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Forschungsartikel

In vivo Nicht-invasive Beobachtung dynamischer Veränderungen im Haarschaft, Melanin und Kollagen während des Haarfollikelzyklus der Mäuse

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DOI:

10.3791/70144

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28. Juli 2026

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Acupuncture and Moxibustion, China Academy of Chinese Medical Sciences, 2Experimental Research Center, China Academy of Chinese Medical Sciences, 3School of Life Science, Beijing University of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

† These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Diese Studie präsentiert eine nicht-invasive, in vivo Methode mit Zwei-Photonen- und Zweitharmonischer Generationsmikroskopie, um die Haarschäftmorphologie, Melanindynamik und die dermale Kollagendichte während des gesamten Haarfollikelzyklus bei Mäusen längs zu überwachen und bietet so einen soliden methodischen Rahmen für die therapeutische Forschung bei Haarausfall.

Zusammenfassung

Traditionelle Bewertungen des Haarfollikelzyklus basieren auf invasiven histologischen Methoden, die die kontinuierliche Längsbeobachtung einschränken. Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass nicht-invasive optische Bildgebung, insbesondere die Zwei-Photonen-exzitierte Fluoreszenz (TPEF) und die zweitharmonische Erzeugung (SHG), dynamische Veränderungen in vivo in Haarschäften, Melanin und Kollagen über mehrere Haarfollikelzyklen hinweg genau verfolgen und quantifizieren kann. Die Haarschäfte von C57BL/6-Mäusen wurden während der Anagen-, Katagen- und Telogen-Phasen in vivo mittels Dermoskopie, Fotografie und Elektronenmikroskopie überwacht. Konkret wurden TPEF unter 800 nm Anregung und Bildgebung zur Quantifizierung der Melanindynamik verwendet, während SHG unter 950 nm zur Beobachtung interfollikulärer Kollagenveränderungen verwendet wurde. Um die Genauigkeit zu gewährleisten, wurden die in-vivo-optischen Messungen kreuzvalidiert: Die Melanindynamik wurde durch Hautfotografie für das Gesamterscheinungsbild des Gewebes sowie Hämatoxylin- und Eosin-(HE)-Färbung für die Haarbulbexpression bestätigt, während Kollagenveränderungen durch Beurteilung der Faserdichte und -orientierung mit einem flüssigkristallpolarisierenden Bildgebungssystem auf Sirius-Rot-gefärbten Schnitten validiert wurden. Die Beobachtungen zeigten, dass während der Anagenphase der Haardurchmesser und die Melaninproduktion schrittweise zunahmen, begleitet von einer signifikanten Verringerung der Kollagendichte zwischen den Follikelen. Während der Katagen- und Telogenphasen sanken die Melaninspiegel allmählich, und die Kollagendichte erholte sich allmählich auf das Ausgangsniveau. Dieses Projekt etabliert eine validierte, nicht-invasive In-vivo-Methodik zur Bewertung der umfassenden Dynamik der Haarfollikel und bietet einen robusten experimentellen Rahmen für die präklinische Bewertung von Wirkstoffen für Haarausfallbehandlungen.

Einleitung

Die Haarfollikel der C57BL/6-Mäuse zeigen Synchronizität und Regelmäßigkeit, was experimentelle Bequemlichkeit bietet und sie zu einem gängigen Tiermodell zur Untersuchung von Hautkrankheitenmacht. Die Haarfollikel treten in der siebten Woche nach der Geburt der C57BL/6-Maus3 in die zweite telogene Phase ein. Ohne künstliche Intervention wird diese telogene Phase bis zur zwölften Woche nach derGeburt 4 aufrechterhalten. Dieser verlängerte Zeitraum von Telogen ist ein häufiger Zeitpunkt, der in der Forschung verwendet wird, um denWachstumszyklus 5 der Haarfollikel zu synchronisieren. Nach der künstlichen Enthaarung der Mäuse beginnen die Haarfollikel sofort in dieAnagen-Phase 6 einzutreten.

