie Röhre 3 ohne Antikörper als Negativkontrolle.
    1. Nach 15 Minuten Inkubation gib 1 mL PBS in Röhren 2 und 3.
    2. Zentrifugieren Sie Röhren 2 und 3 (4 °C, 500 × g, 5 min), entsorgen Sie das Supernatant, fügen Sie 300 μL Puffer hinzu und wirbeln zum Mischen für die Ladeprobe.
  7. Führen Sie eine Durchflusszytometrie-Erfassung der vorbereiteten Proben durch.
  8. Analysieren Sie die Flowzytometriedaten und führen Sie Statistiken mit kompatibler Software durch.

6. Messung der TNF-α-induzierten RA-FLS-Proliferation mittels MTS-Assay

  1. Verdauen Sie RA-FLS der dritten Generation mit EDTA-freiem Trypsin.
  2. Beenden Sie die Verdauung mit einem vollständigen DMEM-Medium, zentrifugieren (4 °C, 500 × g, 5 min) und entsorgen Sie den Überwasserstoff.
  3. Das Pellet wird in einem vollständigen DMEM-Medium wieder suspendiert, Zellzählungen durchgeführt und auf 1 × 10⁵ Zellen/L verdünnt.
  4. Säe die resuspendierten Zellen in eine 96-Well-Platte mit 100 μL pro Bohrloch.
  5. Inkubieren Sie die Platte in einem Zellkulturinkubator, bis eine Zelladhäsion eintritt, und teilen Sie sie dann in leere Kontroll- und Interventionsgruppen auf.
  6. Fügen Sie der Interventionsgruppe 10 ng/mL TNF-α hinzu und der leeren Kontrollgruppe ein gleiches Volumen PBS.
  7. Nach 24 Stunden Intervention werden 10 μL MTS-Reagenzen zu jedem Brunnen hinzugefügt und die Inkubation im Zellkulturinkubator fortgesetzt.
  8. Nach 1 Stunde Inkubation wird die Absorptionskraft (OD) bei 490 nm mit einem Mikroplattenmesser gemessen.
  9. Berechnen Sie die Lebensfähigkeit der Zellproliferation anhand des OD-Werts jedes Bohrlochs.

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Ergebnisse

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Mit dem Protokoll konnten wir erfolgreich kurzfristig kultiviertes, patientenabgeleitetes RA-FLS isolieren. Ein schematisches Diagramm des prozeduralen Workflows wird bereitgestellt (Abbildung 1). Unter Lichtmikroskopie zeigte das RA-FLS einen vorherrschenden morphologischen Phänotyp von spindelförmigen und unregelmäßigen polygonalen Zellen. Die Zellen zeigten eine umfangreiche zytoplasmatische Ausbreitung mit verlängerten Prozessen. Die Zellgrenzen erschien...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll etabliert eine reproduzierbare Methode zur Isolierung und kurzfristigen Kultur von RA-FLS bei RA-Patienten, deren Erfolg sich in hoher Zelllebensfähigkeit, einem charakteristischen Phänotyp, spezifischer Markerexpression und funktioneller Reaktion auf entzündliche Reize zeigt.

Kritische Schritte und technische Überlegungen
Die Zuverlässigkeit dieser Methode hängt von mehreren kritischen Schritten ab. Zunächst sollte frische...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren berichten von keinem Interessenkonflikt in dieser Arbeit und bestätigen, dass die Nutzung von Figdraw zur Erstellung von Abbildung 1 den Lizenzbedingungen der Plattform entspricht.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde von der Nationalen Naturwissenschaftlichen Stiftung Chinas (Nr. 82074223 und 8207141673) sowie vom Schlüsselprojekt auf Zentralregierungsebene unterstützt: Die Etablierung einer nachhaltigen Nutzung wertvoller chinesischer Medizinressourcen (Nr. 2060302).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Alexa Fluor 488-konjugiertes Anti-Kaninchen-IgGZhongshan Jingqiao BiotechnologieZF-0511
0,25 % Trypsin-EDTA (1X)Gibco25200-072
4 % ParaformaldehydSolarbioP1110
Alexa Flour674 anti-menschliche CD68Biolegende562111
Tierfreie BlockierungslösungZell-Signaltechnik15019
APC Anti-Mensch CD90Biolegende559869
BD FACSDiva Software 8.0.2BD Biosciences657925
BD LSRFortessaBD Biosciences647177
BV605 anti-menschlicher CD11bBidegend563015
CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS)PromegaG358A
Kollagenase IISolarbioC8150
DAPI-haltiges fluoreszierendes MontagemediumZhongshan Jingqiao BiotechnologieZLI-9556
DAPI-haltiges fluoreszierendes MontagemediumZhongshan Jingqiao BiotechnologieZLI-9556
Dulbeccos modifiziertes Adlermedium (DMEM), hoher GlukosespiegelHyCloneSH30022.01
Fetales Rinderserum-Superfine (FBS)Shanghai Zhongqiao Xindan Biotechnology Co., Ltd.ZQ0500
FITC-anti-menschliches CD14Biolegende325604
PBS, 1&Times; (pH 7,4) Phosphatgepufferte KochsalzlösungServicebioG4202
Penicillin-Streptomycin-Mischungslösung (Doppelantibiotika) 100 x Mal;Shanghai Zhongqiao Xindan Biotechnology Co., Ltd.CSP006
QuickBlock universeller Proteinblocker und AntikörperverdünnungspufferBeyotimeP0270-500ml
Rekombinantes menschliches TNF-ΑPeprotech300-01A
Transkriptionsfaktor-FärbungsbuffeBioscience00-5523-00
Triton X-100SolarbioT8200
Trypsin-Lösung (EDTA-frei)Beijing Labgic Technology Co., Ltd.BL526A

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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