Nach dem Eintritt in die Wachstumsphase vermehren und differenzieren sich die Stammzellen in der Wölbungsregion zur äußeren Wurzelscheide, wachsen nach unten und erhöhen so die Follikellänge7. Die Basis des Haarstrangs erstreckt sich nach oben, während sich der Haarfollikelvertieft. Die Stammzellen in der Zwiebel differenzieren sich kontinuierlich zum Haarschaft und der inneren Wurzelscheide9. Die Sekretion von Kollagen und Melanin in der Haut verändert sich ebenfalls schnell während der Anagen-Phase10 und spielt eine wichtige Rolle bei der Haarfollikelentwicklung 11,12. In Haarausfall-bezogenen Studien wird die Melaninsekretion meist anhand der Hautfarbe bewertet, was keine präzise Quantifizierung13 erlaubt. Bis heute konzentrierte sich die Forschung am Kollagen überwiegend auf Entwicklung und Alterung statt auf die zyklischen Dynamiken der Quantifizierung.

Derzeit ist eine wesentliche Einschränkung bei der Bewertung von Haarfollikelzyklen und regenerativen Therapien die Abhängigkeit von destruktiven histologischen Endpunkten, was die Euthanasierung verschiedener Tierkohorten zu bestimmten Zeitpunktenerforderlich macht 14. Dies verhindert eine kontinuierliche, longitudinale Verfolgung exakt derselben Follikelmikroumgebung über mehrere Zyklen. Darüber hinaus fehlt konventionellen nicht-invasiven Techniken wie der Dermatoskopie die Gewebedurchdringung, um tiefe Follikelveränderungensichtbar zu sehen 15, und die makroskopische Beobachtung kann Melanin nicht präzise quantifizieren, sodass die melaninmangelnde Wurzel des Knallhaars während der späten Regressions- und Ruhephasen schwer zu erkennen ist16,17. Während verschiedene optische Technologien die longitudinale in vivo Beobachtung18,19 vorangebracht haben, wie etwa Flüssigkristallpolarimetrie zur Bewertung von Kollagenfasern20,21, Hautkonfokalmikroskopie zur Beobachtungvon Pigmentierung 22,24 und optische Kohärenztomographie zur Messung der Hautdicke 25,26,27bietet die Multiphotonenmikroskopie eine einzigartig überzeugende Lösung. Die kombinierte Verwendung von Zwei-Photonen-Exzitationsfluoreszenz (TPEF) und zweitharmonischer Erzeugung (SHG) bietet deutliche Vorteile: Sie ermöglicht eine labelfreie, hochauflösende optische Schnittung tief in die Dermis, wodurch eine gleichzeitige in vivo Quantifizierung von Melanin-Autofluoreszenz und Kollagenfaserarchitektur ohne exogene Farbstoffeermöglicht 28,29. In dieser Studie vermuten die Autoren, dass nicht-invasive TPEF/SHG-Bildgebung diese strukturellen Veränderungen dynamisch und präzise quantifizieren kann, mit einer Genauigkeit, die mit invasiven histologischen Goldstandards vergleichbar ist. Durch die Bewältigung dieses zentralen wissenschaftlichen Problems zielt diese Studie darauf ab, ein robustes, longitudinales in vivo-Bildgebungsrahmen zu etablieren, das die nicht-invasive Bewertung von Therapeutika für Alopecia30 unterstützt.

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Protokoll

Alle Methoden, bei denen Wirbeltiere eingesetzt werden, wurden in Übereinstimmung mit institutionellen Richtlinien durchgeführt. Alle tierexperimentellen Verfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee des Experimental Research Center der China Academy of Chinese Medical Sciences (Protokollcode: ERCCACMS11-2210-03) genehmigt. Alle in dieser Studie verwendeten Materialien sind in der Materialtabelle aufgeführt.

Tiervorbereitung und makroskopische Beobachtung
Männliche C57BL/6 Mäuse, 6 Wochen alt und 20 ± 2 g schwer, wurden von einem kommerziellen Lieferanten bezogen. Die Mäuse wurden in eine histologische Analysekohorte (n = 39) und eine kontinuierliche in vivo bildgebende Kohorte (n = 3) eingeteilt. Das Rückenhaar aller Mäuse wurde enthaart, um den Haarfollikelzyklus zu synchronisieren. Der Haarwachstumsstatus wurde jeden zweiten Tag von Tag 2 bis Tag 26 nach der Enthaarung untersucht. Die Rückseiten der Mäuse in der Bildgruppengruppe wurden bis Tag 26 jeden zweiten Tag mit einer Kamera fotografiert. Ein fester Brennweite von 15 cm wurde eingehalten, und es wurden konsistent, standardisierte Umgebungslichtbedingungen im Labor gewährleistet, um makroskopische Veränderungen genau zu dokumentieren.

In vivo TPEF- und SHG-Bildgebung
Bildgebende Sitzungen wurden an den Tagen 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 und 26 nach der Enthaarung durchgeführt. Die Mäuse wurden mit Isofluran betäubt. Vollständiger Bewusstseinsverlust wurde durch Beobachtung der Atemfrequenz und das Testen des Fußreflexes mit einem sanften Zehenkniff sichergestellt. Die narkosierte Maus wurde an der Bühne eines Zwei-Photonen-Mikroskops befestigt. Für die TPEF-Bildgebung von Melanin war das Mikroskop mit einem 25-fachen Wasserimmersionsobjektiv ausgestattet (numerische Apertur = 1,05), und die Anregungswellenlänge wurde auf 800 nm eingestellt. Ein Z-Stack-Scan der Melanin-Autofluoreszenz wurde durchgeführt und erreichte eine Gesamtabtasttiefe von 45 μm. Die Schrittlänge wurde auf 2 μm gesetzt, die Bildauflösung auf 1.024 × 1.024 Pixel und die Aufnahmegeschwindigkeit auf 4 μs/Pixel. Für die SHG-Bildgebung von Kollagenfasern wurde die Anregungswellenlänge auf 950 nm eingestellt, wobei das gleiche 25-fache Wasserimmersionsobjektiv verwendet wurde. Ein Z-Stack-Scan von der Oberseite des Dermis bis zu einer Gesamtabtasttiefe von 45 μm wurde initiiert, wobei eine Schrittweite von 2 μm, eine Bildauflösung von 1.024 × 1.024 Pixel und eine Aufnahmegeschwindigkeit von 4 μs/Pixel beibehalten wurde. Nach der Bildaufnahme wurde die Maus vorsichtig aus der Mikroskopphase entfernt, Isofluran abgesetzt und auf eine Wärmematte gelegt, bis sie vollständig wieder bewusst war, bevor sie in den Heimkäfig zurückgebracht wurde.

Gewebesammlung und histologische Verarbeitung
Eine eigene, separate Kohorte von drei Mäusen aus der histologischen Gruppe wurde alle zwei Tage von Tag 2 bis Tag 26 eingeschläfert, gemäß den institutionellen Richtlinien, um sicherzustellen, dass keine Maus für längsgående histologische Probenentnahmen wiederverwendet wurde. Eine 2 cm × 2 cm große, volldicke dorsale Hautgewebeprobe, die genau an der Schnittstelle der horizontalen und vertikalen Mittellinie auf dem Rücken jeder Maus zentriert ist, wurde chirurgisch entfernt. Das entfernte Hautgewebe wurde flach auf eine harte Karte gelegt, um ein Kantenkräuseln zu verhindern, und sofort in ein Reagenzglas mit 4 % Paraformaldehyd eingetaucht. Die fixierten Gewebe wurden dehydriert und eingebettet, um 6 μm dicke Paraffinabschnitte herzustellen. Vor dem Entwachsen wurden die Paraffinabschnitte 120 Minuten lang auf einem Rutschheizer erhitzt. Die Schnitte wurden mit Hämatoxylin und Eosin (HE) sowie Sirius Red unter Verwendung standardmäßiger Färbesets gemäß den Anweisungen des Herstellers gefärbt. Die Abschnitte wurden mit neutralem Gummi montiert und mit einem umgekehrten Mikroskop beobachtet. Für flüssigkristallpolarisierte Bildgebung wurden die entwachsten und Sirius Red-gefärbten Abschnitte unter einem polarisierten Lichtmikroskop fotografiert. Ein einheitlicher Polarisationswinkel wurde durch das Kreuzen von Polarisator und Analysator in genau 90° Winkel hergestellt, um einen maximal dunklen Hintergrund (Extinktionszustand) zu erreichen, und dieser spezielle Winkel wurde bei allen nachfolgenden Bildaufnahmen konsequent gesperrt.

In vivo Dermoskopie und Elektronenmikroskopie der Haarschäfte
Vor dem Zupfen wurde der Bereich des dorsalen Haarwachstums in vivo mit einem klinischen Dermatoskop mit 20-facher Vergrößerung untersucht. Die Haarregeneration wurde mit einem standardisierten 0–3-Bewertungssystem quantifiziert, das auf der Erscheinung und Dichte des Haares basiert (0 = kein sichtbares Haar; 1 = spärliches Haaraufkommen; 2 = mittlere Haardichte; 3 = dichte, vollständige Haarbedeckung). Um eine unvoreingenommene Probenahme zu gewährleisten, wurde der dorsale depilierte Bereich jeder Maus visuell in vier gleich große Quadranten unterteilt. Ein Zufallszahlengenerator wurde verwendet, um pro Maus zwei Quadranten auszuwählen, und aus jedem ausgewählten Quadranten wurden mit steriler Pinzette fünf neu wachsende Haarschäfte fest gezogen. Die gezupften Haarschäfte wurden sofort eingetaucht und in 2,5 % Glutaraldehyd in einem 0,1 M großen Phosphatpuffer (pH 7,4) für 4 Stunden bei 4 °C fixiert, um die Ultrastruktur zu erhalten. Die fixierten Haarschäfte wurden dreimal in 0,1 M Phosphatpuffer gewaschen und sequentiell durch eine graduierte Ethanolserie (50 %, 70 %, 80 %, 90 % und 100 %) pro Konzentration dehydriert, gefolgt von einer kritischen Punkttrocknung mit flüssigemCO2. Die getrockneten Haarschäfte wurden horizontal auf leitfähiges, doppelseitiges Carbonband montiert, das an Aluminiumstubben befestigt war. Die Proben wurden mit einer 10-nm-Goldschicht mit einem Vakuum-Sputter-Beschichtungsbeschichter für 60 Sekunden beschichtet, um Elektronenladung zu verhindern. Die beschichteten Proben wurden in ein Rasterelektronenmikroskop eingeführt, und die Haarschäfte wurden mit einer Beschleunigungsspannung von 5,0 kV beobachtet. Ultramikroskopische morphologische Veränderungen wurden systematisch durch die Aufnahme von Bildern mit 500- und 1.000-facher Vergrößerung bewertet, wobei insbesondere der Haardurchmesser sowie die strukturelle Integrität und Anordnung der kutikulären Schuppen dokumentiert wurden.

Daten- und statistische Analyse
Bildparameter wurden mit generischer Bildanalysesoftware gemessen und quantifiziert. Alle statistischen Analysen und grafischen Darstellungen wurden mit standardisierter statistischer Analysesoftware durchgeführt. Für kontinuierliche In-vivo-Überwachungsdaten , die von denselben Tieren über mehrere Zeitpunkte gewonnen wurden, wurde die statistische Signifikanz mittels Varianzanalyse (RM-ANOVA) und anschließend Bonferronis Post-hoc-Test bestimmt. Für histologische Daten unabhängiger Tierproben wurde eine gewöhnliche Einweg-ANOVA gefolgt von Tukeys Post-hoc-Test verwendet, um statistische Unterschiede zu bewerten. Alle Ergebnisse wurden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) angegeben. Unterschiede wurden als statistisch signifikant bei *p < 0,05, p < 0,01 und ***p < 0,001 angesehen.

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Ergebnisse

Beobachtung von Maushaaren
Fotografische Beobachtungen des Maushaarwachstums sind in Abbildung 1A dargestellt. Das Haarwachstum durch die Hautoberfläche begann am 10. Tag, die Entwicklung wurde zwischen Tag 12 und 16 fortgesetzt (S. < 0,05). Die Haarabdeckung stagnierte anschließend von Tag 18 bis Tag 26 (S. > 0,05) (Abbildung 1B). Darüber hinaus erleichterte die Dermoskopie die nicht-invasi...

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Diskussion

Das C57BL/6-Mausmodell wurde ausgewählt, weil seine zweite telogene Phase stabil von Woche 7 bis Woche 12 andauert. Da das 26-tägige Beobachtungsfenster vollständig in diese statische Phase fällt, werden die beobachteten tiefgreifenden dynamischen Veränderungen explizit durch den durch Enthaarung induzierten Zyklusverlauf angetrieben, wobei natürliche altersbedingte Schwankungen vollständig ausgeschlossen werden. Wenn die Enthaarung während der telogenen Phase durchgeführt wird, treten d...

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Offenlegungen

Die Autoren geben an, dass sie keine bekannten konkurrierenden finanziellen Interessen oder persönlichen Beziehungen haben, die die in diesem Artikel berichtete Arbeit beeinflusst haben könnten. Ein Vorabdruck dieses Artikels ist im öffentlichen BioRxiv-Repository im folgenden Referenzverzeichnis42 verfügbar.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde vom China Academy of Chinese Medical Sciences Innovation Fund (ID: CI2025C001), dem Scientific and Technological Innovation Project der China Academy of Chinese Medical Sciences (Grant Nr. NLTS2025004) sowie die Grundlagenforschungsmittel für die zentralen Forschungsinstitute für öffentliche Wohlfahrt (Zuschussnummer JJPY2025002).

Beiträge der Autoren: Konzeptualisierung, Gaiying He und Yi Wang; Untersuchung, Menghua Liu, Xiaoyu Wang und Fenglong Wang; Datenkuratierung, Menghua Liu; Schreiben – Originalentwurfsvorbereitung, Menghua Liu; Finanzierungserwerbung, Yi Wang. Alle Autoren haben die veröffentlichte Version des Manuskripts gelesen und zugestimmt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
C57BL/6 Mäuse,Beijing Vital River Laboratory Animal TechnologySCXK (Jing) 2021-0006Verwendet für Tiermodelle
Digitale DSLR-KameraCanonEOS 80DVerwendet, um Bilder des Rückens von Mäusen aufzunehmen
H&E FärbesetLtdSolarbio Science & Technology Co.G1120Verwendet zum Färben von Gewebeschnitten
Invertiertes MikroskopOlympusBX51Verwendet zum Fotografieren
IsofluranRWD Life Science Co.R510-22-16Verwendet zur Betäubung von Tieren
Mai Tai DeepSeeSpectraPhysicsMai Tai HPVerwendet für TPEF und SHG in vivo Bildgebung
Medizinischer elektronischer DermatoskopChina Chuanghong Medical Technology Co.CH-DSIS-2000Verwendet für in vivo Bildgebung der Hautfarbe
Polarisiertes LichtmikroskopOlympusBX51-PVerwendet für die Bildgebung der Sirius Red Färbung
Rasterelektronenmikroskop (SEM)Hitachi High-Tech CorporationSU8010Zur Beobachtung der Haarschaft-Ultrastruktur
Sirius Red FärbesetSolarbioG1472Zur Färbung von Kollagenfasern
Kleintier-NarkosemaschineRWD Life Science Co.R500Verwendet zur Betäubung von Tieren

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